Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Prezentujemy opartą na elektronice platformę mikroprzepływową do mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek. W szczególności mierzymy właściwości elastyczne i lepkie pojedynczych komórek z przepustowością do 10 komórek na sekundę. Nasza metoda wymaga minimalnego przygotowania próbki, wykorzystuje prosty pomiar elektroniczny, zastępując drogi sprzęt optyczny i złożoną analizę obrazu, a także jest nieniszcząca, co oznacza, że nasze podejście jest kompatybilne z dalszymi analizami.

Mechano-NPS zastosowano do wielu typów komórek, w tym próbek pierwotnych, i zmierzono wpływ składników subkomórkowych na lepkosprężystość pojedynczych komórek. Może być wykorzystany do zrozumienia zachowania komórek, określenia progresji choroby lub monitorowania odpowiedzi na lek. Aby rozpocząć, usuń składniki poddane obróbce plazmowej z komory plazmowej.

Odpipetuj roztwór metanolu i wody dejonizowanej dwa do jednego na szklane podłoże za pomocą prefabrykowanych elektrod. Następnie umieść formę PDMS stroną z funkcją do dołu na szklanym podłożu. Umieść urządzenie pod stereoskopem, aby wyregulować wyrównanie.

Upiecz wyrównane urządzenie, aby zakończyć produkcję urządzenia. Przygotuj źródło ciśnienia, płytkę drukowaną, sprzęt laboratoryjny i oprogramowanie do akwizycji danych. Następnie wyrównaj kołki nagłówka zacisków z otworami na płytce drukowanej i wyrównaj kołki sprężynowe zacisków z podkładkami kontaktowymi elektrod w urządzeniu mikroprzepływowym.

Następnie włóż kołki nagłówka zacisków do otworów na płytce drukowanej, upewniając się, że kołki sprężynowe pozostają wyrównane z podkładkami stykowymi elektrody. Skonfiguruj i podłącz sprzęt elektroniczny. Następnie ustaw wartości, aby zainicjować sesję pozyskiwania danych i ustaw częstotliwość próbkowania dla akwizycji.

Hodowla i przygotowanie komórek zgodnie z odpowiednim protokołem hodowli komórkowej wybranej linii komórkowej. Następnie zawiesić komórki w przygotowanym roztworze 2% FBS i 1X PBS w stężeniu od 100 000 do 500 000 komórek na mililitr. Utrzymuj komórki na lodzie na czas trwania eksperymentów.

Aby załadować komórki do urządzenia mikroprzepływowego, przetnij 30 centymetrów rurki z politetrafluoroetylenu za pomocą żyletki. Użyj strzykawki, aby wrzucić próbkę komórek do końca rurki i podłącz ten sam koniec do wlotu urządzenia. Na koniec podłącz przeciwległy koniec rurki do mikroprzepływowego regulatora ciśnienia.

Aby przeprowadzić eksperyment, należy ustawić żądane stałe ciśnienie napędowe w oprogramowaniu regulatora ciśnienia i pozwolić, aby próbka wypełniła urządzenie. Jeśli w kanałach mikroprzepływowych tworzą się pęcherzyki, należy użyć wypełnienia ślepego zaułka. Podłącz wylot urządzenia i przyłóż niskie ciśnienie do wlotu, aby wypchnąć powietrze przez przepuszczalny gaz PDMS.

Następnie ustaw żądane napięcie, obracając pokrętło napięcia na zasilaczu i włącz napięcie, naciskając przycisk włączania. Włącz prąd przedwzmacniacz i ustaw czułość tak nisko, jak to możliwe. Alternatywnie, ustaw wzmocnienie tak wysoko, jak to możliwe, bez przeciążania przedwzmacniacza lub przekraczania maksymalnego analogowego napięcia wejściowego DAQ.

Naciśnij zielony przycisk Uruchom w menu wstążki programu MATLAB, aby rozpocząć skrypt NPS skryptu akwizycji danych. m, a następnie rozpocznij próbkowanie i zapisywanie danych. Aby zakończyć eksperyment, naciśnij przycisk Stop w lewym dolnym rogu okna wykresu na żywo, aby zakończyć skrypt akwizycji danych.

Następnie wyłącz wyjście zasilania, naciskając przycisk On. Na koniec ustaw źródło ciśnienia na zerowe ciśnienie w oprogramowaniu regulatora ciśnienia. Do analizy danych surowy sygnał powinien mieć wystarczający stosunek sygnału do szumu, aby odfiltrować szum i wyodrębnić istotne składniki.

Co najważniejsze, wzrost sygnału prądu z każdego węzła powinien być na tyle solidny, aby można było łatwo zidentyfikować podimpulsy na podstawie sygnału różnicowego. Złośliwe komórki MCF-7 mają większą dystrybucję wCDI niż niezłośliwe komórki MCF-10A, co wskazuje, że złośliwe komórki MCF-7 są bardziej miękkie niż ich niezłośliwe odpowiedniki MCF-10A. Komórki MCF-10A i MCF-7 leczone latrunkuliną wykazują wzrost wCDI.

Wyraźny rozkład wCDI różnicujący dwa podstawowe typy komórek wskazuje, że komórki LEP są bardziej miękkie niż komórki MEP. Niezłośliwe MCF-10A i nieleczone MCF-10A i MCF-7 mają większy odsetek komórek, które natychmiast się regenerują, co wskazuje na niższą lepkość niż ich złośliwe lub leczone latrunkuliną odpowiedniki. Jeśli odczyt prądu na żywo wydaje się nieprawidłowy, przerwij eksperyment i sprawdź kanał mikroprzepływowy.

Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza ani zatkań, aby ogniwa swobodnie przepływały od wlotu do wylotu. Ponieważ nasza metoda nie uszkadza komórek, można przeprowadzić dalsze analizy, takie jak sekwencja RNA lub immunofluorescencja. Może to pomóc w odkryciu niektórych podstawowych powodów, dla których komórki mają odrębne fenotypy mechaniczne.