Elektrodeformacja z modulacją amplitudy do oceny zmęczenia mechanicznego komórek biologicznych

Nasze badania koncentrują się na badaniu biomechaniki komórek krążących, takich jak ludzkie krwinki czerwone. Wykorzystujemy elektrokinetykę, mikrofluidykę i materiałoznawstwo, aby zrozumieć mechaniczne pochodzenie uszkodzeń błon komórkowych, a także mechanizmy leżące u podstaw skrócenia żywotności komórek krwi w niektórych chorobach. Badanie zmęczenia komórek biologicznych jest wyzwaniem.

Wymaga to stosowania cyklicznych obciążeń błon komórkowych i śledzenia deformacji w poszczególnych komórkach. Korzystając z kluczowania z przesunięciem amplitudy (ASK) do modulowania zachowania elektrodeformacji czerwonych krwinek, mogliśmy określić ilościowo, w jaki sposób zmiany deformowalności komórek dostosowują się do cykli obciążenia. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że błony czerwonych krwinek mogą ulegać degradacji przez samo cykliczne rozciąganie.

Nasz protokół wykorzystuje dielektroforezę do przesuwania ogniw na krawędzie elektrod w celu pomiaru odkształcenia elektrody. Nie wymaga żadnej techniki stabilizacji i może być stosowany bezpośrednio do zawieszania komórek. Zastosowanie mikroelektrod interdigitowanych pozwala nam na pomiar kilkudziesięciu ogniw w jednym polu widzenia.

Aby przygotować pożywkę dielektroforezy lub pożywkę DEP, odważ 12,75 grama sacharozy i 0,45 grama dekstrozy za pomocą wagi. Rozpuść oba proszki w roztworze 150 mililitrów wody dejonizowanej i 3,5 mililitra PBS. Za pomocą testera przewodności o niskim zakresie zmierz przewodność, aby upewnić się, że wynosi 0.04 Siemensa na metr.

Za pomocą osmometru potwierdź, że osmolarność mieści się w normalnym zakresie osocza krwi. Przygotowane podłoże DEP należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W 15-mililitrowej probówce rozpuść 0,5 grama albuminy surowicy bydlęcej w 10 mililitrach pożywki DEP i dokładnie wymieszaj za pomocą mieszalnika wirowego, aby przygotować pożywkę główną.

Na początek przyklej taśmę do głównej płytki krzemowej SU-8 do projektowania kanału mikroprzepływowego na wewnętrznej stronie plastikowej 14-centymetrowej szalki Petriego i wyczyść ją gazowym azotem. Zważ odpowiednie ilości polidimetylosiloksanu lub bazy PDMS i utwardzacza PDMS w papierowym kubku. Za pomocą drewnianej szpatułki wymieszaj te dwa, aż mieszanina stanie się mętna biała.

Wlej mieszaninę PDMS do plastikowej szalki Petriego zawierającej płytkę krzemową. Następnie umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym wyposażonym w trójdrogowy zawór odcinający. Przekręć zawór kurka, aby podłączyć podciśnienie do komory osuszającej w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszanki.

Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza z elementów kanałów, umieść szalkę Petriego w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza na cztery godziny. Gdy szalka Petriego ostygnie do temperatury pokojowej, umieść ją na macie do krojenia. Za pomocą skalpela wytnij część PDMS nad płytką krzemową.

Umieść wycięty PDMS między dwoma arkuszami folii do owijania laboratorium. Szczelina między wcięciem mikrokanału a folią pomaga zlokalizować wlot i wylot kanału mikroprzepływowego. Następnie za pomocą żyletki wytnij pojedynczy kanał z dużego PDMS.

Za pomocą odpowiednich stempli biopsyjnych wykonaj odpowiednie otwory wlotowe i wylotowe w kanale. Umieść cały dziurkowany kanał stroną kanału skierowaną do góry na czystym szklanym szkiełku. Umieść szklane podłoże zawierające cienkowarstwowe elektrody międzypalcowe tlenku indu i cyny lub ITO na tym samym szkiełku, z elektrodami skierowanymi do góry.

