Name: Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj metody biofizyczne do badania kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez PROTAC: SPR, BLI i ITC. Protokoły te umożliwiają optymalizację projektowania cząsteczek degradujących białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta nagrodą za Innowacyjność i Rozwój Technologii od Centrum Rozwoju Terapii w Broad Institute of MIT i Harvardzie. Autorzy pragną podziękować członkom zespołu kierowniczego wyższego szczebla oraz komisji rewizyjnej za wsparcie tych prac.

Wszystkie białka uległy nadekspresji w >E.coli z dobrą wydajnością i czystością (>80%) zgodnie z protokołami literaturowymi18. Biotynylację przeprowadzono przy użyciu reakcji katalizowanej przez BirA18. Wszystkie małe cząsteczki przygotowano w roztworach podstawowych 1 mM w 100% DMSO. Procedury opisane w niniejszym dokumencie nie wymagają specjalistycznego laboratoryjnego sprzętu bezpieczeństwa ani środków ostrożności. Należy używać standardowych laboratoryjnych środków ochrony osobistej (PPE) (tj. fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych i rękawic).
Białka użyte w tym badaniu są wymienione poniżej: 
VHL: biotynylowany kompleks VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) ze znacznikiem Avi na C-końcu ElonginB. 
Brd4BD2: Nieoznakowany Brd4BD2(333-460) 
CRBN: biotynylowany CRBN(319-442) ze znacznikiem Avi na końcu N 
PPM1D: nieoznakowany lub podwójnie oznaczony His8-tagowany PPM1D(1-420) na końcu N
Małe cząsteczki użyte w tym badaniu są wymienione poniżej: 
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC, który wiąże się z VHL i Brd4BD2 
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN KD ~ 3 μM, nie wiąże się z PPM1D 
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN KD ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM 
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): nie wiąże się z CRBN, PPM1DK D = 1-2 nM
1. Metoda 1: ITC (izotermiczna kalorymetria miareczkowa)
UWAGA: Miareczkowanie odbywa się za pomocą mikrokalorymetru z automatycznym wstrzykiwaniem.
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu: Przygotować 3 l buforu zawierającego 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.</li>
	<li>Dializa: Dializować VHL i Brd4BD2 (~ 500 μL przy 150 μM każdy) w stosunku do 1 l buforu przygotowanego w kroku 1.1, 3 razy w temperaturze 4 °C, odpowiednio przez 4 godziny, 2 godziny i około 16 godzin. Należy zachować bufor po ostatniej dializie do wykorzystania w kolejnych krokach.</li>
	<li>Przygotować próbki na 96-dołkowej płytce z plastikową osłoną.
	<ol>
		<li>Do każdego miareczkowania należy przygotować 400 μl roztworu dla celi, 125 μl dla strzykawki i 400 μl buforu do czyszczenia. Dodaj próbki do trzech kolejnych studzienek na płytce. Ponieważ wywar złożony jest przygotowywany w 1 mM w 100% DMSO, dodaj ten sam procent DMSO do roztworów białkowych, aby zapewnić pasujący bufor w komórce i strzykawce. Dodaj 2% DMSO do końcowych roztworów.
		<ol>
			<li>Próbka do miareczkowania VHL do MZ1: Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl buforu, 4 μl MZ1 przy 1 mM (10 μM stężenie końcowe) i 4 μL 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM, 2,5 μl 100% DMSO (stężenie końcowe 84 μM).</li>
			<li>Próbki do miareczkowania VHL do buforu (dane zostaną wykorzystane do odjęcia tła danych wygenerowanych z próbki 1.3.1.1): Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl buforu, 8 μl 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i dodać 2,5 μl 100% DMSO.</li>
			<li>Próbki do miareczkowania VHL do MZ1 i Brd4BD2: Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM stężenie końcowe), 3,36 μL MZ1 przy 1 mM (stężenie końcowe 8,4 μM) i 4,64 μl 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i 2,5 μl 100% DMSO.</li>
			<li>Próbki do miareczkowania VHL do Brd4BD2 (tło 1.3.1.3): Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μL 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM stężenie końcowe) i 8 μL 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i 2,5 μl 100% DMSO.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchomić wszystkie cztery miareczkowania na mikrokalorymetrze. Każdy z nich składa się z 19 wstrzyknięć 2 μl roztworu strzykawkowego z szybkością 2 μl/s w odstępach 120 s. Wykonaj wstępne wstrzyknięcie białka (0,4 μl) i odrzuć je podczas analizy danych. Wszystkie doświadczenia należy wykonywać w temperaturze 25 °C, mieszając przy 600 obr./min.</li>
	<li>Analiza danych: Dopasuj dane do modelu z pojedynczym miejscem wiązania, aby uzyskać stechiometrię (n), stałą dysocjacji (KD) i entalpię wiązania (ΔH) za pomocą oprogramowania analitycznego dostarczonego przez producenta (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Metoda 2: BLI (interferometria biowarstw)
<ol>
	<li>Przeprowadzić eksperymenty BLI przy użyciu czujników pokrytych streptawidyną (SA) w temperaturze pokojowej (RT) z częstotliwością akwizycji 5 Hz. Podczas zautomatyzowanego eksperymentu BLI upewnij się, że czujniki są nieruchome w jednej kolumnie i poruszają się między różnymi kolumnami 96-dołkowej, płaskiej, czarnej płytki o maksymalnej objętości dołka 392 μL. Napełnij każdą studzienkę płytki użytej w eksperymencie 200 μl roztworu. 
	UWAGA: BLI jest przydatny tylko do wykrywania interakcji białko-białko (tj. tworzenia kompleksów trójskładnikowych). Nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć interakcje między białkami a małymi cząsteczkami.
