Name: Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę HCR RNA WM-FISH do wizualizacji genów receptorów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komara Anopheles. Technika ta umożliwia jednoczesne mapowanie ekspresji wielu genów w ich naturalnym środowisku tkankowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Margo Herre i laboratorium Leslie Vosshall za udostępnienie ich protokołu hybrydyzacji in-situ dla wyrostków węchowych Aedes aegypti. Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health dla C.J.P. (NIAID R01Al137078), stypendium HHMI Hanna Gray dla J.I.R, Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award dla J.I.R. oraz stypendium podoktorskie Johns Hopkins Malaria Research Institute dla J.I.R. Dziękujemy Johns Hopkins Malaria Research Institute i Bloomberg Philanthropies za ich wsparcie.

1. Rozważania i przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Zdecyduj, czy odpowiedni będzie cały montaż lub kriosekcja tkanki. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem całościowego obrazowania in situ RNA w czułku komara Anopheles i palpie szczęki bez kriosekcji. Jeśli próbki są grubsze niż 5 mm, zaleca się kriosekcję, aby umożliwić penetrację sondy.</li>
	<li>Zidentyfikuj interesujące Cię geny i skopiuj sekwencje, w tym introny i eksony, z odpowiedniej bazy danych. Transkrybuj sekwencję genu na RNA w celu syntezy.</li>
	<li>Zdecyduj, czy kupić sondy od dostawców komercyjnych, czy też sondy będą syntetyzowane w laboratorium. 
	UWAGA: W tym badaniu sondy in situ zostały zakupione od komercyjnego dostawcy (patrz tabela materiałów). Alternatywnie można go zsyntetyzować w sposób wcześniej zgłoszony10. Odczynniki użyte w badaniu przedstawiono w tabeli 1. Materiały potrzebne do przygotowania odczynników są wymienione w Tabeli Materiałów.</li>
</ol>
2. Prefiksacja tkanek
<ol>
	<li>Znieczulenie 10-15 dorosłych samic lub samców komarów Anopheles coluzzii (szczep N'Gousso) w wieku 5-10 dni po wschodach, zbierając je za pomocą aspiratora doustnego do papierowego kubka lub plastikowej rurki i umieszczając w wiadrze zawierającym lód. Skuteczne znieczulenie wywołane zimnem można potwierdzić, gdy komary są unieruchomione.</li>
	<li>Odetnij im głowę, usuwając głowy z okolicy szyi za pomocą kleszczy. Używając ręki niedominującej, chwyć klatkę piersiową kleszczami i oddziel szyję od ciała kleszczami trzymanymi przez rękę dominującą. Umieść głowy w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl buforu dimetylosulfotlenku chitynazy-chymotrypsyny (bufor CCD) na lodzie. 
	UWAGA: Zamrożenie zwierząt może zdeformować czułki; Zalecane jest szybkie powalenie na lód. Wiek komara podczas testów może się różnić w zależności od projektu. Ważne jest, aby potwierdzić i skoordynować ich stan fizjologiczny, na przykład czy są karmione krwią, głodzone czy kryte. W tym badaniu pobrano próbki węchowych przydatków od komarów, które były karmione krwią i kojarzone.</li>
	<li>Podgrzej głowy komarów w buforze CCD w temperaturze 37 ° C na bloku grzewczym przez 5 minut, a następnie przenieś probówkę zawierającą głowy komarów do pieca hybrydyzacyjnego i obracaj w temperaturze 37 ° C. Czas inkubacji w buforze CCD zależy od rodzaju tkanki. W przypadku czułków żeńskich Anopheles należy stosować 20 min, czułków męskich potrzeba 15 minut, natomiast dłuższy czas inkubacji (1 h) potrzebny jest w przypadku palpów szczękowych.</li>
	<li>Przenieś całą zawartość probówki do szkiełka do wycinkowego zegarka. Delikatnie wlej próbkę do wgłębienia szkła zegarka (do sekcji). Jeśli główki komarów utknęły w probówce, użyj pipety, aby dodać bufor CCD do probówki i wypłucz głowicę.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś głowy lub wszelkie czułki/palpki oderwane podczas inkubacji i zamocuj w 1 ml wstępnego utrwalacza. 
	UWAGA: Pozostały bufor CCD można zachować w temperaturze -20 ° C. Bufor może być ponownie użyty do 3x. Jeśli utrwalacz wstępny zmieni kolor na lekko brązowawy z powodu przenoszenia buforu CCD przez tkanki, należy go zastąpić innym 1 ml utrwalacza.</li>
