Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu
21 lipca 2023
To badanie opisuje szybką i skuteczną metodę analizy składników komórkowych skrzepów krwi w mózgu poprzez rozpuszczanie skrzepów, barwienie komórek i rutynowe badanie krwi.
Nasze badania koncentrują się głównie na zakrzepicy mózgu. Wiele badań wykazało, że składniki komórek zakrzepów krwi w mózgu korelują z diagnozą, leczeniem i rokowaniem zakrzepicy mózgu. W tym badaniu opracowaliśmy nową metodę analizy składników komórkowych zakrzepów krwi mózgowej.
Wyzwaniem w analizie składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu jest uwolnienie nienaruszonych komórek ze skrzepów. Dzieje się tak, ponieważ usieciowana fibryna szczelnie owija komórki krwi w skrzepie. Obecne podejścia do badania składników komórkowych skrzepów opierają się na barwieniu in-situ, które nie nadaje się do kompleksowego badania składników komórkowych.
Wręcz przeciwnie, nasza metoda umożliwia zarówno ilościową, jak i jakościową analizę składników komórek zakrzepu krwi w mózgu. Nasza metoda wykorzystuje enzym fibrynolityczny do degradacji fibryny w skrzepach krwi, uwalniając nienaruszone komórki. Dane uzyskane z analizy składników komórkowych ułatwią badanie mechanizmów zakrzepicy mózgowej na poziomie molekularnym.
Nasz zespół będzie nadal koncentrował się na badaniu fibrynolizy i układu krzepnięcia. Na początek umieść zebrane próbki skrzepów krwi mózgowej na czystym naczyniu za pomocą pęsety. Następnie za pomocą pipety dodaj do niej pięć mililitrów soli fizjologicznej i delikatnie potrząśnij naczyniem.
Usuń sól fizjologiczną za pomocą pipety. Za pomocą nożyczek posiekaj skrzepy na małe kawałki. Ponownie dodaj pięć mililitrów soli fizjologicznej do skrzepów i delikatnie potrząśnij naczyniem przed zassaniem soli fizjologicznej pipetą.
Następnie za pomocą pęsety przenieś kawałki skrzepów na nową, czystą płytkę w kształcie litery U. Przygotuj roztwór roboczy sFE, dostosowując stężenie sFE do 2000 jednostek na mililitr za pomocą soli fizjologicznej. Dodać 300 mikrolitrów roztworu roboczego sFE do wstępnie poddanych obróbce skrzepów.
Aby zainicjować pierwszą rundę degradacji, inkubuj mieszaninę sFE i skrzepów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pół godziny. Następnie delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać próbkę poddaną działaniu sFE i za pomocą czystej pipety przenieś płynną porcję do sterylnej probówki. Odłóż pozostały skrzep na kolejną rundę degradacji.
Odwirować zebraną ciecz w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie za pomocą pipety przenieś supernatant lub odzyskany roztwór sFE do innej czystej probówki. Zawiesić powstałe w ten sposób osady komórkowe w 50 mikrolitrach soli fizjologicznej, delikatnie mieszając.
Następnie należy przeprowadzić kolejne rundy degradacji pozostałych skrzepów przy użyciu odzyskanego roztworu SFE, jak pokazano wcześniej. Zebrać mieszaninę komórek z każdej rundy degradacji, aby przygotować próbkę krwi. Dodać pięć mikrolitrów otrzymanej próbki komórek do szkiełka podstawowego pokrytego poli-L-lizyną i za pomocą szkiełka nakrywkowego rozsmarować komórki.
Pozwól płynowi odparować w temperaturze pokojowej. Aby wykonać barwienie komórek, delikatnie dodaj 100 mikrolitrów barwnika Wrighta do rozmazu komórkowego. Pozostaw komórki do barwienia przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie spłucz barwnik czystą wodą.
Na koniec zbadaj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu świetlnego. We wczesnym stadium degradacji zaobserwowano zwarte czerwone skrzepy krwi z bezbarwnym roztworem roboczym. Rozpuszczanie skrzepów obserwowano po 30-minutowej inkubacji, a przedłużona inkubacja trwająca do pięciu godzin rozpuściła większość skrzepów, podczas gdy w negatywnej grupie kontrolnej nie było znaczącej zmiany, nawet po 10-godzinnej inkubacji.