	<ol>
		<li>Przygotowanie buforu: Przygotować 100 ml buforu zawierającego 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.</li>
		<li>Optymalizacja dla etapu unieruchomienia: Załaduj czujnik testowy do 1-3 nm, zgodnie z zaleceniami producenta. Obciążenie ~1,0 nm jest używane do opisanych tutaj procedur. Aby to osiągnąć, zanurz czujnik w roztworze zawierającym VHL w stężeniu 1,5 μg/ml na 80 s.</li>
		<li>Przeprowadzić pomiary kinetyczne BLI, stosując siedem czujników SA w następującej kolejności:
		<ol>
			<li>W pierwszej fazie podstawowej zanurz się w buforze na 60 sekund.</li>
			<li>W fazie unieruchomienia zanurzyć w roztworze VHL o stężeniu 1,5 μg/ml na 80 s.</li>
			<li>W drugiej fazie podstawowej zanurz się w buforze na 60 sekund.</li>
			<li>W fazie asocjacji zanurzyć w roztworze o stałym stężeniu Brd4BD2 przy 2 μM, stałym stężeniu DMSO przy 2% i zmiennych stężeniach MZ1 przy 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM i 0 nM (czujnik odniesienia) przez 300 s.</li>
			<li>W fazie dysocjacji zanurz się w buforze na 600 s.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta. kon, koff i KD są raportowane dla dopasowania danych (Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Metoda 3: SPR (powierzchniowy rezonans plazmonowy)
UWAGA: Wszystkie eksperymenty SPR są przeprowadzane przy użyciu chipów czujników pokrytych streptawidyną (SA) w RT. Chociaż chip NTA jest używany do wykrywania między białkiem a małymi cząsteczkami, należy go używać z ostrożnością w przypadku stosowania do kompleksu trójskładnikowego, ponieważ obserwuje się znacznie wyższe tło niż chip SA, prawdopodobnie ze względu na oddziaływania elektrostatyczne między naładowaną powierzchnią chipa a białkiem w analicie.
<ol>
	<li>SPR do współpracy VHL-MZ1
	<ol>
		<li>Przygotowanie buforu.
		<ol>
			<li>Przygotuj 1 l bufor zawierający 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 i przepuść go przez jednostkę filtrującą 0,2 μm.</li>
			<li>Usuń 20 ml buforu do wykorzystania w przyszłości (bufor wolny od DMSO) i napełnij ponownie 20 ml DMSO (2% DMSO w końcowym buforze działającym). Utrzymuj DMSO na poziomie 2% we wszystkich próbkach opisanych poniżej (kroki 3.1 i 3.2)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aktywuj chip SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchomij VHL do ~2000 RU (wstrzyknąć roztwór białka 5 μg/ml przy 5 μL/min).</li>
		<li>Przygotować MZ1 w 3-krotnym, 8-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 10 μM na 384-dołkowej, stożkowej dnie, półprzezroczystej, polipropylenowej płytce o maksymalnej objętości 130 μL. Przykryj płytkę samoprzylepnymi, przezroczystymi foliami z tworzywa sztucznego kompatybilnymi z mikropłytkami polipropylenowymi.
		<ol>
			<li>Przygotuj górne stężenie z buforem wolnym od DMSO, aby zapewnić 2% DMSO w końcowym stężeniu. Do 147 μl buforu wolnego od DMSO dodaj 1,5 μl bulionu MZ1 w 1 mM i 1,5 μl 100% DMSO.</li>
			<li>Przygotować 3-krotne seryjne rozcieńczenie z uruchomionym buforem zawierającym 2% DMSO. Do 100 μl bieżącego buforu dodać 50 μl roztworu o najwyższym stężeniu przygotowanym w kroku 3.1.3.1 i dobrze wymieszać, aby przygotować 2. najwyższe stężenie.</li>
			<li>Następnie przenieść 50 μl roztworu przygotowanego w kroku 3.1.3.2 do następnych 100 μl działającego buforu, dobrze wymieszać, aby przygotować trzecie najwyższe stężenie i tak dalej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność; czas kontaktu: 120 s; czas dysocjacji: 300 s; natężenie przepływu: 50 μL/min.</li>
		<li>Przeprowadzić analizę danych za pomocą oprogramowania ewaluacyjnego dostarczonego przez producenta urządzenia. Analiza w stanie ustalonym wykazała, że KD = 26 (± 3) nM i Rmax ~91% (± 5%) osiągnięto wiązanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SPR dla VHL: MZ1: kompleks trójskładnikowy Brd4BD2
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.1.1.</li>
		<li>Aktywuj układ SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchomij VHL do ~100 RU. Wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 0,5 μg/ml VHL przy natężeniu przepływu 5 μl/min i czasie kontaktu od 1 do 5 minut, aż do osiągnięcia gęstości powierzchni ~100 RU.</li>
		<li>Przygotować próbki do dwóch 5-krotnych, 5-punktowych jednocyklowych wstrzyknięć w 96-dołkową, przezroczystą, polistyrenową płytkę o okrągłym dnie o maksymalnej objętości 323 μl i przykryć ją samoprzylepnymi, przezroczystymi foliami z tworzywa sztucznego, które są kompatybilne z mikropłytkami polistyrenowymi, jak opisano w krokach 3.2.3.1-3.2.3.2.
		<ol>
			<li>Kontrola ujemna: analit zawiera tylko Brd4BD2.
			<ol>
				<li>Przygotować najwyższe stężenie przy 25 μM w bieżącym buforze o objętości 200 μL (#A5)</li>
				<li>Dodaj po 160 μl Brd4BD2 w 2 μM w buforze bieżącym do następnych 4 studzienek po lewej stronie (#A1-A4)</li>
				<li>Przenieś 40 μl A5 do A4. Dobrze wymieszaj.</li>
				<li>Przenieś 40 μl formatu A4 do formatu A3. Dobrze wymieszaj. Rób to aż do A1.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Tworzenie kompleksu trójskładnikowego: analit zawiera MZ1 i Brd4BD2.
