Name: Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Naucz się izolacji jąder z mózgu i szpiku kostnego myszy do wieloomowych analiz pojedynczych jąder. Zoptymalizowana metoda zwiększa czystość jąder z 36% do niemal 100%, poprawiając jakość danych sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ana Jeemin Choi była wspierana przez stypendium z Międzynarodowego Programu Doktoranckiego Pasteura - Uniwersytetu Paryskiego (PPU).

High-Quality Sample Preparation for Multiome 10X Genomics Analysis

<ol><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Cerrizuela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scNMT+protocol+for+multiomics+profiling+of+single+cells+from+mouse+brain+and+pancreatic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101555(2022).</li>
<li>Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics+techniques%3A+From+conception+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics techniques: From conception to applications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317(2022).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+chromatin+accessibility+and+gene+expression+in+thousands+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells.</a> Science (New York, N.Y.). 361 (6409), 1380-1385 (2018).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61542(2020).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomics+reveals+functional+compartmentalization+in+syncytial+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 6375(2020).</li>
<li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).</li>
<li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), e480(2022).</li>
<li>Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptome+analysis+reveals+dysregulation+of+angiogenic+endothelial+cells+and+neuroprotective+glia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Morabito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+chromatin+accessibility+and+transcriptomic+characterization+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease.</a> Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+transcriptomics+reveals+genes+associated+with+the+vulnerability+of+middle+temporal+gyrus+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 188(2022).</li>
<li>Paul, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+heterogeneity+and+lineage+commitment+in+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors.</a> Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).</li>
<li>Kaufmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG+educates+hematopoietic+stem+cells+to+generate+protective+innate+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis.</a> Cell. 172 (1-2), 176-190.e19 (2018).</li>
<li>Christ, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+diet+triggers+NLRP3-dependent+innate+immune+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Western diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming.</a> Cell. 172 (1-2), 162-175.e14 (2018).</li>
<li>Moorlag, S. J. C. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucan+Induces+protective+trained+immunity+against+mycobacterium+tuberculosis+infection%3A+A+key+role+for+IL-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1.</a> Cell Reports. 31 (7), 107634(2020).</li>
<li>de Laval, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP%CE%B2-dependent+epigenetic+memory+induces+trained+immunity+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674.e8 (2020).</li>
<li>Renthal, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+mosaic+Rett+syndrome+brain+tissue+by+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).</li>
<li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brain+vascular+atlas+reveals+diverse+mediators+of+Alzheimer%27s+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk.</a> Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).</li>
<li>Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+single-cell+and+single-nuclei+suspensions+from+embryonic+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains.</a> STAR Protocols. 4 (1), 101944(2022).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Ranzoni, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+human+developmental+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487.e7 (2021).</li>
<li>10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide, Document Number CG000338 Rev F. , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Meyerhoff,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Haag, S., Murthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+monocyte+and+macrophage+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Murine monocyte and macrophage culture.</a> Bio-Protocol. 11 (6), e3928(2021).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Jiang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Quality control of single-cell RNA-seq.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 1935, 1-9 (2019).</li>
<li>Regan, C., Preall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for single-cell genomics.</a> Current Protocols. 2 (8), e498(2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). , At 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Shomroni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+RNA-sequencing+approach+and+its+applicability+connecting+genotype+to+phenotype+in+ageing+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 4091(2022).</li>
<li>Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> eNeuro. 9 (2), (2022).</li>
<li>Gérard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie wysokiej jakości zawiesiny komórek lub jąder ma kluczowe znaczenie dla powodzenia analiz monokomórkowych lub jednokomórkowych RNA-Seq i monokomórkowych 29,30,31. W tym miejscu opisaliśmy protokoły przygotowania próbek i izolacji jąder do testów multiomowych z dwóch rodzajów tkanek: mózgu i szpiku kostnego.
Protokół mózgu opisany w tym artykule pozwala na odzyskanie wysokiej jakości jąder ze świeżo zamrożonej tkanki mózgowej. Obejmuje ona następujące etapy: rozerwanie zamrożonej tkanki, izolację jąder, oczyszczanie jąder oraz kontrolę jakości przygotowanego materiału. Tkanka mózgowa składa się z wielu różnych typów komórek, a procedura dysocjacji tkanek i izolacji jąder powinna zachować proporcje populacji komórek obecnych w tkance wyjściowej. W tym przypadku zoptymalizowano skład buforu do lizy i czas inkubacji, aby umożliwić pełną i delikatną lizę wszystkich populacji komórek tworzących tkankę.
Protokół HSPC szpiku kostnego jest nieco inny, ponieważ wymaga jednego dodatkowego kroku na początku eksperymentu w celu wyizolowania interesującej populacji komórek z heterogenicznej zawiesiny komórkowej. Po pobraniu świeżej tkanki czerwone krwinki są poddawane lizie, a próbka jest wzbogacana o podzbiór komórek będących przedmiotem zainteresowania. Docelowe komórki są poddawane lizie, jądra są izolowane, a jakość przygotowanego materiału jest kontrolowana.