Po barwieniu Wrighta, dojrzałe czerwone krwinki, płytki krwi i różne granulocyty były wyraźnie identyfikowalne pod mikroskopem świetlnym. Składniki komórek mogą być z powodzeniem analizowane ilościowo za pomocą automatycznej hematologii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje szybką i skuteczną metodę analizy składników komórkowych skrzepów krwi mózgowej poprzez rozpuszczanie skrzepu, barwienie komórek i rutynowe badanie krwi. Metoda ta rozwiązuje problem uwalniania nienaruszonych komórek z gęsto splecionej fibryny w skrzepach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Hematologia
- Badania nad zakrzepicą
Wstęp
- Zakrzepica mózgu jest poważnym stanem medycznym.
- Komponenty komórkowe zakrzepów krwi w mózgu mają kluczowe znaczenie dla diagnostyki i leczenia.
- Obecne metody analizy tych komponentów są ograniczone.
- Barwienie in situ nie jest kompleksowe w badaniach nad komponentami komórkowymi.
Cel badania
- Opracowanie nowej metody analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu.
- Poprawa zrozumienia mechanizmów zakrzepicy mózgowej.
- Udoskonalenie strategii diagnostycznych i terapeutycznych dla pacjentów.
Zastosowane metody
- Techniki rozpuszczania skrzepów.
- Procedury barwienia komórek.
- Metody rutynowego badania krwi.
- Analiza uwolnionych nienaruszonych komórek.
Główne wyniki
- Nowa metoda pozwala na skuteczne wydzielenie nienaruszonych komórek z zakrzepów.
- Analiza składników komórkowych dostarcza cennych informacji na temat zakrzepicy mózgowej.
- Wyniki wykazują poprawę możliwości diagnostycznych.
- Metoda wykazuje potencjał do szerszego zastosowania w hematologii.
Wnioski
- Ustanowiona metoda stanowi znaczący postęp w analizie zakrzepów krwi w mózgu.
- Może ona pogłębić zrozumienie zakrzepicy oraz jej następstw.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zastosowanie tej metody w różnych celach klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa i jakościowa analiza składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów oraz stratyfikacji ryzyka w badaniach nad chorobami naczyniowo-mózgowymi. Metoda ta umożliwia odzyskanie nienaruszonych komórek z zakrzepów, co pozwala pokonać ograniczenia barwienia in situ i wspiera wysoką wiarygodność walidacji celów w biologii zakrzepicy. Podejście to zwiększa wartość predykcyjną wczesnego wykrywania oraz procesów badawczych i translacyjnych skoncentrowanych na zakrzepicy i patologiach naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę składu komórkowego zakrzepów mózgowych w celu mechanistycznego ograniczania ryzyka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez uwalnianie nienaruszonych komórek krwi do dalszych analiz.
- Ułatwia wyjaśnienie szlaków w biologii zakrzepicy dzięki kompleksowemu profilowaniu komórkowemu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki komórek do analiz ilościowych i jakościowych.
- Poprawia powtarzalność analizy poprzez standaryzację uwalniania komórek ze złożonych skrzepów.
- Umożliwia wiarygodną ocenę czynników rozpuszczających skrzepy oraz odpowiedzi komórkowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie analizy komórkowej do modeli zakrzepicy mózgu istotnych w kontekście danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki zastosowaniu wiarygodnych odczytów w układach komórkowych.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy działania, co pozwala na podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w portfolio chorób naczyniowych w oparciu o ocenę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając odzyskanie nienaruszonych komórek do testowania hipotez, opracowywania testów oraz prowadzenia badań translacyjnych w zakresie zakrzepicy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie analizy molekularnej i komórkowej składników skrzepu.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników komórkowych w celu standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia mierzalne liczby i typy komórek do analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia na poziomie komórkowym z modelami chorób, wspierając dopasowanie biomarkerów i ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat postępowania dla analizy składników komórkowych w różnych kontekstach badań nad zakrzepicą.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad zakrzepicą.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i analizę komórek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w programach dotyczących chorób naczyniowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów związanych z zakrzepicą.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obchodzenia się ze skrzepami, trawienia enzymatycznego i analizy komórkowej.
- Wymagany jest dostęp do enzymów fibrynolitycznych, wirówek oraz infrastruktury mikroskopowej.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności odzyskiwania i barwienia komórek.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych typów skrzepów lub systemów modelowych.
- Wydajność i integralność komórek zależą od składu skrzepu oraz efektywności enzymu.