			<ol>
				<li>Przygotować najwyższe stężenie, dodając 4 μl MZ1 przy 20 μM w 100% roztworze DMSO do 196 μl zawierających 25,5 μM Brd4BD2 w buforze wolnym od DMSO (#B5). Końcowe stężenia to 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 i 2% DMSO.</li>
				<li>Dodaj po 160 μl Brd4BD2 w 2 μM do bieżącego buforu do następnych 4 studzienek po lewej stronie (#B1-B4)</li>
				<li>Przenieść 40 μl witaminy B5 do witaminy B4. Dobrze wymieszaj.</li>
				<li>Przenieść 40 μl witaminy B4 do witaminy B3. Dobrze wymieszaj. Rób to aż do B1.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchom SPR w konfiguracji jednocyklowej: Czas kontaktu: 100 s; czas dysocjacji: 720 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. Zastosuj trzy wstrzyknięcia buforu przed każdą próbką, aby zapewnić stabilne tło.</li>
		<li>Analiza danych: Zastosuj trzecie wstrzyknięcie buforu jako tło do odejmowania. Jako kontrola ujemna, gdy MZ1 nie jest obecny, odpowiedź SPR między VHL a Brd4BD2 jest znikoma. Gdy MZ1 jest obecny, dopasowanie kinetyczne wskazuje, że oddziaływanie między VHL i kompleksem MZ1-Brd4BD2 ma kwłączone = 7,9 (± 1,5) *107 / M / s, kwyłączone = 0,014 s-1 i KD = 1 nM. (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SPR dla oddziaływań CRBN i małych cząsteczek
	<ol>
		<li>Przygotowanie buforu.
		<ol>
			<li>Przygotować 1 l bufor zawierający 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 i przepuścić go przez jednostkę filtrującą 0,2 μm.</li>
			<li>Usuń 20 ml buforu i uzupełnij 20 ml 100% DMSO (2% DMSO w końcowym buforze). Ważne jest, aby utrzymać DMSO na poziomie 2% we wszystkich próbkach opisanych poniżej (kroki 3.3, 3.4 i 3.5).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aktywuj układ SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchom, CRBN do ~800 RU.</li>
		<li>Przygotować związki w 3-krotnym, 6-punktowym seryjnym rozcieńczeniu na 384-dołkowej płytce o najwyższym stężeniu 30 μM, jak opisano w ppkt 3.1.3.</li>
		<li>Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność, czas kontaktu: 60 s, czas dysocjacji: 90 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. W przypadku tego systemu wystarczą trzy wstrzyknięcia bufora, aby uzyskać stabilne tło. W przypadku innych systemów testowych może być konieczne wykonanie dodatkowych iniekcji buforowych.</li>
		<li>Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta. 
		UWAGA: Analiza w stanie ustalonym wskazuje, że KD BRD-2512 i BRD-5110 wynoszą około 3 μM. Jednak wiązanie osiągnęło tylko ~ 70%R max wiązania przy najwyższym stężeniu. Zarówno słabe powinowactwo, jak i kształt sensorgramu wskazują, że prawdopodobieństwo wystąpienia nierozpuszczalności związku w wysokich stężeniach. W związku z tym rzeczywisty KD może być wyższy niż 3 μM. BRD-4761, który nie wiąże się z CRBN, został włączony jako kontrola ujemna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SPR dla PPM1D i oddziaływań małocząsteczkowych
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.3.1. Użyj chipa czujnika kwasu nitrylooctowego (NTA).</li>
		<li>Zastosuj pojedynczy cykl, ponieważ głowica bojowa PPM1D ma powolne kwłączania i wyłączania. Zregeneruj chip NTA przy użyciu domyślnej konfiguracji producenta i unieruchamiaj PPM1D do ~ 1000 RU po każdym wstrzyknięciu związku (wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 5 μg/ml przy 5 μl/min).</li>
		<li>Przygotować związki w 3-krotnym, 5-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 400 nM, jak opisano w ppkt 3.1.3.</li>
		<li>Uruchom SPR w konfiguracji jednocyklowej: Tryb: wysoka wydajność; czas kontaktu: 90 s; czas dysocjacji: 600 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. Zastosuj trzy wstrzyknięcia buforu przed każdym związkiem, aby zapewnić stabilne tło.</li>
		<li>analiza danych. Zastosować trzecie wstrzyknięcie buforu jako tło do odejmowania. Jako kontrola ujemna, BRD-2512 nie wykazuje wiązania z PPM1D. W przypadku BRD-4761 i BRD-5110 dopasowanie kinetyczne wskazywało, że KD dla obu wynosi 1-2 nM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SPR dla CRBN:PROTAC: Kompleks trójskładnikowy PPM1D
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.3.1.</li>
		<li>Aktywuj chip SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchamij CRBN do ~35 RU (wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 0,5 μg/ml przy 5 μl/min).</li>
		<li>Przygotować trzy związki w 3-krotnym, 6-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 30 μM, utrzymując [PPM1D] na poziomie 1 μM we wszystkich próbkach, w tym w próbach ślepych, stosując metodę opisaną w kroku 3.2.3.</li>
		<li>Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność; czas kontaktu: 60 s; czas dysocjacji: 90 s; natężenie przepływu: 50 μL/min.</li>
		<li>Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta. 
