Name: Elektrodeformacja z modulacją amplitudy do oceny zmęczenia mechanicznego komórek biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę elektrodeformacji z modulacją amplitudy do badania zmęczenia mechanicznego erytrocytów ludzkich. Technika ta umożliwia ilościową ocenę zmian odkształcalności komórek pod wpływem cyklicznych obciążeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez NSF/CMMI Mechanobiologia Sztucznych Nośników Tlenu Opartych na Hemoglobinie (#1941655) oraz NSF/CMMI Dynamiczna i Zmęczeniowa Analiza Zdrowych i Chorych Czerwonych Krwinek (#1635312).

Niezidentyfikowana ludzka krew pełna została uzyskana komercyjnie. Prace z próbkami krwi przeprowadzono w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 z wykorzystaniem protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego na Uniwersytecie Atlantyckim Florydy.
1. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Przyklej taśmą główną płytkę krzemową SU-8 do projektowania kanału mikroprzepływowego po wewnętrznej stronie plastikowej szalki Petriego o średnicy 14 cm i wyczyść ją gazemN2.</li>
	<li>W papierowym kubku odważyć 60 g bazy polidimetylosiloksanu (PDMS) i 6 g utwardzacza PDMS. Wymieszaj dwie części za pomocą drewnianej szpatułki, aż mieszanina będzie mętna biała.</li>
	<li>Wlej mieszaninę PDMS do plastikowej szalki Petriego zawierającej płytkę krzemową. Umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym z 3-kierunkowym kranem. Przekręć zawór kurka, aby podłączyć podciśnienie do komory eksykatora w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z PDMS.</li>
	<li>Ponownie wprowadzić powietrze do komory eksykatora, regulując zawór odcinający w celu połączenia komory eksykatora z otoczeniem w cyklach około 5 minut. Powtarzaj, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte z elementów kanałów.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego w piekarniku nagrzanym do temperatury 70 °C na 4 godziny. Po upływie tego czasu wyjmij szalkę Petriego, pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej i umieść ją na macie do krojenia.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wytnij część PDMS nad płytką krzemową. Umieść wycięty PDMS między dwoma arkuszami folii do pakowania w laboratorium. Szczelina utworzona między wgłębieniem mikrokanału a półprzezroczystą folią ułatwia identyfikację lokalizacji kanału mikroprzepływowego, a także jego odpowiedniego wlotu i wylotu.</li>
	<li>Za pomocą żyletki wytnij pojedynczy kanał z dużego PDMS. Przebić otwór wlotowy 3 mm i otwór wylotowy 1,5 mm za pomocą stempli biopsyjnych odpowiednich dla dwóch rozmiarów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść kanał z otworem, stroną kanału skierowaną do góry, na czystym szkiełku podstawowym. Umieść szklane podłoże o wymiarach 20 mm x 15 mm zawierające cienkowarstwowe elektrody międzypalcowe tlenku indu i cyny (ITO) na tym samym szkiełku podstawowym z elektrodami skierowanymi do góry.</li>
	<li>Delikatnie umieść szkiełko podstawowe z PDMS i podłożem w myjce plazmowej. Zamknij zawór gazowy, włącz przełącznik pompy i odczekaj 2 minuty, aby uzyskać odczyt czujnika 600 - 800 mTorr.</li>
	<li>Włącz wyłącznik zasilania i poczekaj 30 sekund. Przekręć pokrętło zasilania RF z niskiego na wysoki i odczekaj 1 minutę.</li>
	<li>Następnie odwróć sekwencję, przekręcając pokrętło RF do pozycji niskiej, przełącznik zasilania do pozycji OFF, przełącznik pompy do pozycji OFF i otwierając zawór gazowy.</li>
	<li>Natychmiast po otwarciu komory myjki plazmowej należy podnieść i obrócić PDMS tak, aby strona kanału była skierowana w dół (180°). Umieść kanał na wierzchu podłoża ITO. Proces klejenia już się rozpoczął.</li>
	<li>Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij rogi PDMS przez około 3 sekundy. Unikaj naciskania na sam kanał. 
	UWAGA: Proces klejenia zachodzi spontanicznie po fizycznym kontakcie między dwiema obrabianymi powierzchniami.</li>
	<li>Załadować podłoże gruntujące do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 23 G. Ostrożnie zwilż kanał, wkładając igłę prosto do studzienki wlotowej, a następnie uwalniając pożywkę. Działaj powoli. Nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza. Inkubować przez co najmniej 3 minuty.</li>
	<li>Usunąć główne podłoże za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl. Umyj kanał pożywką DEP 3 razy, wkładając pożywkę DEP do kanału. Utrzymuj kanał mokry przez cały czas.</li>
</ol>
2. Urządzenie testowe
UWAGA: Urządzenie testowe zostało zaprojektowane przy użyciu oprogramowania CAD 3D i zawiera jednostkę obudowy podstawowej oraz jednostkę górną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Następnie jest produkowany przy użyciu 3-osiowej frezarki CNC o standardowej granicy tolerancji około ± 0,005 cala wymiar uchwytu testowego jest sprawdzany za pomocą suwmiarki elektronicznej (nie pokazano). Sterylność oprawy nie jest wymagana do badań biomechanicznych in vitro.
<ol>
	<li>Wstępnie przewody do końców miseczki lutowniczej dwóch zestawów sprężynowych złączy tłokowych.</li>
	<li>Włóż sprężynowe łączniki tłokowe do jednostki górnej i stwórz trwałe połączenie, dodając kroplę kleju epoksydowego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie bufora roboczego elektrodeformacji
<ol>
	<li>Aby przygotować pożywkę DEP, odważ 12,75 g sacharozy i 0,45 g dekstrozy za pomocą wagi.</li>
