Name: Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj analizę małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych przy użyciu mikroiniekcji plazmidów. Ta metoda umożliwia badanie pierwotnych efektów białek z minimalnymi efektami wtórnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu National Institutes of Health (GM070736) przyznanego H. Fölsch. S.F. Ang otrzymał stypendium A*STAR Graduate Scholarship, a R.S. Kang był wspierany przez Cellular and Molecular Basis of Disease Training Program (GM8061)

1. Izolacja plazmidowego DNA
<ol>
	<li>Użyj zestawu Sigma-Aldrich endotoxin-free maxiprep do przygotowania wolnego od endotoksyn DNA zgodnie z protokołem producenta. Zestaw ten sprawdza się w naszych badaniach, ponieważ niezawodnie usuwa endotoksyny z preparatów DNA. Endotoksyny wstrzykiwane wraz z DNA do jąder komórkowych prowadzą do śmierci komórek.</li>
	<li>Do wyizolowanego DNA dodaj 100 μl fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1), wymieszaj w wortexie i wiruj przez 1 min przy 13,000 rpm w mikrowirówce Eppendorf. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki i dodaj 100 μl chloroform/alkohol izoamylowy (24:1), wymieszaj w wortexie i wiruj w powyższy sposób. Przenieś górną fazę wodną zawierającą DNA do nowej probówki. Ten etap jest niezbędny do usunięcia białek z DNA, co zapobiega zapychaniu się igły do mikroiniekcji.</li>
	<li>Wytrąć DNA, dodając octan sodu (pH 6.0) do stężenia końcowego 300 mM oraz 2-krotną objętość 100% etanolu. Inkubuj przez noc w temperaturze -20°C. Wiruj DNA przez 20 min przy 13,000 rpm w mikrowirówce Eppendorf, przemyj raz 70% etanolem i resuspenduj w 300 μl wody wolnej od endotoksyn (Sigma-Aldrich).</li>
	<li>Oznacz stężenie DNA. Typowe stężenie DNA mieści się w zakresie od 1 do 5 μg/μl.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek MDCK
<ol>
	<li>Przeprowadź pasaż komórek MDCK. Policz komórki i wysiej 4 X 105 komórek na przezroczyste filtry Transwell o średnicy 12 mm (rozmiar porów 0,4 μm, Corning Costar, 3460). W przypadku eksperymentu obejmującego kontrolę z pozorowaną injekcją (mock-injection) oraz dwa różne mutanty białek Rab, należy wysiać komórki na trzy filtry.</li>
	<li>Hoduj komórki MDCK w pożywce MEM z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, 0,1 mg/ml penicyliny/streptomycyny oraz 7% (obj./obj.) płodowej surowicy bydlęcej (= pożywka wzrostowa MEM) w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.</li>
	<li>Codziennie wymieniaj pożywkę w komorze basolateralnej. Wspomaga to proces polaryzacji, ponieważ naśladuje sytuację komórek nabłonkowych u zwierząt.</li>
	<li>2 dni po wysianiu sprawdź pod mikroskopem, czy komórki rosną w postaci zwartej monowarstwy. Jeśli w monowarstwie nie występują żadne przerwy, przeprowadź eksperyment w 3. dniu. Jeśli przerwy nadal są widoczne, przeprowadź eksperyment w 4. dniu.</li>
</ol>
3. Procedura mikroiniekcji i inkubacje poiniekcyjne
<ol>
	<li>W dniu eksperymentu przygotować 5 ml pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEPES w jednej płytce 60 x 15 mm dla każdego filtra i umieścić w inkubatorze w temperaturze 39°C. Dodatkowo, przygotować jedną studzienkę płytki 12-dołkowej z 1 ml pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEPES i 0,1 mg/ml cykloheksymidu na filtr i umieścić w inkubatorze w temperaturze 31°C.</li>