		UWAGA: Podczas gdy BRD-2512 i BRD-4761 wykazują brak/znikomą odpowiedź, BRD-5110 wyraźnie pokazuje "efekt haka" w stanie ustalonym z szybką kinetyką włączania/wyłączania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5A-C). Eksperymentalna odpowiedź wiązania z BRD-5110 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5C) znajduje się pomiędzy przewidywaną odpowiedzią z symulacji, gdy zakłada się, że KD (CRBN, cpd) wynosi 3 lub 10 μM (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5E), co sugeruje, że trójskładnikowe KD i binarne KD są bardzo podobne. Nie ma widocznej kooperatywności PPM1D: BRD-5110: tworzenia kompleksu CRBN.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Characterization of Ternary Complex Formation in PROTACs Using Biophysical Assays

<ol><li>Balaji, V., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+E3+ubiquitin+ligases+by+homotypic+and+heterotypic+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
<li>Song, L., Luo, Z. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+ubiquitin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of ubiquitin signaling.</a> Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).</li>
<li>Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ubiquitin+ligases%3A+styles%2C+structures+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions.</a> Molecular Biomedicine. 2 (1), 23(2021).</li>
<li>Grice, G. L., Nathan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recognition+of+ubiquitinated+proteins+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).</li>
<li>Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degraders+enter+the+clinic+-+a+new+approach+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).</li>
<li>Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aToure%2C+M+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed.+In+English%29%22">Angewandte Chemie (International ed. In English)</a>. 55 (6), 1966-1973 (2016).</li>
<li>Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+different+E3+ligases+for+small+molecule+induced+protein+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).</li>
<li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+live-cell+kinetic+degradation+and+mechanistic+profiling+of+PROTAC+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).</li>
<li>Nabet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dTAG+system+for+immediate+and+target-specific+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).</li>
<li>Paiva, S. -L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+protein+degradation%3A+elements+of+PROTAC+design%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted protein degradation: elements of PROTAC design.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+target+warhead+and+linkage+vector+on+inducing+protein+degradation%3A+Comparison+of+bromodomain+and+extra-terminal+%28BET%29+degraders+derived+from+triazolodiazepine+%28JQ1%29+and+tetrahydroquinoline+%28I-BET726%29+BET+inhibitor+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).</li>
<li>Roy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li>
<li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li>
<li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li>
<li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+magnesium-dependent+1+%CE%B4+%28PPM1D%29%2C+serine%2Fthreonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362(2021).</li>
<li>Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li>
<li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li>
<li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li>
<li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Biofizyczna charakterystyka binarnych i trójskładnikowych oddziaływań między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka może dostarczyć unikalnych i uzupełniających informacji w odniesieniu do powszechnie stosowanych systemów komórkowych. Zrozumienie powinowactwa między każdą głowicą bojową cząsteczki PROTAC a jej partnerami wiążącymi białka może pomóc w ukierunkowaniu wysiłków chemii medycznej w kierunku optymalizacji tych interakcji. Wcześniej opublikowane struktury krystaliczne trójskładnikowych kompleksów PROTAC ujawniły, że atomy w regionie łącznikowym mogą tworzyć interakcje z jednym lub oboma partnerami wiążącymi białka 16,20. Eksperymentalne określenie kooperatywności tworzenia kompleksu trójskładnikowego może pomóc w optymalizacji łącznika.
W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie trzech różnych technik biofizycznych, które mogą dostarczyć informacji na temat powinowactwa wiązania między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka. Metoda 1 szczegółowo opisuje konfigurację eksperymentalną kalorymetrii miareczkowej izotermicznej (ITC) dla cząsteczki PROTAC, MZ1, kompleksu ligazy VHL E3 i bromodomeny Brd4BD2 . Wyniki ITC wykazały KD 59 nM dla interakcji binarnej między MZ1 i VHL oraz 4 nM dla interakcji trójskładnikowej między VHL a wstępnie zmieszanymi MZ1 i Brd4BD2. Powinowactwa były zgodne z obserwowanymi w SPR (unieruchomione wiązanie VHL z MZ1K D = 26 nM, unieruchomione wiązanie VHL z wstępnie zmieszanymi MZ1 i Brd4BD2 K D = 1 nM) i BLI (KD = 2,8 nM). Podczas gdy wyniki ITC KD dla wiązania VHL z MZ1 są zgodne z podanymi wartościami16, uzyskana stechiometria jest inna. Jednym z potencjalnych wyjaśnień tego wyniku jest słaba rozpuszczalność MZ1 w buforze opartym na HEPES zastosowanym w opisanym tutaj protokole, podczas gdy wyniki z literatury zostały wygenerowane przy użyciu buforu opartego na Bis-tris. Autorzy woleli używać tych samych komponentów bufora w SPR, ITC i BLI.
Metoda 2 opisuje układ doświadczalny do analizy BLI oddziaływania unieruchomionego VHL, stałego stężenia Brd4BD2 i różnych stężeń MZ1. Ze względu na ograniczenia czułości techniki, można było wygenerować wartości KD, k on ik off dla tworzenia kompleksu trójskładnikowego, ale nie dla interakcji binarnej między MZ1 a białkami.
Metoda 3 opisuje wiele testów SPR. SPR jest bardziej czuły niż BLI i może być stosowany do obserwacji zarówno interakcji białko-mała cząsteczka (binarna), jak i białko-białko (trójskładnikowa). W tym drugim przypadku sygnały tła powinny być uważnie monitorowane, ponieważ białko w analicie może dawać wysokie i niestabilne sygnały. SPR jest bardzo wrażliwy na odczynniki o wysokim współczynniku załamania światła, w tym DMSO, glicerol i detergenty. Jeżeli białko jest przechowywane w buforze zawierającym glicerol lub detergent, bufor bieżący musi zawierać odpowiednie stężenia tych składników. Alternatywnie, zastosowanie chromatografii wykluczającej rozmiar całkowicie usuwa je przed jakimkolwiek eksperymentem SPR. Należy dołożyć starań, aby dokładnie dopasować stężenia DMSO między próbkami buforu i analitu. Korekty rozpuszczalnika DMSO są wykonywane zgodnie z instrukcjami producenta.
Metoda opisana w kroku 3.1 opisuje test SPR dla binarnej interakcji VHL-MZ1. Metoda 3.2 opisuje test SPR dla kompleksu trójskładnikowego VHL: MZ1: Brd4BD2 , w którym VHL jest unieruchomiony, a analitem jest sam Brd4BD2 lub kompleks MZ1: Brd4BD2 . W tym systemie interakcja między Brd4BD2 a VHL jest znikoma. Formacja kompleksu trójskładnikowego jest wysoce kooperatywna (ɑ = 26). Współczynnik odchylenia dla tworzenia kompleksu trójskładnikowego wynosi 0,014 s-1, co wymaga zastosowania kinetyki jednego cyklu. Wyniki ITC wskazują również na wysoce kooperatywną formację kompleksu trójskładnikowego (ɑ=15). Metody SPR w krokach 3.3, 3.4 i 3.5 opisują testy do oceny tworzenia kompleksu między CRBN i PPM1D indukowanego obecnością cząsteczki PROTAC, BRD-5110. Cząsteczka PROTAC ma słabe powinowactwo do CRBN (KD ~ 3 μM) i silne powinowactwo do PPM1D (KD = 1-2 nM). W rezultacie, słabe wiązanie z CRBN nie jest nasycone i powoduje obserwowany "efekt haczyka". Chociaż możliwe jest zwiększenie rozpuszczalności ligandów poprzez zwiększenie stężenia DMSO użytego w eksperymencie, ważne jest, aby w takich przypadkach dokładnie monitorować stabilność białka, na którą wysokie stężenia DMSO mogą mieć negatywny wpływ. Dodatkowo DMSO ma wysokie ciepło rozpuszczania, które może przesłaniać ciepło wiązania ligandów z białkiem. Należy dołożyć starań, aby dopasować stężenia DMSO roztworu w strzykawce i roztworu w kuwecie. Autorzy zalecają dializę obu roztworów z tym samym preparatem buforowym.
