Name: Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj nową metodę analizy składników komórkowych zakrzepów mózgowych poprzez rozpuszczanie fibryny enzymem sFE. Technika umożliwia uwolnienie nienaruszonych komórek do badań ilościowych i jakościowych, poprawiając diagnostykę zakrzepicy mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Biuro Nauki i Technologii miasta Xiamen (3502Z20227197) oraz Biuro Nauki i Technologii prowincji Fujian (nr 2019J01070, No.2021Y0027).

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Komisji Etyki Medycznej Uniwersytetu Huaqiao. Skrzepy krwi mózgowej zostały chirurgicznie usunięte i pobrane w Pierwszym Szpitalu Quanzhou, powiązanym z Uniwersytetem Medycznym Fujian, za świadomą zgodą pacjentów.
1. Wstępne leczenie zakrzepów krwi
<ol>
	<li>Umieść skrzepy na czystym naczyniu, dodaj pęsetą 5 ml soli fizjologicznej, delikatnie potrząśnij naczyniem i usuń sól fizjologiczną pipetą. 
	UWAGA: Powtórz płukanie trzy razy.</li>
	<li>Pokrój skrzepy na mniejsze kawałki (mniejsze niż 5 mm x 5 mm x 5 mm) nożyczkami. Dodać 5 ml soli fizjologicznej, delikatnie wstrząsnąć naczyniem i usunąć sól fizjologiczną pipetą. 
	UWAGA: Powtórz płukanie trzy razy. Upewnij się, że podczas płukania nie są zasysane żadne kawałki skrzepu.</li>
	<li>Przenieś skrzepy na inną czystą płytkę U. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu (przechowywać płytkę w temperaturze 2-8 °C) i ponownie uruchomić później.</li>
</ol>
2. Tromboliza
<ol>
	<li>Przygotować roztwór roboczy sFE, dostosowując stężenie sFE do 2000 U/ml za pomocą soli fizjologicznej. 
	UWAGA: sFE został przygotowany zgodnie z dobrze znanymi protokołami Tang Lab15.</li>
	<li>Dodać 300 μl roztworu roboczego sFE do wstępnie potraktowanych skrzepów.</li>
	<li>Wykonaj pierwszą rundę degradacji.
	<ol>
		<li>Inkubować mieszaninę sFE i skrzepów w temperaturze 37 °C przez 0,5 h. 
		UWAGA: Blot potraktowany solą fizjologiczną ustawiono jako kontrolę ujemną. Nie obracaj sample na wytrząsarce.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać próbkę. Przenieś płynną część do innej czystej probówki za pomocą czystej pipety. 
		UWAGA: Pozostałe skrzepy zostały wykorzystane do kolejnej rundy degradacji.</li>
		<li>Odwirować płynną część o stężeniu 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant do innej czystej probówki za pomocą pipety, aby uzyskać odzyskany roztwór sFE.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać wytrącanie się komórek z 50 μl soli fizjologicznej. 
		UWAGA: Mieszanina komórek była przechowywana w temperaturze 2-8 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj późniejszą degradację.
	<ol>
		<li>Skompletować pozostałe skrzepy (etap 2.3.2) odzyskanym roztworem sFE (etap 2.3.4) w temperaturze 37 °C przez 0,5 h. 
		UWAGA: Pozostałe kroki były takie same jak w pierwszej rundzie degradacji. Proces degradacji był zakończony aż do degradacji całych skrzepów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj zbieranie komórek.
	<ol>
		<li>Przygotuj próbkę krwinek, zbierając mieszaninę komórek z każdej rundy degradacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie Wrighta
<ol>
	<li>Wykonaj rozmaz komórek.
	<ol>
		<li>Dostosuj komórki do gęstości 1 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dodać 5 μl komórek do szkiełka podstawowego pokrytego poli-lizyną, a następnie rozsmarować je za pomocą szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Odparować ciecz w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie.
	<ol>
		<li>Dodaj 200 μl barwnika Wrighta (patrz tabela materiałów) do delikatnie rozmazu komórek i dodaj 600 μl barwnika B Wrighta, aby równomiernie wymieszać. Plamić przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Delikatnie spłucz barwnik czystą wodą. 
		UWAGA: Wybarwiony rozmaz komórkowy można przechowywać w temperaturze pokojowej do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie mikroskopowe.
	<ol>
		<li>Zbadaj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu świetlnego (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Rutynowe badanie krwi
<ol>
	<li>Dostosuj komórki do gęstości 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Analizuj składniki komórek, takie jak płytki krwi, erytrocyty, białe krwinki, limfocyty, neutrofile, monocyty, eozynofile, bazofile i niedojrzałe granulocyty za pomocą analizatora autohematologicznego zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

