Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów
17 listopada 2023
Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.
Nasza grupa interesuje się systemem chemosensorycznym komarów. Mamy nadzieję, że celując w zmysł smaku i węchu komara, możemy powstrzymać go przed znalezieniem nas i ugryzieniem. Hybrydyzacja reakcji łańcuchowej fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest nowym osiągnięciem.
Technologia ta jest bardzo czuła, solidna i zdolna do multipleksowania kilku celów genowych, dzięki czemu możemy wizualizować ekspresję i lokalizację tych genów jednocześnie w ich naturalnym środowisku. Transkryptomika specjalna to najnowocześniejsza metoda stosowana w dziedzinie biologii przestrzennej. Technologia ta jest w stanie multipleksować kilka tysięcy genów i można jednocześnie wizualizować ekspresję tych genów.
Nasz protokół pozwala nam bezpośrednio wizualizować, które neurony w antenie wyrażają którykolwiek z około 50 możliwych receptorów jonotropowych. Daje nam to fundamentalną mapę drogową, która pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób ta klasa receptorów czynników może pośredniczyć w zachowaniach. Neurony węchowe w narządach węchowych owada, takie jak antena, są zwykle zakopane w ochronnej chitynowej powłoce.
To sprawia, że wizualizacja ekspresji receptorów węchowych w tych neuronach jest bardzo trudna. Nasz protokół wykorzystuje połączenie leczenia chitynazami i najnowocześniejszym protokołem fluorescencji in situ, aby przezwyciężyć te wyzwania. Na początek podgrzej rozcięte głowy komarów Anopheles w buforze CCD w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bloku grzewczym przez pięć minut.
Przenieś rurkę z główkami komarów do pieca do hybrydyzacji w celu obracania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś całą zawartość rurki do szkiełka do zegarka preparacyjnego. Za pomocą kleszczy podnieś główki lub odłączone czułki i zamocuj je w jednym mililitrze utrwalacza.
W nutatorze obracaj głowice w utrwalaczu wstępnym przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić sekcję tkanek, najpierw opłucz głowy jednym mililitrem 0,1% PBS Tween na lodzie. Następnie przenieś głowice do szkiełka do preparacji.
Pod mikroskopem preparacyjnym usuń interesujące Cię tkanki z głowy za pomocą ostrych kleszczy. Przytrzymaj przednią część głowy kleszczami i chwyć antenę innymi kleszczami od podstawy. Podobnie, usuń palpy, przenieś czułki i palpy do pustych probówek wolnych od DNRNaz umieszczonych na lodzie.
Odwodnić tkankę w 400 mikrolitrach odczynnika odwadniającego przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp odczynnik odwadniający 400 mikrolitrami metanolu absolutnego i odwodnij tkanki przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po zakończeniu utrwalania należy ponownie nawodnić tkanki w czteroetapowej serii stopniowanych roztworów nawadniających przez 10 minut na lodzie.
Następnie umyj chusteczki w 400 mikrolitrach PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować tkanki w 400 mikrolitrach roztworu proteinazy K przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj tkanki dwa razy w 400 mikrolitrach PBST, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.
Po dodaniu utrwalacza po ponownym umyciu tkanki PBST przed hybrydyzacją sondy. Zanurz tkankę w 400 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego sondy na pięć minut. Następnie usuń bufor i wstępnie zhybrydyzuj tkankę w 400 mikrolitrach podgrzanego buforu do hybrydyzacji sondy przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Zastąp podgrzany bufor hybrydyzacyjny sondy 400 mikrolitrami podgrzanego roztworu sondy. Umieść probówkę w nutatorze na dwie noce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umieść nutator w inkubatorze pokrytym pudełkiem.
Następnie zindywiduanować tkankę w 400 mikrolitrach buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Po umyciu tkanek w pięciokrotnym SSCT, inkubować w 400 mikrolitrach buforu amplifikacyjnego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować bufor wzmacniający z probówki.
Następnie dodaj mieszankę podgrzanych spinek do włosów H1 i H2. Następnie odpipetować sto mikrolitrów buforu amplifikacyjnego. Nutuj tkankę przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Aby zamontować chusteczkę, najpierw umieść pięć kropli roztworu montażowego na szklanym szkiełku.
Następnie za pomocą kleszczy chwyć umyte próbki tkanek za ich podstawę. Delikatnie zanurz i spłucz w serii kropelek roztworu montażowego. Następnie zamontuj za pomocą roztworu montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce.
Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Analizy HCR-FISHed tkanki węchowej samicy komara Anopheles wykazały, że IR41t. 1, IR75d i IR7t były mniej obfite w czułkach.