Ogólne zalecenia i wytyczne są oparte na przeprowadzonych i zgłoszonych eksperymentach tutaj. Gdy powinowactwo oddziaływań binarnych między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka jest silne (KD <1 μM), SPR dostarcza wiarygodnych i powtarzalnych powinowactw wraz z cennymi informacjami na temat kooperatywności tworzenia kompleksów trójskładnikowych. W przypadku, gdy powinowactwo oddziaływania binarnego między jednym z partnerów wiążących białko a cząsteczką PROTAC jest słabe (K D >1 μM), konieczne będzie zmodyfikowanie układu testowego. W takich przypadkach zastosowanie symulacji molekularnych, w których stałe wiązania są stałe, a stężenia liganda i analitu są zróżnicowane, może być cenne w kierowaniu projektowaniem testów i interpretacji wyników eksperymentalnych. Testy ITC dostarczają ważnych informacji na temat stechiometrii wiązania, ale wymagają znacznie więcej odczynników białkowych i złożonych w porównaniu z SPR i BLI. Ponadto rozpuszczalność cząsteczki PROTAC może być ograniczona w eksperymentach ITC. BLI ma wyższą przepustowość niż ITC i wymaga mniej odczynników białkowych i złożonych. Jednak ze względu na ograniczenia czułości, BLI może być stosowany tylko do oceny tworzenia kompleksu trójskładnikowego, a nie interakcji binarnych między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka. Zaleca się, aby SPR był stosowany do rutynowych testów zarówno binarnych, jak i trójskładnikowych testów wiązania PROTAC oraz testów BLI i ITC stosowanych do ortogonalnej walidacji wyników z SPR.

Poliubikwitynacja białek w komórce jest ściśle regulowanym procesem, który obejmuje enzymy z rodziny ligaz ubikwityny1,2. Enzymy końcowe w szlaku to ligazy ubikwityny E3, które kowalencyjnie przyłączają cząsteczki ubikwityny do swoich partnerów wiążących białka3. Poliubikwitynacja tych partnerów wiążących białka jest ukierunkowana na degradację proteolityczną przez proteasom4. System ten jest częścią procesu homeostazy białek, który został terapeutycznie wykorzystany do indukowania degradacji białek zaangażowanych w chorobę5. Małe cząsteczki, które indukują interakcję między ligazami ubikwityny E3, takie jak ligaza E3 von Hippel-Lindau (VHL) lub cereblon (CRBN), są zwykle zbudowane z głowicy wiążącej ligazę E3 połączonej elastycznym łącznikiem z głowicą bojową, która wiąże się z białkiem przeznaczonym do degradacji. Te heterobifunkcyjne cząsteczki są powszechnie określane jako chimery ukierunkowane na proteolizę lub PROTACS6.
Rozwój PROTACS polega na ocenie zdolności molekuł do indukowania degradacji białek w komórkach. Opracowano wiele komórkowych systemów testowych, które monitorują indukowaną interakcję między białkiem docelowym a składnikami ligazy E3, takimi jak VHL lub CRBN, po potraktowaniu komórek cząsteczką PROTAC. Jeden z takich testów komórkowych, system nanoluc-Halotag7, obejmuje ligazę E3 połączoną z akceptorem Halotag i docelowe białko oznaczone donorem nanoluc. Tworzenie kompleksu trójskładnikowego zbliża donor nanoluc i akceptor Halotag do siebie, umożliwiając transfer energii z donora do akceptora, co skutkuje emisją światła. Warianty tego systemu mogą być wykorzystane do oceny przepuszczalności komórkowej cząsteczek PROTACS8 lub zmian względnego poziomu ubikwitynacji białka docelowego9. Podczas gdy te systemy komórkowe są niezbędne do napędzania optymalizacji PROTACS, tworzenie kompleksów między ligazami E3 a białkami przeznaczonymi do degradacji jest procesem wieloetapowym10,11. Kinetyka i termodynamika zachodzących interakcji binarnych i trójskładnikowych przyczynia się do ubikwitynacji wydajności i wynikającej z niej degradacji białka12,13,14.
Poniżej opisane są protokoły, które można dostosować do biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez PROTACS za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), interferometrii biowarstwowej (BLI) i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Protokoły SPR i ITC dla cząsteczki MZ1 PROTAC, która indukuje tworzenie kompleksu trójskładnikowego między Brd4BD2 i VHL, pochodzące z doniesień literaturowych13,15 i opisane tutaj, były w stanie podsumować zgłoszone wyniki z pewną modyfikacją zgłoszonych procedur, które zostaną omówione. Opis testu BLI stosowanego do oceny tworzenia kompleksu trójskładnikowego między MZI, Brd4BD2 i VHL znajduje się w niniejszym raporcie. Pomiary powinowactwa z BLI były zgodne z tymi obserwowanymi w SPR i ITC. Opisano również wcześniej opublikowany protokół, w którym opracowano test SPR do oceny indukowanego przez PROTAC tworzenia kompleksu trójskładnikowego między PPM1D, fosfatazą białkową Ser / Thr, której ekspresja jest indukowana w sposób zależny od p53 16, a CRBN. W tym przypadku cząsteczka PROTAC ma powinowactwo nanomolowe do PPM1D, ale tylko powinowactwo mikromolowe do CRBN. W tym przypadku wiązanie cząsteczki PROTAC z CRBN nie jest nasycone, co skutkuje powszechnie obserwowanym "efektem haczyka". Efekt haka jest właściwością trzech układów ciała, w których istnieją dwa gatunki, które mogą tworzyć kompleks heterotrimeryczny, gdy oba są związane z cząsteczką pomostową (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1) 17. Efekt haczyka obserwuje się, gdy stężenie gatunku łączącego się jest nadmierne w stosunku do dwóch pozostałych gatunków. Wynikowy stan to taki, w którym interakcje binarne konkurują z oddziaływaniami trójskładnikowymi. Systemy, w których obserwuje się efekt haka, wymagają szczególnych rozważań dotyczących projektowania eksperymentalnego omówionych w niniejszym raporcie. Podano ogólne koncepcje i wymagania dotyczące odczynników do oceny wykorzystania testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez PROTAC.

