Name: Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę tworzenia unaczynionego modelu mikroguza człowieka w mikrofluidycznym urządzeniu on-a-chip. Ta technika umożliwia badanie biologii nowotworów, skuteczności leków i interakcji immunologicznych w warunkach przepływowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium dr Christophera Hughesa za ich cenny wkład w opisane procedury, a także naszym współpracownikom z laboratorium dr Abrahama Lee za pomoc w projektowaniu i produkcji platformy. Prace te zostały wsparte przez następujące granty: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) oraz TL1 TR001415 i W81XWH2110393 (SJH).

Preparing a Microfluidics-Based Vascularized Human Micro-Tumor Model

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2023%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2023.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+tumor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Applications of tumor chip technology.</a> Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).</li>
<li>Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+niche+in+next+generation+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The vascular niche in next generation microphysiological systems.</a> Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+microfluidic+organ-chips+for+drug+screening%2C+disease+models+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).</li>
<li>Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+organoid-on-a-chip+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized organoid-on-a-chip models.</a> Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).</li>
<li>Del Piccolo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-on-chip+modeling+of+organ-specific+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis.</a> Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798(2021).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li>
<li>Sobrino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microtumors+in+vitro+supported+by+perfused+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks.</a> Sci Rep. 6, 31589(2016).</li>
<li>Phan, D. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vascularized+and+perfused+organ-on-a-chip+platform+for+large-scale+drug+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications.</a> Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).</li>
<li>Hachey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+vascularized+micro-tumor+model+of+human+colorectal+cancer+recapitulates+in+vivo+responses+to+standard-of-care+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy.</a> Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).</li>
<li>Hachey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Vascularized+Micro-Tumor+Model+of+Patient-Derived+Colorectal+Cancer+Recapitulates+Clinical+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease.</a> Transl Res. 255, 97-108 (2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+in+vitro+vascularized+micro-organ+and+micro-tumor+models+are+reproducible+organ-on-a-chip+platforms+for+studies+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs.</a> Toxicology. 445, 152601(2020).</li>
<li>Jahid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+Design+of+CDC42+Effector+Interaction+Inhibitors+for+the+Treatment+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer.</a> Cell Rep. 39 (4), 110760(2022).</li>
<li>Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+generating+large-scale+nearly+identical+human+microphysiological+vascularized+tissue+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays.</a> Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).</li>
<li>Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+perfused+human+capillary+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+-+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro perfused human capillary networks.</a> Tissue Eng - Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+on-chip+microfluidic+pressure+regulator+that+facilitates+reproducible+loading+of+cells+and+hydrogels+into+microphysiological+system+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms.</a> Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).</li>
<li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-on-a-chip%3A+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).</li>
<li>Kurokawa, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+three-dimensional+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems.</a> Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).</li>
<li>Romero-López, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+the+human+tumor+microenvironment%3A+Colon+tumor-derived+extracellular+matrix+promotes+angiogenesis+and+tumor+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth.</a> Biomaterials. 116, 118-129 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS one. 6 (11), e27385(2011).</li>
<li>Corliss, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REAVER%3A+A+program+for+improved+analysis+of+high-resolution+vascular+network+images%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images.</a> Microcirculation. 27 (5), e12618(2020).</li>
<li>Urban, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+for+drug+discovery+and+cancer+research%3A+Automated+analysis+of+vascularization+images%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FACM+Trans+Comput+Biol+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images.</a> IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).</li>
<li>COMSOL Multiphysics. , Stockholm, Sweden. www.comsol.com (2023).</li>
</ol>

CCWH posiada udziały w spółce Aracari Biosciences, Inc., która komercjalizuje wersję technologii opisanej w tym artykule. Warunki tego porozumienia zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w Irvine, zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów. Nie ma innych konfliktów interesów.

Prawie każda tkanka w organizmie otrzymuje składniki odżywcze i tlen poprzez układ naczyniowy, co czyni go krytycznym komponentem w realistycznym modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków in vitro. Co więcej, szereg nowotworów i stanów chorobowych definiuje dysfunkcja oraz nadmierna przepuszczalność śródbłonka naczyniowego3. W szczególności w przypadku nowotworów naczynia związane z guzem są często słabo ukrwione, przerwane i nieszczelne, przez co stanowią barierę dla dostarczani...