	<li>Obracać głowice w utrwalaczu wstępnym przez 24 godziny w temperaturze 4°C za pomocą nutatora. 
	UWAGA: Prędkość kołysania nutatora użytego w tym badaniu nie była regulowana; Zastosowano domyślną prędkość ustawioną przez producenta (12 obr./min).</li>
</ol>
3. Sekcja tkanek
<ol>
	<li>Płucz głowice 4x (5 min na pranie) 1 ml 0,1% PBS-Tween na lodzie. Aby uniknąć utraty próbki, użyj pipety dołączonej do końcówki ładującej żel, aby usunąć płyn. 
	UWAGA: Zamiast kroku 3.1 można wykonać dwa szybkie mycia, a następnie 10-minutowe pranie i końcowe szybkie pranie.</li>
	<li>Przenieś głowice w tubie do szkiełka do preparacji. Delikatnie wlej próbkę do wgłębienia szkiełka zegarkowego. Wypłucz głowy komarów, które utknęły w tubie, za pomocą 0,1% PBS-Tween.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym usuń interesujące tkanki (czułki/palpy) z głowy za pomocą ostrych kleszczy. Przytrzymaj tylną część głowy kleszczami i chwyć antenę innymi kleszczami od podstawy. Oczyść kleszcze papierem zwilżonym rozpuszczalnikiem wolnym od RNAzy. Usuń palpy, korzystając z tego samego procesu.</li>
	<li>Przenieś czułki i palpy za pomocą kleszczyków do pustych probówek wolnych od DNA/RNaz umieszczonych na lodzie. Oddziel różne części tkanki do wstępnie oznakowanych różnych probówek.</li>
	<li>Odwodnić tkankę w 400 μl rozpuszczalnika zawierającego mieszaninę metanolu (MeOH 80%) i dimetylosulfotlenku (DMSO 20%) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby umieszczania tkanki na nutatorze; Pozostaw go na stojaku na probówki w temperaturze pokojowej na stole laboratoryjnym. Zaleca się stosowanie świeżej mieszaniny rozpuszczalników. Aby uzyskać roztwór podstawowy o objętości 500 μl, zmieszaj 400 μl MeOH ze 100 μl DMSO.</li>
	<li>Zastąp odczynnik odwadniający 400 μl absolutnego (100%) metanolu i odwodnij tkanki przez noc w temperaturze -20 °C. Pozwól, aby tkanki osiadły grawitacyjnie i użyj pipety do usunięcia cieczy. 
	UWAGA: Próbki są zdolne do długotrwałego odwodnienia, testowano do 4 nocy bez utraty sygnału.</li>
</ol>
4. Tkanka po utrwaleniu
<ol>
	<li>Nawadniaj tkanki w czteroetapowej serii 400 μl MeOH/PBS-Tween przez 10 minut na lodzie. Zacznij od 75% MeOH/25% PBS-Tween, następnie 50% MeOH/50% PBS-Tween, następnie 25% MeOH/75% PBS-Tween, a na końcu 100% PBS-Tween. 
	UWAGA: Do usunięcia buforu z probówki można użyć końcówki ładującej żel z małym otworem, aby uniknąć utraty tkanek. Usunięcie buforu można wykonać pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Przemyć 400 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami zawierającej 0,1% Tween-20 (PBS-T) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć, umieszczając próbkę na nutatorze.</li>
	<li>Przygotować 20 μg/ml roztworu proteinazy-K i inkubować w 400 μl roztworu proteinazy-K przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Rozcieńczyć 20 mg/ml proteinazy-K (1000x roztwór podstawowy), tj. 2 μl w 2 ml 0,1% PBS-Tween. Resztki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 ° C.</li>
	<li>Zatrzymaj trawienie enzymatyczne tkanek, przemywając 2x przez 10 min 400 μL 0,1% PBS-tween.</li>
	<li>Dodać 400 μl postutrwalacza i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Prać 3x, 15 min na pranie, z 400 μL 0,1% PBS-Tween.</li>
</ol>
5. Hybrydyzacja sondy
<ol>
	<li>Inkubować tkankę w 400 μl buforu do hybrydyzacji sondy przez 5 minut. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w buforze, delikatnie pipetując.</li>
	<li>Przygotuj się do następnego kroku, podgrzewając porcję buforu hybrydyzacyjnego sondy do 37 ° C przez 30 minut.</li>
	<li>Usunąć bufor i wstępnie zhybrydyzować 400 μl wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego sondy przez 30 minut w temperaturze 37 ° C.</li>
	<li>Przygotować roztwór sondy dla docelowych receptorów chemosensorycznych (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a lub Orco), dodając 8 pM sondy. Dodać 8 μl 1 μM sondy do 500 μl wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego sondy.</li>
