Name: Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę konstrukcji perfuzyjnej sieci naczyniowej w sferoidach przy użyciu platformy mikroprzepływowej. Technika umożliwia symulację podawania leków in vitro i wspiera badania w dziedzinie inżynierii tkankowej oraz medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CREST JST (numer grantu JPMJCR14W4), Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI (numer grantu 25600060, 16K16386), The Center of Innovation Program z MEXT i JST, Projekt Skoncentrowany na Rozwoju Kluczowej Technologii Oceny z Japan Agency for Medical Research and Development, AMED, Mizuho Foundation for the Promotion of Sciences. Mikroprodukcja była wspierana przez Kyoto University Nano Technology Hub.

1. Wykonanie formy urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Zaprojektuj wzór urządzenia mikroprzepływowego za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania (Clewin5 lub AutoCAD 2016 itp.). Aby uzyskać informacje na temat funkcji Clewin5, zapoznaj się z instrukcją obsługi (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual). 
	UWAGA: Plik projektu jest dostępny w pliku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Przenieś plik projektowy do generatora mikrowzorów i załaduj do narzędzia maskę chromową pokrytą dodatnim fotorezystem.</li>
	<li>Naświetl dodatni fotorezystor w obszarze wzoru za pomocą generatora mikrowzorów.</li>
	<li>Rozwiń dodatni fotorezystor za pomocą wywoływacza (tabela materiałów) i spłucz maskę wodą dejonizowaną (DI).</li>
	<li>Za pomocą wytrawiacza chromowego (Tabela materiałów) wytrawić chrom w odsłoniętym obszarze, z którego usunięto dodatni fotorezyst. Spłucz maskę wodą DI</li>.
	<li>Usuń pozostały fotorezystor z maski za pomocą acetonu. 
	UWAGA: Maska przezroczystości może być alternatywą dla maski Cr.</li>
	<li>Przygotuj czystą płytkę krzemową (4 cale, P(100)) i wiruj heksametyldisilazan (HMDS) z prędkością 3,000 obr./min przez 30 s.</li>
	<li>Piecz HMDS na miękko przez 5 minut w temperaturze 120 °C i schładzaj wafel przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powlekaj ujemny fotorezyst (tabela materiałów) przy 500 obr./min przez 10 s i 1,200 obr./min przez 30 s. 
	UWAGA: Stan powłoki wirowej powinien dać warstwy fotorezystu o grubości około 100 μm na płytkach po fotolitografii.</li>
	<li>Wstępnie piecz negatywowy fotorezystor przez 45 minut w temperaturze 95 °C i schładzaj wafel przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Sprawdź natężenie światła UV w każdym eksperymencie i oblicz czas ekspozycji dla całkowitej dawki energii ekspozycji przy 250 mW/cm2. Umieść fotomaskę (krok 1.1-1.6) na płytce i wystaw je na działanie światła UV.</li>
	<li>Piecz ujemny fotorezystor przez 1 minutę w temperaturze 65 °C i 5 minut w temperaturze 95 °C. Pozostaw wafel do ostygnięcia przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozwijaj ujemną warstwę fotorezystu przez 15 minut w pierwszej kąpieli wywoływacza (tabela materiałów) i 2 minuty w drugiej kąpieli. Płukać wafel w pierwszej kąpieli izopropanolowej (IPA) przez 10 s, a następnie w drugiej kąpieli IPA przez 10 s.</li>
	<li>Fotorezystor ujemny należy wypalić na twardo przez 30 minut w temperaturze 200 °C i schłodzić wafel przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmierz grubość ujemnej warstwy fotorezystu za pomocą profilera powierzchniowego.</li>
	<li>Umieścić wafel w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej i dodać 200 μl silanu (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu). Włączyć pompę na 10 minut, następnie wyłączyć ją i trzymać wafel w eksykatorze przez 4 godziny.</li>
</ol>
2. Etapy produkcji i montaż warstw PDMS
<ol>
	<li>Odlewać prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) (baza PDMS: utwardzacz = 10:1 (w/w)) i odgazowywać w komorze próżniowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Utwardzić PDMS w temperaturze 80°C w piekarniku z wentylacją przez noc.</li>
	<li>Oderwij PDMS od płytki krzemowej.</li>
	<li>Dobrze przebij otwory 1A - 3B (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i kulturę sferoidalną. Użyj dziurkacza o średnicy 2 mm do otworów 1A - 3B i dziurkacza o średnicy 1 mm do studzienki sferoidalnej.</li>
	<li>Wyczyść płytę PDMS i szklane szkiełko nakrywkowe (24 mm × 24 mm) taśmą klejącą, kilkakrotnie przyklejając i odklejając taśmę. Następnie potraktuj płytę PDMS plazmą powietrzną przez 40 s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>Przymocować płytę PDMS do szklanego szkiełka nakrywkowego, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z powierzchni między płytą PDMS a szkiełkiem nakrywkowym i utwardzić w temperaturze 80 °C przez co najmniej 12 godzin.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sferoidy
UWAGA: W badaniu, czerwone białko fluorescencyjne wyrażające ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (RFP-HUVEC) i zielone fluorescencyjne białko wyrażające HUVEC (GFP-HUVEC) są używane odpowiednio w sferoidach i mikrokanałach, aby odróżnić pochodzenie HUVEC po zbudowaniu perfuzyjnej sieci naczyniowej. Jeśli pochodzenie HUVEC nie jest potrzebne, do eksperymentu wystarczą nieoznakowane HUVEC.