	<li>Rozpuść oba proszki w jednym pojemniku ze 150 ml wody dejonizowanej (DI) i 3,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Za pomocą testera przewodności niskiego zakresu zmierz przewodność i upewnij się, że wynosi 0,04 S/m (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2). 
	UWAGA: Można użyć innej wartości przewodności, co może zmienić znak i wielkość wynikowej siły DEP11. Odkształcenie elektro wymaga jednak dodatniej siły DEP.</li>
	<li>Za pomocą osmometru upewnij się, że osmolarność mieści się w normalnym zakresie osocza krwi, od 275 do 295 mOsm/kg wody (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Pożywka DEP jest teraz przygotowana.</li>
	<li>W probówce o pojemności 15 ml rozpuścić 0,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 ml pożywki DEP. Dokładnie wymieszaj. Główne podłoże urządzenia jest teraz przygotowane.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny komórek
<ol>
	<li>Przepłukać 20 μl krwi pełnej, odwirowując krew z 1 ml PBS o stężeniu 268 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić erytrocyty w 1 ml PBS. Delikatnie odpipetować do wymieszania. Myć erytrocyty przez 3 minuty w temperaturze 268 x g i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Wyekstrahować 5 μl osadu RBC za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 10 μl i całkowicie rozlać do 1 ml pożywki DEP. Umyć komórki przez odwirowanie w temperaturze 268 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić erytrocyty w 1 ml pożywki DEP. Delikatnie odpipetować do wymieszania.</li>
	<li>Myć erytrocyty przez 3 minuty w temperaturze 268 x g i wyrzucić supernatant. Odpipetować 2 μl osadu RBC do 500 μl pożywki DEP. Zawiesina komórek jest teraz przygotowywana ze stężeniem w zakresie 1 - 6,2 x 104 komórek/μL12, co można potwierdzić za pomocą standardowego szkiełka do liczenia komórek.</li>
</ol>
5. Konfiguracja elektrodeformacji i testy zmęczeniowe
<ol>
	<li>Umieść urządzenie mikroprzepływowe w dolnej części uchwytu testowego. Dopasuj górną część oprawy do urządzenia i zmontuj dwie części za pomocą dwóch zestawów nylonowych i nakrętek (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4).</li>
	<li>Umieść przyrząd testowy na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj jeden żądany zestaw elektrod pod mikroskopem.</li>
	<li>Podłącz odpowiednią parę przewodów elektrod, które pasują do znajdującego się zestawu elektrod, do zacisku wyjściowego generatora funkcyjnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Usunąć 5 μl pożywki DEP z 3 mm wlotu kanału mikroprzepływowego. Powoli załadować 5 μl zawiesiny komórek do wlotu za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl.</li>
	<li>Pozwól komórkom osiąść przez 1 minutę. W razie potrzeby dodaj dodatkowe medium DEP do wlotu, aby wepchnąć komórki do kanału.</li>
	<li>Obserwuj kanał pod 20-krotnym powiększeniem. Użyj filtra pasmowoprzepustowego 414/46 nm, aby zwiększyć kontrast obrazowania.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Sinus i zdefiniuj sinusoidę o amplitudzie2 V RMS przy częstotliwości 3 MHz. Naciśnij przycisk Mod, aby włączyć modulację. Zmień tryb fali na ASK, naciskając opcję Typ.</li>
	<li>Ustaw częstotliwość modulacji na 250 mHz, co odpowiada 4-sekundowemu okresowi ładowania-rozładowywania (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A). Włącz wyjście generatora funkcyjnego.</li>
	<li>Nagrywaj 1-minutowy film co 10 minut przy 30 klatkach na s (fps).</li>
</ol>
6. Charakterystyka deformacji RBC
<ol>
	<li>Korzystając z aplikacji do edycji wideo, otwórz .avi pliki nagrane w poprzednim kroku, naciskając Ctrl+O. Użyj osi czasu, aby wybrać interesującą klatkę i ustawić identyczną klatkę początkową i końcową zaznaczenia, naciskając Home, a następnie End na klawiaturze.</li>
	<li>Wyeksportuj ramkę obrazu. Wybierz format wyjściowy JPEG i naciśnij OK.</li>
	<li>Otwórz aplikację ImageJ i załaduj obrazy zapisane w poprzednim kroku. Zacznij od ustawienia wymaganych pomiarów, naciskając przycisk Analizuj > Ustaw pomiary i upewniając się, że pola wyboru Powierzchnia, Obwód i Elipsa dopasowania są zaznaczone. Naciśnij przycisk OK.</li>
	<li>Następnie przekonwertuj obraz na skalę szarości, wybierając opcję Obraz > Wpisz > 8-bitowy.</li>
	<li>Następnie przekonwertuj obraz na plik binarny za pomocą opcji Image > Dostosuj > progowanie. W oknie dialogowym Próg dostosuj dwa suwaki zgodnie z potrzebami. Naciśnij przycisk Zastosuj, a następnie zamknij okno dialogowe Próg.</li>
	<li>Wybierz Analizuj narzędzia > > Menedżer zwrotu z inwestycji. W Menedżerze ROI naciśnij pole wyboru Pokaż wszystko. Nie zamykaj tego pudełka.</li>
	<li>Wybierz narzędzie Różdżka (obrysowywanie), zaznacz odpowiednią komórkę na obrazie i naciśnij T na klawiaturze. Wybrana komórka zostanie ponumerowana. Można ponownie zaznaczyć nową komórkę. Zaznacz wszystkie odpowiednie komórki, które mają być mierzone. Odpowiednie komórki są identyfikowane jako te, które są odizolowane od innych komórek. Liczba tych komórek może wynosić od 50 do 200 w jednym polu widzenia.</li>
	<li>Wróć do pola Menedżer zwrotu z inwestycji i naciśnij przycisk Zmierz. Spowoduje to otwarcie okna Wyniki. Kolumny oznaczone jako Główna i Pomocnicza to długości dopasowanej osi głównej i pomocniczej elipsy (w pikselach). Wybierz opcję Plik > Zapisz jako, aby wyeksportować pomiary jako plik w formacie CSV.</li>
	<li>Korzystając z dowolnego odpowiedniego oprogramowania do analizy obliczeniowej, oblicz iloraz głównych i drugorzędnych.</li>
</ol>