	<li>Usuń wstępnie podgrzany bufor hybrydyzacyjny sondy i zastąp go 400 μl podgrzanego roztworu sondy.</li>
	<li>Inkubować tkankę w temperaturze 37 ° C przez dwie noce na nutatorze umieszczonym w inkubatorze i przykrytym pod pudełkiem.</li>
</ol>
6. Wzmocnienie sondy
<ol>
	<li>Podgrzej bufor do płukania sondy do 37 ° C. Usuń nadmiar roztworu sondy, przepłukując chusteczkę 5x, po 10 minut na mycie, 400 μl buforu do płukania sondy w temperaturze 37 ° C, nutując w inkubatorze. 
	UWAGA: Można rozpocząć przygotowania do kroku 6.4. Zobacz uwagę w kroku 6.4.</li>
	<li>Próbki myć 2x, 5 minut na pranie, 400 μL 5x cytrynianu soli fizjologicznej zawierającego 10% Tween-20 (SSCT) w temperaturze pokojowej. Rozmrozić bufor wzmacniający do temperatury pokojowej na blacie stołu.</li>
	<li>Przygotować tkankę do amplifikacji przez inkubację z 400 μl buforu do amplifikacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ze względu na lepkość buforu amplifikacyjnego tkanki mogą nie być całkowicie zanurzone. Wymieszać, delikatnie pipetując bufor amplifikacyjny znajdujący się poniżej tkanki i wyrzucając bufor na wierzch tkanki, aż do zanurzenia.</li>
	<li>Oddzielnie przygotuj 18 pM spinki do włosów h1 i 18 pM spinki do włosów h2, podgrzewając 6 μl bulionu 3 μM w temperaturze 95 °C przez 90 s i schładzaj do temperatury pokojowej w ciemnej szufladzie przez 30 minut. Upewnij się, że probówki PCR są szczelnie zamknięte, aby zapobiec parowaniu spinek do włosów podczas podgrzewania w termocyklerze. 
	UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, krok 6.4 można zainicjować podczas 4.kroku prania w kroku 6.1. Spinki do włosów powinny być oddzielnie podgrzewane, aby zapobiec reakcji krzyżowej. Na tym etapie spinki do włosów nie powinny być rozcieńczane żadnym buforem. Spinki do włosów można kupić u producenta sondy wraz z sondami.</li>
	<li>Zastąp bufor wzmacniający dodany w kroku 6.3 mieszaniną zawierającą podgrzane spinki do włosów (z kroku 6.4) wraz ze 100 μl buforu do amplifikacji. Typowa reakcja będzie zawierać 6 μl h1, 6 μl h2 i 100 μl buforu amplifikacyjnego. 
	UWAGA: Spinki do włosów h1 i h2 można połączyć po schłodzeniu do temperatury pokojowej, a następnie dodać do 100 μl buforu wzmacniającego. Aby uniknąć przenoszenia próbek tkanek z jednej probówki do drugiej, bufor wzmacniający z kroku 6.3 można usunąć i zastąpić mieszaniną spinek do włosów rozcieńczoną w buforze do amplifikacji.</li>
	<li>Inkubować tkankę przez noc i nutować w ciemności w temperaturze pokojowej przy użyciu domyślnej prędkości nutatora.</li>
</ol>
7. Montaż próbki tkanki
<ol>
	<li>Rozcieńczyć bufor amplifikacyjny w inkubowanej tkance za pomocą 300 μL 5x SSCT (chlorek sodu z cytrynianem sodu rozcieńczony w Tween-20). 
	UWAGA: Rozcieńczenie jest pomocne w zmniejszeniu lepkości i ułatwia usunięcie buforu amplifikacyjnego z tkanki. Użyliśmy Triton-X 100 do etapu przed utrwaleniem i Tween-20 do etapu po utrwaleniu ze względu na różnice w ich działaniu jako środków przenikających błonę komórkową.</li>
	<li>Przemyj chusteczkę 5x 400 μL 5x SSCT w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W razie potrzeby chusteczkę należy tymczasowo przechowywać w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do montażu. Nie przekroczyliśmy 2 dni przed wykonaniem badania.</li>
	<li>Przygotuj 5 kropel roztworu montażowego na szklanym szkiełku. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby ją poszerzyć, a następnie przenieś tkankę do nowego szkiełka podstawowego.</li>
	<li>Chwyć próbki tkanek za podstawę za pomocą kleszczy, a następnie delikatnie zanurz i spłucz w serii kropelek roztworu montażowego. Uważaj, aby na tym etapie nie złamać tkanek.</li>
	<li>Zamontuj za pomocą roztworu montażowego, umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij lakierem do paznokci. Obrazowanie próbek tkanek in situ za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>