10X Genomics dostarcza kilka zatwierdzonych protokołów do izolacji jąder w wielu różnych tkankach 32,33. Firma wprowadza również na rynek zestaw do izolacji jąder z prostym procesem izolowania jąder od zwalidowanych tkanek34. Protokoły te wymagają jednak dodatkowej optymalizacji, aby dostosować specyfikę niektórych próbek. Przykładem są próbki, które wymagają pracy z małą liczbą danych wejściowych komórek. W przypadku tych próbek najtrudniejszymi etapami są wirowanie, które musi być wystarczająco rygorystyczne, aby oczyścić próbkę i wystarczająco delikatne, aby uniknąć utraty komórek/jąder. Dzięki opisanemu tutaj protokołowi dostosowaliśmy 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27, aby znaleźć delikatną równowagę między tymi dwoma wymaganiami. Jak pokazano na przykładzie przygotowania jąder z posortowanych HSPC, poprawiliśmy odzysk jąder bez wpływu na jakość próbki.
Dodatkowym wyzwaniem jest etap lizy oczyszczonych komórek w celu izolacji jąder. Trudniejsze warunki lizy i dłuższy czas inkubacji mogą uszkodzić jądra, a tym samym wpłynąć na jakość danych sekwencjonowania. Rycina 5 przedstawia reprezentatywne obrazowanie jąder z próbek szpiku kostnego w różnych czasach inkubacji z buforem do lizy i ilustruje, jak różny może być stan jąder w zależności od lizy komórek. W przykładzie HSPC zidentyfikowaliśmy 3-minutową lizę jako stan, który skutkuje najwyższym odsetkiem zdrowo wyglądających, nienaruszonych jąder i najniższym odsetkiem uszkodzonych jąder. Czas inkubacji lizy powinien być zoptymalizowany dla każdego nowego rodzaju próbki.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig05.jpg"> 
Rysunek 5: Kontrola jakości jąder za pomocą mikroskopii. Pokazano reprezentatywne obrazy w jasnym polu izolowanych jąder ze szpiku kostnego myszy z (A) nienaruszonymi i (B) uszkodzonymi jądrami. Podziałka 5 μm. Zdjęcia wykonano mikroskopem odwróconym przy użyciu 40-krotnego obiektywu ELWD NA 0,60 i 1,5-krotnego zoomu cyfrowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Oba protokoły szczegółowo opisane w tej pracy opierają się na oczyszczaniu docelowych komórek lub jąder za pomocą wysokoprzepustowych instrumentów FACS. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla protokołów przygotowania pojedynczych komórek/jąder, w których rzadkie podzbiory komórek mają być izolowane z heterogenicznych zawiesin. W tych, podobnie jak w pokazanym tutaj przykładzie dla sortowania HSPC, może być wymagany panel wysokowymiarowej cytometrii przepływowej, aby umożliwić "bramkowanie" na populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Sortowanie jest niezwykle szybkie i dokładne, co prowadzi do ponad 95% czystości posortowanych podzbiorów komórek. Takie podejście wystawia zawiesinę komórkową na ciśnienie do 70 psi i dlatego może być ograniczające sortowanie delikatnych komórek (np. komórek dendrytycznych, neutrofili), ponieważ może spowodować pęknięcie ich błony komórkowej. W takich przypadkach należy wybrać alternatywne rozwiązania do oczyszczania komórek, w tym sortowanie magnetyczne, zastosowanie urządzeń nowej generacji (np. CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36 lub systemy oparte na kropelkach (np. ODIN, Sensific)37. Niemniej jednak niska szybkość sortowania w tych technologiach, z sortowaniem komórek, które trwa godzinami, a nie minutami, jest silnym czynnikiem ograniczającym zastosowanie tych podejść w przygotowaniu żywotnych komórek do Multiome i innych zastosowań jednokomórkowych opartych na analizie dużej liczby komórek.
Do oczyszczania jąder wyizolowanych z tkanki metodą z wyboru jest FACS ze względu na jej przepustowość i czystość izolowanego materiału. Jądra nie są wrażliwe na nacisk, a przefiltrowane izolaty tkanek można łatwo oczyścić za pomocą sortera komórek. Jeśli laboratorium nie jest wyposażone w przyrząd FACS, istnieją inne alternatywy, nieco mniej wydajne, ale wystarczająco dobre. Przykłady obejmują ultrawirowanie lub użycie małego sprzętu, takiego jak MARS (Applied Cell), który oddziela cząstki na podstawie ich różnicy wielkości za pomocą fal akustycznych; Myjka laminarna CURIOX wykorzystująca właściwości hydrofobowe zawiesin komórek/jąder; lub LEVITAS bio, który opiera się na fizycznych właściwościach komórek (lewitacja) w celu oddzielenia ich od gruzu.