	<li>Włączyć mikroskop do mikroiniekcji i ustawić podgrzewany stolik na 39°C. Używamy mikroskopu odwróconego (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) z podgrzewanym stolikiem, obiektywami 10X i 32X oraz urządzenia Eppendorf Femtojet (Injectman NI2). Na koniec otworzyć butlę z azotem zasilającą stół pneumatyczny.</li>
	<li>Rozcieńczyć DNA w wodzie filtrowanej (używając filtra 0,2 μm) do stężenia końcowego 0,2 mg/ml w całkowitej objętości 10 - 100 μl. Następnie wirować DNA w mikrocentryfudze Eppendorf przy 13 000 rpm przez 30 min. Usunąć górną część i przenieść do nowej probówki. Krok ten gwarantuje, że podczas ładowania rozcieńczonego DNA do igły do mikroiniekcji załaduje się precyzyjnie „czyste” DNA. DNA jest teraz gotowe do mikroiniekcji.</li>
	<li>Przygotować komórki, wyjmując pierwszy filtr z naczynia hodowlanego. Za pomocą skalpela (Feather Surgical Blade, stal nierdzewna, nr 11) wyciąć filtr z uchwytu i umieścić w 5 ml podgrzanej do 39°C pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEPES (płytka 60 x 15 mm). Przycisnąć filtr w płytce hodowlanej skalpelem użytym do wycinania, tak aby otwór skalpela otaczał środek filtra. Umieścić płytkę hodowlaną na podgrzewanym stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Nabrać 2-3 μl rozcieńczonego DNA (w tym przypadku plazmidów kodujących VSVGts045-GFP = kontrola mikroiniekcji pozornej) do igły do mikroiniekcji (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), odkręcić osłonkę ochronną igły i odłożyć ją. Teraz igła jest gotowa do wkręcenia w uchwyt. Aby to zrobić, nacisnąć klawisz menu w urządzeniu Injectman i upewnić się, że zawór jest zamknięty. Wkręcić igłę w uchwyt, uważając, aby nie dokręcić jej zbyt mocno, co mogłoby doprowadzić do jej złamania. Następnie ponownie nacisnąć klawisz menu; przyłożone Pc zapobiegnie zasysaniu pożywki do igły podczas procedury mikroiniekcji. Na koniec dotknąć dżojstika, aby wymazać zapamiętaną pozycję startową.</li>
	<li>Aby opuścić igłę na komórki, użyć obiektywu 10X i wprowadzić igłę w wiązkę światła nad cieczą. Następnie ustawić ostrość na komórkach, ponownie przesunąć punkt ostrości w górę, obracając pokrętło ostrości o 180°, i odnaleźć igłę. Następnie powoli wprowadzić igłę w obszar ostrości, potem ponownie ją rozmyć (dążąc do ponownego ustawienia ostrości na komórkach), a następnie znów wprowadzić igłę w obszar ostrości. Powtarzać do momentu, aż igła dotknie powierzchni pożywki, co objawi się widocznym halo. Gdy komórki będą ostre, a igła wciąż rozmyta (tj. poza płaszczyzną ogniskową), zmienić obiektyw na 32X i dostroić ustawienia wstępne.</li>
	<li>Ustawić limit osi z, dotykając błony apikalnej końcówką igły i odejmując około 10 μm, ponieważ jądra znajdują się mniej więcej 10 μm pod błoną apikalną.</li>
	<li>Po ustawieniu limitu z dobrać odpowiednie ciśnienie iniekcji. Rozpocząć od 95 PSI. Jeśli ciśnienie będzie zbyt wysokie, komórki ulegną rozerwaniu. Jeśli ciśnienie będzie zbyt niskie, pojawi się biała kropka, która nie zniknie, ale nic innego się nie stanie. Przy udanej iniekcji nastąpi zmiana fazy bez zmiany wielkości komórki. Podczas iniekcji jak najszybciej przesunąć igłę o kilka mikronów poza płaszczyznę ogniskową. Wycelować igłą nad jądrem (tj. w środek pojedynczej komórki) i nacisnąć przycisk iniekcji w dżojstiku, nie przytrzymując go.</li>