Chemosensory Gene Expression Mapping in Mosquito Olfactory Appendages

<ol><li>Konopka, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+in+Anopheles+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Olfaction in Anopheles mosquitoes.</a> Chem Senses. 46, (2021).</li>
<li>Raji, J. I., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+ionotropic+receptors+in+human+host-seeking+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes.</a> Curr Opin Insect Sci. 54, 100967(2022).</li>
<li>Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technical+review+and+guide+to+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization.</a> PeerJ. 8, e8806(2020).</li>
<li>Herre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+odor+coding+in+the+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Non-canonical odor coding in the mosquito.</a> Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).</li>
<li>Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+antennal-expressed+ionotropic+receptors+in+the+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito.</a> Cell Rep. 42 (2), 112101(2023).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+in+situ+amplification+for+multiplexed+imaging+of+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression.</a> Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).</li>
<li>Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+higher+gain%2C+lower+cost%2C+greater+durability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+multiplexed%2C+quantitative%2C+sensitive%2C+versatile%2C+robust%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145 (12), dev165753(2018).</li>
<li>Schwarzkopf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+chain+reaction+enables+a+unified+approach+to+multiplexed%2C+quantitative%2C+high-resolution+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Development. 148 (22), dev199847(2021).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+a+multiplexed+zoo+of+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression.</a> Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).</li>
<li>Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+receptors+in+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae+tuned+to+amines+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids.</a> Sci Rep. 7, 40297(2017).</li>
<li>Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+transcriptome+profiles+of+anopheline+mosquitoes+reveal+human+host+olfactory+specialization+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae.</a> BMC Genomics. 14, 749(2013).</li>
<li>Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-receptor-mediated+regulation+of+chemosensory+gene+expression+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Cell Rep. 38 (10), 110494(2022).</li>
<li>Athrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+gene+expression+in+olfactory+organs+of+the+anthropophilic+Anopheles+coluzzii+and+zoophilic+Anopheles+quadriannulatus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus.</a> BMC Genomics. 18 (1), 751(2017).</li>
<li>Task, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoreceptor+co-expression+in+Drosophila+melanogaster+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons.</a> eLife. 11, e72599(2022).</li>
<li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li>
<li>Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+quantitative+analysis+of+mRNA+expression+within+intact+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos.</a> Development. 145 (1), dev156869(2018).</li>
<li>Herre, M., Greppi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+to+visualize+gene+expression+in+peripheral+chemosensory+tissues+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).</li>
<li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year%3A+spatially+resolved+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year: spatially resolved transcriptomics.</a> Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Trzecia generacja łańcuchowej reakcji hybrydyzacji (HCR) jest niezwykła ze względu na swoją czułość i solidność w wizualizacji kilku celów RNA8. HCR WM-FISH został z powodzeniem zastosowany na zarodkach Drosophila, kurczaków, myszy i danio pręgowanego, a także na larwach nicieni i danio pręgowanego 10,16,17. Czułki komarów i szczęki są zazwyczaj podatne na wysoką autofluorescencję i słabą penetra...