W tym miejscu opisujemy protokoły pozwalające uzyskać dużą liczbę jąder i najlepszą czystość dla dalszego protokołu Multiome. Sortowanie metodą FACS i powtarzające się etapy wirowania powodują znaczne straty materiału wyjściowego. Z tego powodu w opisanym przez nas protokole preparacji jąder z mózgu wymagana jest wystarczająco obfita ilość materiału wyjściowego, aby po sortowaniu FACS udało się zebrać co najmniej 500 000 jąder. Jeżeli nie można spełnić tego kryterium, należy zastosować alternatywne protokoły. Podczas pracy z rzadkimi populacjami komórek lub małymi skrawkami tkanek dostępna ilość materiału wyjściowego może być czynnikiem ograniczającym. Aby rozwiązać ten problem, możliwe jest usprawnienie odzyskiwania jąder poprzez (a) zmniejszenie objętości lizy, (b) zmniejszenie objętości płukania, (c) użycie pojedynczego płukania z wydłużonym czasem wirowania w celu poprawy odzysku, jak wskazano w protokołach 10X Genomics dla izolacji jąder o niskim nakładzie komórki. W przypadku analizy multiomicznej materiału o niskiej zawartości warto rozważyć zastosowania oparte na płytkach, takie jak scNMT, SNARE-seq i Paired-seq38 , które wymagają znacznie mniejszej liczby próbek wejściowych.
Podsumowując, opisaliśmy dwa solidne protokoły przygotowania jąder z mózgu i HSPC szpiku kostnego do dalszej analizy Multiome. Protokoły te mają zastosowanie w każdym projekcie naukowym, który wymaga wysokiej jakości zawiesin pojedynczych jąder z tych dwóch typów tkanek, niezależnie od postawionego pytania naukowego. Nasza grupa stosuje protokół izolacji jąder mózgowych w badaniach nad rozwojem mózgu po inaktywacji różnych docelowych genów oraz w badaniach odpowiedzi immunologicznej w kontekście chorób neurologicznych. Używamy protokołu izolacji jąder szpiku kostnego do rozszyfrowania udziału różnych subpopulacji krwiotwórczych w tworzeniu układu odpornościowego.

Przez wiele lat techniki jednokomórkowe były złotym standardem w analizie procesów biologicznych. Początkowo ograniczały się one do fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii, cytometrii przepływowej i podobnych testów. Przełom w analizie pojedynczych komórek nastąpił wraz z opracowaniem podejść do profilowania molekularnego pojedynczych komórek, w szczególności sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-Seq), które umożliwiło scharakteryzowanie całego transkryptomu poszczególnych komórek. Niezwykle wydajny scRNA-Seq generuje informacje o statusie transkrypcji komórki w określonym stanie i punkcie czasowym. Nie zapewnia jednak wglądu w regulację genów, która napędza transkrypcję, ani w modyfikacje molekularne, które zachodzą w czasie. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, włożono wiele wysiłku w opracowanie jednokomórkowych testów multiomicznych, które umożliwiają analizę wielu czynników i procesów z tej samej komórki1,2,3,4. Pierwszy udany pomiar dwóch modalności w pojedynczych komórkach nastąpił dzięki połączeniu wzorców ekspresji białek powierzchniowych multipleksu z pełnym transkryptomem poszczególnych komórek w podejściu CITE-Seq5. Nowsze ewolucje łączą ekspresję genów z dostępnością chromatyny (Test dla chromatyny dostępnej dla transpozazy przy użyciu sekwencjonowania, ATAC-Seq), jednocześnie wychwytując w ten sposób modalności transkryptomiczne i epigenomiczne w tych samych komórkach (np. sci-CAR)6. Pierwsze komercyjne rozwiązania, które pozwoliły na powiązanie transkryptomiki z fenotypem komórki lub ze zmianami epigenetycznymi tej samej komórki, pochodziły od 10X Genomics.
Eksperymenty dotyczące profilowania molekularnego pojedynczej komórki obejmują następujące kroki: (1) dysocjacja tkanek lub przygotowanie zawiesin jednokomórkowych; (2) oczyszczanie komórek i/lub izolacja jąder; (3) partycjonowanie i kodowanie kreskowe; (4) budowa biblioteki i kontrola jakości; 5) sekwencjonowanie nowej generacji; (6) Analiza danych. Chociaż kroki (3)-(6) mogą się znacznie różnić w zależności od zastosowanej technologii, początkowe kroki są na ogół wspólne dla wszystkich z nich. Jakość przygotowanej zawiesiny komórek/jąder będzie miała wpływ na ogólny wynik eksperymentu. W zależności od rodzaju tkanki, uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek/jąder może być trudne. Specyfika niektórych tkanek, takich jak serce, mięśnie, mózg, płuca, jelita i inne, wymaga metod rozbijania tkanek i izolacji jąder dostosowanych do każdego rodzaju próbki, aby zagwarantować produkcję wysokiej jakości jąder do analizy molekularnej7,8,9,10. Metody rozbijania tkanek i protokoły dysocjacji mogą być mechaniczne, enzymatyczne (np. mieszanina kolagenaz i DNazy) lub kombinacja tych dwóch i mogą być wykonywane ręcznie lub za pomocą narzędzi (np. Qiagen DSC-400, gentleMACS).