Rak pozostaje głównym problemem zdrowotnym na całym świecie i jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. Tylko w 2023 roku National Center for Health Statistics przewiduje ponad 1,9 miliona nowych przypadków raka i ponad 600 000 zgonów z powodu raka w USA1, podkreślając pilną potrzebę skutecznych metod leczenia. Jednak obecnie tylko 5,1% leków przeciwnowotworowych wchodzących w badania kliniczne ostatecznie uzyskuje aprobatę FDA. Niepowodzenie obiecujących kandydatów w pomyślnym przejściu przez badania kliniczne można częściowo przypisać zastosowaniu niefizjologicznych systemów modelowych, takich jak hodowle 2D i sferoidalne, podczas przedklinicznego opracowywania leków2. W tych klasycznych modelach nowotworowych brakuje istotnych składników mikrośrodowiska guza, takich jak nisza zrębowa, związane z nią komórki odpornościowe i perfundowane naczynia krwionośne, które są kluczowymi determinantami oporności terapeutycznej i progresji choroby. W związku z tym nowy system modelowy, który lepiej naśladuje ludzkie mikrośrodowisko guza in vivo, jest niezbędny do poprawy klinicznego przełożenia wyników przedklinicznych.
Dziedzina inżynierii tkankowej szybko się rozwija, dostarczając ulepszonych metod badania chorób ludzkich w warunkach laboratoryjnych. Jednym ze znaczących osiągnięć jest pojawienie się systemów mikrofizjologicznych (MPS), znanych również jako chipy narządowe lub chipy tkankowe, które są funkcjonalnymi, zminiaturyzowanymi ludzkimi narządami zdolnymi do replikacji zdrowych lub chorych warunków3,4,5. W tym kontekście, chipy nowotworowe, które są trójwymiarowymi, opartymi na mikroprzepływach modelami ludzkich nowotworów in vitro, zostały opracowane do badań onkologicznych2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Te zaawansowane modele uwzględniają sygnały biochemiczne i biofizyczne w dynamicznym mikrośrodowisku guza, umożliwiając naukowcom badanie zachowania guza i reakcji na leczenie w bardziej fizjologicznie odpowiednim kontekście. Jednak pomimo tych postępów, niewiele grup z powodzeniem wprowadziło żywy, funkcjonalny układ naczyniowy, szczególnie taki, który sam tworzy wzorce w odpowiedzi na przepływ fizjologiczny3,4,5,6. Włączenie funkcjonalnej sieci naczyniowej ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozwala na modelowanie barier fizycznych, które wpływają na dostarczanie leków lub komórek, naprowadzanie komórek do różnych mikrośrodowisk oraz transśródbłonkową migrację komórek nowotworowych, zrębowych i odpornościowych. Dzięki włączeniu tej funkcji, chip nowotworowy może lepiej reprezentować złożoność obserwowaną w mikrośrodowisku guza in vivo.
Aby zaspokoić tę niezaspokojoną potrzebę, opracowaliśmy nowatorską platformę do badań przesiewowych leków, która umożliwia tworzenie sieci mikronaczyń w urządzeniu mikroprzepływowym8,9,10,11,12,13,14,15, 16. Ta podstawowa platforma chipów narządowych, określana jako unaczyniony mikronarząd (VMO), może być dostosowana do praktycznie każdego układu narządów w celu odtworzenia oryginalnej fizjologii tkanek do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i zastosowań medycyny spersonalizowanej. VMO są ustanawiane przez wspólną hodowlę komórek śródbłonka tworzących kolonie śródbłonka pochodzących z komórek (ECFC-EC), HUVEC lub iPSC-EC (zwanych dalej EC) oraz wielu komórek zrębu w komorze, w tym normalnych ludzkich fibroblastów płuc (NHLF), które przebudowują macierz, oraz perycytów, które owijają i stabilizują naczynia. VMO można również ustanowić jako system modelowy raka poprzez kokulturację komórek nowotworowych wraz z powiązanym zrębem w celu utworzenia unaczynionego mikroguza (VMT)8,9,10,11,12,13, lub model chipa nowotworowego. Poprzez kohodowlę wielu typów komórek w dynamicznym środowisku przepływu, perfundowane sieci mikronaczyniowe tworzą się de novo w komorach tkankowych urządzenia, gdzie waskulogeneza jest ściśle regulowana przez natężenia przepływu śródmiąższowego14,15. Pożywka jest napędzana przez kanały mikroprzepływowe urządzenia przez hydrostatyczną głowicę ciśnieniową, która zaopatruje otaczające komórki komory tkankowej w składniki odżywcze wyłącznie przez mikronaczynia, o współczynniku przepuszczalności 1,2 x 10-7 cm/s, podobnym do tego, jaki obserwuje się dla naczyń włosowatych in vivo8.
Włączenie samoorganizujących się mikronaczyń do modelu VMT stanowi znaczący przełom, ponieważ: 1) naśladuje strukturę i funkcję unaczynionych mas guza in vivo; 2) potrafi modelować kluczowe etapy przerzutów, w tym interakcje guz-śródbłonek i komórki zrębu; 3) ustanawia fizjologicznie selektywne bariery dla dostarczania składników odżywczych i leków, poprawiając farmaceutyczne badania przesiewowe; oraz 4) umożliwia bezpośrednią ocenę leków o właściwościach antyangiogennych i przeciwprzerzutowych. Odtwarzając dostarczanie in vivo składników odżywczych, leków i komórek odpornościowych w złożonym mikrośrodowisku 3D, platforma VMO/VMT jest fizjologicznie istotnym modelem, który można wykorzystać do przeprowadzania badań przesiewowych leków i badania biologii specyficznej dla raka, naczyń krwionośnych lub narządów. Co ważne, VMT wspomaga rozwój różnych typów nowotworów, w tym raka jelita grubego, czerniaka, raka piersi, glejaka, raka płuc, raka otrzewnej, raka jajnika i raka trzustki8,9,10,11,12,13. Oprócz tego, że jest tania, łatwa do założenia i przygotowana do eksperymentów o wysokiej przepustowości, platforma mikroprzepływowa jest w pełni kompatybilna optycznie z analizą obrazu interakcji guz-zręb w czasie rzeczywistym i reakcji na bodźce lub terapie. Każdy typ komórki w systemie jest oznaczony innym markerem fluorescencyjnym, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację i śledzenie zachowania komórek przez cały eksperyment, tworząc okno na dynamiczne mikrośrodowisko guza. Wcześniej wykazaliśmy, że VMT wierniej modeluje in vivo wzrost guza, architekturę, heterogeniczność, sygnatury ekspresji genów i odpowiedzi na leki niż standardowe metody hodowli10. Co ważne, VMT wspiera wzrost i badanie komórek pochodzących od pacjentów, w tym komórek nowotworowych, co lepiej modeluje patologię guzów macierzystych niż standardowe hodowle sferoidalne i dalej rozwija wysiłki medycyny spersonalizowanej11. Manuskrypt ten przedstawia metody tworzenia VMT, prezentując jego użyteczność w badaniu nowotworów u ludzi.