<ol><li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edoxaban+versus+dual+antiplatelet+therapy+for+leaflet+thrombosis+and+cerebral+thromboembolism+after+TAVR%3A+The+ADAPT-TAVR+Randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial.</a> Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).</li>
<li>Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+venous+sinus+thrombosis+incidence+is+higher+than+previously+thought%3A+a+retrospective+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study.</a> Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).</li>
<li>Sacco, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+definition+of+stroke+for+the+21st+century%3A+a+statement+for+healthcare+professionals+from+the+American+Heart+Association%2FAmerican+Stroke+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association.</a> Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).</li>
<li>Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+villains+and+targets+in+arterial%2C+venous%2C+and+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).</li>
<li>Mocsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+novel+functions+of+neutrophils+in+immunity%2C+inflammation%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).</li>
<li>Dhanesha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKM2+promotes+neutrophil+activation+and+cerebral+thromboinflammation%3A+therapeutic+implications+for+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke.</a> Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).</li>
<li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombus+neutrophil+extracellular+traps+content+impair+tpa-induced+thrombolysis+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li>
<li>Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+methodology+for+calculating+platelet+contribution+to+clot+strength+%28platelet+component%29+in+thromboelastometry+and+thrombelastography%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography.</a> Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).</li>
<li>Daraei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fiber+diameter+and+porosity+measurements+of+plasma+clots+in+scanning+electron+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images.</a> Biomolecules. 11 (10), 1536(2021).</li>
<li>Abbasi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+thrombus+composition+in+thrombectomy+stroke+patients+with+longer+time+to+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization.</a> Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).</li>
<li>C W Francis, a, Marder, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+clot+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concepts of clot lysis.</a> Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).</li>
<li>Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).</li>
<li>Fotso Fotso, A., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Diagnosis+of+tick-borne+african+relapsing+fevers%3A+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments.</a> Front Public Health. 3, 254(2015).</li>
<li>Liou, G. Y., Byrd, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioliquid+markers+for+pancreatic+cancer%3A+What+we+have+vs.+what+we+need%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need.</a> Cancers (Basel). 15 (9), 2446(2023).</li>
<li>Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+a+fibrinolytic+enzyme+from+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus.</a> Journal of Visualized Experiments. 196, e65631(2023).</li>
<li>Ge, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+Nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus.</a> International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+whole+cells+and+cell+debris+using+surface+plasmon+coupled+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission.</a> Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).</li>
<li>Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+prescribing+for+adults+in+ambulatory++care+in+the+USA%2C+2007-09%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

sFE jest środkiem fibrynolitycznym , który może bezpośrednio i skutecznie rozkładać fibrynę12,16. W tym przypadku sFE zastosowano do degradacji usieciowanej fibryny skrzepów krwi mózgowej, uwolnienia zamkniętych komórek w skrzepach i analizy składników komórkowych skrzepów jakościowo i ilościowo. Dane mikroskopowe i rutynowe badanie krwi wykazały, że zamknięte komórki zostały uwolnione ze skrzepów krwi. Co więcej, typy komórek i struktury uwolnionych komórek nie ...