Wektory komarów, takie jak Anopheles gambiae, polegają na bogatym repertuarze genów chemosensorycznych wyrażonych w ich obwodowych wyrostkach węchowych, aby rozwijać się w złożonym świecie chemicznym i identyfikować behawioralnie istotne zapachy emanujące od ludzkich gospodarzy, wykrywać źródła nektaru i lokalizować miejsca składania jaj1. Czułek komara i palp szczęki są wzbogacone w geny chemosensoryczne, które napędzają wykrywanie zapachów w tych wyrostkach węchowych. Trzy główne klasy kanałów jonowych bramkowanych ligandem napędzają wykrywanie zapachów w wyrostkach węchowych komarów: receptory zapachowe (OR), które działają z obowiązkowym koreceptorem receptora zapachowego (Orco); receptory jonotropowe (IR), które oddziałują z jednym lub więcej koreceptorami IR (IR8a, IR25a i IR76b); chemosensoryczne receptory smakowe (GR), które działają jako kompleks trzech białek do wykrywania dwutlenku węgla (CO2) 1,2.
Hybrydyzacja in situ fluorescencji RNA jest potężnym narzędziem do wykrywania ekspresji endogennego mRNA3. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta wykorzystuje znakowaną fluoroforem jednoniciową sondę kwasu nukleinowego z sekwencją komplementarną do docelowego mRNA. Wiązanie fluorescencyjnej sondy RNA z docelowym RNA umożliwia identyfikację komórek wyrażających interesujący nas transkrypt. Najnowsze osiągnięcia umożliwiają teraz wykrywanie transkryptów w całych tkankach komarów4,5. Pierwsza generacja technologii reakcji łańcuchowej hybrydyzacji (HCR) wykorzystywała wzmacniacz HCR oparty na RNA; zostało to ulepszone w metodzie drugiej generacji, która zamiast tego wykorzystywała zmodyfikowane DNA dla wzmacniacza HCR6,7. To ulepszenie spowodowało 10-krotny wzrost sygnału, radykalny spadek kosztów produkcji i znaczną poprawę trwałości odczynników6,7.
W protokole opisujemy wykorzystanie metody trzeciej generacji HCR z fluorescencyjną fluorescencją RNA in situ (HCR RNA WM-FISH), przeznaczonej do wykrywania przestrzennej lokalizacji i ekspresji dowolnego genu8,9. Ta dwuetapowa metoda najpierw wykorzystuje sondy kwasów nukleinowych specyficzne dla interesującego nas mRNA, ale które zawierają również sekwencję rozpoznawania inicjatora; drugi krok wykorzystuje spinki do włosów znakowane fluoroforem, które wiążą się z sekwencją inicjującą w celu wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Metoda ta pozwala również na multipleksowanie dwóch lub więcej sond RNA i wzmacnianie sygnałów sondy w celu ułatwienia wykrywania i kwantyfikacji RNA8. Wizualizacja obfitości transkryptów i wzorców lokalizacji RNA genów chemosensorycznych ulegających ekspresji w przydatkach węchowych oferuje pierwszą linię wglądu w funkcje genów chemosensorycznych i kodowanie zapachów.