Techniki jednokomórkowe stały się narzędziem z wyboru w badaniach biomedycznych. W neurobiologii różnorodność komórek w mózgu i złożoność ich funkcji wymagają analizy o wysokiej rozdzielczości i przepustowości w celu wizualizacji rzadkich populacji komórek i oceny ich niejednorodności11,12,13,14. Powiązanie tożsamości komórkowej i mechanizmów regulacji genów poszczególnych komórek dostarcza informacji na temat rozwoju i fizjologii mózgu. Innym przykładem są badania odpowiedzi immunologicznej w kontekście chorób zakaźnych, autoimmunologicznych lub nowotworowych, które w dużym stopniu opierają się na analizach pojedynczych komórek. Niejednorodność podzbiorów komórek odpornościowych oraz złożoność ich aktywności i interakcji z innymi typami komórek wymagają rozdzielczości pojedynczej komórki w celu rozszyfrowania mechanizmów leżących u podstaw odpowiedzi immunologicznej. Komórki odpornościowe wywodzą się ze szpiku kostnego, w którym krwiotwórcze komórki progenitorowe składają się ze stopniowo różnicujących się komórek, które nabywają i tracą markery powierzchni komórek w procesie krokowym przed wyjściem ze szpiku kostnego do domu na obrzeżach. Analiza pojedynczych komórek pozwala na drobiazgową charakterystykę etapów rozwoju komórkowego. Można to osiągnąć poprzez fenotypowanie pojedynczych komórek, konwencjonalnie wykonywane za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej. Wykazano jednak, że sygnatury transkryptomiczne pojedynczych komórek ujawniają bardziej precyzyjną identyfikację podtypów komórek progenitorowych, ponieważ komórki te są rozmieszczone w klastrach, które wpadają jedna w drugą, a zatem mogą być błędnie zidentyfikowane przy użyciu podejścia opartego na markerach powierzchni komórek gruboziarnistych15. Coraz więcej badań ujawnia modyfikacje epigenetyczne, które hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) mogą nabyć w wyniku ekspozycji na różne czynniki, co ma znaczący wpływ na długoterminową reakcję układu odpornościowego16,17,18,19. Nowatorskie technologie multiomiczne umożliwiają badanie tych procesów z rozdzielczością pojedynczej komórki.
Wiele protokołów izolacji komórek i jąder zostało opisanych dla brain11,20,21,22 i próbki szpiku kostnego23,24. Aby zminimalizować błąd systematyczny wynikający ze zmienności eksperymentalnej, konieczna jest walidacja zoptymalizowanych protokołów przygotowania pojedynczych jąder do wspólnego sekwencjonowania transkryptomicznego i epigenomicznego pojedynczych komórek, zapewniając w ten sposób odtwarzalność jednokomórkowych testów multiomicznych.
Tutaj opisane są dwa solidne protokoły przygotowania jąder z (1) świeżo zamrożonej tkanki mózgowej i (2) świeżych HSPC szpiku kostnego do dalszej analizy pojedynczej komórki Multiome (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołów izolacji jąder ze świeżo zamrożonych tkanek mózgu i szpiku kostnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>18 G x 1 & frac12; (1,2 mm x 38 mm) Igły Agani</td><td>Terumo</td><td>AN*1838S1</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka FACS z okrągłym dnem z nasadką sitka do komórek 35 &mikro; m</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>probówki 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD pharmagen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor lizujący</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-mysz CD117 (c-Kit)</td><td>BioLegend</td><td>105812</td><td>Klon: 2B8</td></tr><tr><td>APC/Cyjanina 7 anty-mysz CD16/32 (Fc&gamma; R)</td> <td>BioLegend</td><td>101328</td><td>Klon: 93</td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie BD FACSDiva v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp; roztwór podstawowy 10%</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do barwienia komórek</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CMOS Prime 95B 25 mm</td><td>Photometrix</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko komory zliczania komórek Hrabina</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe 24 mm x 24 mm 0,13-0,17 mm</td><td>Marka</td><td>BR470819</td><td></td></tr><tr><td>Digitonine 5%</td><td>Invitrogen</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe&nbsp;</td><td>Swann-Morton&nbsp;</td><td>0508</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony epifluorescencji Nikon Ti2 -E</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30123603</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td> <td>VWR</td><td>83801.290</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysie CD34</td><td>Invitrogen</td><td>11-0341-85</td><td>Klon: Kleszcze RAM34</td></tr><tr><td>do sekcji</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>11533387</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce 2 ml</td><td>Szkło Bellco</td><td>1984-10002</td><td>Tłuczek " A&rdquo; Duży prześwit: .0030-.0050 i prime; i Tłuczek " B&rdquo; Mały prześwit: .0005-.0025&Prime;</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD zestaw do usuwania martwych komórek</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu 1 M</td><td>Sigma aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Fluoromount-G&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Substytut Nonidet P40</td><td>Sigma aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Bufor jąder 20x&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji jąder EZ prep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NUC-101</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kompensacyjne OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue koktajl przeciw myszom (w tym anty-mysie CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>133310</td><td>Klony (w tej samej kolejności co wymienione przeciwciała): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119</td></tr><tr><td>Paski probówki do PCR 0,2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>PE przeciw myszom Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend</td><td>122507</td><td>Klon: E13-161.7</td></tr><tr><td>szalka Petriego 100 mm x 20 mm OPTILUX</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Ply-L-lizyna 0,01% przefiltrowana sterylnie, odpowiednia do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Drukowane szkiełka mikroskopowe 8-dołkowe 6 mm numerowane</td><td>Epredia</td><td>ER-301B-CE24</td><td></td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor rnazy 5000 U</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparacji</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu 5 M</td><td>Sigma aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe, PES, 0,2 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysty lakier do paznokci&nbsp;</td><td>dowolny</td><td>niemający zastosowania</td><td></td></tr><tr><td>roztwór chlorowodorku Trizma pH 7,4</td><td>Sigma aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,4%</td><td>gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad&nbsp;</td><td></td><td></td>1662404</tr><tr><td>UltraPure Distilated Water Bez Dnazy/Rnazy</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

Analiza pojedynczych komórek stała się podejściem z wyboru do odkrywania złożoności procesów biologicznych, które wymagają oceny zmienności indywidualnych odpowiedzi komórkowych na leczenie lub infekcję z rozdzielczością pojedynczej komórki. 