	<li>Wykonać iniekcję w 100-500 komórkach znajdujących się w obrębie otworu skalpela leżącego na komórkach. Po zakończeniu umieścić komórki wraz z naczyniem hodowlanym i skalpelem w inkubatorze w temperaturze 39°C i inkubować przez 2 h. W tym czasie VSVGts045-GFP jest eksprymowany i wydzielany do ER. Jednak w temperaturze 39°C VSVGts045-GFP nie może prawidłowo przyjąć konformacji i w związku z tym nie może opuścić ER. Jednocześnie w eksperymentach z ko-iniekcją badana mała GTPaza będzie gromadzić się w cytozolu.</li>
	<li>Po 2 h przenieść komórki do 1 ml pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEPES i 0,1 mg/ml cykloheksymidu w płytce 12-dołkowej i inkubować przez 2 h w temperaturze 31°C. Podczas tego okresu „pościgu” (chase period) VSVGts045-GFP prawidłowo przyjmie konformację, opuści ER i zostanie dostarczony na powierzchnię komórki.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.1 – 3.10 dla filtra drugiego (iniekcja plazmidów kodujących VSVGts045-GFP oraz np. Rab13T22N z tagiem V5) i trzeciego (iniekcja plazmidów kodujących VSVGts045-GFP oraz np. Rab13Q67L z tagiem V5). Każda iniekcja zajmie około 20 - 60 min. Jest jednak absolutnie kluczowe, aby traktować każdy filtr w ten sam sposób podczas inkubacji ze zmianą temperatury oraz barwienia powierzchniowego, aż do momentu utrwalenia komórek. Po utrwaleniu można przeprowadzić resztę protokołu barwienia dla wszystkich filtrów jednocześnie.</li>
</ol>
4. Barwienie powierzchniowe do analizy immunofluorescencyjnej
Uwaga: aby uniknąć blaknięcia sygnału GFP białka VSVGts045-GFP, należy chronić preparaty przed światłem, owijając je folią aluminiową podczas wszystkich kolejnych procedur.
<ol>
	<li>W przypadku chęci przeprowadzenia barwienia powierzchniowego, naczynie hodowlane z komórkami należy umieścić na metalowej płytce w lodzie i przemyć komórki 1X lodowatym PBS2+ (PBS [0,2 g/litr KCl, 0,2 g/litr KH2PO4, 8 g/litr NaCl oraz 2,17 g/litr Na2HPO4 x 7 H2O] oraz 0,1 g/litr CaCl2 i 0,1 g/litr MgCl2 x 6 H2O). Następnie na czystą parafilm położoną na metalowej płytce w lodzie należy nanieść 30 μl przeciwciała rozpoznającego ektodomenę badanego białka, w tym przypadku mysiego przeciwciała monoklonalnego TK1 (IgG1, otrzymanego od śp. Thomasa Kreisa). Filtr z komórkami należy położyć odwróconą stroną na kropli przeciwciał, a następnie nanieść kilka kropli przeciwciał na tylną stronę filtra. Inkubować przez 1 h w lodzie.</li>
	<li>Komórki należy przenieść do płytki 12-dołkowej, przemyć 3X lodowatym PBS2+ (lub PBS2+ w temperaturze pokojowej RT, jeśli nie przeprowadzono uprzedniego barwienia powierzchniowego) i utrwalić 3% paraformaldehydem przez 15 min w RT.</li>
	<li>Komórki należy przemyć raz PBS2+ i pozostawić w PBS2+ na 5 min.</li>
	<li>Komórki należy inkubować w buforze blokującym i permeabilizującym (BPB) (2% [mas/obj] BSA, 0,4% [mas/obj] saponiny w PBS2+) z dodatkiem 10% [obj/obj] surowicy koziej. Inkubować przez 1 h w RT.</li>
	<li>Przeciwciała pierwszorzędowe do wykrywania ekspresyjnej Rab GTPazy, w tym przykładzie anty-V5 (mysie przeciwciało monoklonalne IgG2a, Invitrogen), należy rozcieńczyć 1:200 w BPB. Rozcieńczone przeciwciała należy wirować w mikrowirówce Eppendorf przez 10 min przy 13 000 rpm. Na czystą parafilm umieszczoną w komorze wilgotnościowej należy nanieść 30 μl roztworu przeciwciał. Komórki na filtrze należy położyć odwróconą stroną na kropli przeciwciał i inkubować przez 1 h w RT.</li>
	<li>Komórki należy przenieść z powrotem (stroną górną do góry) do płytki 12-dołkowej i przemyć 5X w ciągu 30 min buforem BPB w RT.</li>