<table><tbody><tr><td>Bufor wzmacniający</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>Instrumenty molekularne, Inc. | Hybrydyzacja in situ + immunofluorescencja</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>chlorku wapnia (CaCl2) 1M&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>21115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Chitynaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-50UN</td><td></td></tr><tr><td>Chymotrypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CHY5S-10VL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20901-551</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>11251</td><td>Numer 5</td></tr><tr><td>Końcówka ładująca żel</td><td>Costar</td><td>4853</td><td>1-200 &micro; Końcówka L</td></tr><tr><td>Spinki do włosów&nbsp;</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>Instrumenty molekularne, Inc. | Hybrydyzacja in situ + inicjator immunofluorescencji</td><td>h1 i h2 rozdziela</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Sonda IR25a</td><td>Instrumenty molekularne Identyfikator</td><td>zestawu sond: PRK149&nbsp;</td><td>AGAP010272</td></tr><tr><td>Sonda IR41t.1</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>&nbsp; Identyfikator zestawu sondy: PRK978</td><td>AGAP004432</td></tr><tr><td>Sonda IR64a</td><td>Instrumenty molekularne Identyfikator</td><td>zestawu sond: PRK700&nbsp;</td><td>AGAP004923</td></tr><tr><td>Sonda IR75d</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>Zestaw sond ID: PRK976</td><td>AGAP004969</td></tr><tr><td>Sonda IR76b</td><td>Sonda instrumentów molekularnych</td><td>ID: PRI998</td><td>AGAP011968</td></tr><tr><td>Sonda IR7t</td><td>Identyfikator zestawu sond do instrumentów molekularnych</td><td>: PRL355</td><td>AGAP002763</td></tr><tr><td>Sonda IR8a</td><td>Zestaw sond do instrumentów molekularnych</td><td>ID: PRK150</td><td>AGAP010411</td></tr><tr><td>Rurki LoBind</td><td>VWR</td><td>80077-236</td><td>0,5 mL DNA/RNA Probówki LoBind</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2) 1M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>A412-500</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Thermo Fisher</td><td>43-879-36</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Denville Scientific</td><td>Model 135</td><td>3-D Mini rocker</td></tr><tr><td>Sonda Orco</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>Zestaw sond ID PRD954</td><td>AGAP002560</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (20%)</td> <td>Usługi mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>15713-S Sól fizjologiczna</td><td></td></tr><tr><td>buforowana fosforanami (10X PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny sondy</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>https://www.molecularinstruments.com/</td> <td>50 ml</td></tr><tr><td>Bufor do płukania sondy</td><td>Instrumenty molekularne Instrumenty molekularne</td><td>Instrumenty molekularne, Inc. | Hybrydyzacja in situ + immunofluorescencja</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian soli fizjologicznej (SSC) 20x&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-557-044</td><td></td></tr><tr><td>Diament SlowFade</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>S36972</td><td>roztwór montażowy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl) 5M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp; (10 %)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (10%) Teknova</td><td></td> <td>T0027</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko zegarka</td><td>Carolina</td><td>742300</td><td>&nbsp; 1 5/8" kwadrat; przejrzysty</td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja reakcja łańcuchowa rna cała góra fluorescencja in situ hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Hybridization Chain Reaction RNA Whole-Mount Fluorescence In situ Hybridization of Chemosensory Genes in Mosquito Olfactory Appendages