<table><tbody><tr><td>96-płytkowe</td><td>płytki Greiner</td><td>655076</td><td>płaskodenne, czarne płytki używane W eksperymentach BLI</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Nunc</td><td>73520-120</td><td>Płytka do przygotowania próbki ITC</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Greiner</td><td>650101</td><td>Płytka używana do przygotowania próbek do eksperymentów SPR</td></tr><tr><td>Automatyczny mikrokalorymetr iTC200</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Przyrząd używany do przeprowadzania eksperymentów ITC. Produkt wycofany z rynku.</td></tr><tr><td>Biacore S200</td><td>Cytiva</td><td>29136649</td><td>Instrument używany do wykonywania eksperymentów SPR</td></tr><tr><td>MZ1</td><td>ProbeChem</td><td>PC-60099</td><td>PROTAC wiążący się z VHL i chipem czujnika Brd4BD2</td></tr><tr><td>NTA</td><td>Cytiva</td><td>BR100532</td><td>chip SPR używany do wykonywania eksperymentów SPR z udziałem PPM1D</td></tr><tr><td>Octet Red-384</td><td>Sartorius</td><td></td><td>Instrument używany do wykonywania eksperymentów BLI. Produkt wycofany z rynku.</td></tr><tr><td>Osłona płytki</td><td>Malvern</td><td>PQA0001</td><td>Osłona płytki Nunc 96-dołkowa (73520-120)</td></tr><tr><td>Osłona płytki</td><td>Cytiva</td><td>28975816</td><td>Osłona płytki do płytki Greiner (650101)</td></tr><tr><td>Układ czujnika serii S SA</td><td>Cytiva</td><td>BR100531</td><td>Chip SPR używany do przeprowadzania eksperymentów SPR z udziałem MZ1:VHL:BRD4</td></tr><tr><td>Streptawidyna (SA) Biosensory zanurzania i odczytu</td><td>Sartorius</td><td>18-509</td><td>Czujniki powlekane stosowane w BLI Eksperymenty</td></tr></tbody></table>

opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (protacs)

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

Ligazy i białka E3 przeznaczone do degradacji mogą być indukowane do tworzenia kompleksów przez heterobifunkcjonalne cząsteczki w wieloetapowym procesie. Kinetyka i termodynamika zachodzących oddziaływań przyczynia się do efektywności ubikwitynacji i wynikającej z niej degradacji białka. Techniki biofizyczne, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometria biowarstwowa (BLI) i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) dostarczają cennych informacji, które można wykorzystać do optymalizacji tych interakcji. Korzystając z dwóch systemów modelowych, stworzono zestaw narzędzi do testów biofizycznych w celu zrozumienia kooperatywności tworzenia kompleksów trójskładnikowych oraz wpływu "efektu haczyka" na kinetykę wiązania. W jednym przypadku oceniono cząsteczkę chimery ukierunkowaną na proteolizę (PROTAC), która indukowała tworzenie kompleksu trójskładnikowego między Brd4BD2 i VHL. Heterobifunkcyjna cząsteczka MZ1 ma powinowactwo nM zarówno do białka Brd4BD2 (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM), jak i do kompleksu VHL (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). Dla tego systemu opracowano solidne testy SPR, BLI i ITC, które odtworzyły opublikowane wyniki wykazujące kooperatywność tworzenia kompleksów trójskładnikowych. W drugim przypadku badano cząsteczkę, która indukowała trójskładnikowe kompleksy między białkiem 46,0 kDa, PPM1D i cereblonem [CRBN (319-442)]. Heterobifunkcyjna cząsteczka, BRD-5110, ma SPRK D = 1 nM dla PPM1D, ale znacznie słabsze wiązanie ze skróconym kompleksem CRBN (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). W tym przypadku wiązanie dla CRBN w SPR nie było nasycone, co skutkowało "efektem haczyka". Oceniono przepustowość i wymagania dotyczące odczynników dla SPR, BLI i ITC, a także przedstawiono ogólne zalecenia dotyczące ich stosowania w projektach PROTAC.

Charakterystykę kompleksu binarnego VHL: MZ1 oraz kompleksu trójskładnikowego VHL: MZ1: Brd4BD2 przedstawiono na Rysunku 2 (ITC), Rysunku 3 (BLI) oraz Rysunku 4 (SPR) przy zastosowaniu bardzo podobnego buforu. Wartości KD uzyskane z ortogonalnych analiz są spójne. Kooperatywność można obliczyć jako KD (binarny) / KD (trójskładnikowy), co daje wynik wyraźnie dodatni (15 z ITC lub 26 z SPR).
Charakterystykę układu CRBN:PROTAC:PPM1D przeprowadzono za pomocą SPR (Rycina 5A-D). Białko CRBN unieruchomiono do poziomu ~35 RU, aby ułatwić obserwację tworzenia kompleksu trójskładnikowego. Wiązanie samego PROTAC spowodowało sygnał &lt;2 RU, co znajduje się poniżej poziomu szumu. Obecność PPM1D w analizowanym roztworze generuje wysoki sygnał tła na powierzchni chipa SA, a najwyższe stężenie, jakie można zastosować, wynosi około 1 µM. Wartość ta jest niższa niż KD pomiędzy CRBN a jego głowicą (≥3 µM), zatem spodziewany jest tzw. „efekt haczyka” (hook effect). SPR jest wystarczająco czułe, aby go wykryć, co jest zgodne z wynikami symulacji (Rycina 5E). Symulację przeprowadzono w oparciu o niekooperatywne równowagi opisane w literaturze19, łącząc je z klasycznym obliczeniem SPR [Responsemax = (ResponseLigand × MassImmobilization)/MassLigand]. Ponieważ KD pomiędzy CRBN a związkiem nie zostało dokładnie określone ze względu na nierozpuszczalność związku w wysokich stężeniach, symulację przeprowadzono przy użyciu czterech założeń dla KD: 1 µM, 3 µM, 10 µM lub 30 µM. Wyniki eksperymentalne mieściły się pomiędzy symulowanymi krzywymi dla 3 µM i 10 µM, co jest niemal identyczne z KD w układzie binarnym, co sugeruje brak kooperatywności.