W ciągu ostatnich 10 lat opracowano wiele technik profilowania molekularnego pojedynczej komórki, a kilka dedykowanych technologii zostało skomercjalizowanych. Profilowanie pojedynczych komórek oparte na kropelkach 10X Genomics to szeroko rozpowszechniona technologia, która oferuje gotowe do użycia odczynniki do transkryptomicznego i wieloomicznego profilowania pojedynczych komórek. Technologia obejmuje procesy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek i pojedynczych jąder (odpowiednio scRNA-Seq i snRNA-Seq), scATAC-Seq, profilowania immunologicznego pojedynczej komórki (sekwencjonowanie BCR/TCR) i multiomu. Ten ostatni łączy w sobie informację transkrypcyjną (scRNA-Seq) i epigenetyczną (scATAC-Seq) pochodzącą z tej samej komórki. 
Jakość (żywotność, integralność, czystość) zawiesin pojedynczych komórek lub pojedynczych jąder wyizolowanych z tkanek i analizowanych za pomocą któregokolwiek z tych podejść jest kluczowa dla generowania danych wysokiej jakości. W związku z tym protokoły przygotowania próbek powinny być dostosowane do specyfiki każdej tkanki biologicznej i zapewniać wytwarzanie wysokiej jakości zawiesin komórek i jąder.
Ten artykuł opisuje dwa protokoły przygotowania próbek mózgu i szpiku kostnego dla dalszego potoku multiome 10X Genomics. Protokoły są wykonywane etapowo i obejmują dysocjację tkanek, sortowanie komórek, izolację jąder i kontrolę jakości przygotowanej zawiesiny jąder, która jest używana jako materiał wyjściowy do partycjonowania komórek i kodów kreskowych, przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Te ustandaryzowane protokoły tworzą wysokiej jakości biblioteki jąder oraz solidne i wiarygodne dane.

Dwa opisane powyżej protokoły szczegółowo opisują izolację jąder od dwóch różnych typów tkanek. Różnice i podobieństwa między tymi dwoma protokołami są schematycznie przedstawione w Rysunek 1.
Oczyszczanie jąder z mózgu myszy 
W opisanym tu protokole proponujemy łagodną metodę przygotowania jąder z próbek mózgu. Rozpoczyna się od mechanicznej dysocjacji tkanki mózgowej w buforze do lizy, po której następują etapy płukania i filtrowania sitkiem, które usuwają pozostałą tkankę z zawiesiny. Późniejsze usuwanie zanieczyszczeń, niezlizowanych komórek i małych cząstek jest osiągane przez FACS, aby zagwarantować, że tylko oczyszczone jądra są ładowane do dalszego protokołu Multiome. Rysunek 2 pokazuje profil jąder przed i po sortowaniu. Po przefiltrowaniu, a przed sortowaniem jąder, próbka zawiera dużą ilość zanieczyszczeń, przy czym ponad 99% "singletów" jest dodatnich na obecność barwienia jądrowego (7-AAD), co wskazuje na optymalną lizę komórek (<klasa silna="xfig">Rysunek 2A). Jądra są sortowane na podstawie bramki dodatniej 7-AAD. Frakcję posortowanego materiału pobiera się w celu sprawdzenia czystości przygotowanych jąder. Rysunek 2B pokazuje profil jąder mózgowych po sortowaniu. Sortowanie jąder pozwoliło na zwiększenie czystości jąder z początkowych 36% (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) do prawie 100% (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</silna></silna></klasa>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig02.jpg"> 
Rysunek 2: Strategia bramkowania dla sortowania jąder i test czystości po sortowaniu. Jądra wybarwiono 7-AAD i pobrano za pomocą sortera komórek. (A) Jądra są najpierw bramkowane na podstawie ich wielkości i ziarnistości (odpowiednio FSC-A i SSC-A). Pojedyncze cząstki są następnie wybierane na podstawie ich właściwości FSC-A/FSC-H i barwienia 7-AAD. (B) Po sortowaniu komórek frakcja jąder z probówki zbiorczej jest badana pod kątem czystości przy użyciu tej samej strategii bramkowania, co w A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Oczyszczanie komórek progenitorowych hematopoetycznych komórek macierzystych (HSPC) szpiku kostnego myszy&lt;br /&gt;
Po wyizolowaniu ze szpiku kostnego, do 2 x 105 HSPC są sortowane według FACS, zgodnie ze strategią bramkowania pokazaną na Rysunek 3A. Ocenia się skuteczność sortowania i czystość próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</silna>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig03v2.jpg"> 