Komary są skutecznymi wektorami śmiertelnych chorób i mogą poruszać się w swoim chemicznym środowisku za pomocą receptorów chemosensorycznych wyrażonych w ich węchowych przydatkach. Zrozumienie, w jaki sposób receptory chemosensoryczne są zorganizowane przestrzennie w obwodowych przydatkach węchowych, może dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób zapach jest kodowany w układzie węchowym komarów i dostarczyć nowych sposobów zwalczania rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez komary. Pojawienie się trzeciej generacji hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, fluorescencji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), pozwala na mapowanie przestrzenne i jednoczesne profilowanie ekspresji wielu genów chemosensorycznych. W tym miejscu opisujemy stopniowe podejście do wykonywania HCR RNA WM-FISH na czułce komara Anopheles i palpie szczęki. Zbadaliśmy czułość tej techniki, badając profil ekspresji jonotropowych receptorów węchowych. Zapytaliśmy, czy opisana technika HCR WM-FISH jest odpowiednia do badań multipleksowych poprzez wiązanie sond RNA z trzema spektralnie różnymi fluoroforami. Wyniki dostarczyły dowodów na to, że HCR RNA WM-FISH jest bardzo czuły na jednoczesne wykrywanie wielu genów chemosensorycznych w czułkach i wyrostkach węchowych szczęki. Dalsze badania potwierdzają przydatność HCR WM-FISH do profilowania koekspresji podwójnych i potrójnych celów RNA. Technika ta, po zastosowaniu z modyfikacjami, może być przystosowana do lokalizacji interesujących genów w tkankach węchowych innych gatunków owadów lub w innych przydatkach.

Wykrywanie genów chemosensorycznych w czułkach Anopheles 
Zbadaliśmy czułość metody HCR FISH (Rysunek 1) w wykrywaniu ekspresji receptorów chemosensorycznych w tkankach węchowych komarów. Kierując się danymi dotyczącymi transkrypcji RNA, zgłoszonymi wcześniej dla czułek samic komara Anopheles, opracowaliśmy sondy skierowane przeciwko różnym IR. Średnie wartości transkrypcji z czterech niezależnych badań transkryptomu czułek wykazały, że Ir41t.1 (11 RPKM)...

Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Mosquitoes are effective vectors of deadly diseases and can navigate their chemical environment using chemosensory receptors expressed in their olfactory ...

Nasza grupa interesuje się systemem chemosensorycznym komarów. Mamy nadzieję, że celując w zmysł smaku i węchu komara, możemy powstrzymać go przed znalezieniem nas i ugryzieniem. Hybrydyzacja reakcji łańcuchowej fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest nowym osiągnięciem.Technologia ta jest bardzo czuła, solidna i zdolna do multipleksowania kilku celów genowych, dzięki czemu możemy wizualizować ekspresję i lokalizację tych genów jednocześnie w ich naturalnym środowisku. Transkryptomika specjalna to najnowocześniejsza metoda stosowana w dziedzinie biologii przestrzennej. Technologia ta jest w stanie multipleksować kilka tysięcy genów i można jednocześnie wizualizować ekspresję tych genów.Nasz protokół pozwala nam bezpośrednio wizualizować, które neurony w antenie wyrażają którykolwiek z około 50 możliwych receptorów jonotropowych. Daje nam to fundamentalną mapę drogową, która pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób ta klasa receptorów czynników może pośredniczyć w zachowaniach. Neurony węchowe w narządach węchowych owada, takie jak antena, są zwykle zakopane w ochronnej chitynowej powłoce.To sprawia, że wizualizacja ekspresji receptorów węchowych w tych neuronach jest bardzo trudna. Nasz protokół wykorzystuje połączenie leczenia chitynazami i najnowocześniejszym protokołem fluorescencji in situ, aby przezwyciężyć te wyzwania. Na początek podgrzej rozcięte głowy komarów Anopheles w buforze CCD w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bloku grzewczym przez pięć minut.Przenieś rurkę z główkami komarów do pieca do hybrydyzacji w celu obracania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś całą zawartość rurki do szkiełka do zegarka preparacyjnego. Za pomocą kleszczy podnieś główki lub odłączone czułki i zamocuj je w jednym mililitrze utrwalacza.W nutatorze obracaj głowice w utrwalaczu wstępnym przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić sekcję tkanek, najpierw opłucz głowy jednym mililitrem 0,1% PBS Tween na lodzie. Następnie przenieś głowice do szkiełka do preparacji.Pod mikroskopem preparacyjnym usuń interesujące Cię tkanki z głowy za pomocą ostrych kleszczy. Przytrzymaj przednią część głowy kleszczami i chwyć antenę innymi kleszczami od podstawy. Podobnie, usuń palpy, przenieś czułki i palpy do pustych probówek wolnych od DNRNaz umieszczonych na lodzie.Odwodnić tkankę w 400 mikrolitrach odczynnika odwadniającego przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp odczynnik odwadniający 400 mikrolitrami metanolu absolutnego i odwodnij tkanki przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po zakończeniu utrwalania należy ponownie nawodnić tkanki w czteroetapowej serii stopniowanych roztworów nawadniających przez 10 minut na lodzie.Następnie umyj chusteczki w 400 mikrolitrach PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować tkanki w 400 mikrolitrach roztworu proteinazy K przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj tkanki dwa razy w 400 mikrolitrach PBST, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.Po dodaniu utrwalacza po ponownym umyciu tkanki PBST przed hybrydyzacją sondy. Zanurz tkankę w 400 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego sondy na pięć minut. Następnie usuń bufor i wstępnie zhybrydyzuj tkankę w 400 mikrolitrach podgrzanego buforu do hybrydyzacji sondy przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Zastąp podgrzany bufor hybrydyzacyjny sondy 400 mikrolitrami podgrzanego roztworu sondy. Umieść probówkę w nutatorze na dwie noce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umieść nutator w inkubatorze pokrytym pudełkiem.Następnie zindywiduanować tkankę w 400 mikrolitrach buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Po umyciu tkanek w pięciokrotnym SSCT, inkubować w 400 mikrolitrach buforu amplifikacyjnego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować bufor wzmacniający z probówki.Następnie dodaj mieszankę podgrzanych spinek do włosów H1 i H2. Następnie odpipetować sto mikrolitrów buforu amplifikacyjnego. Nutuj tkankę przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Aby zamontować chusteczkę, najpierw umieść pięć kropli roztworu montażowego na szklanym szkiełku.Następnie za pomocą kleszczy chwyć umyte próbki tkanek za ich podstawę. Delikatnie zanurz i spłucz w serii kropelek roztworu montażowego. Następnie zamontuj za pomocą roztworu montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce.Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Analizy HCR-FISHed tkanki węchowej samicy komara Anopheles wykazały, że IR41t. 1, IR75d i IR7t były mniej obfite w czułkach.IR64a był trzy razy liczniejszy niż reszta genów kandydujących. Kolokalizację rodzin receptorów Orco i IR25a zaobserwowano w czułce, a także w palpie szczękowym komara. Wzorce kolokalizacji sugerują, że komórki dodatnie IR76b wyrażają IR25a, podczas gdy komórki dodatnie IR8a częściowo kolokalizują się z IR76b i IR25a.

