Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Nasza platforma tumo-on-a-chip została opracowana w celu fizjologicznego modelowania wzrostu unaczynionych mikroguzów u ludzi i pozwala nam odpowiedzieć zarówno na podstawowe, jak i translacyjne pytania badawcze, pytania, które koncentrują się na podstawowej biologii nowotworu, skuteczności leków, odpowiedzi guza, podstawowych procesach immunologicznych, potencjalnej interwencji immunoterapeutycznej i spersonalizowanych podejściach terapeutycznych. Skuteczne przełożenie odkryć przedklinicznych na skuteczne metody leczenia raka zależy od wiernego odtworzenia stanu chorobowego i systemów modelowych. Protokół ten określa ustanowienie unaczynionego mikroguza lub VMT w celu naśladowania mikrośrodowiska guza in vitro.

VMT wiernie odtwarza kluczowe aspekty ludzkiego nowotworu, uzyskując klinicznie istotne wyniki. Nasz model pozwala nam na prowadzenie fizjologicznie istotnych, translacyjnych badań nad rakiem u ludzi. W szczególności nasz protokół, w przeciwieństwie do innych modeli, obejmuje dynamiczne warunki przepływu, umożliwia integrację komórek odpornościowych i immunoterapię, a ponadto pozwala nam na włączenie podejść medycyny spersonalizowanej.

Wykorzystujemy model VMT, aby napędzać inicjatywy medycyny spersonalizowanej zarówno na arenie przedklinicznej, jak i klinicznej. Model ten pogłębia naszą wiedzę na temat czynników mikrośrodowiskowych w interakcjach komórka-komórka wpływających na oporność terapeutyczną i progresję nowotworu. Co więcej, VMT jest obiecujący, jeśli chodzi o odkrywanie spersonalizowanych metod leczenia dostosowanych do potrzeb pacjenta w celu poprawy opieki klinicznej.

Na początek umieść odczynnik do dysocjacji komórek HBSS EGM-2 i DMEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut. Trombinę i lamininę rozmrażać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a fibrynogen w temperaturze pokojowej. Dodaj 1,5 mikrolitra trombiny do probówki wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów.

Umieść wysterylizowane promieniami UV płytki o wysokiej przepustowości w eksykatorze na 30 minut, aby usunąć powietrze uwięzione w mikroprzepływach. Umieść kolbę T75 pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu, aby potwierdzić zbieżność komórek i wydajność transdukcji. Umyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami HBSS.

Następnie dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do kolby i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez jedną do dwóch minut. Delikatnie postukać w kolbę dłonią i obserwować pod mikroskopem, czy wszystkie komórki zostały podniesione. Umyj komórki dziewięcioma mililitrami odpowiedniego podłoża i zbierz zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Natychmiast usuń małą porcję i policz komórki. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiednim podłożu na lodzie.

Korzystając z podanego równania, oblicz liczbę potrzebnych komórek. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 10 do 6 komórek na mililitr i obliczyć potrzebną objętość komórek, korzystając z poniższego równania. Odwirować wymaganą objętość zawiesiny komórek, jak pokazano.

Następnie w obliczonej objętości fibrynogenu ponownie zawieś osad na lodzie. Na początek umieść wysterylizowane promieniami UV płytki o wysokiej przepustowości i porcje trombiny w kapturze do hodowli tkankowych. Umieść przygotowaną mieszankę fibryny komórkowej na lodzie, aby spowolnić krzepnięcie.

Za pomocą pipety P20 pobrać sześć mikrolitrów mieszanki fibryny komórkowej. Następnie delikatnie umieścić końcówkę pipety w podwielokrotności trombiny i dwukrotnie wymieszać bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Podnieś płytkę o dużej przepustowości pod kątem i szybko włóż końcówkę pipety do jednego z otworów ładowania. Płynnym i płynnym ruchem przesunąć tłok pipety do pierwszego oporu i wstrzyknąć mieszaninę fibryny komórkowej do komory tkankowej. Upewnij się, że żel przechodzi całkowicie przez komorę.

Delikatnie ułóż płytkę płasko, nie zdejmując końcówki pipety ani nie przesuwając pipety. Wyjmij końcówkę pipety ręką z P20 i pozostaw ją w otworze portu ładowania. Po dwóch minutach delikatnie wyjmij końcówki pipet z otworów ładowania i umieść pokrywkę na płytce.

Inkubować płytkę przez 15 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu polimeryzacji żelu. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu, aby obserwować równomierne rozmieszczenie komórek w komorze bez pęcherzyków powietrza. Włóż końcówkę pipety P20 do M1 lub M3 i powoli wydal cztery mikrolitry lamininy, aby pokryć cały górny panel.

Zdjąć końcówkę pipety, jak pokazano wcześniej, i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 10 minut, Dodać 275 mikrolitrów kompletnej pożywki EGM-2 do niesprzężonych zbiorników studzienek znajdujących się w rzędach A i B. Włożyć końcówkę pipety P200 do otworu wlotowego pożywki w studzienkach zawierających 275 mikrolitrów EGM-2, i powoli wydalaj 75 mikrolitrów pożywki, obserwując, jak media przemieszczają się przez kanał i bulgoczą po drugiej stronie. Po wyjęciu końcówki pipety wepchnij pozostały materiał z końcówki do zbiornika na media. Dodać 50 mikrolitrów pożywki, aby całkowicie pokryć dolne studzienki boczne w rzędach G i H. Inkubować płytki przez jedną do dwóch godzin, jak pokazano.

Pod mikroskopem zidentyfikuj wszelkie pęcherzyki w kanałach medialnych i usuń je, ponownie wprowadzając 75 mikrolitrów pożywki do kanałów. Sprawdź gołym okiem wloty lub wyloty pożywki pod kątem pęcherzyków powietrza. Następnie włóż końcówkę pipety P200 do otworu i wyciągnij bańkę, podnosząc tłok.

W unaczynionych mikronarządach lub VMO komórki śródbłonka początkowo rozmieszczone równomiernie w komorze tkankowej, ale do 2 dnia zaczęły się rozciągać i świecić. Do 4 dnia komórki śródbłonka zespoliły się z zewnętrznymi kanałami mikroprzepływowymi, tworząc ciągłą sieć naczyniową. Funkcja ścisłej bariery naczyniowej została potwierdzona przez perfuzję FITC-dekstranu przez sieć mikronaczyniową przy minimalnym wycieku.

Perfuzja komórek nowotworowych MDA-MB-231 do BMO spowodowała ich przyleganie do błony śluzowej śródbłonka, a następnie wynaczynienie do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, tworząc liczne mikroprzerzuty w ciągu 24 godzin po perfuzji. Dzięki poklatkowemu obrazowaniu mikroskopowemu obserwowano wynaczynienie limfocytów T do przestrzeni zewnątrzkomórkowej VMO w ciągu 45 minut. W unaczynionych mikroguzach z w pełni uformowanymi naczyniami limfocyty T szybko przylegały do ściany naczynia po perfuzji.