<ol>
	<li>Rozmrozić RFP-HUVEC (3,0 × 105 komórek/fiolkę) i ludzki fibroblast płucny (hLF) (1,0 × 106 komórek/fiolkę) i dodać je do 10 ml pożywki odpowiednio dla komórek śródbłonka i komórek fibroblastów (tabela materiałów). Hoduj je w naczyniu o średnicy 100 mm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-3 dni w przypadku subkonfluentnych RFP-HUVEC i hLF. Ten preparat da ~200 sferoid.</li>
	<li>Odłącz RFP-HUVEC i hLF od szalek z 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA i zatrzymaj reakcję trypsyny za pomocą 4 ml DMEM zawierającego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Po odwirowaniu przy 220 x g przez 3 minuty usunąć supernatant i ponownie zawiesić RFP-HUVEC i hLF w podłożu śródbłonkowym do końcowych stężeń komórek odpowiednio 2,5 × 104 i 1,0 × 105 komórek/ml.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 200 μl zawiesiny komórek (5 000 komórek dla RFP-HUVEC i 20 000 komórek dla hLF) na dołek do 96-dołkowej płytki o bardzo niskiej powierzchni wiązania.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez okres 2-4 dni><.
	UWAGA: Ponieważ średnica sferoidy zależy od okresu hodowli i początkowej liczby komórek w 96-dołkowej płytce, można ją kontrolować za pomocą tych dwóch parametrów.</li>
</ol>
4. Inicjowanie komórek w urządzeniu mikroprzepływowym
Uwaga: Konwencja nazewnictwa otworów, kanałów i studni sferoidalnej jest pokazana w Rysunek 1. Dzień 0 definiujemy jako dzień, w którym kończy się pobieranie komórek do urządzenia mikroprzepływowego. Schemat eksperymentalnych osi czasu jest pokazany w Rysunek 2.
<ol>
	<li>Dzień −1) Ładowanie sferoidów 
	UWAGA: Następujący krok należy wykonać na lodzie, aby zapobiec żelowaniu kolagenu i fibryny.
	<ol>
		<li>Rozpuść fibrynogen w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 2,80 mg/ml.</li>
		<li>Przygotuj zneutralizowany kolagen (3,0 mg/ml w PBS) zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Połącz 107,2 μl roztworu fibrynogenu (2,80 mg/ml), 8,0 μl zneutralizowanego kolagenu (3,0 mg/ml) i 3,6 μl aprotyniny (5 U/ml) na reakcję w probówce. Roztwór ten jest oznaczony jako "roztwór mieszanki wzorcowej" (MS). 
		UWAGA: Objętość wystarcza na załadowanie jednej sferoidy. Jeśli jest więcej niż jedna sferoida, pomnóż każdą objętość przez liczbę sferoid.</li>
		<li>Rozpuścić trombinę w PBS do końcowego stężenia 50 U/mL. 
