Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu

Nasze badania koncentrują się głównie na zakrzepicy mózgu. Wiele badań wykazało, że składniki komórek zakrzepów krwi w mózgu korelują z diagnozą, leczeniem i rokowaniem zakrzepicy mózgu. W tym badaniu opracowaliśmy nową metodę analizy składników komórkowych zakrzepów krwi mózgowej.

Wyzwaniem w analizie składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu jest uwolnienie nienaruszonych komórek ze skrzepów. Dzieje się tak, ponieważ usieciowana fibryna szczelnie owija komórki krwi w skrzepie. Obecne podejścia do badania składników komórkowych skrzepów opierają się na barwieniu in-situ, które nie nadaje się do kompleksowego badania składników komórkowych.

Wręcz przeciwnie, nasza metoda umożliwia zarówno ilościową, jak i jakościową analizę składników komórek zakrzepu krwi w mózgu. Nasza metoda wykorzystuje enzym fibrynolityczny do degradacji fibryny w skrzepach krwi, uwalniając nienaruszone komórki. Dane uzyskane z analizy składników komórkowych ułatwią badanie mechanizmów zakrzepicy mózgowej na poziomie molekularnym.

Nasz zespół będzie nadal koncentrował się na badaniu fibrynolizy i układu krzepnięcia. Na początek umieść zebrane próbki skrzepów krwi mózgowej na czystym naczyniu za pomocą pęsety. Następnie za pomocą pipety dodaj do niej pięć mililitrów soli fizjologicznej i delikatnie potrząśnij naczyniem.

Usuń sól fizjologiczną za pomocą pipety. Za pomocą nożyczek posiekaj skrzepy na małe kawałki. Ponownie dodaj pięć mililitrów soli fizjologicznej do skrzepów i delikatnie potrząśnij naczyniem przed zassaniem soli fizjologicznej pipetą.

Następnie za pomocą pęsety przenieś kawałki skrzepów na nową, czystą płytkę w kształcie litery U. Przygotuj roztwór roboczy sFE, dostosowując stężenie sFE do 2000 jednostek na mililitr za pomocą soli fizjologicznej. Dodać 300 mikrolitrów roztworu roboczego sFE do wstępnie poddanych obróbce skrzepów.

Aby zainicjować pierwszą rundę degradacji, inkubuj mieszaninę sFE i skrzepów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pół godziny. Następnie delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać próbkę poddaną działaniu sFE i za pomocą czystej pipety przenieś płynną porcję do sterylnej probówki. Odłóż pozostały skrzep na kolejną rundę degradacji.

Odwirować zebraną ciecz w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie za pomocą pipety przenieś supernatant lub odzyskany roztwór sFE do innej czystej probówki. Zawiesić powstałe w ten sposób osady komórkowe w 50 mikrolitrach soli fizjologicznej, delikatnie mieszając.

Następnie należy przeprowadzić kolejne rundy degradacji pozostałych skrzepów przy użyciu odzyskanego roztworu SFE, jak pokazano wcześniej. Zebrać mieszaninę komórek z każdej rundy degradacji, aby przygotować próbkę krwi. Dodać pięć mikrolitrów otrzymanej próbki komórek do szkiełka podstawowego pokrytego poli-L-lizyną i za pomocą szkiełka nakrywkowego rozsmarować komórki.

Pozwól płynowi odparować w temperaturze pokojowej. Aby wykonać barwienie komórek, delikatnie dodaj 100 mikrolitrów barwnika Wrighta do rozmazu komórkowego. Pozostaw komórki do barwienia przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie spłucz barwnik czystą wodą.

Na koniec zbadaj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu świetlnego. We wczesnym stadium degradacji zaobserwowano zwarte czerwone skrzepy krwi z bezbarwnym roztworem roboczym. Rozpuszczanie skrzepów obserwowano po 30-minutowej inkubacji, a przedłużona inkubacja trwająca do pięciu godzin rozpuściła większość skrzepów, podczas gdy w negatywnej grupie kontrolnej nie było znaczącej zmiany, nawet po 10-godzinnej inkubacji.

Po barwieniu Wrighta, dojrzałe czerwone krwinki, płytki krwi i różne granulocyty były wyraźnie identyfikowalne pod mikroskopem świetlnym. Składniki komórek mogą być z powodzeniem analizowane ilościowo za pomocą automatycznej hematologii.