IR64a był trzy razy liczniejszy niż reszta genów kandydujących. Kolokalizację rodzin receptorów Orco i IR25a zaobserwowano w czułce, a także w palpie szczękowym komara. Wzorce kolokalizacji sugerują, że komórki dodatnie IR76b wyrażają IR25a, podczas gdy komórki dodatnie IR8a częściowo kolokalizują się z IR76b i IR25a.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół dla reakcji łańcuchowej hybrydyzacji RNA fluorescencji in situ hybridyzacji całopłaszczyznowej (HCR RNA WM-FISH), skierowany na wyjaśnienie przestrzennej i komórkowej ekspresji genów receptorów chemosensorycznych w czułkach komarów i głaszczkach szczękowych. Wykorzystując zaawansowane techniki fluorescencyjne, badanie rzuca światło na systemy chemosensoryczne i ich potencjalne implikacje dla zachowania komarów i ich interakcji z otoczeniem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biotechnologia
- Entomologia
Tło
- System chemosensoryczny komarów jest kluczowy dla ich zachowania.
- Techniki reakcji łańcuchowej hybrydyzacji umożliwiają wielokanałową wizualizację ekspresji genów.
- Wizualizacja receptorów węchowych jest wyzwaniem z powodu ograniczeń anatomicznych.
- Leczenia chityną pomagają w przezwyciężaniu barier w wizualizacji tkanek.
Cel badania
- Opracowanie metody do wizualizacji wielu genów receptorów chemosensorycznych jednocześnie.
- Dostarczenie wglądu w lokalizację i wzorce ekspresji tych receptorów.
- Ułatwienie lepszego zrozumienia zachowań sensorycznych u komarów.
Zastosowanie metod
- Protokół zastosował techniki reakcji łańcuchowej hybrydyzacji RNA WM-FISH.
- Wykorzystano komara Anopheles jako model biologiczny.
- Nie zostały wymienione żadne specyficzne przepływy wielo-omiczne.
- Kluczowe kroki obejmują fiksację tkanek, dehydratację i hybrydyzację, ze ścisłymi czasami inkubacji w różnych temperaturach.
- Wizualizacja następuje po zmontowaniu preparatów.
Główne wyniki
- Wyjaśniono wzorce ekspresji kilku receptorów jonotropiowych w czułkach komarów.
- Zaobserwowano znaczne różnice w obfitości receptorów, przy czym IR64a był znacząco bardziej ekspresowany.
- Kolokalizacja różnych rodzin receptorów wskazuje na złożone interakcje w tkankach chemosensorycznych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia, jak te receptory mediują zachowania sensoryczne.
Wnioski
- To badanie umożliwia głębsze zrozumienie systemów chemosensorycznych komarów dzięki zaawansowanym technikom wizualizacji.
- Zastosowane metody mogą ułatwić dalsze badania nad rolą receptorów sensorycznych w zachowaniu komarów.
- Uzyskane wglądy mogą pomóc w opracowaniu strategii kontroli interakcji komarów z ludźmi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Spatial mapping of chemosensory gene expression in mosquito olfactory appendages enables high-resolution target validation for vector control strategies. The HCR RNA WM-FISH protocol provides robust, multiplexed detection of gene expression, supporting predictive confidence in early discovery and mechanistic de-risking. This capability is directly relevant for biopharma teams seeking to interrogate sensory pathways and prioritize molecular targets in disease-vector insects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of chemosensory gene expression in native tissues.
- Supports functional target validation by mapping receptor localization at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying receptor co-expression and pathway architecture.
- Provides foundational data for prioritizing sensory pathway targets in vector biology.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream screening of modulators or inhibitors.
- Delivers quantitative, reproducible multiplexed readouts for assay standardization.
- Enables robust detection of multiple gene targets in a single workflow, supporting scalability.
- Improves screening readiness by confirming target presence and spatial distribution.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial gene expression with disease-relevant sensory behaviors in vector species.
- Supports translational continuity by enabling adaptation to other insect models or tissues.
- Provides predictive value for preclinical studies targeting chemosensory pathways.
- Facilitates risk-adjusted advancement of vector control candidates based on molecular evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and translational research in vector biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping gene expression in situ.
- Screening: Confirms assay readiness and reproducibility with multiplexed, quantitative outputs.
- Analytics: Provides spatial and quantitative measurements for comparing gene expression across conditions.
- Translational Research: Enables adaptation to other insect models, supporting continuity in vector-targeted programs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial transcriptomics in diverse biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable spatial gene expression workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in vector-targeted R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of sensory pathway targets for vector control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, spatial transcriptomics, and fluorescence imaging.
- Needs access to hybridization ovens, fluorescence microscopes, and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe design and imaging protocols.
- Adaptation to other insect models may require protocol optimization for tissue type and size.
- Precision in tissue handling is critical due to the fragility of olfactory appendages.
