Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Dział technologii cytometrii i biomarkerów wspiera projekty biomedyczne za pomocą najnowocześniejszych technologii i potoków do fenotypowania komórek i profilowania molekularnego z rozdzielczością pojedynczej komórki. W tym kontekście używamy różnych narzędzi do analizy multiomicznej pojedynczych komórek, aby uzyskać wgląd w ekspresję genów i regulację genów w zdrowiu i chorobie. Cytometria przepływowa identyfikuje i pozyskuje poszczególne komórki na podstawie unikalnej charakterystyki.

Ostatnie osiągnięcia obejmują przepustowość oczu, sortery spektralne oparte na obrazie, a technologie te oferują elastyczność w projektowaniu paneli, umożliwiając jednoczesne stosowanie podobnych barwników i zarządzanie autofluorescencją. Głównym wyzwaniem eksperymentalnym przy stosowaniu najnowocześniejszych technologii pojedynczych komórek jest praca ze szczególnie delikatnymi lub rzadkimi populacjami komórek. Każda tkanka lub typ komórki musi zostać poddany precyzyjnie dostrojonej optymalizacji protokołu, aby uzyskać wystarczającą liczbę wysoce żywotnych komórek, które przekładają się na wysokiej jakości dane sekwencjonowania.

Nasz zmodyfikowany protokół przygotowania pojedynczych jąder poprawia regenerację jąder i minimalizuje naprężenia jąder. Jest specjalnie zoptymalizowany pod kątem tkanek mózgu i szpiku kostnego i obejmuje wszystkie etapy od asocjacji próbki do oczyszczania jąder. Na początek napełnij szklankę dwoma mililitrami lodowatego buforu do lizy jąder zawierających 0,01% digitoniny i dodaj do niego wypreparowane fragmenty tkanki mózgowej myszy.

Za pomocą homogenizatora tkanek ze szkła homogenizuj tkankę 25 razy za pomocą tłuczków A i B i przenieś powstały homogenat do 15-mililitrowej probówki. Dodać dwa mililitry lodowatego buforu do lizy jąder zawierających 0,01% digitoniny do homogenatu i inkubować na lodzie przez pięć minut. Następnie odwirować jądra w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Za pomocą mikropipety usuń supernatant i dodaj cztery mililitry lodowatego buforu do lizy jąder zawierających 0,01% digitoniny. Przefiltrować zawiesinę jąder przez sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów. Ponownie odwirować jądra, usunąć supernatant i dodać cztery mililitry buforu barwiącego w celu przepłukania jąder.

Po przefiltrowaniu zawiesiny przez sitko komórkowe o średnicy 40 mikrometrów, osadzać jądra przez wirowanie i ponownie zawiesić jądra w jednym mililitrze PBS, zawierającym 0,04% inhibitorów BSA i RNA. Aby policzyć komórki, wymieszaj 10 mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami jąder w probówce o pojemności 0,5 mililitra. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek.

Przenieść 100 mikrolitrów jąder do probówki facs w celu uzyskania niezabarwionej kontroli. Dodać 10 mikrolitrów 7AAD do pozostałych jąder i inkubować przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przystąpić do sortowania jąder za pomocą facs. Następnie przenieś 10 mikrolitrów posortowanych jąder do nowej probówki facs zawierającej 90 mikrolitrów DPBS z 2% inaktywowanym termicznie FBS.

Po odwirowaniu posortowanych jąder usunąć supernatant za pomocą mikropipety i ponownie zawiesić jądra w 100 mikrolitrach rozcieńczonego buforu jąder. Przed sortowaniem próbka zawiera znaczne ilości zanieczyszczeń, z których ponad 99% zawiera podkoszulki dodatnie na obecność plamy jądrowej, co wskazuje na skuteczną lizę komórek. Jądra mózgu po sortowaniu wykazały wzrost czystości z początkowych 36% do prawie 100%Na początek weź fiolkę zawierającą hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe szpiku kostnego myszy.

Za pomocą mikropipety ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu lizyny ACK i inkubować przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Przenieś zawieszoną mieszaninę do 50-mililitrowej probówki przez wstępnie zwilżone sitko o średnicy 70 mikrometrów. Następnie dodaj 10 mililitrów buforu facs, aby rozcieńczyć bufor lizyny A CK.

Odwirować mieszaninę w 400 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforu facs, najpierw ponownie zawieszając go w jednym mililitrze buforu, a następnie uzupełniając dziewięcioma mililitrami buforu. Teraz wymieszaj 10 mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami komórek w probówce o pojemności 0,5 mililitra i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Aby zabarwić komórki, odwiruj komórki w temperaturze 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić osad w buforze facs, aby osiągnąć końcowe stężenie jeden razy 10 do siedmiu komórek na mililitr, najpierw ponownie zawieszając osad w jednym mililitrze buforu, a następnie uzupełniając pozostałą objętością. Za pomocą mikropipety P1000 przenieś zawiesinę do probówki facs przez nasadkę sitową o średnicy 35 mikrometrów. Następnie przygotuj mieszankę barwiącą, jak pokazano tutaj.

Po odwirowaniu zawiesinę komórek ponownie zawiesić w 300 mikrolitrach barwienia, wymieszać jeden w probówce z próbką i inkubować na lodzie przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Następnie dodaj 300 mikrolitrów mieszanki dwóch do probówki z próbką i inkubuj przez 20 minut na lodzie. Chroniony przed światłem.

Dodać trzy mililitry buforu facs do pojedynczych barwionych i mieszanych barwionych probówek z próbkami. Teraz odwiruj zawiesinę komórkową. Po odrzuceniu supernatantów ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu facs.

Przygotuj 1,5-mililitrową probówkę napełnioną 500 mikrolitrami pożywki zbiorczej. Po skalibrowaniu przyrządu facs dodaj 500 mikrolitrów buforu facs do zawiesiny komórek, a następnie przenieś jeden mililitr próbki przez nasadkę sitka do komórek o średnicy 35 mikrometrów do nowej probówki facs. Po posortowaniu komórek przenieś 10 mikrolitrów posortowanych komórek do nowej probówki facs zawierającej 90 mikrolitrów buforu facs.

Zawiesinę komórkową osadzać przez odwirowanie i ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach PBS z 0,04% BSA. Przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 0,2 mililitra i dodaj 50 mikrolitrów PBS z BSA do oryginalnej probówki, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki. Przenieś komórki do probówki o pojemności 0,2 mililitra, aby osiągnąć całkowitą objętość 100 mikrolitrów.

Przeprowadź eksperyment pilotażowy, aby określić najlepszy czas lizy dla izolacji jąder. Po zagnieżdżeniu jąder ponownie zawiesić osad jądra w 12 mikrolitrach rozcieńczonego buforu jąder. Dodaj dwa mikrolitry jąder do probówki zawierającej 0,4% błękitu trypanowego i osiem mikrolitrów PBS z 0,04% BSA.

I policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek. Po zakończeniu izolacji jąder przenieś sześć mikrolitrów resuspension jąder do nowej probówki facs wstępnie wypełnionej 150 mikrolitrami buforu facs. Dodaj trzy mikrolitry 7AAD i inkubuj przez pięć minut na lodzie.