Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

W tej procedurze bada się wpływ małych ACE GTP na spolaryzowany transport błonowy. Najpierw wstrzyknij plazmidy DNA kodujące małe GTP ACE i białka reporterowe do jąder komórkowych spolaryzowanych komórek. Następnie ekspresja DNA w temperaturach, które zatrzymają białka reporterowe w retikulum endoplazmatycznym lub TGN, podczas gdy małe GTPA gromadzi się w cytozolu, kontynuuj pościg białka reporterowego na powierzchnię komórki w obecności cyklo heide, aby zapobiec dalszej syntezie białek.

Na koniec oznacz białko reporterowe na powierzchni komórki do analizy immunofluorescencyjnej. Wyniki uzyskane z tego testu pozwalają na wizualizację zmiany lokalizacji powierzchni za pomocą mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki istniejących metod, takich jak trans transfekt, jest to, że podczas krótkich czasów nadekspresji osiąganych za pomocą mikroiniekcji, efekty wtórne są minimalne, co pozwala nam badać pierwotne efekty badanych białek.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie polaryzacji komórek, takie jak to, jak małe gtpa reguluje spolaryzowany transport błonowy. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ poszczególne kroki niezbędne do udanej mikroiniekcji są trudne do wyjaśnienia bez pomocy wizualnej Wyizoluj DNA osocza wolne od endotoksyn za pomocą zestawu przygotowawczego Sigma Aldrich bez endotoksyn zgodnie z protokołem producenta. W tym eksperymencie użyj trzech przezroczystych 12-milimetrowych filtrów transwell o wielkości porów 0,4 mikrometra do hodowli.

Komórki umieszczają cztery razy 10 piątych komórek MDCK na każdym filtrze. Po dwóch dniach zbadaj kulturę pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy komórki rosną w zamkniętej monowarstwie. Do mikroiniekcji.

W dniu mikroiniekcji przygotuj płytki o wymiarach 360 na 15 milimetrów zawierające pięciolitrowe podłoże hodowlane MM plus 15 milimetrów heis i umieść je w inkubatorze o temperaturze 39 stopni Celsjusza. Ponadto przygotuj trzy 12-dołkowe płytki z jednym mililitrowym podłożem wzrostowym MEM plus 50 milimolowych heis i 0,1 miligrama na mililitr cykloheksymidu i umieść je w inkubatorze o temperaturze 31 stopni Celsjusza. Włącz mikroskop mikroiniekcyjny, ustawiony jak ten odwrócony mikroskop z podgrzewanymi obiektywami 10 x i 32 x oraz strumieniem einor femto.

Ustaw podgrzewaną scenę na 39 stopni Celsjusza. Otwórz również dopływ zbiornika azotu do stołu powietrznego. Teraz rozcieńczyć DNA przefiltrowaną wodą do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr.

Następnie wirować DNA w mikrowirówce einor z prędkością 13 000 obr./min przez 30 minut. Zdejmij górną część i umieść w nowej tubie. Następnie przygotuj komórki MDCK, wyjmując pierwszy filtr z naczynia hodowlanego za pomocą ostrza chirurgicznego, wytnij filtr z uchwytu filtra i umieść go na przygotowanej płytce o wymiarach 60 na 15 milimetrów zawierającej pięć mililitrów podgrzanej pożywki hodowlanej MEM o temperaturze 39 stopni Celsjusza oraz 50 milimolowych pożywki.

Aby obciążyć filtr na płytce hodowlanej, umieść ostrze chirurgiczne na środku filtra, a następnie przenieś płytkę hodowlaną na podgrzewany stolik mikroskopu. Załaduj dwa do trzech mikrolitrów rozcieńczonego DNA do igły do mikroiniekcji. Przekręć osłonę ochronną igły i pozwól jej opaść na podłogę.

Aby umieścić igłę w uchwycie, naciśnij przycisk menu wstrzykiwacza i upewnij się, że zawór jest zamknięty. Wkręć igłę w jej uchwyt. Uważaj, aby nie wkręcać igły zbyt mocno.

Ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia, ponownie naciśnij menu. Tak więc zastosowane ciśnienie kompensacyjne zapobiegnie zasysaniu pożywki do igły podczas procedury mikroiniekcji. Na koniec dotknij joysticka, aby usunąć zapisany baz, aby opuścić igłę na komórki.

Użyj obiektywu 10 x i umieść igłę w wiązce światła nad płynem. Teraz skup się na komórkach. Ponownie ustaw ostrość, obracając pokrętło ostrości o 180 stopni w górę i znajdź igłę.

Powoli ustawić ostrość igły. Następnie ponownie rozmyj go w ostrości. Praca nad ponownym skupieniem się na komórkach.