		UWAGA: Podwielokrotności 50 U/ml trombiny (20 μL/probówkę) są przechowywane w temperaturze -30 °C i są rozmrażane przed każdym doświadczeniem.</li>
		<li>Umieścić 96-dołkową płytkę zawierającą sferoidy w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Przygotuj dwie szalki Petriego o średnicy 35 mm w komorze bezpieczeństwa biologicznego, z jedną szalką na lodzie (szalka 1), a drugą na blacie (szalka 2). Odpipetuj 99 μl MS na środek naczynia 1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3a), aby utworzyć kroplę.</li>
		<li>Przyciąć końcówki 2 żółtych (10-100 μl) i 3 przezroczystych końcówek do pipet (1-100 μl) w celu pobrania sferoidów z płytki 96-dołkowej, zmieszania trombiny ze stwardnieniem rozsianym, precyzyjnego pobrania sferoid, wstrzyknięcia sferoid do urządzenia i wstrzyknięcia pożywki do urządzenia. Rozmiar porów końcówki powinien być nieco większy niż średnica otworów 1A - 3B kanałów 1 i 3 lub studzienki sferoidalnej w kanale 2, aby zapewnić dokładne dopasowanie. 
		UWAGA: Dalej, o ile nie zaznaczono inaczej, należy używać końcówek do pipet wyciętych na tym etapie. Zdjęcie wyciętych końcówek jest dostępne w Rysunek 4.</li>
		<li>Zbierz sferoidę ze 100 μl pożywki z płytki 96-dołkowej i dodaj ją do szalki 2 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3a).</li>
		<li>Podnieść sferoidę z minimalną objętością podłoża z naczynia 2. Trzymając pipetor w pozycji pionowej, sferoida powinna przesuwać się grawitacyjnie w kierunku dna końcówki pipety. Wysunąć sferoidę, dotykając końcówką pipety menisku kropelki MS w naczyniu 1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3a). 
		UWAGA: Następujące kroki 4.1.10 i 4.1.11 należy wykonać szybko.</li>
		<li>Dodać 1 μl trombiny (50 j./ml) i delikatnie wymieszać z żółtą końcówką pipety.</li>
		<li>Mając pipetę ustawioną na 7 μl, podnieś sferoidę i powoli umieść ją w studzience sferoidowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3b).</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu żelowania fibryny.</li>
		<li>Powoli wstrzyknij pożywkę śródbłonkową z otworów 1A i 3A i wypełnij kanały 1 i 3 pożywką (20 ~ 30 μl / kanał).</li>
		<li>Umieść urządzenie w naczyniu o średnicy 100 mm z mokrym Kimwiste, aby zapobiec parowaniu mediów z urządzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3c).</li>
		<li>Umieść urządzenie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 24 godziny, aby usunąć pęcherzyki na granicy faz między pożywką a fibryną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 0) Załadunek HUVEC
	<ol>
		<li>Rozmrozić GFP-HUVEC (3,0 x 105 komórek/fiolkę) i dodać je do 10 ml podłoża śródbłonkowego. Hoduj je w naczyniu o średnicy 100 mm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-3 dni, aby osiągnąć subkonfluencję. Jedno naczynie sub-konfluentnych GFP-HUVEC wystarcza na przygotowanie 8-10 urządzeń.</li>
		<li>Odłącz GFP-HUVEC od szalek z 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA i zatrzymaj reakcję trypsyny za pomocą 4 ml DMEM zawierającego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny.</li>
		<li>Po odwirowaniu w sile 220 x g przez 3 minuty, ponownie zawiesić GFP-HUVEC w podłożu śródbłonkowym w stężeniu 5,0 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Zawiesinę komórkową HUVEC wstrzyknąć do kanału 1 przez otwór 1B (20 μl/kanał).</li>
		<li>Przechylić urządzenie mikroprzepływowe o 90°, odłożyć je na bok i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby upewnić się, że HUVEC przylegają do fibryny w kanale 2.