<table><tbody><tr><td><mocny>Produkcja</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-merkaptopropylo)trimetoksysilan, 95%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617-100G</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio-One&nbsp; &mu; Przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki polistyrenowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655096</td><td></td></tr><tr><td>metanol &ge; 99,8% ACS</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH1135-1LP</td><td></td></tr><tr><td>MILTEX Sterylny jednorazowy dziurkacz do biopsji z tłokiem, średnica 1 mm,</td> <td>membrana Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>PAX Industries</td><td>HT-6240</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy PDC-001</td><td>Harrick Plasma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Smooth-Cast 385</td><td>Smooth-On</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SP Bel-Art Lab Companion Przezroczysty eksykator próżniowy z poliwęglanu</td><td>Bel-Art</td><td>F42400-4031</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe pokrywki z pierścieniami kondensacyjnymi, płytka 96-dołkowa</td><td>VWR</td><td>82050-827</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych (PDMS)</td><td>Dow</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa/Ładowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioTek Lionheart FX Zautomatyzowany Mikroskop</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td>CYT5MFAW</tr><tr><td>CELLvo Ludzkie śródbłonkowe komórki progenitorowe</td><td>StemBioSys</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I, ogon szczura</td><td>Enzo Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum (typ 4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Corning Hank' s Zrównoważony roztwór soli, 1X bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; DMEM z L-Glutaminą, 4,5 g / L Glukoza i pirogronian sodu</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen z osocza bydlęcego</td><td>Neta Scientific</td><td>SIAL-341573</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna osocze ludzkie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny&ndash; dekstran (70kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70S-1G</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świńskiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder owiec (typ 4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>NHLF &ndash; Normalne ludzkie fibroblasty płuc</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4% w 0,1M buforze fosforanowym Solanka, pH 7,4</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki&nbsp;</td><td>15735-90-1L</td><td></td></tr><tr><td>PBMCs - Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej</td><td>Lonza</td><td>CC-2702</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Premium Grade płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie</td><td>Avantor Seradigm</td><td>97068-091</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mikroprzygotowania Quick-RNA</td><td>Zymo Badania</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>Trombina z osocza bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (elektroforeza),</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Vasculife</td><td>Lifeline Cell Technologia</td><td>LL-0003</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