Mechanical Fatigue Testing of RBCs by Amplitude-Modulated Electrodeformation

<ol><li>Kim, Y., Kim, K., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+techniques+for+red+blood+cell+deformability%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell%E2%80%94An+Overview+of+Studies+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances.</a> Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).</li>
<li>Safeukui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+sensing+and+sequestration+of+spherocytic+erythrocytes+by+the+human+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%2C+The+Journal+of+the+American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).</li>
<li>Naghedi-Baghdar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+diet+on+blood+viscosity+in+healthy+humans%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+physician%22%5BJournal%5D)">Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review.</a> Electronic physician. 10 (3), 6563(2018).</li>
<li>Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+red+cell+lifespan+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+Medicine+and+Hemotherapy%22%5BJournal%5D)">Measurement of red cell lifespan and aging.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).</li>
<li>Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+measuring+red+blood+cell+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Technologies for measuring red blood cell deformability.</a> Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).</li>
<li>Kim, J., Lee, H., Shin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+measurement+of+red+blood+cell+deformability%3A+A+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review.</a> Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).</li>
<li>Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+diversity+of+osmotic+gradient+deformability+of+red+blood+cells+in+human+and+seven+vertebrate+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species.</a> Cells. 11 (8), 1351(2022).</li>
<li>Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformation+measurement+of+individual+cells+in+large+populations+using+a+single-cell+microchamber+array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173702(2012).</li>
<li>Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).</li>
<li>Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell isolation and analysis.</a> Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).</li>
<li>Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyDEP%3A+a+new+computational+tool+for+dielectric+modeling+of+particles+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells.</a> Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).</li>
<li>Haywood, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+full+blood+count%5BTitle%5D)+AND+%22InnovAiT%22%5BJournal%5D)">Interpreting the full blood count.</a> InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).</li>
<li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+fatigue+of+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanical fatigue of human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).</li>
<li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+for+single-cell+characterization+of+impaired+deformability+in+red+blood+cells+under+recurrent+episodes+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modulacja fali sinusoidalnej indukującej siłę DEP metodą ASK OOK może być wykorzystana do badania zmęczenia mechanicznego krwinek czerwonych w długim okresie czasu. W tym protokole ograniczyliśmy testy zmęczeniowe in vitro do 1 godziny, aby zapobiec potencjalnym niekorzystnym skutkom metabolicznym dla odkształcalności komórek. Kompleksowe warunki badań zmęczeniowych można zaprogramować za pomocą techniki elektrodeformacji modulowanej ASK. Można zaprogramować takie parametry, jak częstotliwość ładowania, amplituda i szybk...

Czerwone krwinki (RBC) są najbardziej odkształcalnymi komórkami w ludzkim ciele1. Ich odkształcalność jest bezpośrednio związana z ich funkcją przenoszenia tlenu. Stwierdzono, że zmniejszona odkształcalność w krwinkach czerwonych koreluje z patogenezą kilku zaburzeń krwinek czerwonych2. Pomiary odkształcalności doprowadziły nas do lepszego zrozumienia chorób związanych z RBC3. Normalna długość życia RBC może wahać się od 70 do 140 dni4. Dlatego ważne jest, aby zmierzyć, w jaki sposób ich odkształcalność zmniejsza się wraz z procesem starzenia, np. ich zachowanie zmęczeniowe spowodowane cyklicznymi naprężeniami ścinającymi3.
Pomiar odkształcalności RBC przy dużej przepustowości jest trudny ze względu na siły skali piconewtona (~10-12 N), które są przykładane do poszczególnych komórek. W ciągu ostatniej dekady opracowano wiele technologii do pomiaru odkształcalności komórek5. Pomiary deformacji erytrocytów na poziomie pojedynczej komórki można wykonać za pomocą aspiracji pipet i pęsety optycznej, natomiast analizy masowe wykonuje się za pomocą ektacytometrii gradientu osmotycznego. Analizy ektacytometryczne dostarczają wielu danych, które dają możliwość diagnozowania chorób krwi6,7. Odkształcalność erytrocytów można również analizować przy użyciu teorii lepkosprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych z sondą koloidalną. W tej metodzie analiza obliczeniowa jest stosowana do oszacowania modułu sprężystości RBC, biorąc pod uwagę zarówno reakcje zależne od czasu, jak i w stanie ustalonym. Odkształcalność poszczególnych erytrocytów można zmierzyć za pomocą metody jednokomórkowej matrycy mikrokomorowej. Ta metoda analizuje każdą komórkę przez błonę i cytozolowe markery fluorescencyjne, aby dostarczyć informacji na temat odkształcalności RBC i rozkładu cech komórkowych w złożonych populacjach RBC w celu wykrycia zaburzeń hematologicznych8.
Zmęczenie jest kluczowym czynnikiem degradacji właściwości materiałów inżynieryjnych i biomateriałów. Badanie zmęczeniowe umożliwia ilościową analizę integralności i trwałości konstrukcji poddawanej cyklicznym obciążeniom. Analiza zmęczenia w komórkach biologicznych od dawna jest utrudniona ze względu na brak ogólnej, łatwej do zastosowania, wysokowydajnej i ilościowej metody realizacji cyklicznych deformacji w błonach komórkowych. Jest to możliwe dzięki wykorzystaniu technik modulacji sygnału elektrycznego i elektrodeformacji zastosowanych w warunkach mikroprzepływowych. Technika kluczowania z przesunięciem amplitudy (ASK) jako modulacja cyfrowa jest stosowana za pomocą modulacji kluczowania On-Off (OOK) w tym artykule. Pojęcie kluczowania odnosi się do transmisji sygnałów cyfrowych przez kanał, który do działania wymaga sygnału nośnego fali sinusoidalnej9. Czasy WŁĄCZANIA i WYŁĄCZANIA można ustawić na równe. Pod wpływem kluczowania ON, RBC wchodzą w stan zdeformowany, gdy są wystawione na działanie zewnętrznej siły elektroodkształcenia (Fdep)10 wytworzonej przez niejednorodne pole elektryczne. W trybie OFF-key RBC są w stanie zrelaksowanym. Obserwujemy zmęczenie erytrocytów, a mianowicie postępującą degradację ich zdolności do rozciągania wraz ze wzrostem cykli obciążenia. Spowodowana zmęczeniem utrata odkształcalności w krwinkach czerwonych może dostarczyć informacji na temat nagromadzonych uszkodzeń błony podczas krążenia krwi, umożliwiając nam dalsze badanie powiązań między zmęczeniem komórek a stanami chorobowymi.
Tutaj przedstawiamy procedury krok po kroku, jak testowanie zmęczeniowe RBC jest realizowane w urządzeniu mikroprzepływowym za pomocą modulowanej ASK elektrodeformacji oraz ustawień systemu, takich jak urządzenie mikroprzepływowe, obciążenie mechaniczne i obrazowanie mikroskopowe w celu scharakteryzowania stopniowej degradacji mechanicznej odkształcalności RBC.

