Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie platformy mikroprzepływowej do skonstruowania perfuzyjnej sieci naczyniowej w wielokomórkowym skupisku lub sferoidzie. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące alternatywnego kształtu dziedzin medycyny regeneracyjnej, takie jak znaczenie sieci naczyniowej w modelach tkanek in vivo i in vitro. Główną zaletą tej techniki jest to, że droga podawania leków i suplementów może być symulowana in vitro poprzez dostarczanie obszarów zainteresowania bezpośrednio do sferoid.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z powodu trudności we wprowadzeniu komórek do obszaru docelowego w urządzeniu mikroprzepływowym. Po odlaniu prepolimeru PDMS należy odgazować materiał w komorze próżniowej przez dwie godziny, a następnie utwardzić go przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza w piecu z wentylacją powietrzną. Następnego ranka oderwij PDMS od płytki krzemowej i użyj dziurkacza o średnicy dwóch milimetrów, aby utworzyć otwory w materiale we wskazanych pozycjach.

Użyj stempla o średnicy jednego milimetra, aby utworzyć studnię sferoidalną, a następnie użyj taśmy klejącej do czyszczenia płyty PDMS i szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 24 milimetry. Traktuj czystą płytę plazmą powietrzną przez 40 sekund i przyklej płytę PDMS do szkiełka nakrywkowego. Następnie utwardź PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin.

Dwa do trzech dni przed wysiewem urządzenia mikroprzepływowego dodaj trzy razy 10 do piątego świeżo rozmrożonego hLF, RFP-HUVEC i GFP-HUVEC do 10 mililitrów świeżej pożywki śródbłonkowej w 10-milimetrowym naczyniu. Gdy hLF i RFP-HUVEC osiągną subkonfluencję, zawiesić hLF i RFP-HUVEC w podłożu śródbłonkowym do końcowych stężeń odpowiednio 1,0 razy 10 do piątej i 2,5 razy 10 do czwartej komórki na milimetr. Po dwóch dniach w hodowli zawiesiny, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dodaj 99-mikrolitrową kroplę świeżo przygotowanego roztworu mieszanki głównej do środka 35-milimetrowej szalki Petriego na lodzie.

Aby załadować urządzenie mikroprzepływowe, użyj zmodyfikowanej końcówki mikropipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby przenieść sferoidę i 100 mikrolitrów pożywki na drugą szalkę Petriego o temperaturze pokojowej. Następnie należy zassać sferoidę w minimalnej ilości pożywki i obrócić pipetę pionowo tak, aby sferoida przesunęła się grawitacyjnie na dno końcówki pipety. Przyłożyć końcówkę pipety do menisku kropli mieszanki wzorcowej, aby wyrzucić sferoidę do roztworu bez naciskania tłoka pipety.

Następnie szybko dodaj jeden mikrolitr świeżo przygotowanej trombiny do kropli i delikatnie wymieszaj trombinę z roztworem. Z pipetą ustawioną na siedem mikrolitrów, powoli przenieś sferoidę do studzienki sferoidalnej płyty PDMS. Najważniejszym etapem procedury jest wstrzyknięcie sferoidy z taką ilością żelu, aby sferoida mogła osiąść na dnie urządzenia.

Po załadowaniu delikatnie zdejmij końcówkę pipety, aby zapobiec wyciekom między mikrowkładami. Inkubuj sferoidę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Gdy fibryna zestali się, powoli wstrzyknij od 20 do 30 mikrolitrów pożywki śródbłonkowej do otworów pierwszego A i trzech A, aby załadować odpowiednio kanały pierwszy i trzy.

Następnie przenieś urządzenie na wilgotną chusteczkę laboratoryjną w 100-milimetrowym naczyniu i inkubuj urządzenie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny, aby ułatwić usunięcie wszelkich pęcherzyków na granicy faz między pożywką a fibryną. Następnego dnia dodaj dwa mililitry 0,05% trypsyny-EDTA do sub-konfluentów GFP-HUVEC i zatrzymaj reakcję trypsyny czterema mililitrami kompletnego podłoża, gdy komórki całkowicie się odłączą. Zebrać komórki śródbłonka przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w świeżym podłożu śródbłonkowym w stężeniu pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr

Następnie wstrzyknij 20 mikrolitrów HUVEC do pierwszego otworu B, aby załadować kanał pierwszy, i umieść urządzenie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, przechylone pod kątem 90 stopni, aby upewnić się, że HUVEC przylegają do fibryny w kanale drugim. Po załadowaniu kanału trzeciego w ten sam sposób, umieść urządzenie w nowym 100-milimetrowym naczyniu zawierającym wilgotną chusteczkę laboratoryjną w inkubatorze do hodowli komórkowych na siedem do 14 dni, wymieniając połowę pożywki w kanałach pierwszym i trzecim dziennie. Te reprezentatywne obrazy wykonane w dniu zero ładowania HUVEC pokazują żel fibrynowy załadowany tylko do kanału drugiego, bez żadnego wycieku do kanału pierwszego lub trzeciego oraz z HUVEC z powodzeniem przymocowanymi do ściany bocznej żelu fibrynowego.

Można również zaobserwować, że sferoida jest prawidłowo osadzona na dnie urządzenia. Kiełki angiogenne obserwuje się począwszy od pierwszego dnia, przy czym najdłuższy kiełek osiąga sferoidę w trzecim dniu tego eksperymentu, a większość kiełków angiogennych osiąga sferoidę w siódmym dniu. Optymalnie, po czterech dniach w urządzeniu, można zaobserwować przepływ przez światła naczyń o kącie naczyniowym zdefiniowanym jako kierunek końcówki naczynia i środek sferoidy od korzenia naczyniowego.

Kąty naczyniowe zmniejszają się w sposób zależny od czasu, co wskazuje na migrację kiełków angiogennych w kierunku sferoidy. RFP i GFP-HUVEC mogą skoordynowanie tworzyć pojedyncze światło naczyniowe, wyraźnie wskazując, w jaki sposób kiełki angiogenne z kanałów pierwszego i trzeciego łączą się z RFP-HUVEC w sferoidzie, tworząc ciągłą sieć naczyniową. Co więcej, FITC-dekstran wstrzyknięty do kanału pierwszego przepływa do skonstruowanej sieci naczyniowej i wnętrza sferoidy, ostatecznie docierając do kanału trzeciego, co oznacza, że zintegrowana sieć naczyniowa może dostarczać składniki odżywcze i usuwać produkty przemiany materii ze sferoidy.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się organicznym polem elektrycznym do zbadania skuteczności leków lub suplementów będących przedmiotem zainteresowania w modelach tkanek in vitro.