Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek
2 grudnia 2022
Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.
Prezentujemy opartą na elektronice platformę mikroprzepływową do mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek. W szczególności mierzymy właściwości elastyczne i lepkie pojedynczych komórek z przepustowością do 10 komórek na sekundę. Nasza metoda wymaga minimalnego przygotowania próbki, wykorzystuje prosty pomiar elektroniczny, zastępując drogi sprzęt optyczny i złożoną analizę obrazu, a także jest nieniszcząca, co oznacza, że nasze podejście jest kompatybilne z dalszymi analizami.
Mechano-NPS zastosowano do wielu typów komórek, w tym próbek pierwotnych, i zmierzono wpływ składników subkomórkowych na lepkosprężystość pojedynczych komórek. Może być wykorzystany do zrozumienia zachowania komórek, określenia progresji choroby lub monitorowania odpowiedzi na lek. Aby rozpocząć, usuń składniki poddane obróbce plazmowej z komory plazmowej.
Odpipetuj roztwór metanolu i wody dejonizowanej dwa do jednego na szklane podłoże za pomocą prefabrykowanych elektrod. Następnie umieść formę PDMS stroną z funkcją do dołu na szklanym podłożu. Umieść urządzenie pod stereoskopem, aby wyregulować wyrównanie.
Upiecz wyrównane urządzenie, aby zakończyć produkcję urządzenia. Przygotuj źródło ciśnienia, płytkę drukowaną, sprzęt laboratoryjny i oprogramowanie do akwizycji danych. Następnie wyrównaj kołki nagłówka zacisków z otworami na płytce drukowanej i wyrównaj kołki sprężynowe zacisków z podkładkami kontaktowymi elektrod w urządzeniu mikroprzepływowym.
Następnie włóż kołki nagłówka zacisków do otworów na płytce drukowanej, upewniając się, że kołki sprężynowe pozostają wyrównane z podkładkami stykowymi elektrody. Skonfiguruj i podłącz sprzęt elektroniczny. Następnie ustaw wartości, aby zainicjować sesję pozyskiwania danych i ustaw częstotliwość próbkowania dla akwizycji.
Hodowla i przygotowanie komórek zgodnie z odpowiednim protokołem hodowli komórkowej wybranej linii komórkowej. Następnie zawiesić komórki w przygotowanym roztworze 2% FBS i 1X PBS w stężeniu od 100 000 do 500 000 komórek na mililitr. Utrzymuj komórki na lodzie na czas trwania eksperymentów.
Aby załadować komórki do urządzenia mikroprzepływowego, przetnij 30 centymetrów rurki z politetrafluoroetylenu za pomocą żyletki. Użyj strzykawki, aby wrzucić próbkę komórek do końca rurki i podłącz ten sam koniec do wlotu urządzenia. Na koniec podłącz przeciwległy koniec rurki do mikroprzepływowego regulatora ciśnienia.
Aby przeprowadzić eksperyment, należy ustawić żądane stałe ciśnienie napędowe w oprogramowaniu regulatora ciśnienia i pozwolić, aby próbka wypełniła urządzenie. Jeśli w kanałach mikroprzepływowych tworzą się pęcherzyki, należy użyć wypełnienia ślepego zaułka. Podłącz wylot urządzenia i przyłóż niskie ciśnienie do wlotu, aby wypchnąć powietrze przez przepuszczalny gaz PDMS.
Następnie ustaw żądane napięcie, obracając pokrętło napięcia na zasilaczu i włącz napięcie, naciskając przycisk włączania. Włącz prąd przedwzmacniacz i ustaw czułość tak nisko, jak to możliwe. Alternatywnie, ustaw wzmocnienie tak wysoko, jak to możliwe, bez przeciążania przedwzmacniacza lub przekraczania maksymalnego analogowego napięcia wejściowego DAQ.
Naciśnij zielony przycisk Uruchom w menu wstążki programu MATLAB, aby rozpocząć skrypt NPS skryptu akwizycji danych. m, a następnie rozpocznij próbkowanie i zapisywanie danych. Aby zakończyć eksperyment, naciśnij przycisk Stop w lewym dolnym rogu okna wykresu na żywo, aby zakończyć skrypt akwizycji danych.
Następnie wyłącz wyjście zasilania, naciskając przycisk On. Na koniec ustaw źródło ciśnienia na zerowe ciśnienie w oprogramowaniu regulatora ciśnienia. Do analizy danych surowy sygnał powinien mieć wystarczający stosunek sygnału do szumu, aby odfiltrować szum i wyodrębnić istotne składniki.