<table><tbody><tr><td>Waga wagowa</td><td>ViBRA</td><td>HT-224R</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>BRIGHTLINE</td><td>414/46 BrightLine HC</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Jednorazowe strzykawki z Luer-Lok&trade; Końcówki, 1 ml</td><td>Stemple</td> do biopsji Fisher Scientific <td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>z systemem tłoka, 1,5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-403</td><td></td></tr><tr><td>Stemple do biopsji z systemem tłokowym, 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-407</td> igła o <td>średnicy 1,5 mm i 3 mm</td></tr><tr><td>, BSTEAN X001308N97</td><td></td><td></td><td></td>rozmiarze 23</tr><tr><td>Albumina surowicy Bovin</td><td>RMBIO</td><td>BSA-BSH</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>SCILOGEX</td><td>911015119999</td><td></td></tr><tr><td>probówka stożkowa, 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>MDX01455</td><td>MilliporeSigma&trade;</td></tr><tr><td>Miernik niskiej przewodności EC</td><td>ecoTestr</td><td>358/03</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; &nbsp; Probówki do mikrowirówek zatrzaskowych</td><td>www.eppendorf.com</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td>Generator funkcji kreślenia wykresów</td></tr><tr><td></td><td>SIGLENT</td><td>SDG830</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże elektrody szklanej/ITO</td><td>OSSILA</td><td>S161</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>OLYMPUS</td><td>IX81 -</td> SN9E07015 <td></td></tr><tr><td>Piec laboratoryjny</td><td>QUINCY LAB (QL)MODEL</td> <td>30GCE</td><td>Model cyfrowy</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Wykres</td></tr><tr><td>wykresu mikroosmometru - Model 3300</td><td>Advanced Instruments Inc.</td><td>S / N: 03050397P</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjna folia do owijania Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>FALCON</td><td>SKU=351006</td><td>ICSI/Biopsydish 50*9 mm</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>LONZA</td><td>04-479Q</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick plazma PDCOOL</td><td>NC0301989</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Dassault Systemes</td><td></td><td>Oprogramowanie CAD</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-188-2419</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>SPBEL-ART</td><td>F42400-2121</td><td></td></tr><tr><td>Drewniana szpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0304136</td><td>Depresory do języka Drewno NS 6"</td></tr></tbody></table>

elektrodeformacja z modulacją amplitudy do oceny zmęczenia mechanicznego komórek biologicznych

Amplitude-Modulated Electrodeformation to Evaluate Mechanical Fatigue of Biological Cells

