Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Moje badania zagłębiają się w rolę układu odpornościowego w regeneracji i naprawie. Skupiam się na zrozumieniu, w jaki sposób makrofagi oddziałują z nabłonkowymi komórkami prezenterowymi podczas uszkodzenia napromieniającego gruczołów ślinowych i jak ta interakcja kształtuje proces naprawy. W dziedzinie immunologii i medycyny regeneracyjnej, ostatnie badania kliniczne przeprowadzone na Uniwersytecie w Edynburgu wykazały, że dostarczanie makrofagów jako terapii marskości wątroby jest skuteczne w zmniejszaniu bliznowacenia wątroby i jest realnym sposobem leczenia niewydolności wątroby.

Wykorzystanie modelu hodowli ex-vivo z precyzyjnymi cięciami plastrów w połączeniu z obrazowaniem na żywo komórek znakowanych fluorescencyjnie pozwala nam badać interakcje między komórkami w czasie rzeczywistym, ale w stanie, który bardzo przypomina tkankę in vivo. Zrozumienie lokalizacji makrofagów po urazie daje nam wyobrażenie o tym, z jakimi typami komórek makrofagi preferencyjnie wchodzą w interakcje po urazie. To ostatecznie pozwala nam na wykorzystanie innych metod, takich jak analiza sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, aby spróbować rozwikłać molekularne podstawy takich interakcji w celu poinformowania o przyszłych opcjach terapeutycznych.

Zbadamy dwukierunkową sygnalizację między makrofagami a komórkami nabłonkowymi i sprawdzimy, czy homeostazę gruczołów ślinowych można uratować poprzez egzogenną wymianę tych brakujących sygnałów. Na początek użyj kleszczy, aby usunąć tłuszcz i tkankę łączną z wypreparowanego gruczołu ślinowego podżuchwowego myszy podeczytanej. Następnie umieść gruczoł w probówce zbiorczej z lodowatym roztworem HBSS.

Następnie za pomocą kleszczy pokrój gruczoł na jednocentymetrowe kwadratowe kawałki. Podgrzej 4% agarozę do 50 stopni Celsjusza i wlej roztwór do 35-milimetrowego naczynia. Wlej niewielką ilość roztworu agarozy do osobnego naczynia i dodaj do niego kawałki gruczołu.

Następnie zamieszaj kawałki w nadmiarze agarozy, aby ją pokryć. Następnie umieść cztery do sześciu kawałków gruczołu płasko w pierwszym naczyniu z agarozą. Umieść pokrywkę na naczyniu i przenieś ją do zamrażalnika, przykrywając talerz lodem do ostygnięcia i stężenia.

Aby podzielić kawałki gruczołu, najpierw użyj skalpela, aby ostrożnie przeciąć wokół bloku agarozy osadzonego w gruczole. Następnie nałóż kroplę super kleju na blok agarozy i przymocuj go do etapu wibratomu. Teraz napełnij komorę wibratomu lodowatym PBS zawierającym 1% streptomycyny penicyliny.

Za pomocą skalpela odetnij nadmiar agarozy i utwórz pięciomilimetrowe odstępy między każdym kawałkiem gruczołu. Dopasuj ostrze wibratomu do bloku agarozy i ustaw punkt początkowy i końcowy sekcji. Pokrój blok tkanki na odcinki o grubości 150 mikrometrów z niską prędkością i wysokimi wibracjami.

Po pocięciu skrawków użyj pędzla, aby zebrać plastry i umieścić je w naczyniu ze wstępnie podgrzanym podłożem RPMI zawierającym antybiotyki. Aby wyhodować plastry podżuchwowe, najpierw dodaj 1,5 mililitra pożywki RPMI do dołków sześciodołkowej płytki. Umieść filtry 0,4 mikrometra w studzienkach.

Następnie za pomocą pędzla ostrożnie przenieś od jednego do sześciu plasterków na każdy filtr. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Po napromieniowaniu niektórych eksperymentalnych płytek promieniowaniem gamma w celu wywołania uszkodzenia, należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.

Następnie napełnij dołki 24-dołkowej płytki 500 mikrolitrami pożywki hodowlanej. Za pomocą pędzla wyjmij plastry z filtra i delikatnie zanurz je w studzienkach. Inkubować plastry w odpowiednich plamach jądrowych.

Następnie inkubuj plastry z przeciwciałami przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem. Zanurz plastry w pożywce hodowlanej trzy razy, aby je umyć. Pozwól plastrom inkubować w każdym roztworze do mycia przez 10 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.

Następnie za pomocą kleszczyków usuń taśmę z dwustronnego przekładki do obrazowania. Przyklej przekładkę do dna sześciodołkowej płytki ze szklanym dnem. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów pożywki w szczelinę pośrodku przekładki.

Umieść plasterek na podłożu, upewniając się, że leży płasko. Następnie za pomocą pipety ostrożnie usuń 20 mikrolitrów pożywki ze szczeliny. Za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń taśmę z górnej strony przekładki i umieść na niej 25-milimetrową okrągłą szkiełko zakrywające.

Dociśnij krawędzie podkładki dystansowej, aby zapewnić mocne zamocowanie szkiełka nakrywkowego. Zobrazuj wycinek pod mikroskopem konfokalnym. Nienapromieniowane wycinki gruczołu podżuchwowego hodowane przez siedem dni zachowały sygnał MT i architekturę nabłonka.

Jednak po trzech dniach od napromieniania zaobserwowano zanik zrazik i komórek przewodowych. Komórki kaspazo-dodatnie obserwowano cztery dni po napromienianiu. Podwyższony poziom gamma H2AX zaobserwowano w napromieniowanych wycinkach, co wskazuje na uszkodzenie DNA in vivo.

Obrazowanie makrofagów w czasie rzeczywistym potwierdziło fagocytozę komórek nabłonka w modelu hodowli plastrów. Poszczególne komórki mogą być wykrywane i segmentowane w celu późniejszej analizy zachowania komórek, takiej jak migracja.