		<ol>
			<li>Potwierdź przyczepienie HUVEC do fibryny. Gdy liczba HUVEC przyłączonych na granicy faz między żelem a podłożem jest niewystarczająca, układ krwionośny może zostać odłączony w korzeniu naczyniowym po kilku dniach hodowli urządzenia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5). W protokole wskaźnik powodzenia perfuzji wynosi >50%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz kroki 4.2.4 i 4.2.5 dla kanału 3.</li>
		<li>Hodować komórki w naczyniu o średnicy 100 mm z wilgotnym Kimwipe w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7-14 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1 ~) Wymiana mediów
	<ol>
		<li>Wymieniaj się połową mediów w kanałach 1 i 3 każdego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Barwienie jąder
<ol>
	<li>Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS.</li>
	<li>Usuń media z kanałów 1 i 3 i dodaj 20 μl 4% PFA na kanał. Aby zastąpić roztwór w 4% PFA, powtórz wyjmowanie roztworu z urządzenia i trzykrotne dodawanie 4% PFA.</li>
	<li>Inkubować urządzenie w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Usuń 4% PFA z urządzenia i trzykrotnie umyj kanały PBS.</li>
	<li>Dodać 20 μl lub 10 μg/ml barwnika fluorescencyjnego (tabela materiałów) na kanał, aby zabarwić jądra komórkowe. Aby wymienić roztwór w urządzeniu, powtórz wyjmowanie roztworu z urządzenia i trzykrotne dodanie 10 μg/ml barwnika fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przechowuj urządzenie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
</ol>
6. Perfuzja płynu sferoidy
<ol>
	<li>Przygotować sferoidę po hodowli przez ponad 7 dni w urządzeniu w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zakończenia ciągłego szlaku naczyniowego.</li>
	<li>Usuń podłoże z otworów 1A, 1B, 3A i 3B.</li>
	<li>Wprowadzić 10 μl 10 μM roztworu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu w PBS do otworów 1A i 1B.</li>
	<li>Monitoruj przepływ mikrogranulek lub barwnika FITC pod mikroskopem odwróconym.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja długości kiełków
UWAGA: Oprogramowanie ImageJ ver. 1.49 jest używane do wszystkich analiz obrazu w tym badaniu.
<ol>
	<li>Nakładaj na siebie obrazy z dni 0, 1, 3, 5 i 7 GFP-HUVEC.</li>
	<li>Odejmij pozycję końcówki układu krwionośnego dnia 0 od tej samej pozycji na zdjęciach wykonanych w dniach 1, 3, 5 i 7.</li>
	<li>Określ wzrost końcówki naczynia krwionośnego od pozycji korzenia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6). Odległość między wierzchołkiem naczynia a korzeniem została zdefiniowana jako długość kiełka w tym badaniu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7b).</li>
</ol>
8. Kwantyfikacja kątów naczyniowych
UWAGA: Kąt naczyniowy został zdefiniowany jako kąt składający się z kąta naczyniowego, korzenia i środka sferoidy (<silna klasa="xfig">Rysunek 7c).
<ol>
	<li>Binaryzuj obrazy fluorescencyjne sferoidy kokultury zawierającej RFP-HUVEC i zmierz pozycję "środka ciężkości" za pomocą funkcji analizy w ImageJ. W tym badaniu zmierzona pozycja "środka ciężkości" jest zdefiniowana jako środek sferoidy (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	<li>Określ położenie końcówek naczyń krwionośnych i korzeni w ten sam sposób w kroku 7.</li>
	<li>Zmierz kąty naczyniowe za pomocą funkcji analizy w oprogramowaniu ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+Biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: Biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+polarity+and+functional+bile+canaliculi+in+rat+hepatocyte+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids.</a> Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principle%3A+microenvironmental+influences+in+the+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast.</a> Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+for+netrins+in+regulating+epithelial+behavior+during+lung+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis.</a> Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).</li>
<li>Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+assay+on+a+silicon+chip+applicable+for+tumors+extirpated+from+mammalians%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians.</a> International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+And+Environment+Interactions+In+Tumor+Microregions+-+The+Multicell+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model.</a> Science. 240 (4849), 177-184 (1988).</li>
<li>Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+technologies+for+cell-to-cell+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies.</a> Lab on a Chip. , (2017).</li>
<li>Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+approach+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).</li>
<li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt.2989">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373(2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481(2013).</li>
<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+In+Vivo+Origin+of+Metanephric+Nephron+Progenitors+Enables+Generation+of+Complex+Kidney+Structures+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAuger%2C+FA+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22">Annual Review of Biomedical Engineering</a>. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).</li>
<li>Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Approach+for+Formation+of+Vascularized+Liver+Tissue+by+Endothelial+Cell-Covered+Hepatocyte+Spheroid+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).</li>
<li>Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+assemble+into+a+3-dimensional+prevascular+network+in+a+bone+tissue+engineering+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct.</a> Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).</li>
<li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional%2C+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).</li>
<li>Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Perfused+Human+Capillary+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">In Vitro Perfused Human Capillary Networks.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li>
<li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li>
<li>Huang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microscale+cellular+niches+for+three-dimensional+multicellular+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures.</a> Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).</li>
<li>Newman, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Stromal+Cell+Secretomes+Reveals+a+Critical+Role+for+Stromal+Cell-Derived+Hepatocyte+Growth+Factor+and+Fibronectin+in+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513(2013).</li>
<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
<li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+limits+of+an+in+vitro+thick+prevascularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+Liquid+Tumors%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Leukemic-Cell-Induced+Bone+Marrow+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+developing+vasculature+and+optogenetically+engineered+skeletal+muscle+improves+muscle+contraction+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis.</a> Biomaterials. 156, 65-76 (2018).</li>
</ol>

Autor oświadcza, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wcześniejsze doniesienia pokazują, że hLF wydzielają koktajl wielu czynników angiogennych, takich jak angiopoetyna-1, angiogenina, czynnik wzrostu hepatocytów, transformujący czynnik wzrostu-α, czynnik martwicy nowotworu i niektóre białka macierzy zewnątrzkomórkowej29,30. Test ten opiera się na angiogennym wydzielaniu z hLF w sferoidzie kokultury, co jest ograniczeniem tej techniki. Dlatego tak ważne jest, aby dla stabilnej formacji naczyniowej umieścić sferoidę ...