	<li>Należy rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała wtórne, w tym przypadku kozie anty-mysie IgG1 znakowane Alexa 594 (do wykrywania VSVG na powierzchni, Invitrogen) oraz przeciwciała wtórne znakowane Cy5 do rozpoznawania Rab GTPazy, w tym przykładzie kozie anty-mysie IgG2a znakowane Cy5 (Jackson ImmunoResearch), w stosunku 1:200 w BPB i wirować jak opisano powyżej. Na czystą parafilm w komorze wilgotnościowej należy nanieść 30 μl roztworu przeciwciał i położyć komórki na filtrze odwróconą stroną na kropli przeciwciał. Inkubować przez 1 h w RT.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.6.</li>
	<li>Filtr z komórkami należy zanurzyć 3X w wodzie dejonizowanej i położyć stroną górną do góry na szkiełkach mikroskopowych. Na komórki należy nanieść 10-15 μl medium montażowego (10% [mas/obj] DABCO, 50% [mas/obj] glicerolu w wodzie destylowanej). Na wierzch należy położyć szkiełko nakrywkowe 18x18 mm i za pomocą chusteczek higienicznych delikatnie docisnąć nakrywkę do komórek. Zamocować lakierem do paznokci.</li>
	<li>Preparaty należy analizować za pomocą mikroskopu konfokalnego. Użyto systemu Microsystem LSM 510 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) wyposażonego w obiektyw imersyjny wodny 63X.</li>
	<li>Do przygotowania rycin należy dostosować i połączyć obrazy przy użyciu programów takich jak Adobe Photoshop oraz Adobe Illustrator.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
W celu zapoznania się z przykładami tego, jak koekspresja małych GTPaz zakłóca sortowanie VSVG, prosimy o zapoznanie się z opublikowanymi artykułami dotyczącymi błędnego sortowania apikalnego 3, 4 lub hamowania dostarczania na powierzchnię 7.
 <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Schemat spolaryzowanych i niespolaryzowanych komórek MDCK; porównanie lokalizacji powierzchniowego i całkowitego białka VSVG." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. W przypadku tzw. mock-injection, czyli wstrzyknięcia samego plazmidu kodującego VSVGts045-GFP, białko jest dostarczane na powierzchnię basolateralną dobrze spolaryzowanych komórek MDCK, co stwierdzono na podstawie barwienia powierzchniowego (kolor czerwony, Rycina 1 A). Należy zauważyć, że podczas inkubacji (chase) w 31°C nie całe białko VSVGts045-GFP jest dostarczane do błony basolateralnej, o czym świadczy rozległy wewnątrzkomórkowy sygnał dla białka całkowitego (kolor zielony, Ryciny 1 A i B). W komórkach, które nie są dobrze spolaryzowane, VSVGts045-GFP będzie dostarczane również do błony apikalnej (Rycina 1 B). Jeśli preparaty kontrolne wyglądają jak komórka na Rycini 1 B, dane są niewiarygodne i należy powtórzyć eksperyment z użyciem lepiej spolaryzowanych komórek. Paski skali wynoszą 5 μm.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
<li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li>
<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Kluczowymi czynnikami dla sukcesu eksperymentu z mikroiniekcją są jakość i czystość DNA oraz polaryzacja komórek. Bez spolaryzowanych komórek kontrola iniekcji będzie już wykazywać błędne targetowanie VSVG, co uniemożliwi wykorzystanie eksperymentu. Jeśli DNA będzie słabej jakości, może ono zapchać igłę iniekcyjną, co doprowadzi do niskiej lub całkowitego braku ekspresji pożądanego białka. Zaleca się również stosowanie plazmidów ekspresyjnych znanych z wysokich poziomów ekspresji, takich jak pRKV.