<img alt="Schematy wiązania białko-ligand; binarne i ternarne KD; analiza kooperatywności; wykres efektu haka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ilustracja trzech scenariuszy wiązania oraz definicja różnych wartości KD. (A) Klasyczne układy dwuskładnikowe. (B) Układ trójskładnikowy, w którym jeden koniec PROTAC może zostać nasycony, dzięki czemu można go oceniać jako układ dwuskładnikowy. (C) Układ trójskładnikowy, w którym obserwuje się „efekt haka”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres izotermicznej kalorymetrii miareczkowej przedstawiający powinowactwo wiązania i termodynamikę MZ1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wyniki ITC. Miareczkowanie VHL do MZ1 (po lewej) lub kompleksu MZ1:Brd4BD2 (po prawej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres odpowiedzi sensora; analiza kinetyczna, stałe dysocjacji, K&lt;sub&gt;D&lt;/sub&gt;=2.9 nM; porównanie wykresów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki BLI. MZ1 pośredniczy w tworzeniu kompleksu trójskładnikowego VHL: MZ1: Brd4BD2. (A) Surowe dane. (B) Odjęcie sygnałów tła dla [MZ1] = 0. (C) Dopasowanie kinetyczne danych z B w celu wyznaczenia kon, koff oraz KD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza danych powierzchniowego rezonansu plazmonowego, pomiary KD, wiązanie równowagowe, szybkości kinetyczne, wykres." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wyniki SPR. (A) Wiązanie MZ1 do VHL. (B) Wiązanie kompleksu binarnego MZ1:Brd4BD2 do VHL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy analizy powinowactwa wiązania; grafy przedstawiają odpowiedź związku (RU) w funkcji stężenia i czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wyniki SPR wykazujące „efekt haczyka” (hook effect) dla reprezentatywnego związku PPM1D-PROTAC. CRBN został unieruchomiony na powierzchni chipa SA, podczas gdy stężenie [PPM1D] w analizacie utrzymywano na poziomie 1 µM we wszystkich przypadkach. (A) BRD-2512, związek wiążący się wyłącznie z CRBN, nie daje niemal żadnej odpowiedzi. (B) BRD-4761, związek wiążący się wyłącznie z PPM1D, również nie daje odpowiedzi. (C,D) BRD-5110, PROTAC zawierający głowicę CRBN z BRD-2512 oraz głowicę PPM1D z BRD-4761, wywołał powstanie kompleksu trójskładnikowego. (E) Symulacja wyników SPR przy założeniu, że KD między CRBN a związkiem wynosi 1 µM (czarny), 3 µM (niebieski), 10 µM (czerwony) lub 30 µM (zielony). Krzywa dla BRD-2512 znajduje się między 3 µM a 10 µM, co jest bardzo bliskie zmierzonej binarnej wartości KD, sugerując brak kooperatywności (kooperatywność = 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN). Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

Nasze badania koncentrują się na replikowaniu ustalonych systemów modelowych, walidacji ich za pomocą dodatkowych testów i dostosowywaniu tych metodologii do naszego specyficznego kontekstu badawczego. Naszym celem jest zademonstrowanie wszechstronnego podejścia, które można zastosować w różnych projektach. Obecne wyzwanie eksperymentalne polega na strategicznym doborze odpowiedniego formatu i warunków testu w oparciu o specyficzne wymagania projektu i istniejące luki w wiedzy.Jest to niezbędne do uzyskania skutecznych i dokładnych odpowiedzi w naszych eksperymentach. Nasz protokół zapewnia uproszczone podejście do bezproblemowej adaptacji do różnych systemów PROTACS. Ponadto przeprowadzamy dokładną ocenę każdej metody, podkreślając jej zalety i wady.Oferujemy świadome instrukcje dotyczące wyboru najbardziej odpowiedniego formatu w oparciu o określone warunki. Na początek przygotuj roztwory do komórki, strzykawki i do czyszczenia. Dodaj próbki białka lub buforu do trzech kolejnych dołków na 96-dołkowej płytce.Teraz dodaj odpowiednio 100% DMSO, aby końcowe stężenie wynosiło 2%Uruchom wszystkie cztery miareczkowania na mikrokalorymetrze. Każde miareczkowanie powinno składać się z początkowego wstrzyknięcia 0,4 mikrolitra białka w tempie 2 mikrolitrów na sekundę, a następnie 19 wstrzyknięć 2 mikrolitrów roztworu strzykawki z szybkością 2 mikrolitrów na sekundę w 122. odstępach czasu, co daje w sumie 20 wstrzyknięć. Wykonuj wszystkie eksperymenty w temperaturze 25 stopni Celsjusza, mieszając z prędkością 600 obr./min.W celu analizy danych dopasuj dane do modelu pojedynczego miejsca wiązania, aby uzyskać stechiometrię i stałą dysocjacji oraz entalpię wiązania. Przeprowadzono charakterystykę kompleksu binarnego VHL MZ1 i kompleksu trójskładnikowego VHL MZ1 Brd4. Zaobserwowano pozytywną kooperatywność.Rozpocznij eksperymenty z interferometrią biowarstw lub BLI z czujnikami pokrytymi streptawidyną w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że czujniki są nieruchome w jednym rzędzie. Odpipetować 200 mikrolitrów próbki do studzienek.Następnie zanurz czujnik w roztworze zawierającym VHL na 80 sekund, aby załadować czujnik do 1-3 nanometrów. Teraz zanurz się w buforze na 60 sekund, aby ustalić pierwszą fazę podstawową. W fazie unieruchomienia zanurz czujniki w białku VHL na 80 sekund.Następnie ponownie zanurz się w buforze na 60 sekund, aby ustalić drugą fazę podstawową. Następnie