Czerwone krwinki (RBC) są znane ze swojej niezwykłej odkształcalności. Wielokrotnie ulegają one znacznemu odkształceniu podczas przechodzenia przez mikrokrążenie. Zmniejszona odkształcalność jest obserwowana w fizjologicznie starzejących się erytrocytach. Istniejące techniki pomiaru odkształcalności komórek nie mogą być łatwo wykorzystane do pomiaru zmęczenia, stopniowej degradacji błon komórkowych spowodowanej cyklicznymi obciążeniami. Przedstawiamy protokół oceny degradacji mechanicznej w krwinkach czerwonych od cyklicznych naprężeń ścinających przy użyciu elektrodeformacji opartej na modulacji przesunięcia amplitudy (ASK) w kanale mikroprzepływowym. Krótko mówiąc, elektrody międzypalcowe w kanale mikroprzepływowym są wzbudzane prądem przemiennym o niskim napięciu o częstotliwościach radiowych za pomocą generatora sygnału. Erytrocyty w zawiesinie reagują na pole elektryczne i wykazują dodatnią dielektroforezę (DEP), która przesuwa ogniwa do krawędzi elektrod. Ogniwa są następnie rozciągane pod wpływem sił elektrycznych wywieranych na dwie połówki ogniw, co powoduje rozciąganie jednoosiowe, znane jako elektrodeformacja. Poziom naprężenia ścinającego i wynikające z niego odkształcenie można łatwo regulować, zmieniając amplitudę fali wzbudzenia. Umożliwia to ilościowe określenie nieliniowej odkształcalności erytrocytów w odpowiedzi na małe i duże odkształcenia przy dużej przepustowości. Modyfikacja fali wzbudzenia za pomocą strategii ASK indukuje cykliczne odkształcanie elektromagnesu z programowalnymi szybkościami obciążenia i częstotliwościami. Zapewnia to wygodny sposób charakterystyki zmęczenia RBC. Nasze podejście do elektrodeformacji z modulacją ASK umożliwia po raz pierwszy bezpośredni pomiar zmęczenia RBC spowodowanego obciążeniami cyklicznymi. Może być używany jako narzędzie do ogólnych badań biomechanicznych, do analiz odkształcalności i zmęczenia komórek w innych typach komórek i stanach chorobowych, a także może być łączony ze strategiami kontrolowania mikrośrodowiska komórek, takimi jak napięcie tlenu oraz sygnały biologiczne i chemiczne.

Po wprowadzeniu zawiesiny komórkowej do kanału mikroprzepływowego zaobserwowano stosunkowo jednorodny rozkład komórek. Po podaniu sygnału (np. prostej sinusoidy lub fazy On-Keying modulacji ASK) z generatora funkcji, cienkowarstwowe elektrody interdygitalne wytworzyły niejednorodne zmiennoprądowe pole elektryczne. Zawieszone komórki spontanicznie zareagowały na to pobudzenie elektryczne, wykazując pozytywny efekt DEP, polegający na przemieszczaniu się w stronę krawędzi elektrod o wyższym natężeniu pola. W konsekwencji ko...

Prezentowany tutaj jest protokół do badania zmęczenia mechanicznego w przypadku ludzkich czerwonych krwinek przy użyciu metody elektrodeformacji modulowanej amplitudą. To ogólne podejście można wykorzystać do pomiaru systematycznych zmian w cechach morfologicznych i biomechanicznych komórek biologicznych w zawiesinie od cyklicznej deformacji.

Elektrodeformacja z modulacją amplitudy do oceny zmęczenia mechanicznego komórek biologicznych

Red blood cells (RBCs) are known for their remarkable deformability. They repeatedly undergo considerable deformation when passing through the ...