<p class="jove_cont...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Axiovert 200 z podgrzewanym stolikiem</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Zamówienie indywidualne</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator Injectman NI2 Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>Zamówienie indywidualne</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II (Igły do mikroiniekcji)</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do microloadera</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste podkładki filtracyjne transwell 12-mm</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do maxiprepu plazmidów wolnych od endotoksyn</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA0400</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza funkcji małych gtpaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Komórki nabłonkowe polaryzują swoją błonę plazmatyczną na biochemicznie i funkcjonalnie odrębne domeny apikalną oraz bazolateralną, gdzie domena apikalna przylega do powierzchni „wolnych”, a błona bazolateralna pozostaje w kontakcie z podłożem i sąsiednimi komórkami. Obie domeny błonowe są rozdzielone przez połączenia ścisłe, które tworzą barierę dyfuzyjną. Polaryzację apikalno-bazolateralną można z powodzeniem odtworzyć w hodowli, gdy komórki nabłonkowe, takie jak komórki Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), są wysiewane z wysoką gęstością na filtry poliwęglanowe i hodowane przez kilka dni 1 2. Ustanowienie i utrzymanie polarności komórkowej jest regulowane przez szereg małych GTPaz z superrodziny Ras, takich jak RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 i Rab13 3 4 5 6 7. Podobnie jak wszystkie GTPazy, białka te przechodzą cykl między nieaktywnym stanem związanym z GDP a aktywnym stanem związanym z GTP. Specyficzne mutacje w regionach wiązania nukleotydów zakłócają ten cykl 8. Na przykład Rab13T22N jest trwale zablokowany w formie GDP, przez co określa się go mianem „dominant negative” (dominującego negatywnego), podczas gdy Rab13Q67L nie może już hydrolizować GTP i jest zatem zablokowany w stanie „dominant active” (dominującym aktywnym) 7. Aby przeanalizować ich funkcję w komórkach, zarówno allele dominant negative, jak i dominant active GTPaz są zazwyczaj ekspresowane na wysokim poziomie, aby zakłócić funkcję białek endogennych 9. Elegantnym sposobem na osiągnięcie wysokiego poziomu nadekspresji w krótkim czasie jest wprowadzenie plazmidów kodujących odpowiednie białka bezpośrednio do jąder spolaryzowanych komórek hodowanych na filtrach za pomocą techniki mikroiniekcji. Jest to często łączone ze współiniekcją plazmidów reporterowych kodujących receptory błony plazmatycznej, które są specyficznie sortowane do domeny apikalnej lub bazolateralnej. Ładunkiem często używanym do analizy sortowania do domeny bazolateralnej jest allel temperaturozależny glikoproteiny wirusa zapalenia jam ustnych (VSVGts045) 10. Białko to nie może prawidłowo sfałdować się w 39°C i w związku z tym pozostaje w retikulum endoplazmatycznym (ER), podczas gdy analizowane białko regulatorowe gromadzi się w cytozolu. Zmiana temperatury na 31°C pozwoli następnie VSVGts045 na prawidłowe sfałdowanie, opuszczenie ER i transport do błony plazmatycznej 11. Taki etap śledzenia (chase) jest zazwyczaj przeprowadzany w obecności cykloheksymidu, aby zapobiec dalszej syntezie białek, co pozwala na uzyskanie czystszych wyników. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy procedurę mikroiniekcji plazmidów do spolaryzowanych komórek oraz późniejsze inkubacje, w tym zmiany temperatury, które umożliwiają kompleksową analizę białek regulatorowych zaangażowanych w sortowanie bazolateralne.

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury związane z nadekspresją i analizą małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych z wykorzystaniem techniki mikroiniekcji.

Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Komórki nabłonkowe polaryzują swoją błonę komórkową, tworząc biochemicznie i funkcjonalnie odrębne domeny apikalną i bazolateralną, z czego domena apikalna jest skierowana w stronę...