zanurz się w ustalonym stężeniu kolejnych wstrzyknięć na 300 sekund. Na koniec zanurz czujniki w buforze jeszcze raz na 600 sekund, aby ustalić fazę dysocjacji.Użyj oprogramowania przyrządu, aby przeanalizować dane i oszacować stałą dysocjacji włączonej, nieprawidłowej i równowagi. Przeprowadzono charakterystykę kompleksu binarnego VHL MZ1 i kompleksu trójskładnikowego VHL MZ1 Brd4. Stwierdzono, że MZ1 pośredniczy w tworzeniu kompleksu trójskładnikowego.Aby wykonać SPR dla interakcji VHL MZ1, najpierw aktywuj chip streptawidyny zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uzyskać najwyższe stężenie, dodaj bufor wolny od DMSO do MZ1, aby zapewnić stężenie 2% DMSO. Teraz odpipetuj 50 mikrolitrów roztworu o najwyższym stężeniu do studzienki zawierającej 100 mikrolitrów działającego buforu.Dokładnie wymieszaj, aby uzyskać drugie najwyższe stężenie. Następnie przenieś 50 mikrolitrów roztworu do kolejnych 100 mikrolitrów buforu do pracy. Dobrze wymieszaj, aby przygotować trzecie najwyższe stężenie i tak dalej.Do przykrycia płytki należy użyć samoprzylepnych przezroczystych folii z tworzywa sztucznego kompatybilnych z mikropłytkami polipropylenowymi. Zainicjuj SPR za pomocą konfiguracji wielocyklowej. Ustaw tryb na wysoką wydajność, czas kontaktu na 120 sekund, czas dysocjacji na 300 sekund, a natężenie przepływu na 50 mikrolitrów na minutę.Do przeprowadzenia analizy danych należy użyć oprogramowania ewaluacyjnego dostarczonego przez producenta urządzenia. Aby wykonać SPR dla trójskładnikowego kompleksu VHL MZ1 Brd4, najpierw aktywuj streptawidynę. Wstrzyknąć roztwór VHL, aby unieruchomić go do około 100 jednostek rezonansowych.Do kontroli ujemnej przy użyciu wyłącznie Brd4 należy przygotować najwyższe stężenie 25 mikromoli w buforze bieżącym o objętości 200 mikrolitrów. Do kolejnych czterech studzienek dodaj 160 mikrolitrów każdy z 2 mikromolowych Brd4. Przenieś 40 mikrolitrów z dołka A5 do A4. Następnie odpipetuj studzienkę, aby dokładnie wymieszać.Podobnie przenieś 40 mikrolitrów z dołka A4 do A3, kontynuując ten proces aż do osiągnięcia A1. Do tworzenia kompleksu trójskładnikowego za pomocą MZ1 i Brd4 odpipetować 196 mikrolitrów 25,5 mikromolowego roztworu Brd4. Do tego dodaj 4 mikrolitry 20 mikromolowych MZ1 przygotowanych w 100% roztworze DMSO. Odpipetować 160 mikrolitrów Brd4 w ilości 2 mikromoli w buforze bieżącym do następnych czterech studzienek po lewej stronie.Następnie przenieś 40 mikrolitrów z dołka B5 do B4 i odpipetuj do dokładnego wymieszania. Kontynuuj przenoszenie roztworu z każdej studzienki do B1. Teraz uruchom SPR do konfiguracji pojedynczego cyklu z czasem kontaktu 100 sekund, czasem dysocjacji 720 sekund i natężeniem przepływu 50 mikrolitrów na minutę. Przeprowadzono charakterystykę kompleksu binarnego VHL MZ1 i kompleksu trójskładnikowego VHL MZ1 Brd4.Zaobserwowano pozytywną kooperatywność. Charakterystyka układu cereblon, PROTAC i PPM1D została przeprowadzona przez SPR. Eksperymenty PPM1D wykorzystują niklowy chip NTA, a powierzchnia chipa jest regenerowana po każdym wstrzyknięciu związku.BRD-2512, który wiąże się tylko z mózgiem, i BRD-4761, który wiąże się tylko z PPM1D, wykazują znikomą odpowiedź wiązania. BRD-5110 indukuje tworzenie trójskładnikowego kompleksu między PPM1D i wykazuje efekt haczyka przy wysokich stężeniach związku.

the-development-application-biophysical-assays-for-evaluating-ternary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Wykazano, że regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący nabłonkowym kanałem chlorkowym, oddziałuje z różnymi białkami i reguluje istotne procesy komórkowe; wśród nich dobrze udokumentowano oddziaływania pośredniczone przez motyw PDZ białka CFTR. Niniejszy protokół opisuje opracowane przez nas metody składania kompleksu sygnalizacyjnego makromolekularnego CFTR zależnego od domeny PDZ in vitro.

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Ten protokół opisuje ilościowe wykrywanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach, które zostały zaprojektowane przy użyciu CRISPR/Cas9 do ekspresji znacznika wykrywania endogennego białka wolnego od przeciwciał połączonego z białkiem docelowym. Dołączone są szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania i uzyskiwania ilościowych parametrów degradacji, szybkości, Dmax, DC50 i Dmax50.

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Biosensing (FEB) to bezznacznikowa technika wykrywania interakcji biomolekularnych. Mierzy prąd elektryczny przepływający przez bioczujnik grafenowy, do którego unieruchomione są cele wiążące. Do oceny interakcji biomolekularnych między Hsp90 i Cdc37 wykorzystano technologię FEB i wykryto silną interakcję między tymi dwoma białkami.

Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Poznaj metody biofizyczne do badania kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez PROTAC: SPR, BLI i ITC. Protokoły te umożliwiają optymalizację projektowania cząsteczek degradujących białka.

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS) (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Przeglądaj więcej filmów