Przejście z kultury jednowarstwowej (dwuwymiarowej) na kulturę trójwymiarową jest motywowane potrzebą pracy z modelami kultur, które naśladują funkcje komórkowe żywych tkanek1,2,3. Płaskie i twarde podłoża z tworzyw sztucznych powszechnie stosowane w hodowlach komórkowych nie przypominają większości środowisk zewnątrzkomórkowych w ludzkim ciele. W rzeczywistości wiele badań pokazuje, że trójwymiarowa hodowla odtwarza specyficzną dla tkanki architekturę, mechaniczne i biochemiczne wskazówki oraz komunikację komórka-komórka, których nie zaobserwowano w konwencjonalnej hodowli dwuwymiarowej4,5,6,7,8.
Wielokomórkowe skupisko lub sferoida, jest jedną z najbardziej obiecujących technik realizacji tej trójwymiarowej kultury9,10. Komórki wydzielają macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i mogą wchodzić w interakcje z innymi w sferoidzie. Chociaż niektóre inne podejścia bioinżynieryjne11,12,13,14, takie jak układanie komórek, z powodzeniem odtwarzają złożoność przestrzenną ludzkiego ciała, podejścia te mają tylko dwa lub trzy rodzaje komórek dla ułatwienia analizy i koncentrują się tylko na jednej funkcji docelowych narządów. W przeciwieństwie do tego, komórki w sferoidach są wystawione na różne środowiska hodowlane w zależności od ich pozycji w sferoidzie ze względu na niejednorodne dostarczanie składników odżywczych, tlenu oraz parakrynnych i autokrynnych cząsteczek sygnalizacyjnych w sferoidzie. Ta cecha sferoidów częściowo naśladuje warunki hodowli in vivo i umożliwia komórkom w sferoidach tworzenie znacznie bardziej złożonej, zorganizowanej struktury tkankowej in vitro niż te hodowane w stosach tkankowych9,15,16. Należy zauważyć, że jeśli sferoida składa się z jednego rodzaju komórek, funkcja komórek w sferoidzie nie jest jednolita ze względu na niejednorodne środowisko w sferoidzie. W ciągu ostatnich kilku lat hodowle sferoidalne pozwoliły embrionalnym komórkom macierzystym (ESC), indukowanym pluripotencjalnym komórkom macierzystym (iPSC) lub komórkom macierzystym rezydującym w tkance naśladować sekwencje rozwojowe in vivo i odtwarzać mini-narządy, takie jak brain17, liver18i kidney19,20.
Pomimo znacznego postępu w technikach hodowli sferoidów, hodowla dużych sferoidów przez długi czas jest nadal problematyczna. W tkance trójwymiarowej komórki muszą znajdować się w odległości 150-200 μm od naczynia krwionośnego ze względu na ograniczony dopływ tlenu i składników odżywczych21. Sieci naczyniowe w obrębie sferoidy są niezbędne do rekapitulacji wymiany substancji między krwią a tkankami in vivo. Aby to osiągnąć, inne grupy przeprowadziły współhodowlę komórek śródbłonka z komórkami docelowymi22,23,24 lub indukowały różnicowanie komórek pluripotencjalnych w komórki CD31-dodatnie20. Niemniej jednak, opisane struktury przypominające naczynia nie mają otwartych końców światła, które dostarczałyby tlen i składniki odżywcze do środka sferoidy. Aby naśladować rolę naczyń krwionośnych w odżywianiu komórek w trójwymiarowej hodowli, w sferoidzie musi zostać opracowana otwarta i przepuszczalna sieć naczyniowa.