Niniejsza procedura służy do badania wpływu małych białek GTPazy ACE na polaryzowany transport błonowy. W pierwszej kolejności należy współwstrzyknąć plazmidy DNA kodujące małe białko GTPaza ACE oraz białka reporterowe do jąder komórkowych spolaryzowanych komórek. Następnie należy przeprowadzić ekspresję DNA w temperaturach, które zatrzymają białka reporterowe w retikulum endoplazmatycznym lub w sieci trans-Golgi (TGN), podczas gdy małe białko GTPA będzie gromadzić się w cytozolu; następnie należy przeprowadzić fazę „chase” białka reporterowego do powierzchni komórki w obecności cykloheksymidu, aby zapobiec dalszej syntezie białek.Na koniec należy oznakować białko reporterowe na powierzchni komórki w celu przeprowadzenia analizy immunofluorescencyjnej. Wyniki uzyskane w tym badaniu pozwalają na wizualizację zmian w lokalizacji powierzchniowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja, jest fakt, że podczas krótkiego czasu nadekspresji uzyskiwanego dzięki mikroiniekcji efekty wtórne są minimalne, co pozwala na badanie pierwotnych efektów białek docelowych.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie polarności komórkowej, takie jak sposób, w jaki małe białka gtpa regulują spolaryzowany transport błonowy. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ poszczególne kroki niezbędne do przeprowadzenia udanej mikroiniekcji są trudne do wyjaśnienia bez pomocy wizualnej. Wyizoluj wolne od endotoksyn plazmidowe DNA za pomocą zestawu Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep zgodnie z protokołem producenta. W tym doświadczeniu do hodowli wykorzystaj trzy przezroczyste filtry transwell o średnicy 12 mm i rozmiarze porów 0,4 µm.Na każdy filtr nanosi się 4 × 10⁵ komórek MDCK. Po dwóch dniach należy zbadać hodowlę pod mikroskopem, aby zweryfikować, czy komórki tworzą zamkniętą monowarstwę. Do mikroiniekcji.W dniu mikroiniekcji przygotować płytki o wymiarach 360 na 15 mm z pięcioma litrami pożywki wzrostowej MM oraz 15 mM HEIS i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 39°C. Dodatkowo przygotować trzy płytki 12-dołkowe z jednym mililitrem pożywki wzrostowej MEM oraz 50 mM HEIS i 0,1 mg/mL cykloheksymidu, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 31°C. Włączyć mikroskop do mikroiniekcji, skonfigurowany jako mikroskop odwrócony z grzanym stolikiem, obiektywami 10x i 32x oraz systemem FemtoJet.Ustaw podgrzewany stolik na 39 °C. Otwórz również dopływ azotu z butli do stołu pneumatycznego. Następnie rozcieńcz DNA filtrowaną wodą do końcowego stężenia 0,2 mg/mL.Następnie wirować DNA w mikrowirówce przy 13 000 RPM przez 30 minut. Odobrać górną warstwę i przenieść do nowej probówki. Następnie przygotować komórki MDCK, wyjmując pierwszy filtr z naczynia hodowlanego za pomocą skalpela, wycinając filtr z uchwytu i umieszczając go w przygotowanej płytce 60 by 15 mm zawierającej pięć mililitrów podgrzanej do 39 °C pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEES.Aby obciążyć filtr w płytce hodowlanej, należy umieścić skalpel w centrum filtra, a następnie przenieść płytkę hodowlaną na podgrzewany stolik mikroskopu. Nabierz dwa do trzech µL rozcieńczonego DNA do igły do mikroiniekcji. Odkręć osłonę ochronną igły i odłóż ją na bok.Aby umieścić igłę w uchwycie, naciśnij klawisz menu w strzykawce i upewnij się, że zawór jest zamknięty. Wkręć igłę do uchwytu. Należy uważać, aby nie wkręcać igły zbyt mocno.Aby uniknąć uszkodzenia, ponownie naciśnij klawisz menu. Dzięki temu zastosowane ciśnienie kompensacyjne zapobiegnie zasysaniu medium do igły podczas procedury mikroiniekcji. Na koniec dotknij dżojstika, aby wymazać zapamiętany punkt startowy i opuścić igłę na komórki.Użyj obiektywu 10x i wprowadź