Nasze badania koncentrują się na badaniu biomechaniki komórek krążących, takich jak ludzkie krwinki czerwone. Wykorzystujemy elektrokinetykę, mikrofluidykę i materiałoznawstwo, aby zrozumieć mechaniczne pochodzenie uszkodzeń błon komórkowych, a także mechanizmy leżące u podstaw skrócenia żywotności komórek krwi w niektórych chorobach. Badanie zmęczenia komórek biologicznych jest wyzwaniem.Wymaga to stosowania cyklicznych obciążeń błon komórkowych i śledzenia deformacji w poszczególnych komórkach. Korzystając z kluczowania z przesunięciem amplitudy (ASK) do modulowania zachowania elektrodeformacji czerwonych krwinek, mogliśmy określić ilościowo, w jaki sposób zmiany deformowalności komórek dostosowują się do cykli obciążenia. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że błony czerwonych krwinek mogą ulegać degradacji przez samo cykliczne rozciąganie.Nasz protokół wykorzystuje dielektroforezę do przesuwania ogniw na krawędzie elektrod w celu pomiaru odkształcenia elektrody. Nie wymaga żadnej techniki stabilizacji i może być stosowany bezpośrednio do zawieszania komórek. Zastosowanie mikroelektrod interdigitowanych pozwala nam na pomiar kilkudziesięciu ogniw w jednym polu widzenia.Aby przygotować pożywkę dielektroforezy lub pożywkę DEP, odważ 12,75 grama sacharozy i 0,45 grama dekstrozy za pomocą wagi. Rozpuść oba proszki w roztworze 150 mililitrów wody dejonizowanej i 3,5 mililitra PBS. Za pomocą testera przewodności o niskim zakresie zmierz przewodność, aby upewnić się, że wynosi 0.04 Siemensa na metr.Za pomocą osmometru potwierdź, że osmolarność mieści się w normalnym zakresie osocza krwi. Przygotowane podłoże DEP należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W 15-mililitrowej probówce rozpuść 0,5 grama albuminy surowicy bydlęcej w 10 mililitrach pożywki DEP i dokładnie wymieszaj za pomocą mieszalnika wirowego, aby przygotować pożywkę główną.Na początek przyklej taśmę do głównej płytki krzemowej SU-8 do projektowania kanału mikroprzepływowego na wewnętrznej stronie plastikowej 14-centymetrowej szalki Petriego i wyczyść ją gazowym azotem. Zważ odpowiednie ilości polidimetylosiloksanu lub bazy PDMS i utwardzacza PDMS w papierowym kubku. Za pomocą drewnianej szpatułki wymieszaj te dwa, aż mieszanina stanie się mętna biała.Wlej mieszaninę PDMS do plastikowej szalki Petriego zawierającej płytkę krzemową. Następnie umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym wyposażonym w trójdrogowy zawór odcinający. Przekręć zawór kurka, aby podłączyć podciśnienie do komory osuszającej w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszanki.Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza z elementów kanałów, umieść szalkę Petriego w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza na cztery godziny. Gdy szalka Petriego ostygnie do temperatury pokojowej, umieść ją na macie do krojenia. Za pomocą skalpela wytnij część PDMS nad płytką krzemową.Umieść wycięty PDMS między dwoma arkuszami folii do owijania laboratorium. Szczelina między wcięciem mikrokanału a folią pomaga zlokalizować wlot i wylot kanału mikroprzepływowego. Następnie za pomocą żyletki wytnij pojedynczy kanał z dużego PDMS.Za pomocą odpowiednich stempli biopsyjnych wykonaj odpowiednie otwory wlotowe i wylotowe w kanale. Umieść cały dziurkowany kanał stroną kanału skierowaną do góry na czystym szklanym szkiełku. Umieść szklane podłoże zawierające cienkowarstwowe elektrody międzypalcowe tlenku indu i cyny lub ITO na tym samym szkiełku, z elektrodami skierowanymi do góry.Następnie delikatnie umieść szkiełko w myjce plazmowej. Po zamknięciu zaworu gazowego i włączeniu pompy należy odczekać dwie minuty, aby uzyskać odczyt czujnika od 600 do 800 militorów. Następnie włącz wyłącznik zasilania i odczekaj 30 sekund, zanim przekręcisz pokrętło zasilania RF z niskiego na wysoki i odczekasz minutę.Następnie, aby wyłączyć zestaw, postępuj zgodnie z odwrotną sekwencją. Natychmiast po otwarciu komory myjki plazmowej należy podnieść i obrócić PDMS o 180 stopni tak, aby strona kanału była skierowana w dół. Umieść kanał na wierzchu podłoża ITO, aby rozpocząć proces klejenia.Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij rogi PDMS przez około trzy sekundy. Załadować pożywkę gruntującą do jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 23. Powoli i ostrożnie zwilżyć kanał, wkładając igłę prosto do wlotu, przed uwolnieniem pożywki bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.Po inkubacji przez co najmniej trzy minuty usunąć główne podłoże za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Na koniec przemyj kanał pożywką dielektroforetyczną trzy razy, wkładając medium do kanału. Aby rozpocząć płukanie 20 mikrolitrów krwi pełnej, odwirowując ją z jednym mililitrem PBS o temperaturze 268G przez trzy minuty.Następnie odrzucić supernatant. Zawiesić powstałe czerwone krwinki lub erytrocyty w jednym mililitrze PBS przez delikatne pipetowanie. Ponownie umyć erytrocyty i wyrzucić supernatant, jak wykazano wcześniej.Za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów wyekstrahuj pięć mikrolitrów granulatu RBC i całkowicie dozuj go do jednego mililitra pożywki dielektroforetycznej lub DEP. Umyć komórki i odrzucić supernatant, jak pokazano. Zawiesić granulowane krwinki czerwone w jednym mililitrze pożywki DEP przez delikatne pipetowanie.Po umyciu komórek i odrzuceniu supernatantu, odpipetować dwa mikrolitry osadu RBC do 500 mikrolitrów pożywki DEP. Potwierdzić stężenie otrzymanej zawiesiny komórek za pomocą standardowego szkiełka do liczenia komórek. Aby rozpocząć, umieść urządzenie mikroprzepływowe w dolnej części uchwytu testowego.Dopasuj górną część oprawy do urządzenia i za pomocą dwóch zestawów nylonowych i nakrętek zmontuj obie części. Umieść przyrząd testowy na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj jeden żądany zestaw elektrod pod mikroskopem, podłącz odpowiednią parę przewodów elektrod, które pasują do znajdującego się zestawu elektrod, do zacisku wyjściowego generatora funkcyjnego.Usunąć pięć mikrolitrów pożywki dielektroforetycznej lub DEP z trzymilimetrowego wlotu kanału mikroprzepływowego. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów powoli załaduj pięć mikrolitrów przygotowanej zawiesiny czerwonych krwinek lub erytrocytów do wlotu i pozwól komórkom osiąść przez jedną minutę. Obserwuj kanał w 20-krotnym powiększeniu.Naciśnij przycisk sinusoidalny i zdefiniuj falę sinusoidalną o amplitudzie średniej kwadratowej dwóch woltów z częstotliwością trzech megaherców. Naciśnij przycisk mod, aby włączyć modulację. Naciśnij opcję typu, aby zmienić tryb fali na kluczowanie z przesunięciem amplitudy lub ASK.Ustaw częstotliwość modulacji na 250 miliherców, co odpowiada czterosekundowemu okresowi ładowania/rozładowywania. Włącz wyjście generatora funkcji i nagrywaj jednominutowe wideo co 10 minut z prędkością 30 klatek na sekundę. Erytrocyty spontanicznie reagowały na wzbudzenie elektryczne, przesuwając się w kierunku krawędzi elektrod o większym natężeniu pola.W fazie on-keying, RBC zostały rozciągnięte z powodu odkształcenia elektrycznego, podczas gdy w fazie off-keying RBC zostały rozluźnione. Podczas śledzenia poszczególnych erytrocytów podczas godzinnego testu zmęczeniowego zaobserwowano stopniowy spadek deformacji komórek.