Brak potwierdzonych modeli raka, które podsumowują mikrośrodowisko nowotworów litych in vitro, pozostaje znaczącym wąskim gardłem dla przedklinicznych badań nad rakiem i rozwoju terapeutycznego. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy unaczyniony mikroguz (VMT), czyli chip nowotworowy, system mikrofizjologiczny, który realistycznie modeluje złożone mikrośrodowisko ludzkiego guza. VMT tworzy się de novo w platformie mikroprzepływowej poprzez wspólną hodowlę wielu typów komórek ludzkich w dynamicznych, fizjologicznych warunkach przepływu. Ten inżynieryjny konstrukt mikroguza zawiera żywą, perfundowaną sieć naczyniową, która podtrzymuje rosnącą masę guza, tak jak robią to nowo powstałe naczynia in vivo. Co ważne, leki i komórki odpornościowe muszą przejść przez warstwę śródbłonka, aby dotrzeć do guza, modelując in vivo fizjologiczne bariery dla dostarczania i skuteczności terapii. Ponieważ platforma VMT jest optycznie przezroczysta, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamicznych procesów, takich jak wynaczynienie komórek odpornościowych i przerzuty, można uzyskać dzięki bezpośredniej wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie komórek w tkance. Co więcej, VMT zachowuje heterogeniczność guza in vivo, sygnatury ekspresji genów i odpowiedzi na leki. Praktycznie każdy typ guza może być dostosowany do platformy, a pierwotne komórki ze świeżych tkanek chirurgicznych rosną i reagują na leczenie farmakologiczne w VMT, torując drogę do prawdziwie spersonalizowanej medycyny. W tym miejscu przedstawiono metody tworzenia VMT i wykorzystywania go do badań onkologicznych. To innowacyjne podejście otwiera nowe możliwości badania nowotworów i reakcji na leki, dostarczając naukowcom potężnego narzędzia do rozwoju badań nad rakiem.

Zgodnie z opisanymi tutaj protokołami, opracowano VMO i VMT, wykorzystując komercyjnie zakupione EC, NHLF oraz, w przypadku VMT, linię komórek raka piersi potrójnie ujemnego MDA-MB-231. W celu symulacji przerzutów w opracowanych VMO przeprowadzono perfuzję komórek nowotworowych. W każdym modelu, do 5. dnia kokultury, w odpowiedzi na przepływ napędzany grawitacyjnie przez komorę tkankową samoistnie tworzy się sieć naczyniowa, która służy jako kanał do dostarczania składników odżywczych, środków terapeutycznych oraz komóre...