Rysunek 3: Strategia bramkowania do sortowania HSPC szpiku kostnego. (A) Reprezentatywna strategia bramkowania FACS do sortowania żywotnych hematopoetycznych komórek macierzystych LKS+ i komórek progenitorowych szpiku CD34+ do izolacji jąder. (B) Reprezentatywne powierzchnie FACS wykorzystywane do weryfikacji czystości populacji posortowanych komórek. Pokazano proporcje różnych podzbiorów komórek w odniesieniu do populacji rodzicielskiej. *Dwie posortowane populacje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Protokół "Low Cell Input Nuclei Isolation" pozwala na izolację jąder z próbek o maksymalnej liczbie 105 komórek. Obejmuje niewielką liczbę etapów wirowania, minimalizując w ten sposób utratę komórek/jąder. Dostosowaliśmy objętość do lizy i płukania proporcjonalnie do wejścia komórki i wydłużyliśmy czas wirowania w celu maksymalnego odzysku jąder. Przeprowadziliśmy eksperyment pilotażowy w celu oceny ilości odzyskanych jąder przez liczenie oraz ich jakości za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania mikroskopowego. Rysunek 4 pokazuje próbkę HSPC po lizie komórek. Protokół ten wygenerował jądra wysokiej jakości, jak zaobserwowano w Rysunek 5A, bez żadnych zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na dalszy protokół multiome.
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig04.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 4: Test czystości sortowania izolowanych jąder HSPC szpiku kostnego. Jądra zostały wybarwione 7-AAD i pozyskane przez sorter komórek. Jądra zostały najpierw bramkowane na podstawie ich wielkości i ziarnistości (odpowiednio FSC-A i SSC-A) w celu oceny czystości próbki. Proporcja jąder jest wskazywana w odniesieniu do populacji rodzicielskiej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Numer rurki</td>
			<td>Nazwa rury</td>
			<td>Poplamiony byt</td>
			<td>Ilość poplamionego elementu</td>
			<td>Przeciwciało/barwnik (μL)</td>
			<td>Bufor zbiorczy (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Niepoplamione</td>
			<td>Komórek</td>
			<td>5 00 000</td> osób
			<td>N/a</td>
			<td rowspan="7">200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>LIVE/DEAD Możliwa do naprawienia plama Aqua Dead Cell </td>
			<td>Komórek</td>
			<td>5 00 000</td> osób
			<td>0,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>APC/Cyjanina 7 anty-mysz CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>Koraliki elektroniczne OneComp</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Pacific Blue anty-mysi koktajl Lineage</td>
			<td>Koraliki elektroniczne OneComp</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>PE przeciw myszom Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>Koraliki elektroniczne OneComp</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Układ chroniący przed myszami APC CD117 (zestaw c)</td>
			<td>Koraliki elektroniczne OneComp</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Anty-mysz FITC CD34</td>
			<td>Koraliki elektroniczne OneComp</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Kontrola pojedynczego barwnika dla ustawień kompensacji na cytometrze przepływowym. Wskazane są wymagane kontrole pojedynczego barwienia, liczba komórek lub kulek do barwienia oraz ilości przeciwciał.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mistrz Mix</td>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Końcowe rozcieńczenie</td>
			<td>Przeciwciało/barwnik (μL)</td>
			<td>Typ bufora</td>
			<td>Bufor (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Mix 1</td>
			<td>APC/Cyjanina 7 anty-mysz CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>1/500</td> szt.
			<td>Rozdział 1.2</td>
			<td rowspan="2">DPBS</td>
			<td rowspan="2">300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Możliwa do naprawienia plama Aqua Dead Cell </td>
			<td>1/250</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Mix 2</td>
			<td>Pacific Blue anty-mysi koktajl Lineage</td>
			<td>1/20</td>
			<td>Rozdział 30</td>
			<td rowspan="4">Bufor FACS</td>
			<td rowspan="4">300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE przeciw myszom Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Układ chroniący przed myszami APC CD117 (zestaw c)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anty-mysz FITC CD34</td>
			<td>1/50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Całkowita objętość barwienia </td>
			<td>600</td> szt.
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Skład mieszanki barwiącej dla HSPC szpiku kostnego. Pokazano objętości odczynników wymaganych do barwienia jednej próbki zawierającej 40 milionów komórek. W celu barwienia większej liczby próbek należy pomnożyć wskazaną objętość przez wymaganą liczbę próbek i dodać połowę dodatkowej objętości próbki, aby zapewnić wystarczającą objętość mieszanki wzorcowej.