Choroba naczyniowo-mózgowa jest jedną z trzech głównych chorób, które mogą zagrażać zdrowiu ludzkiemu, wśród których niedokrwienna choroba naczyniowa mózgu stanowi ponad 80%. Zakrzepica mózgu i zakrzepica żył mózgowych są obecnie najbardziej niepokojącymi chorobami niedokrwiennymi naczyń mózgowych, głównie spowodowanymi przez zakrzepy krwi mózgowej1,2. Jeśli leczenie nie zostanie przeprowadzone prawidłowo, będzie miało wysoki wskaźnik niepełnosprawności i śmiertelności oraz wysoki wskaźnik nawrotów po wypisie ze szpitala3.
Ostatnio, rosnąca liczba badań wykazała, że składniki komórkowe zakrzepów krwi w mózgu są ściśle skorelowane z diagnozą, leczeniem i rokowaniem zakrzepicy mózgu4,5,6. Dlatego dostępność danych dotyczących składu skrzepliny, zwłaszcza składników komórek, jest ważna dla diagnozy klinicznej i leczenia. Niestety, obecnie dostępne metody nie są w stanie kompleksowo przeanalizować składnika skrzepu krwi pod względem ilościowym i jakościowym. Na przykład, barwienie in situ oparte na Martius Scarlett Blue może badać tylko czerwono-białe krwinki niektórych wycinków skrzepu7. Barwienie in situ oparte na immunohistochemii (IHC) może badać tylko ograniczone składniki krwi niektórych wycinków skrzepu przy użyciu ich przeciwciał8. Metody mikroskopowe oparte na obrazach dotyczą tylko specyficznej struktury skrzepu9. Co więcej, wszystkie te metody są pracochłonne i czasochłonne10. Do tej pory nie opisano procedur ilościowego i jakościowego badania składników komórek skrzeplinowych mózgu. Powszechnie wiadomo, że usieciowana fibryna szczelnie owija komórki krwi w skrzepy11. W związku z tym specyficzna degradacja usieciowanej fibryny i uwolnienie nienaruszonych komórek ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy składników komórkowych.
Poprzednie prace wyizolowały enzym fibrynolitytyczny z Sipunculus nudus (sFE), który może szybko i specyficznie rozkładać fibrynę12. W tym artykule zaproponowano metodę analizy składników komórkowych skrzeplin mózgowych w oparciu o unikalną aktywność sFE. Protokół ten wykorzystywał sFE do degradacji fibryny skrzepów, a następnie analizował składniki komórek za pomocą barwienia Wrighta i rutynowego badania krwi13,14. Zgodnie z tą metodą składniki komórkowe skrzeplin mózgowych można badać ilościowo i jakościowo. Ten prosty i skuteczny protokół może być stosowany do analizy składników komórkowych innych skrzepów krwi.

<table><tbody><tr><td>Płytka reakcyjna aglutynacji ROTEST</td><td></td><td>RTB-4003</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny analizator hematologiczny</td><td>SYSMEX</td><td>XNB2</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny pionowy ciśnieniowy sterylizator parowy&nbsp;</td>Probówka wirówkowa <td>SANYO</td><td>MLS-3750</td><td></td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td><td>Biosharp</td><td>BS-15-M</td><td></td></tr><tr><td>Czysta ławka</td><td>Inkubator stałotemperaturowy AIRTECH</td><td>BLB-1600</td><td></td></tr> Naczynie <tr><td>hodowlane</td><td>JINGHONG</td><td>JHS-400</td><td></td></tr><tr><td>(100 mm)</td><td></td>Piec grzewczo-suszący <td>serii NEST</td> 704001 <td></td></tr><tr><td>DHG&nbsp;</td>Elektroniczna waga analityczna <td>SENXIN</td><td>DGG-9140AD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DENVER</td><td>TP-213</td><td></td></tr><tr><td>Membrana filtracyjna (0,22 &mikro; m)</td><td></td>Wirówka z mikrochłodzeniem <td>Millex GP SLGP033NK</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Szkiełka mikroskopowe <td>Cence</td><td>H1650-W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CITOGLAS</td><td>01-30253-50</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Referencyjne</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0CN</td><td></td></tr><tr><td>Normalna sól</td> fizjologiczna <td>CISEN</td><td>H37022337</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE E100</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Beyotime</td><td>C0221A Końcówka</td> do pipet (1 ml ) Axygene T-1000XT-C Końcówka <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> do pipet (200 &mikro;<td></td></tr><tr><td> L)</td> <td>Pipetor Axygene</td><td>T-200XT-C</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL) Pipetor</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ZY18723</td><td></td></tr><tr><td>(200 &mikro; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ZY20280</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>MARTOR</td><td>23111</td><td></td></tr><tr><td>Mały oscylator wirowy</td><td>Kylin-Bell</td><td>VORTEX KB3</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Hystic</td><td>HKQS-180</td><td></td></tr><tr><td>Wright Roztwór do barwienia</td><td>Beyotime</td><td>C0135-500ml</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