igłę w wiązkę światła nad cieczą. Następnie ustaw ostrość na komórkach. Ponownie przesuń płaszczyznę ostrości w górę, obracając pokrętło ostrości o 180 stopni w górę, i zlokalizuj igłę.Powoli przesuń igłę, aby uzyskać ostrość. Następnie ponownie ją rozostrz. Pracuj nad tym, aby ponownie uzyskać ostrość obrazu komórek.Ponownie ustaw ostrość na igłę. Powtarzaj czynność, aż igła dotknie powierzchni podłoża, co objawi się pojawieniem obwódki (halo). Kontynuuj, aż osiągniesz punkt, w którym komórki będą ostre, ale igła pozostanie rozmyta, znajdując się poza płaszczyzną ogniskową.Przełącz teraz na obiektyw 32x i dokonaj ustawień wstępnych. Ustaw limit osi Z, dotykając końcówką igły błony apikalnej i odejmując około 10 µm, ponieważ jądra komórkowe znajdują się w odległości około 10 µm pod błoną apikalną.Teraz przesuń igłę o kilka mikronów poza płaszczyznę ogniskową tak szybko, jak to możliwe. Wyceluj igłę powyżej jądra komórkowego, a następnie naciśnij i zwolnij przycisk wtrysku w joysticku. Zacznij od 95 PSI, aby dobrać odpowiednie ciśnienie wtrysku.Jeśli ciśnienie jest zbyt wysokie, komórki pękają. Jeśli ciśnienie jest zbyt niskie, widoczna pozostaje biała kropka, ale nic innego się nie dzieje. Przeprowadź pomyślną iniekcję obejmującą zmianę fazy bez zmiany rozmiaru komórki.Wstrzyknij od 100 do 500 komórek do otworu w skalpelu, który spoczywa na komórkach. Następnie umieść komórki wraz z naczyniem hodowlanym i skalpelem w inkubatorze w temperaturze 39 °C i inkubuj przez dwie godziny. Na koniec przenieś komórki do przygotowanej płytki 12-dołkowej zawierającej 1 ml medium MEM z dodatkiem 50 mM i 0,1 mg/ml cykloheksymidy i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 31 °C.Aby uniknąć blaknięcia sygnału ekspresyjnego GFP, należy chronić preparaty przed światłem, owijając je folią aluminiową podczas wszystkich kolejnych procedur barwienia powierzchniowego. Umieścić szalkę hodowlaną z komórkami na metalowej płytce z lodem i przemyć. Raz zimnym PBS++, a następnie umieścić czysty kawałek paraformy na metalowej płytce z lodem i nanieść pipetą krople 30 µL przeciwciała rozpoznającego domenę zewnątrzkomórkową badanego białka.Następnie należy położyć filtr zawierający komórki odwrócony stroną górną do dołu na kropli i dodać kilka kropli przeciwciała na tylną stronę filtra. Inkubować przez jedną godzinę na lodzie. Przemyć komórki trzy razy lodowatym PBS++ i utrwalić 3% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy przemyć komórki raz roztworem PBS plus plus i inkubować w PBS plus plus przez pięć minut. Teraz inkubuj komórki w przepuszczalnym buforze blokującym. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, rozcieńczając przeciwciała pierwszorzędowe w stosunku 1:200 w BPB w celu wykrycia ekspresji RAB GTP ACE; wiruj przez 10 minut przy 13 000 RPM. Nanieś pipetą 30 µL roztworu przeciwciał na czystą laminkę umieszczoną w wilgotnej komorze.Umieścić komórki na filtrze odwróconym do góry na kroplach przeciwciał i inkubować przez jedną godzinę. W temperaturze pokojowej umieścić komórki ponownie stroną górną do góry w płytce 12-dołkowej i przemyć pięć razy w ciągu 30 minut roztworem BPB w temperaturze pokojowej po inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi, uwzględniając etap płukania.Zanurz komórki na filtrze trzykrotnie w wodzie dejonizowanej, a następnie umieść filtr stroną górną do góry na mikropreparatach w 10 µL medium montażowego. Na wierzchu umieść szkiełko nakrywki o wymiarach 18 x 18 mm i za pomocą chusteczek delikatnie dociśnij szkiełko do komórek. Na koniec zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci. W przypadku pozornej infekcji samym plazmidem kodującym V-S-V-G-T-S-O 45 GFP białko jest dostarczane