Rysunek uzupełniający 1: Protokół izolacji komórek szpiku kostnego. (A) Otwórz otrzewną. Białe przerywane linie wskazują linię, wzdłuż której należy przeciąć. (B) Po oderwaniu skóry od tylnej nogi, ułóż nożyczki wzdłuż kręgosłupa w stawie biodrowym, aby wyciąć nogę bez przecinania kości udowej. (C) Wygląd nogi oddzielonej od ciała przed usunięciem mięśni. (D) Wygląd nogi po usunięciu mięśni. (E) Procedura oddzielania kości udowej w stawie kolanowym, a następnie w stawie biodrowym, z zachowaniem ostrożności, aby nie rozciąć kości udowej. Białe zakrzywione strzałki pokazują wymagany ruch. Białe kropkowane strzałki wskazują obszar, który należy delikatnie oddzielić za pomocą nożyczek, aby uszczypnąć. (F) Procedura otwarcia dystalnej części kości udowej (tj. części wcześniej przyczepionej do kości piszczelowej w stawie kolanowym) poprzez bezpieczne chrząstkę i dystalną nasadę nożyczkami i odwrócenie jej do tyłu, aby odsłonić szpik kostny. (G) Cztery występy, oznaczone czarnymi strzałkami, powinny być widoczne na odsłoniętym końcu physis. (H) Pojawienie się kości udowej z otwartym końcem skierowanym w dół do przygotowanej probówki o pojemności 0,5 ml umieszczonej w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 150 μl buforu FACS. (I) Wygląd granulowanych komórek szpiku kostnego i białej kości udowej po szybkim odwirowaniu w dawce 12 000 x g. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/Moraes-Cabe%20et%20al_Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

Dział technologii cytometrii i biomarkerów wspiera projekty biomedyczne za pomocą najnowocześniejszych technologii i potoków do fenotypowania komórek i profilowania molekularnego z rozdzielczością pojedynczej komórki. W tym kontekście używamy różnych narzędzi do analizy multiomicznej pojedynczych komórek, aby uzyskać wgląd w ekspresję genów i regulację genów w zdrowiu i chorobie. Cytometria przepływowa identyfikuje i pozyskuje poszczególne komórki na podstawie unikalnej charakterystyki.Ostatnie osiągnięcia obejmują przepustowość oczu, sortery spektralne oparte na obrazie, a technologie te oferują elastyczność w projektowaniu paneli, umożliwiając jednoczesne stosowanie podobnych barwników i zarządzanie autofluorescencją. Głównym wyzwaniem eksperymentalnym przy stosowaniu najnowocześniejszych technologii pojedynczych komórek jest praca ze szczególnie delikatnymi lub rzadkimi populacjami komórek. Każda tkanka lub typ komórki musi zostać poddany precyzyjnie dostrojonej optymalizacji protokołu, aby uzyskać wystarczającą liczbę wysoce żywotnych komórek, które przekładają się na wysokiej jakości dane sekwencjonowania.Nasz zmodyfikowany protokół przygotowania pojedynczych jąder poprawia regenerację jąder i minimalizuje naprężenia jąder. Jest specjalnie zoptymalizowany pod kątem tkanek mózgu i szpiku kostnego i obejmuje wszystkie etapy od asocjacji próbki do oczyszczania jąder. Na początek napełnij szklankę dwoma mililitrami lodowatego buforu do lizy jąder zawierających 0,01% digitoniny i dodaj do niego wypreparowane fragmenty tkanki mózgowej myszy.Za pomocą homogenizatora tkanek ze szkła homogenizuj tkankę 25 razy za pomocą tłuczków A i B i przenieś powstały homogenat do 15-mililitrowej probówki. Dodać dwa mililitry lodowatego buforu do lizy jąder zawierających 0,01% digitoniny do homogenatu i inkubować na lodzie przez pięć minut. Następnie odwirować jądra w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Za pomocą mikropipety usuń supernatant i dodaj cztery mililitry lodowatego buforu do lizy jąder zawierających 0,01% digitoniny. Przefiltrować zawiesinę jąder przez sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów. Ponownie odwirować jądra, usunąć supernatant i dodać cztery mililitry buforu barwiącego w celu przepłukania jąder.Po przefiltrowaniu zawiesiny przez sitko komórkowe o średnicy 40 mikrometrów, osadzać jądra przez wirowanie i ponownie zawiesić jądra w jednym mililitrze PBS, zawierającym 0,04% inhibitorów BSA i RNA. Aby policzyć komórki, wymieszaj 10 mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami jąder w probówce o pojemności 0,5 mililitra. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek.Przenieść 100 mikrolitrów jąder do probówki facs w celu uzyskania niezabarwionej kontroli. Dodać 10 mikrolitrów 7AAD do pozostałych jąder i inkubować przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przystąpić do sortowania jąder za pomocą facs. Następnie przenieś 10 mikrolitrów posortowanych jąder do nowej probówki facs zawierającej 90 mikrolitrów DPBS z 2% inaktywowanym termicznie FBS.Po odwirowaniu posortowanych jąder usunąć supernatant za pomocą mikropipety i ponownie zawiesić jądra w 100 mikrolitrach rozcieńczonego buforu jąder. Przed sortowaniem próbka zawiera znaczne ilości zanieczyszczeń, z których ponad 99% zawiera podkoszulki dodatnie na obecność plamy jądrowej, co wskazuje na skuteczną lizę komórek. Jądra