Zakrzepica mózgu, zakrzep krwi w tętnicy lub żyle mózgowej, jest najczęstszym rodzajem zawału mózgu. Badanie składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu jest ważne dla diagnozy, leczenia i rokowania. Jednak obecne podejścia do badania składników komórkowych skrzepów opierają się głównie na barwieniu in situ, które nie nadaje się do kompleksowego badania składników komórkowych, ponieważ komórki są ciasno owinięte w skrzepy. Wcześniejsze badania z powodzeniem wyizolowały enzym fibrynolitytyczny (sFE) z Sipunculus nudus, który może bezpośrednio degradować usieciowaną fibrynę, uwalniając składniki komórkowe. W badaniu tym opracowano kompleksową metodę opartą na sFE do badania składników komórkowych skrzepliny mózgowej. Protokół ten obejmuje rozpuszczanie skrzepu, uwalnianie komórek, barwienie komórek i rutynowe badanie krwi. Zgodnie z tą metodą składniki komórek można badać ilościowo i jakościowo. Przedstawiono reprezentatywne wyniki eksperymentów przeprowadzonych przy użyciu tej metody.

W początkowej fazie procesu degradacji stwierdzono, że skrzepy krwi miały czerwoną, zwartą strukturę, a roztwór roboczy był bezbarwny. Po 30 min inkubacji roztwór roboczy przybrał jasnoczerwony kolor, co wskazywało na uwolnienie uwięzionych komórek krwi do roztworu roboczego. Większość skrzepów rozpuściła się po wydłużeniu czasu inkubacji do 5 h, a roztwór roboczy stał się jasnoczerwony. Przeciwnie, w grupie z fizjologicznym roztworem soli (NC) nie zaobserwowano istotnych zmian nawet po 10 h inkubacji (<strong class="xfi...

To badanie opisuje szybką i skuteczną metodę analizy składników komórkowych skrzepów krwi w mózgu poprzez rozpuszczanie skrzepów, barwienie komórek i rutynowe badanie krwi.

Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...

Nasze badania koncentrują się głównie na zakrzepicy mózgu. Wiele badań wykazało, że składniki komórek zakrzepów krwi w mózgu korelują z diagnozą, leczeniem i rokowaniem zakrzepicy mózgu. W tym badaniu opracowaliśmy nową metodę analizy składników komórkowych zakrzepów krwi mózgowej.Wyzwaniem w analizie składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu jest uwolnienie nienaruszonych komórek ze skrzepów. Dzieje się tak, ponieważ usieciowana fibryna szczelnie owija komórki krwi w skrzepie. Obecne podejścia do badania składników komórkowych skrzepów opierają się na barwieniu in-situ, które nie nadaje się do kompleksowego badania składników komórkowych.Wręcz przeciwnie, nasza metoda umożliwia zarówno ilościową, jak i jakościową analizę składników komórek zakrzepu krwi w mózgu. Nasza metoda wykorzystuje enzym fibrynolityczny do degradacji fibryny w skrzepach krwi, uwalniając nienaruszone komórki. Dane uzyskane z analizy składników komórkowych ułatwią badanie mechanizmów zakrzepicy mózgowej na poziomie molekularnym.Nasz zespół będzie nadal koncentrował się na badaniu fibrynolizy i układu krzepnięcia. Na początek umieść zebrane próbki skrzepów krwi mózgowej na czystym naczyniu za pomocą pęsety. Następnie za pomocą pipety dodaj do niej pięć mililitrów soli fizjologicznej i delikatnie potrząśnij naczyniem.Usuń sól fizjologiczną za pomocą pipety. Za pomocą nożyczek posiekaj skrzepy na małe kawałki. Ponownie dodaj pięć mililitrów soli fizjologicznej do skrzepów i delikatnie potrząśnij naczyniem przed zassaniem soli fizjologicznej pipetą.Następnie za pomocą pęsety przenieś kawałki skrzepów na nową, czystą płytkę w kształcie litery U. Przygotuj roztwór roboczy sFE, dostosowując stężenie sFE do 2000 jednostek na mililitr za pomocą soli fizjologicznej. Dodać 300 mikrolitrów roztworu roboczego sFE do wstępnie poddanych obróbce skrzepów.Aby zainicjować pierwszą rundę degradacji, inkubuj mieszaninę sFE i skrzepów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pół godziny. Następnie delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać próbkę poddaną działaniu sFE i za pomocą czystej pipety przenieś płynną porcję do sterylnej probówki. Odłóż pozostały skrzep na kolejną rundę degradacji.Odwirować zebraną ciecz w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie za pomocą pipety przenieś supernatant lub odzyskany roztwór sFE do innej czystej probówki. Zawiesić powstałe w ten sposób osady komórkowe w 50 mikrolitrach soli fizjologicznej, delikatnie mieszając.Następnie należy przeprowadzić kolejne rundy degradacji pozostałych skrzepów przy użyciu odzyskanego roztworu SFE, jak pokazano wcześniej. Zebrać mieszaninę komórek z każdej rundy degradacji, aby przygotować próbkę krwi. Dodać pięć mikrolitrów otrzymanej próbki komórek do szkiełka podstawowego pokrytego poli-L-lizyną i za pomocą szkiełka nakrywkowego rozsmarować komórki.Pozwól płynowi odparować w temperaturze pokojowej. Aby wykonać barwienie komórek, delikatnie dodaj 100 mikrolitrów barwnika Wrighta do rozmazu komórkowego. Pozostaw komórki do barwienia przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie spłucz barwnik czystą wodą.Na koniec zbadaj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu świetlnego. We wczesnym stadium degradacji zaobserwowano zwarte czerwone skrzepy krwi z bezbarwnym roztworem roboczym. Rozpuszczanie skrzepów obserwowano po 30-minutowej inkubacji, a przedłużona inkubacja trwająca do pięciu godzin rozpuściła większość skrzepów, podczas gdy w negatywnej grupie kontrolnej nie było znaczącej zmiany, nawet po 10-godzinnej inkubacji.Po barwieniu Wrighta, dojrzałe czerwone krwinki, płytki krwi i różne granulocyty były wyraźnie identyfikowalne pod mikroskopem świetlnym. Składniki komórek mogą być z powodzeniem analizowane ilościowo za pomocą automatycznej hematologii.

