Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo
17 listopada 2023
Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.
Moje badania zagłębiają się w rolę układu odpornościowego w regeneracji i naprawie. Skupiam się na zrozumieniu, w jaki sposób makrofagi oddziałują z nabłonkowymi komórkami prezenterowymi podczas uszkodzenia napromieniającego gruczołów ślinowych i jak ta interakcja kształtuje proces naprawy. W dziedzinie immunologii i medycyny regeneracyjnej, ostatnie badania kliniczne przeprowadzone na Uniwersytecie w Edynburgu wykazały, że dostarczanie makrofagów jako terapii marskości wątroby jest skuteczne w zmniejszaniu bliznowacenia wątroby i jest realnym sposobem leczenia niewydolności wątroby.
Wykorzystanie modelu hodowli ex-vivo z precyzyjnymi cięciami plastrów w połączeniu z obrazowaniem na żywo komórek znakowanych fluorescencyjnie pozwala nam badać interakcje między komórkami w czasie rzeczywistym, ale w stanie, który bardzo przypomina tkankę in vivo. Zrozumienie lokalizacji makrofagów po urazie daje nam wyobrażenie o tym, z jakimi typami komórek makrofagi preferencyjnie wchodzą w interakcje po urazie. To ostatecznie pozwala nam na wykorzystanie innych metod, takich jak analiza sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, aby spróbować rozwikłać molekularne podstawy takich interakcji w celu poinformowania o przyszłych opcjach terapeutycznych.
Zbadamy dwukierunkową sygnalizację między makrofagami a komórkami nabłonkowymi i sprawdzimy, czy homeostazę gruczołów ślinowych można uratować poprzez egzogenną wymianę tych brakujących sygnałów. Na początek użyj kleszczy, aby usunąć tłuszcz i tkankę łączną z wypreparowanego gruczołu ślinowego podżuchwowego myszy podeczytanej. Następnie umieść gruczoł w probówce zbiorczej z lodowatym roztworem HBSS.
Następnie za pomocą kleszczy pokrój gruczoł na jednocentymetrowe kwadratowe kawałki. Podgrzej 4% agarozę do 50 stopni Celsjusza i wlej roztwór do 35-milimetrowego naczynia. Wlej niewielką ilość roztworu agarozy do osobnego naczynia i dodaj do niego kawałki gruczołu.
Następnie zamieszaj kawałki w nadmiarze agarozy, aby ją pokryć. Następnie umieść cztery do sześciu kawałków gruczołu płasko w pierwszym naczyniu z agarozą. Umieść pokrywkę na naczyniu i przenieś ją do zamrażalnika, przykrywając talerz lodem do ostygnięcia i stężenia.
Aby podzielić kawałki gruczołu, najpierw użyj skalpela, aby ostrożnie przeciąć wokół bloku agarozy osadzonego w gruczole. Następnie nałóż kroplę super kleju na blok agarozy i przymocuj go do etapu wibratomu. Teraz napełnij komorę wibratomu lodowatym PBS zawierającym 1% streptomycyny penicyliny.
Za pomocą skalpela odetnij nadmiar agarozy i utwórz pięciomilimetrowe odstępy między każdym kawałkiem gruczołu. Dopasuj ostrze wibratomu do bloku agarozy i ustaw punkt początkowy i końcowy sekcji. Pokrój blok tkanki na odcinki o grubości 150 mikrometrów z niską prędkością i wysokimi wibracjami.
Po pocięciu skrawków użyj pędzla, aby zebrać plastry i umieścić je w naczyniu ze wstępnie podgrzanym podłożem RPMI zawierającym antybiotyki. Aby wyhodować plastry podżuchwowe, najpierw dodaj 1,5 mililitra pożywki RPMI do dołków sześciodołkowej płytki. Umieść filtry 0,4 mikrometra w studzienkach.
Następnie za pomocą pędzla ostrożnie przenieś od jednego do sześciu plasterków na każdy filtr. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Po napromieniowaniu niektórych eksperymentalnych płytek promieniowaniem gamma w celu wywołania uszkodzenia, należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.
Następnie napełnij dołki 24-dołkowej płytki 500 mikrolitrami pożywki hodowlanej. Za pomocą pędzla wyjmij plastry z filtra i delikatnie zanurz je w studzienkach. Inkubować plastry w odpowiednich plamach jądrowych.
Następnie inkubuj plastry z przeciwciałami przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem. Zanurz plastry w pożywce hodowlanej trzy razy, aby je umyć. Pozwól plastrom inkubować w każdym roztworze do mycia przez 10 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.
Następnie za pomocą kleszczyków usuń taśmę z dwustronnego przekładki do obrazowania. Przyklej przekładkę do dna sześciodołkowej płytki ze szklanym dnem. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów pożywki w szczelinę pośrodku przekładki.
Umieść plasterek na podłożu, upewniając się, że leży płasko. Następnie za pomocą pipety ostrożnie usuń 20 mikrolitrów pożywki ze szczeliny. Za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń taśmę z górnej strony przekładki i umieść na niej 25-milimetrową okrągłą szkiełko zakrywające.
Dociśnij krawędzie podkładki dystansowej, aby zapewnić mocne zamocowanie szkiełka nakrywkowego. Zobrazuj wycinek pod mikroskopem konfokalnym. Nienapromieniowane wycinki gruczołu podżuchwowego hodowane przez siedem dni zachowały sygnał MT i architekturę nabłonka.