W ciągu ostatnich kilku lat, niektóre grupy badawcze w dziedzinie mikroinżynierii opisały metody budowy perfuzyjnej sieci naczyniowej, spontanicznie tworzonej w urządzeniu mikroprzepływowym przy użyciu czynników angiogennych z hodowanych komórek fibroblastów25,26. Te sieci naczyniowe mają podobną morfologię do swoich odpowiedników in vivo i mogą być przebudowywane przez czynniki środowiskowe, dzięki czemu nadają się do naśladowania funkcji naczyniowych w kulturze sferoidalnej. Celem tego protokołu jest skonstruowanie perfuzyjnej sieci naczyniowej w sferoidzie przy użyciu platformy mikroprzepływowej27. Urządzenie mikroprzepływowe jest modyfikowane w stosunku do wcześniej zgłoszonego device25 tak, aby można było włączyć sferoidę. Kierując angiogenne wydzielanie z komórek fibroblastów w sferoidzie do komórek śródbłonka w mikrokanałach, angiogenne kiełki z mikrokanalików zełączyły się ze sferoidem i utworzyły perfuzyjną sieć naczyniową. Metoda ta pozwala na bezpośrednie dostarczanie szerokiej gamy substancji, takich jak cząsteczki fluorescencyjne i kulki w skali mikrometrycznej, do wnętrza sferoidy, co stanowi ramy dla długotrwałej hodowli tkankowej z sieciami naczyniowymi.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>Maska chromowa pokryta AZP 1350.</td><td>TECHNOLOGIA CZYSTEJ POWIERZCHNI</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Generator mikrowzorów</td><td>Heidelberg</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26 Wywoływacz</td><td>Rohm i Haas</td> electronic <td>materials-Developer</td> <td>w protokole 1.4</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>Sasaki Chemical</td><td>S-24</td><td>Wytrawiacz chromu w protokole 1.5</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Wako</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan (HMDS)</td><td>Tokyo Ohka Kogyo</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem-Negative</td><td></td> <td>Photoresist w protokole 1.9</td></tr><tr><td>Ekspozycja na promieniowanie UV</td><td>Nanometric Technology Inc</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Deweloper</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Wywoływacz ujemnego fotorezystu w protokole 1.13</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>Profilomierz powierzchni</td><td>Veeco</td><td>Veeco Dektak XT-S</td><td></td></tr><tr><td>(Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silan</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning Toray</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji (1,0mm)&nbsp;</td>Dziurkacz do biopsji <td>Kai Industries</td><td>BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>(2,0 mm)&nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>System plazmowy</td><td>Femto Science</td><td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>SZKŁO MATSUNAMI C024241</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>RFP Wyrażające ludzką komórkę śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Angio Proteomia</td><td>cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>Normalne ludzkie fibroblasty płuc</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy pożywek do wzrostu fibroblastów</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific 11965092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>0,05 W/v% Trypsyna-0,53 mmol/l EDTA&bull; Roztwór 4Na z fenolem Red</td><td>Wako</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sole buforowane fosforanem)</td><td>Takara bio</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Bakelit Sumitomo</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200ul&nbsp; Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Model 370</td><td></td></tr><tr><td>GFP Ekspresja ludzkiej komórki śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen z osocza bydlęcego</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Aprotynina z płuc bydlęcych</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Trombina z osocza bydlęcego</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>Barwnik fluorescencyjny do barwienia jąder w protokole 5.5</td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu</td><td>Wako</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Degital Kamera CCD</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny skaningowy laserowy mikroskop biologiczny</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny</td><td>Sigma</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Sferoida (agregat wielokomórkowy) jest uważana za dobry model żywych tkanek w ludzkim ciele. Pomimo znacznego postępu w hodowlach sferoidalnych, przepuszczalna sieć naczyniowa w sferoidach pozostaje krytycznym wyzwaniem dla długoterminowych hodowli wymaganych do utrzymania i rozwoju ich funkcji, takich jak ekspresja białek i morfogeneza. W protokole przedstawiono nowatorską metodę integracji perfuzyjnej sieci naczyniowej w sferoidzie w urządzeniu mikroprzepływowym. Aby indukować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie, angiogenne kiełki połączone z mikrokanałami zostały skierowane do sferoidy poprzez wykorzystanie czynników angiogennych z ludzkich fibroblastów płuc hodowanych w sferoidzie. Kiełki angiogenne dotarły do sferoidy, połączyły się z komórkami śródbłonka współhodowanymi w sferoidzie i utworzyły ciągłą sieć naczyniową. Sieć naczyniowa może przenikać do wnętrza sferoidy bez żadnego wycieku. Skonstruowana sieć naczyniowa może być dalej wykorzystywana jako droga dostarczania składników odżywczych i usuwania produktów przemiany materii, naśladując krążenie krwi in vivo. Metoda ta stanowi nową platformę w hodowli sferoidalnej w kierunku lepszej rekapitulacji żywych tkanek.