Ponownie ustaw ostrość igłę w dół. Powtarzaj tę czynność, aż igła dotknie powierzchni podłoża, w którym to momencie zaobserwuje się aureolę. Kontynuuj docieranie do punktu, w którym komórki są ostre, ale igła jest nadal rozmyta poza płaszczyzną ogniskowej.

Teraz przełącz się na cel 32x i znajdź ustawienia kursu. Ustaw granicę Z, dotykając błony wierzchołkowej końcówką igły i odejmując około 10 mikrometrów. Ponieważ jądra leżą około 10 mikrometrów pod błoną wierzchołkową.

Teraz wyciągnij igłę o kilka mikronów z płaszczyzny ogniskowej tak szybko, jak to możliwe. Wycelować igłą powyżej jądra, nacisnąć i zwolnić przycisk wstrzyknięcia joysticka. Zacznij od 95 PSI, aby znaleźć odpowiednie ciśnienie wtrysku.

Jeśli ciśnienie jest zbyt wysokie, ogniwa eksplodują. Jeśli ciśnienie jest zbyt niskie, biała kropka utrzymuje się, ale nic więcej się nie dzieje. Wykonać udaną iniekcję obejmującą zmianę fazy bez zmiany wielkości komórki.

Wstrzyknij od 100 do 500 komórek w otwór ostrza chirurgicznego, który leży na komórkach. Następnie umieść komórki za pomocą naczynia hodowlanego i ostrza chirurgicznego w inkubatorze o temperaturze 39 stopni Celsjusza i inkubuj przez dwie godziny. Na koniec przenieś komórki na przygotowaną 12-dołkową płytkę o pojemności jednego mililitra, MEM plus 50 milimoli 0,1 miligrama na mililitr, cyklo heide i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 31 stopni Celsjusza.

Aby uniknąć blaknięcia wyrażonego sygnału GFP, należy chronić próbki przed światłem, przykrywając je folią aluminiową podczas wszystkich kolejnych procedur barwienia powierzchni. Umieść komórki w naczyniu hodowlanym na metalowej płytce na lodzie i umyj. Po zastosowaniu lodowatego PBS plus plus umieść czysty kawałek paraformy na metalowej płytce na pipecie lodowej 30 mikrolitrowych kropli przeciwciała, które rozpoznaje domenę ektogeniczną interesującego Cię białka.

Teraz umieść filtr zawierający komórki do góry nogami na kropli i dodaj kilka kropli przeciwciała na tylną stronę filtra. Inkubować przez godzinę na lodzie. Umyj komórki trzykrotnie lodowatym PBS plus plus i utrwal 3% aldehydem paraform przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Kontynuuj jednokrotne mycie komórek za pomocą PBS plus plus i równoważ w PBS plus plus przez pięć minut. Teraz inkubuj komórki w blokującym przepuszczalnym buforze. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w stosunku jeden do 200 w BPB, aby wykryć wyrażoną wirówkę RAB GTP ACE przez 10 minut W pipecie 13 000 obr./min, 30 mikrolitrów roztworu przeciwciała na czysty param umieszczony w mokrej komorze.

Umieść komórki na filtrze do góry nogami na kroplach przeciwciał i inkubuj przez godzinę. W temperaturze pokojowej umieść komórki z powrotem prawą stroną do góry w 12. Dobrze rozszczepić i przemyć pięć razy w ciągu 30 minut BPB w temperaturze pokojowej po inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi, w tym etapem przemywania wodą.

Zanurz komórki na filtrze trzy razy w wodzie dejonizowanej i umieść prawą stroną do góry na mikroszkiełkach na 10 mikrolitrach mocowania Umieść na wierzchu mikro pokryte szkło o wymiarach 18 na 18 milimetrów i za pomocą chusteczek do twarzy delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do komórek. Na koniec uszczelnić lakierem do paznokci w pozorowanym wstrzyknięciu tylko plazmidu kodującego V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. Białko jest dostarczane do podstawno-bocznej powierzchni dobrze spolaryzowanych komórek MDCK, co ocenia się na podstawie czerwonego zabarwienia powierzchni w komórkach, które nie są dobrze spolaryzowane.

Część białka fuzyjnego GFP zostanie dostarczona do błony wierzchołkowej. Jeśli próbki kontrolne wyglądają w ten sposób, nie można ufać danym i eksperyment należy powtórzyć z lepiej spolaryzowanymi komórkami. Należy zauważyć, że nie cała fuzja wyrażona do GFP jest dostarczana do błony podstawno-bocznej podczas pogoni za 31 stopniami Celsjusza, o czym świadczy rozległy wewnątrzkomórkowy zielony sygnał dla całego białka Po opanowaniu ta technika powinna zająć około 10 do 12 godzin po jej rozwinięciu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transportem błonowym do zbadania białek regulatorowych w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać białka w spolaryzowanych komórkach nabłonka za pomocą techniki mikroiniekcji.