Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Nasze badania koncentrują się na replikowaniu ustalonych systemów modelowych, walidacji ich za pomocą dodatkowych testów i dostosowywaniu tych metodologii do naszego specyficznego kontekstu badawczego. Naszym celem jest zademonstrowanie wszechstronnego podejścia, które można zastosować w różnych projektach. Obecne wyzwanie eksperymentalne polega na strategicznym doborze odpowiedniego formatu i warunków testu w oparciu o specyficzne wymagania projektu i istniejące luki w wiedzy.

Jest to niezbędne do uzyskania skutecznych i dokładnych odpowiedzi w naszych eksperymentach. Nasz protokół zapewnia uproszczone podejście do bezproblemowej adaptacji do różnych systemów PROTACS. Ponadto przeprowadzamy dokładną ocenę każdej metody, podkreślając jej zalety i wady.

Oferujemy świadome instrukcje dotyczące wyboru najbardziej odpowiedniego formatu w oparciu o określone warunki. Na początek przygotuj roztwory do komórki, strzykawki i do czyszczenia. Dodaj próbki białka lub buforu do trzech kolejnych dołków na 96-dołkowej płytce.

Teraz dodaj odpowiednio 100% DMSO, aby końcowe stężenie wynosiło 2%Uruchom wszystkie cztery miareczkowania na mikrokalorymetrze. Każde miareczkowanie powinno składać się z początkowego wstrzyknięcia 0,4 mikrolitra białka w tempie 2 mikrolitrów na sekundę, a następnie 19 wstrzyknięć 2 mikrolitrów roztworu strzykawki z szybkością 2 mikrolitrów na sekundę w 122. odstępach czasu, co daje w sumie 20 wstrzyknięć. Wykonuj wszystkie eksperymenty w temperaturze 25 stopni Celsjusza, mieszając z prędkością 600 obr./min.

W celu analizy danych dopasuj dane do modelu pojedynczego miejsca wiązania, aby uzyskać stechiometrię i stałą dysocjacji oraz entalpię wiązania. Przeprowadzono charakterystykę kompleksu binarnego VHL MZ1 i kompleksu trójskładnikowego VHL MZ1 Brd4. Zaobserwowano pozytywną kooperatywność.

Rozpocznij eksperymenty z interferometrią biowarstw lub BLI z czujnikami pokrytymi streptawidyną w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że czujniki są nieruchome w jednym rzędzie. Odpipetować 200 mikrolitrów próbki do studzienek.

Następnie zanurz czujnik w roztworze zawierającym VHL na 80 sekund, aby załadować czujnik do 1-3 nanometrów. Teraz zanurz się w buforze na 60 sekund, aby ustalić pierwszą fazę podstawową. W fazie unieruchomienia zanurz czujniki w białku VHL na 80 sekund.

Następnie ponownie zanurz się w buforze na 60 sekund, aby ustalić drugą fazę podstawową. Następnie zanurz się w ustalonym stężeniu kolejnych wstrzyknięć na 300 sekund. Na koniec zanurz czujniki w buforze jeszcze raz na 600 sekund, aby ustalić fazę dysocjacji.

Użyj oprogramowania przyrządu, aby przeanalizować dane i oszacować stałą dysocjacji włączonej, nieprawidłowej i równowagi. Przeprowadzono charakterystykę kompleksu binarnego VHL MZ1 i kompleksu trójskładnikowego VHL MZ1 Brd4. Stwierdzono, że MZ1 pośredniczy w tworzeniu kompleksu trójskładnikowego.

Aby wykonać SPR dla interakcji VHL MZ1, najpierw aktywuj chip streptawidyny zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uzyskać najwyższe stężenie, dodaj bufor wolny od DMSO do MZ1, aby zapewnić stężenie 2% DMSO. Teraz odpipetuj 50 mikrolitrów roztworu o najwyższym stężeniu do studzienki zawierającej 100 mikrolitrów działającego buforu.

Dokładnie wymieszaj, aby uzyskać drugie najwyższe stężenie. Następnie przenieś 50 mikrolitrów roztworu do kolejnych 100 mikrolitrów buforu do pracy. Dobrze wymieszaj, aby przygotować trzecie najwyższe stężenie i tak dalej.

Do przykrycia płytki należy użyć samoprzylepnych przezroczystych folii z tworzywa sztucznego kompatybilnych z mikropłytkami polipropylenowymi. Zainicjuj SPR za pomocą konfiguracji wielocyklowej. Ustaw tryb na wysoką wydajność, czas kontaktu na 120 sekund, czas dysocjacji na 300 sekund, a natężenie przepływu na 50 mikrolitrów na minutę.

Do przeprowadzenia analizy danych należy użyć oprogramowania ewaluacyjnego dostarczonego przez producenta urządzenia. Aby wykonać SPR dla trójskładnikowego kompleksu VHL MZ1 Brd4, najpierw aktywuj streptawidynę. Wstrzyknąć roztwór VHL, aby unieruchomić go do około 100 jednostek rezonansowych.

Do kontroli ujemnej przy użyciu wyłącznie Brd4 należy przygotować najwyższe stężenie 25 mikromoli w buforze bieżącym o objętości 200 mikrolitrów. Do kolejnych czterech studzienek dodaj 160 mikrolitrów każdy z 2 mikromolowych Brd4. Przenieś 40 mikrolitrów z dołka A5 do A4. Następnie odpipetuj studzienkę, aby dokładnie wymieszać.

Podobnie przenieś 40 mikrolitrów z dołka A4 do A3, kontynuując ten proces aż do osiągnięcia A1. Do tworzenia kompleksu trójskładnikowego za pomocą MZ1 i Brd4 odpipetować 196 mikrolitrów 25,5 mikromolowego roztworu Brd4. Do tego dodaj 4 mikrolitry 20 mikromolowych MZ1 przygotowanych w 100% roztworze DMSO. Odpipetować 160 mikrolitrów Brd4 w ilości 2 mikromoli w buforze bieżącym do następnych czterech studzienek po lewej stronie.

Następnie przenieś 40 mikrolitrów z dołka B5 do B4 i odpipetuj do dokładnego wymieszania. Kontynuuj przenoszenie roztworu z każdej studzienki do B1. Teraz uruchom SPR do konfiguracji pojedynczego cyklu z czasem kontaktu 100 sekund, czasem dysocjacji 720 sekund i natężeniem przepływu 50 mikrolitrów na minutę. Przeprowadzono charakterystykę kompleksu binarnego VHL MZ1 i kompleksu trójskładnikowego VHL MZ1 Brd4.

Zaobserwowano pozytywną kooperatywność. Charakterystyka układu cereblon, PROTAC i PPM1D została przeprowadzona przez SPR. Eksperymenty PPM1D wykorzystują niklowy chip NTA, a powierzchnia chipa jest regenerowana po każdym wstrzyknięciu związku.

BRD-2512, który wiąże się tylko z mózgiem, i BRD-4761, który wiąże się tylko z PPM1D, wykazują znikomą odpowiedź wiązania. BRD-5110 indukuje tworzenie trójskładnikowego kompleksu między PPM1D i wykazuje efekt haczyka przy wysokich stężeniach związku.