hybridization-chain-reaction-rna-whole-mount-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Korzystając z dwóch metod do oszacowania ekspresji genów w głównych wyrostkach smakowych Aedes aegypti, zidentyfikowaliśmy zestaw genów przypuszczalnie leżących u podstaw reakcji neuronalnych na gorzkie i odpychające związki, zgodnie z badaniem elektrofizjologicznym.

Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół hybrydyzacji RNA in situ, szczególnie dla niskopoziomowych genów receptora zapachowego (OR), jak również innych genów, w czułkach owadów za pomocą sond znakowanych digoksygeniną (DIG) lub biotyną.

Lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację RNA in situ

Biorąc pod uwagę ich prostą anatomię, jądra Anopheles oferują dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje hybrydyzację in situ z fluorescencją na całej górze, technikę stosowaną do badania tego procesu biologicznego, a także fenotyp szczepów transgenicznych zawierających mutacje w genach zaangażowanych w produkcję plemników.

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Przedstawiono kombinację różnych technik w celu maksymalizacji zakresu gromadzonych danych z tkanki mysiej.

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

Tutaj opisujemy proces barwienia immunologicznego czułków Drosophila przez całe mocowanie, co pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne związane z dywersyfikacją neuronów receptorów węchowych (ORN).

Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Poznaj metodę HCR RNA WM-FISH do wizualizacji genów receptorów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komara Anopheles. Technika ta umożliwia jednoczesne mapowanie ekspresji wielu genów w ich naturalnym środowisku tkankowym.

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów (Wideo) | JoVE Journal

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Przeglądaj więcej filmów