a-comprehensive-approach-to-analyze-cell-components-cerebral-blood

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło: Kim, D., et. al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji zakrzepowej choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wizualizację skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Mysi model zakrzepliny mózgowej jest wstrzykiwany z nanocząstkami złota ukierunkowanymi na fibrynę, działającymi jako środek kontrastujący. Mysz jest...

Wizualizacja skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Celem tego artykułu jest przedstawienie metody, która pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję drzewa naczyniowo-mózgowego u myszy po mikrotomografii komputerowej i określeniu objętości całych segmentów naczynia, które mogą być użyte do ilościowego określenia skurczu naczyń mózgowych w mysich modelach krwotoku podpajęczynówkowego.

Wolumetryczna metoda ilościowego oznaczania skurczu naczyń mózgowych w mysim modelu krwotoku podpajęczynówkowego

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje nowatorską technikę pomiaru trzech najważniejszych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu na tym samym zestawie próbek mózgu gryzoni. Wykorzystanie tylko jednej próbki mózgu jest bardzo korzystne pod względem kosztów etycznych i ekonomicznych.

Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

Ten protokół przedstawia metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi na łagodne urazowe uszkodzenie mózgu oraz integracji tych danych jako części wielowymiarowej analizy systemów przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów.

Analiza systemowa odpowiedzi neurozapalnej i hemodynamicznej na urazowe uszkodzenie mózgu

Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.

Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych

Tradycyjne modele udaru fotozakrzepowego (PTS) głównie indukują gęste agregaty płytek krwi o wysokiej odporności na tkankowe leczenie aktywatorem plazminogenu (tPA)-litycznym. Tutaj zmodyfikowany mysi model PTS jest wprowadzany przez jednoczesne wstrzykiwanie trombiny i barwnika światłoczułego w celu fotoaktywacji. Model PTS wzmocniony trombiną wytwarza mieszane skrzepy płytkowo-fibrynowe i jest bardzo wrażliwy na trombolizę tPA.

Wzbogacony fibryną i wrażliwy na tPA model udaru fototrombotycznego

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj nową metodę analizy składników komórkowych zakrzepów mózgowych poprzez rozpuszczanie fibryny enzymem sFE. Technika umożliwia uwolnienie nienaruszonych komórek do badań ilościowych i jakościowych, poprawiając diagnostykę zakrzepicy mózgowej.

Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu

Przeglądaj więcej filmów