mózgu po sortowaniu wykazały wzrost czystości z początkowych 36% do prawie 100%Na początek weź fiolkę zawierającą hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe szpiku kostnego myszy.Za pomocą mikropipety ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu lizyny ACK i inkubować przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Przenieś zawieszoną mieszaninę do 50-mililitrowej probówki przez wstępnie zwilżone sitko o średnicy 70 mikrometrów. Następnie dodaj 10 mililitrów buforu facs, aby rozcieńczyć bufor lizyny A CK.Odwirować mieszaninę w 400 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforu facs, najpierw ponownie zawieszając go w jednym mililitrze buforu, a następnie uzupełniając dziewięcioma mililitrami buforu. Teraz wymieszaj 10 mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami komórek w probówce o pojemności 0,5 mililitra i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Aby zabarwić komórki, odwiruj komórki w temperaturze 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ponownie zawiesić osad w buforze facs, aby osiągnąć końcowe stężenie jeden razy 10 do siedmiu komórek na mililitr, najpierw ponownie zawieszając osad w jednym mililitrze buforu, a następnie uzupełniając pozostałą objętością. Za pomocą mikropipety P1000 przenieś zawiesinę do probówki facs przez nasadkę sitową o średnicy 35 mikrometrów. Następnie przygotuj mieszankę barwiącą, jak pokazano tutaj.Po odwirowaniu zawiesinę komórek ponownie zawiesić w 300 mikrolitrach barwienia, wymieszać jeden w probówce z próbką i inkubować na lodzie przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Następnie dodaj 300 mikrolitrów mieszanki dwóch do probówki z próbką i inkubuj przez 20 minut na lodzie. Chroniony przed światłem.Dodać trzy mililitry buforu facs do pojedynczych barwionych i mieszanych barwionych probówek z próbkami. Teraz odwiruj zawiesinę komórkową. Po odrzuceniu supernatantów ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu facs.Przygotuj 1,5-mililitrową probówkę napełnioną 500 mikrolitrami pożywki zbiorczej. Po skalibrowaniu przyrządu facs dodaj 500 mikrolitrów buforu facs do zawiesiny komórek, a następnie przenieś jeden mililitr próbki przez nasadkę sitka do komórek o średnicy 35 mikrometrów do nowej probówki facs. Po posortowaniu komórek przenieś 10 mikrolitrów posortowanych komórek do nowej probówki facs zawierającej 90 mikrolitrów buforu facs.Zawiesinę komórkową osadzać przez odwirowanie i ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach PBS z 0,04% BSA. Przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 0,2 mililitra i dodaj 50 mikrolitrów PBS z BSA do oryginalnej probówki, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki. Przenieś komórki do probówki o pojemności 0,2 mililitra, aby osiągnąć całkowitą objętość 100 mikrolitrów.Przeprowadź eksperyment pilotażowy, aby określić najlepszy czas lizy dla izolacji jąder. Po zagnieżdżeniu jąder ponownie zawiesić osad jądra w 12 mikrolitrach rozcieńczonego buforu jąder. Dodaj dwa mikrolitry jąder do probówki zawierającej 0,4% błękitu trypanowego i osiem mikrolitrów PBS z 0,04% BSA.I policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek. Po zakończeniu izolacji jąder przenieś sześć mikrolitrów resuspension jąder do nowej probówki facs wstępnie wypełnionej 150 mikrolitrami buforu facs. Dodaj trzy mikrolitry 7AAD i inkubuj przez pięć minut na lodzie.

high-quality-brain-bone-marrow-nuclei-preparation-for-single-nuclei

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Niniejszy artykuł opisuje protokół stosowany do badania homingu komórek krwiotwórczych do ich nisz w szpiku kostnym.

Homing komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego

Opisujemy proces wykorzystujący laserową mikrodysekcję do izolacji i ekstrakcji RNA z homogenicznej populacji komórek — neuronów piramidowych — w warstwie III zakrętu skroniowego górnego w pośmiertnych ludzkich mózgach. Następnie przeprowadzamy linearną amplifikację (opartą na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z macierzą Affymetrix human X3P.

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Tkanki Drosophila często zawierają niejednorodną mieszaninę typów komórek. Aby zbadać ekspresję genów w określonych typach komórek z danej tkanki, jądra mogą być genetycznie znakowane, a następnie izolowane przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak analiza ekspresji genów i immunoprecypitacja chromatyny.

Izolacja oznaczonych jąder z tkanek Drosophila w oparciu o powinowactwo do analizy ekspresji genów

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Naucz się izolacji jąder z mózgu i szpiku kostnego myszy do wieloomowych analiz pojedynczych jąder. Zoptymalizowana metoda zwiększa czystość jąder z 36% do niemal 100%, poprawiając jakość danych sekwencjonowania.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Przeglądaj więcej filmów