Następnie delikatnie umieść szkiełko w myjce plazmowej. Po zamknięciu zaworu gazowego i włączeniu pompy należy odczekać dwie minuty, aby uzyskać odczyt czujnika od 600 do 800 militorów. Następnie włącz wyłącznik zasilania i odczekaj 30 sekund, zanim przekręcisz pokrętło zasilania RF z niskiego na wysoki i odczekasz minutę.

Następnie, aby wyłączyć zestaw, postępuj zgodnie z odwrotną sekwencją. Natychmiast po otwarciu komory myjki plazmowej należy podnieść i obrócić PDMS o 180 stopni tak, aby strona kanału była skierowana w dół. Umieść kanał na wierzchu podłoża ITO, aby rozpocząć proces klejenia.

Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij rogi PDMS przez około trzy sekundy. Załadować pożywkę gruntującą do jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 23. Powoli i ostrożnie zwilżyć kanał, wkładając igłę prosto do wlotu, przed uwolnieniem pożywki bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Po inkubacji przez co najmniej trzy minuty usunąć główne podłoże za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Na koniec przemyj kanał pożywką dielektroforetyczną trzy razy, wkładając medium do kanału. Aby rozpocząć płukanie 20 mikrolitrów krwi pełnej, odwirowując ją z jednym mililitrem PBS o temperaturze 268G przez trzy minuty.

Następnie odrzucić supernatant. Zawiesić powstałe czerwone krwinki lub erytrocyty w jednym mililitrze PBS przez delikatne pipetowanie. Ponownie umyć erytrocyty i wyrzucić supernatant, jak wykazano wcześniej.

Za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów wyekstrahuj pięć mikrolitrów granulatu RBC i całkowicie dozuj go do jednego mililitra pożywki dielektroforetycznej lub DEP. Umyć komórki i odrzucić supernatant, jak pokazano. Zawiesić granulowane krwinki czerwone w jednym mililitrze pożywki DEP przez delikatne pipetowanie.

Po umyciu komórek i odrzuceniu supernatantu, odpipetować dwa mikrolitry osadu RBC do 500 mikrolitrów pożywki DEP. Potwierdzić stężenie otrzymanej zawiesiny komórek za pomocą standardowego szkiełka do liczenia komórek. Aby rozpocząć, umieść urządzenie mikroprzepływowe w dolnej części uchwytu testowego.

Dopasuj górną część oprawy do urządzenia i za pomocą dwóch zestawów nylonowych i nakrętek zmontuj obie części. Umieść przyrząd testowy na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj jeden żądany zestaw elektrod pod mikroskopem, podłącz odpowiednią parę przewodów elektrod, które pasują do znajdującego się zestawu elektrod, do zacisku wyjściowego generatora funkcyjnego.

Usunąć pięć mikrolitrów pożywki dielektroforetycznej lub DEP z trzymilimetrowego wlotu kanału mikroprzepływowego. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów powoli załaduj pięć mikrolitrów przygotowanej zawiesiny czerwonych krwinek lub erytrocytów do wlotu i pozwól komórkom osiąść przez jedną minutę. Obserwuj kanał w 20-krotnym powiększeniu.

Naciśnij przycisk sinusoidalny i zdefiniuj falę sinusoidalną o amplitudzie średniej kwadratowej dwóch woltów z częstotliwością trzech megaherców. Naciśnij przycisk mod, aby włączyć modulację. Naciśnij opcję typu, aby zmienić tryb fali na kluczowanie z przesunięciem amplitudy lub ASK.

Ustaw częstotliwość modulacji na 250 miliherców, co odpowiada czterosekundowemu okresowi ładowania/rozładowywania. Włącz wyjście generatora funkcji i nagrywaj jednominutowe wideo co 10 minut z prędkością 30 klatek na sekundę. Erytrocyty spontanicznie reagowały na wzbudzenie elektryczne, przesuwając się w kierunku krawędzi elektrod o większym natężeniu pola.

W fazie on-keying, RBC zostały rozciągnięte z powodu odkształcenia elektrycznego, podczas gdy w fazie off-keying RBC zostały rozluźnione. Podczas śledzenia poszczególnych erytrocytów podczas godzinnego testu zmęczeniowego zaobserwowano stopniowy spadek deformacji komórek.