Jednak po trzech dniach od napromieniania zaobserwowano zanik zrazik i komórek przewodowych. Komórki kaspazo-dodatnie obserwowano cztery dni po napromienianiu. Podwyższony poziom gamma H2AX zaobserwowano w napromieniowanych wycinkach, co wskazuje na uszkodzenie DNA in vivo.
Obrazowanie makrofagów w czasie rzeczywistym potwierdziło fagocytozę komórek nabłonka w modelu hodowli plastrów. Poszczególne komórki mogą być wykrywane i segmentowane w celu późniejszej analizy zachowania komórek, takiej jak migracja.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę obrazowania na żywo z wykorzystaniem precyzyjnie wycinanych plastrów ślinianki podżuchwowej myszy, co umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym oddziaływań międzykomórkowych podczas procesów homeostazy i regeneracji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Medycyna regeneracyjna
- Biologia komórki
Wstęp
- Zrozumienie roli układu odpornościowego w naprawie tkanek jest kluczowe.
- Makrofagi wchodzą w interakcje z komórkami nabłonkowymi podczas urazu i regeneracji.
- Niedawne badania kliniczne badały terapię makrofagami w marskości wątroby.
- Techniki obrazowania na żywo mogą ujawnić dynamiczne interakcje komórkowe.
Cel badania
- Zbadanie interakcji makrofagów z komórkami nabłonkowymi po urazie.
- Zbadanie szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w homeostazę ślinianek.
- Wykorzystanie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek do analizy molekularnej interakcji.
Zastosowane metody
- Model hodowli precyzyjnie ciętych plastrów ślinianek podżuchwowych myszy.
- Obrazowanie na żywo komórek znakowanych fluorescencyjnie.
- Promieniowanie gamma w celu wywołania uszkodzeń w hodowanych plastrach.
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania zachowania komórek.
Główne wyniki
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym potwierdziło fagocytozę komórek nabłonkowych przez makrofagi.
- Po napromieniowaniu zaobserwowano atrofię komórek oraz uszkodzenia DNA.
- Lokalizacja makrofagów dostarczyła informacji na temat ich oddziaływań.
- Zachowanie poszczególnych komórek przeanalizowano za pomocą technik segmentacji.
Wnioski
- Badanie to pogłębia zrozumienie interakcji między makrofagami a nabłonkiem.
- Obrazowanie żywych komórek jest cennym narzędziem do badania procesów regeneracyjnych.
- Wyniki mogą być pomocne w opracowaniu przyszłych strategii terapeutycznych w zakresie naprawy tkanek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza interakcji międzykomórkowych w czasie rzeczywistym w tkance ślinianek pobranej ex vivo umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do szlaków regeneracyjnych oraz funkcji komórek odpornościowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych dla naprawy tkanek i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji w początkowej fazie rozwoju portfolio w obszarze immunologii i medycyny regeneracyjnej. Metoda ta łączy statyczne spostrzeżenia histologiczne z dynamicznymi, ilościowymi danymi, które mają kluczowe znaczenie dla badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację oddziaływań makrofagów z nabłonkiem po urazie w celu walidacji funkcjonalnych celów terapeutycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie roli komórek odpornościowych w regeneracji tkanek.
- Dostarcza ilościowych danych behawioralnych, co pozwala na zwiększenie pewności prognostycznej w odniesieniu do hipotez terapeutycznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowaną platformę tkankową ex vivo do powtarzalnych badań obrazowania na żywo.
- Ułatwia standaryzację odczytów zachowania komórek dla dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Generuje ilościowe parametry migracji i oddziaływań w celu rozwoju i optymalizacji testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki ex vivo z procesami regeneracyjnymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp badań poprzez powiązanie zachowania komórek z punktami końcowymi badań przedklinicznych.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów dzięki integracji z wynikami sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda obrazowania na żywo ex vivo integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając testowanie hipotez, walidację celów oraz badania translacyjne w zakresie regeneracji tkanek.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza danych w czasie rzeczywistym na temat sygnałów odpornościowo-nabłonkowych oraz wyjaśnia szlaki sygnałowe po urazie.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dla testów migracji i interakcji komórkowych.
- Analityka: Umożliwia segmentację i pomiar zachowań poszczególnych komórek w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy dynamiczne odpowiedzi komórkowe z przedklinicznymi wynikami regeneracyjnymi.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do badania różnorodnych interakcji międzykomórkowych w kontekście regeneracji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów regeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w obrazowaniu żywych komórek i wspiera skalowalny rozwój testów.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczanie praktycznych, ilościowych danych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów regeneracyjnych i immunomodulacyjnych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obrazowania żywych komórek oraz hodowli tkanek ex vivo.
- Wymagany jest dostęp do wysokoprzepustowej mikroskopii konfokalnej oraz infrastruktury do analizy obrazu.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów znakowania i obrazowania między zespołami.
- Możliżna może być konieczność adaptacji metody dla różnych typów tkanek lub modeli urazów.
- Przepustowość i skalowalność są ograniczone przez czas trwania obrazowania oraz stopień złożoności przygotowania tkanek.