Co najważniejsze, wzrost sygnału prądu z każdego węzła powinien być na tyle solidny, aby można było łatwo zidentyfikować podimpulsy na podstawie sygnału różnicowego. Złośliwe komórki MCF-7 mają większą dystrybucję wCDI niż niezłośliwe komórki MCF-10A, co wskazuje, że złośliwe komórki MCF-7 są bardziej miękkie niż ich niezłośliwe odpowiedniki MCF-10A. Komórki MCF-10A i MCF-7 leczone latrunkuliną wykazują wzrost wCDI.
Wyraźny rozkład wCDI różnicujący dwa podstawowe typy komórek wskazuje, że komórki LEP są bardziej miękkie niż komórki MEP. Niezłośliwe MCF-10A i nieleczone MCF-10A i MCF-7 mają większy odsetek komórek, które natychmiast się regenerują, co wskazuje na niższą lepkość niż ich złośliwe lub leczone latrunkuliną odpowiedniki. Jeśli odczyt prądu na żywo wydaje się nieprawidłowy, przerwij eksperyment i sprawdź kanał mikroprzepływowy.
Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza ani zatkań, aby ogniwa swobodnie przepływały od wlotu do wylotu. Ponieważ nasza metoda nie uszkadza komórek, można przeprowadzić dalsze analizy, takie jak sekwencja RNA lub immunofluorescencja. Może to pomóc w odkryciu niektórych podstawowych powodów, dla których komórki mają odrębne fenotypy mechaniczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą platformy mikrofluidycznej opartej na elektronicznych sensory mechano-node-pore (mechano-NPS). Platforma umożliwia pomiar zarówno właściwości elastycznych, jak i lepkich komórek z przepustowością do 10 komórek na sekundę, umożliwiając minimalną preparację próbki i nieniszczącą analizę.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikrofluidyka
Tło
- Mechano-NPS to innowacyjna platforma do badania mechaniki pojedynczych komórek.
- Metoda umożliwia analizę różnych typów komórek, w tym próbek pierwotnych.
- Dostarcza wglądu w właściwości lepkowiskotyczne komórek.
- Podejście jest zgodne z dalszymi analizami, co zwiększa jego przydatność w badaniach.
Cel badania
- Opracowanie metody mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek.
- Efektywne pomiar właściwości elastycznych i lepkich komórek.
- Ułatwienie zrozumienia zachowania komórek i postępu choroby.
Zastosowane metody
- Platforma mikrofluidyczna oparta na elektronice do analizy komórek.
- Pomiar lekowiskotyczności pojedynczych komórek.
- Minimalna preparacja próbki wymagana.
- Niniszczące pomiary zgodne z dalszymi analizami.
Główne wyniki
- Udane pomiary właściwości elastycznych i lepkich różnych typów komórek.
- Zdemonstrowane zastosowanie mechano-NPS w badaniu podkomórkowych składników.
- Możliwość monitorowania reakcji na leki i zrozumienia mechanizmów chorobowych.
Wnioski
- Mechano-NPS jest cennym narzędziem do mechanicznego fenotypowania komórek.
- Platforma oferuje opłacalną alternatywę dla tradycyjnych metod.
- Otwierają nowe drogi dla badań w dziedzinie mechaniki komórek i biofizyki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) enables rapid, label-free, multi-parameter viscoelastic profiling of single cells, addressing the need for higher-throughput, quantitative mechanical phenotyping in discovery-stage biopharma R&D. By providing both elastic and viscous measurements at moderate throughput with minimal sample preparation, this platform supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. Its compatibility with downstream analyses positions it as a reusable capability for portfolio-wide biological interrogation and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cell mechanical phenotypes relevant to disease progression and drug response.
- Supports functional target validation by distinguishing cell states based on viscoelastic properties.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking subcellular components to measurable biophysical outputs.
- Provides multi-parameter data to inform predictive confidence and triage in early discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, label-free mechanical phenotyping assays for downstream compound screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative viscoelastic readouts for assay development.
- Enables moderate-throughput screening readiness without reliance on complex optical systems.
- Supports reliable evaluation of compound effects on cell mechanics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical phenotyping with disease-relevant cellular states for translational biomarker exploration.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling downstream molecular analyses.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions based on biophysical cell state changes.
- Offers predictive de-risking for mechanistic hypotheses in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
Mechano-NPS integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking at the single-cell level.
- Discovery Biology: Quantifies viscoelastic properties to test mechanistic hypotheses and clarify disease pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Generates multi-parameter measurements (size, deformation, recovery) for robust statistical comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and downstream molecular profiling of phenotyped cells.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse cell types and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible mechanical phenotyping with minimal sample prep.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing actionable biophysical data early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement across multiple discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, electronics-based measurement, and data analysis.
- Needs access to standard soft lithography fabrication and electronic data acquisition infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data interpretation.
- Adaptable to a range of cell types and compatible with downstream molecular analyses.
- Throughput is moderate (up to 10 cells/sec), balancing depth of measurement with screening needs.