Rysunek 1 przedstawia schemat oraz zdjęcie urządzenia mikrofluidycznego. Posiada ono trzy równoległe kanały, z których kanał 2 zawiera dołek na sferoid. Kanały 1 i 3 służą do hodowli HUVEC, a kanał 2 do sferoidu. Każdy kanał jest oddzielony trapezoidalnymi mikrosłupkami zaprojektowanymi do wzorowania PDMS. Mikrosłupki zapobiegają wyciekaniu hydrożelu z kanału 2 do kanałów 1 i 3 dzięki napięciu powierzchniowemu oraz umożliwiają wymianę substancji między sferoi...

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie platformy mikroprzepływowej do skonstruowania perfuzyjnej sieci naczyniowej w wielokomórkowym skupisku lub sferoidzie. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące alternatywnego kształtu dziedzin medycyny regeneracyjnej, takie jak znaczenie sieci naczyniowej w modelach tkanek in vivo i in vitro. Główną zaletą tej techniki jest to, że droga podawania leków i suplementów może być symulowana in vitro poprzez dostarczanie obszarów zainteresowania bezpośrednio do sferoid.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z powodu trudności we wprowadzeniu komórek do obszaru docelowego w urządzeniu mikroprzepływowym. Po odlaniu prepolimeru PDMS należy odgazować materiał w komorze próżniowej przez dwie godziny, a następnie utwardzić go przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza w piecu z wentylacją powietrzną. Następnego ranka oderwij PDMS od płytki krzemowej i użyj dziurkacza o średnicy dwóch milimetrów, aby utworzyć otwory w materiale we wskazanych pozycjach.Użyj stempla o średnicy jednego milimetra, aby utworzyć studnię sferoidalną, a następnie użyj taśmy klejącej do czyszczenia płyty PDMS i szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 24 milimetry. Traktuj czystą płytę plazmą powietrzną przez 40 sekund i przyklej płytę PDMS do szkiełka nakrywkowego. Następnie utwardź PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin.Dwa do trzech dni przed wysiewem urządzenia mikroprzepływowego dodaj trzy razy 10 do piątego świeżo rozmrożonego hLF, RFP-HUVEC i GFP-HUVEC do 10 mililitrów świeżej pożywki śródbłonkowej w 10-milimetrowym naczyniu. Gdy hLF i RFP-HUVEC osiągną subkonfluencję, zawiesić hLF i RFP-HUVEC w podłożu śródbłonkowym do końcowych stężeń odpowiednio 1,0 razy 10 do piątej i 2,5 razy 10 do czwartej komórki na milimetr. Po dwóch dniach w hodowli zawiesiny, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dodaj 99-mikrolitrową kroplę świeżo przygotowanego roztworu mieszanki głównej do środka 35-milimetrowej szalki Petriego na lodzie.Aby załadować urządzenie mikroprzepływowe, użyj zmodyfikowanej końcówki mikropipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby przenieść sferoidę i 100 mikrolitrów pożywki na drugą szalkę Petriego o temperaturze pokojowej. Następnie należy zassać sferoidę w minimalnej ilości pożywki i obrócić pipetę pionowo tak, aby sferoida przesunęła się grawitacyjnie na dno końcówki pipety. Przyłożyć końcówkę pipety do menisku kropli mieszanki wzorcowej, aby wyrzucić sferoidę do roztworu bez naciskania tłoka pipety.Następnie szybko dodaj jeden mikrolitr świeżo przygotowanej trombiny do kropli i delikatnie wymieszaj trombinę z roztworem. Z pipetą ustawioną na siedem mikrolitrów, powoli przenieś sferoidę do studzienki sferoidalnej płyty PDMS. Najważniejszym etapem procedury jest wstrzyknięcie sferoidy z taką ilością żelu, aby sferoida mogła osiąść na dnie urządzenia.Po załadowaniu delikatnie zdejmij końcówkę pipety, aby zapobiec wyciekom między mikrowkładami. Inkubuj sferoidę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Gdy fibryna zestali się, powoli wstrzyknij od 20 do 30 mikrolitrów pożywki śródbłonkowej do otworów pierwszego A i trzech A, aby załadować