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Nasza platforma tumo-on-a-chip została opracowana w celu fizjologicznego modelowania wzrostu unaczynionych mikroguzów u ludzi i pozwala nam odpowiedzieć zarówno na podstawowe, jak i translacyjne pytania badawcze, pytania, które koncentrują się na podstawowej biologii nowotworu, skuteczności leków, odpowiedzi guza, podstawowych procesach immunologicznych, potencjalnej interwencji immunoterapeutycznej i spersonalizowanych podejściach terapeutycznych. Skuteczne przełożenie odkryć przedklinicznych na skuteczne metody leczenia raka zależy od wiernego odtworzenia stanu chorobowego i systemów modelowych. Protokół ten określa ustanowienie unaczynionego mikroguza lub VMT w celu naśladowania mikrośrodowiska guza in vitro.VMT wiernie odtwarza kluczowe aspekty ludzkiego nowotworu, uzyskując klinicznie istotne wyniki. Nasz model pozwala nam na prowadzenie fizjologicznie istotnych, translacyjnych badań nad rakiem u ludzi. W szczególności nasz protokół, w przeciwieństwie do innych modeli, obejmuje dynamiczne warunki przepływu, umożliwia integrację komórek odpornościowych i immunoterapię, a ponadto pozwala nam na włączenie podejść medycyny spersonalizowanej.Wykorzystujemy model VMT, aby napędzać inicjatywy medycyny spersonalizowanej zarówno na arenie przedklinicznej, jak i klinicznej. Model ten pogłębia naszą wiedzę na temat czynników mikrośrodowiskowych w interakcjach komórka-komórka wpływających na oporność terapeutyczną i progresję nowotworu. Co więcej, VMT jest obiecujący, jeśli chodzi o odkrywanie spersonalizowanych metod leczenia dostosowanych do potrzeb pacjenta w celu poprawy opieki klinicznej.Na początek umieść odczynnik do dysocjacji komórek HBSS EGM-2 i DMEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut. Trombinę i lamininę rozmrażać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a fibrynogen w temperaturze pokojowej. Dodaj 1,5 mikrolitra trombiny do probówki wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów.Umieść wysterylizowane promieniami UV płytki o wysokiej przepustowości w eksykatorze na 30 minut, aby usunąć powietrze uwięzione w mikroprzepływach. Umieść kolbę T75 pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu, aby potwierdzić zbieżność komórek i wydajność transdukcji. Umyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami HBSS.Następnie dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do kolby i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez jedną do dwóch minut. Delikatnie postukać w kolbę dłonią i obserwować pod mikroskopem, czy wszystkie komórki zostały podniesione. Umyj komórki dziewięcioma mililitrami odpowiedniego podłoża i zbierz zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki.Natychmiast usuń małą porcję i policz komórki. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiednim podłożu na lodzie.Korzystając z podanego równania, oblicz liczbę potrzebnych komórek. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 10 do 6 komórek na mililitr i obliczyć potrzebną objętość komórek, korzystając z poniższego równania. Odwirować wymaganą objętość zawiesiny komórek, jak pokazano.Następnie w obliczonej objętości fibrynogenu ponownie zawieś osad na lodzie. Na początek umieść wysterylizowane promieniami UV płytki o wysokiej przepustowości i porcje trombiny w kapturze do hodowli tkankowych. Umieść przygotowaną mieszankę fibryny komórkowej na lodzie, aby spowolnić krzepnięcie.Za pomocą pipety P20 pobrać sześć mikrolitrów mieszanki fibryny komórkowej. Następnie delikatnie umieścić końcówkę pipety w podwielokrotności trombiny i dwukrotnie wymieszać bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.Podnieś płytkę o dużej przepustowości pod kątem i szybko włóż końcówkę pipety do jednego z otworów ładowania. Płynnym i płynnym ruchem przesunąć tłok pipety do pierwszego oporu i wstrzyknąć mieszaninę fibryny komórkowej do komory tkankowej. Upewnij się, że żel przechodzi całkowicie przez komorę.Delikatnie ułóż płytkę płasko, nie zdejmując końcówki pipety ani nie przesuwając pipety. Wyjmij końcówkę pipety ręką z P20 i pozostaw ją w otworze portu ładowania. Po dwóch minutach delikatnie wyjmij końcówki pipet z otworów ładowania i umieść pokrywkę na płytce.Inkubować płytkę przez 15 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu polimeryzacji żelu. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu, aby obserwować równomierne rozmieszczenie komórek w komorze bez pęcherzyków powietrza. Włóż końcówkę pipety P20 do M1 lub M3 i powoli wydal cztery mikrolitry lamininy, aby pokryć cały górny panel.Zdjąć końcówkę pipety, jak pokazano wcześniej, i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 10 minut, Dodać 275 mikrolitrów kompletnej pożywki EGM-2 do niesprzężonych zbiorników studzienek znajdujących się w rzędach A i B. Włożyć końcówkę pipety P200 do otworu wlotowego pożywki w studzienkach zawierających 275 mikrolitrów EGM-2, i powoli wydalaj 75 mikrolitrów pożywki, obserwując, jak media przemieszczają się przez kanał i bulgoczą po drugiej stronie. Po wyjęciu końcówki pipety wepchnij pozostały materiał z końcówki do zbiornika na media. Dodać 50 mikrolitrów pożywki, aby całkowicie pokryć dolne studzienki boczne w rzędach G i H. Inkubować płytki przez jedną do dwóch godzin, jak pokazano.Pod mikroskopem zidentyfikuj wszelkie pęcherzyki w kanałach medialnych i usuń je, ponownie wprowadzając 75 mikrolitrów pożywki do kanałów. Sprawdź gołym okiem wloty lub wyloty pożywki pod kątem pęcherzyków powietrza. Następnie włóż końcówkę pipety P200 do otworu i wyciągnij bańkę, podnosząc tłok.W unaczynionych mikronarządach lub VMO komórki śródbłonka początkowo rozmieszczone równomiernie w komorze tkankowej, ale do 2 dnia zaczęły się rozciągać i świecić. Do 4 dnia komórki śródbłonka zespoliły się z zewnętrznymi kanałami mikroprzepływowymi, tworząc ciągłą sieć naczyniową. Funkcja ścisłej bariery naczyniowej została potwierdzona przez perfuzję FITC-dekstranu przez sieć mikronaczyniową przy minimalnym wycieku.Perfuzja komórek nowotworowych MDA-MB-231 do BMO spowodowała ich przyleganie do błony śluzowej śródbłonka, a następnie wynaczynienie do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, tworząc liczne mikroprzerzuty w ciągu 24 godzin po perfuzji. Dzięki poklatkowemu obrazowaniu mikroskopowemu obserwowano wynaczynienie limfocytów T do przestrzeni zewnątrzkomórkowej VMO w ciągu 45 minut. W unaczynionych mikroguzach z w pełni uformowanymi naczyniami limfocyty T szybko przylegały do ściany naczynia po perfuzji.

establishing-physiologic-human-vascularized-micro-tumor-model-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy procedurę wykonania i obsługi urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe in vitro. Zmienność apoptozy w obrębie tkanki nowotworowej została określona ilościowo przy użyciu barwników fluorescencyjnych, a następnie oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego, doksorubicyny, do tkanki nowotworowej.

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Przedstawiamy szczegółowy protokół generowania mysiego modelu ksenoprzeszczepu malformacji żylnej. Model ten opiera się na podskórnym wstrzyknięciu komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta zawierających hiperaktywujące mutacje genu TIE2 i/lub PIK3CA. Zmiany ksenoprzeszczepowe ściśle odwzorowują cechy histopatologiczne tkanki pacjenta z VM.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Ten protokół opisuje budowę mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi in vitro przy użyciu pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z gotowych materiałów.

Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

Poznaj metodę tworzenia unaczynionego modelu mikroguza człowieka w mikrofluidycznym urządzeniu on-a-chip. Ta technika umożliwia badanie biologii nowotworów, skuteczności leków i interakcji immunologicznych w warunkach przepływowych.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Przeglądaj więcej filmów