amplitude-modulated-electrodeformation-to-evaluate-mechanical-fatigue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Opisano wiarygodną metodę badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęskowych (OHC), obejmującą elektromotywność, motywność powolną oraz zginanie. Motywność OHC jest wywoływana poprzez stymulację zewnętrznym przemiennym polem elektrycznym, a metoda wykorzystuje szybką rejestrację obrazu, oświetlenie LED oraz najnowszej generacji oprogramowanie do analizy obrazu.

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Ten protokół opisuje krok po kroku proces budowy zarówno elektrycznych, jak i magnetycznych stymulatorów używanych do stymulacji tkanek biologicznych. Protokół zawiera wytyczne dotyczące obliczeniowej symulacji pól elektrycznych i magnetycznych oraz produkcji urządzeń stymulujących.

Urządzenia do stymulacji tkanek biologicznych i pola magnetycznego

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Poniższe badanie ocenia profil toksykologiczny wybranego szkieletu metaloorganicznego za pomocą wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i substratu (ECIS), techniki badań przesiewowych w czasie rzeczywistym o wysokiej przepustowości.

Elektryczne wykrywanie podłoża komórkowego do oceny profili toksykologicznych struktury metaloorganicznej w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę elektrodeformacji z modulacją amplitudy do badania zmęczenia mechanicznego erytrocytów ludzkich. Technika ta umożliwia ilościową ocenę zmian odkształcalności komórek pod wpływem cyklicznych obciążeń.

Elektrodeformacja z modulacją amplitudy do oceny zmęczenia mechanicznego komórek biologicznych

Przeglądaj więcej filmów