odpowiednio kanały pierwszy i trzy.Następnie przenieś urządzenie na wilgotną chusteczkę laboratoryjną w 100-milimetrowym naczyniu i inkubuj urządzenie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny, aby ułatwić usunięcie wszelkich pęcherzyków na granicy faz między pożywką a fibryną. Następnego dnia dodaj dwa mililitry 0,05% trypsyny-EDTA do sub-konfluentów GFP-HUVEC i zatrzymaj reakcję trypsyny czterema mililitrami kompletnego podłoża, gdy komórki całkowicie się odłączą. Zebrać komórki śródbłonka przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w świeżym podłożu śródbłonkowym w stężeniu pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr.Następnie wstrzyknij 20 mikrolitrów HUVEC do pierwszego otworu B, aby załadować kanał pierwszy, i umieść urządzenie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, przechylone pod kątem 90 stopni, aby upewnić się, że HUVEC przylegają do fibryny w kanale drugim. Po załadowaniu kanału trzeciego w ten sam sposób, umieść urządzenie w nowym 100-milimetrowym naczyniu zawierającym wilgotną chusteczkę laboratoryjną w inkubatorze do hodowli komórkowych na siedem do 14 dni, wymieniając połowę pożywki w kanałach pierwszym i trzecim dziennie. Te reprezentatywne obrazy wykonane w dniu zero ładowania HUVEC pokazują żel fibrynowy załadowany tylko do kanału drugiego, bez żadnego wycieku do kanału pierwszego lub trzeciego oraz z HUVEC z powodzeniem przymocowanymi do ściany bocznej żelu fibrynowego.Można również zaobserwować, że sferoida jest prawidłowo osadzona na dnie urządzenia. Kiełki angiogenne obserwuje się począwszy od pierwszego dnia, przy czym najdłuższy kiełek osiąga sferoidę w trzecim dniu tego eksperymentu, a większość kiełków angiogennych osiąga sferoidę w siódmym dniu. Optymalnie, po czterech dniach w urządzeniu, można zaobserwować przepływ przez światła naczyń o kącie naczyniowym zdefiniowanym jako kierunek końcówki naczynia i środek sferoidy od korzenia naczyniowego.Kąty naczyniowe zmniejszają się w sposób zależny od czasu, co wskazuje na migrację kiełków angiogennych w kierunku sferoidy. RFP i GFP-HUVEC mogą skoordynowanie tworzyć pojedyncze światło naczyniowe, wyraźnie wskazując, w jaki sposób kiełki angiogenne z kanałów pierwszego i trzeciego łączą się z RFP-HUVEC w sferoidzie, tworząc ciągłą sieć naczyniową. Co więcej, FITC-dekstran wstrzyknięty do kanału pierwszego przepływa do skonstruowanej sieci naczyniowej i wnętrza sferoidy, ostatecznie docierając do kanału trzeciego, co oznacza, że zintegrowana sieć naczyniowa może dostarczać składniki odżywcze i usuwać produkty przemiany materii ze sferoidy.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się organicznym polem elektrycznym do zbadania skuteczności leków lub suplementów będących przedmiotem zainteresowania w modelach tkanek in vitro.

perfusable-vascular-network-with-tissue-model-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Prezentujemy protokół do wysokoprzepustowej produkcji kanałów naczyniowych o elastycznych rozmiarach i pożądanych wzorach na standardowej sześciodołkowej płytce przy użyciu technologii biodruku 3D, określanej jako naczynia na płytce (VOP). Platforma ta ma potencjał, aby przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń związanych z upośledzonym śródbłonkiem.

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.

Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych

Poznaj metodę konstrukcji perfuzyjnej sieci naczyniowej w sferoidach przy użyciu platformy mikroprzepływowej. Technika umożliwia symulację podawania leków in vitro i wspiera badania w dziedzinie inżynierii tkankowej oraz medycyny regeneracyjnej.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Przeglądaj więcej filmów