na powierzchnię podstawno-boczną dobrze spolaryzowanych komórek MDCK, co oceniono na podstawie czerwonego barwienia powierzchni w komórkach, które nie są dobrze spolaryzowane.Część białka fuzyjnego GFP zostanie dostarczona do błony apikalnej. Jeśli próbki kontrolne wyglądają w ten sposób, dane nie są wiarygodne i eksperyment należy powtórzyć z użyciem lepiej spolaryzowanych komórek. Należy zauważyć, że nie całe białko fuzyjne GFP jest dostarczane do błony bazolateralnej podczas fazy pogoni w 31 °C, o czym świadczy rozległy wewnątrzkomórkowy sygnał zielony dla całkowitego białka. Po opanowaniu, technika ta powinna zająć około 10 do 12 godzin po jej opracowaniu.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny transportu błonowego do eksploracji białek regulacyjnych w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ekspresować białka w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych przy użyciu techniki mikroiniekcji.

analyzing-function-small-gtpases-microinjection-plasmids-into

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza funkcji małych GTPaz przez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Bezpośrednia injekcja cDNA do jądra komórkowego jest skuteczną techniką transfekcji komórek pomitotycznych. Metoda ta zapewnia wysoki poziom ekspresji białek heterologicznych z pojedynczych lub wielu konstruktów cDNA i umożliwia badanie funkcji białek w fizjologicznie istotnym środowisku z wykorzystaniem różnych testów na pojedynczych komórkach.

Wewnątrzjądrowa mikroiniekcja DNA do rozdzielonych neuronów dorosłych ssaków

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Opisano technikę genetycznego manipulowania komórkami nabłonkowymi w całych embrionalnych gruczołach podżuchwowych myszy (SMG) hodowanych ex vivo za pomocą transferu genów wirusowych. Metoda ta wykorzystuje wrodzoną zdolność nabłonka SMG i mezenchymy do spontanicznej rekombinacji po oddzieleniu i zakażeniu zaczątków nabłonka wektorami adenowirusowymi.

Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Ten protokół porównuje względne pokrewieństwo partnerów wiążących dla GTPaz rodziny Rho, w tym Rac1. In vivo białka wiążące Rac1 konkurują o pojedynczy interfejs wiążący, którego konformacja jest podyktowana przez związany nukleotyd. Nukleotyd jest zarówno ważny, jak i trudny do kontrolowania eksperymentalnie ze względu na wysoką szybkość hydrolizy.

Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Opisujemy metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która zachowuje integralność komórkową i homeostazę białek. Adenofection umożliwia analizę funkcjonalną białek w procesach biologicznych, które opierają się na precyzyjnie dostrojonej dynamice opartej na aktynie, takiej jak mitotyczny podział komórek i miogeneza, na poziomie pojedynczej komórki.

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Tutaj opisujemy protokół do badania prenylacji i obciążenia guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) GTPazy Rho. Protokół ten składa się z dwóch szczegółowych metod, a mianowicie frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentu sprzężonego z GTPazą. Protokół może być używany do pomiaru prenylacji i obciążenia GTP różnych innych małych GTPaz.

Wykrywanie prenylacji małej GTPazy i wiązania GTP za pomocą frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentowego sprzężonego z GTPazą

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Poznaj analizę małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych przy użyciu mikroiniekcji plazmidów. Ta metoda umożliwia badanie pierwotnych efektów białek z minimalnymi efektami wtórnymi.

Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Przeglądaj więcej filmów