Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Nasza grupa interesuje się systemem chemosensorycznym komarów. Mamy nadzieję, że celując w zmysł smaku i węchu komara, możemy powstrzymać go przed znalezieniem nas i ugryzieniem. Hybrydyzacja reakcji łańcuchowej fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest nowym osiągnięciem.

Technologia ta jest bardzo czuła, solidna i zdolna do multipleksowania kilku celów genowych, dzięki czemu możemy wizualizować ekspresję i lokalizację tych genów jednocześnie w ich naturalnym środowisku. Transkryptomika specjalna to najnowocześniejsza metoda stosowana w dziedzinie biologii przestrzennej. Technologia ta jest w stanie multipleksować kilka tysięcy genów i można jednocześnie wizualizować ekspresję tych genów.

Nasz protokół pozwala nam bezpośrednio wizualizować, które neurony w antenie wyrażają którykolwiek z około 50 możliwych receptorów jonotropowych. Daje nam to fundamentalną mapę drogową, która pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób ta klasa receptorów czynników może pośredniczyć w zachowaniach. Neurony węchowe w narządach węchowych owada, takie jak antena, są zwykle zakopane w ochronnej chitynowej powłoce.

To sprawia, że wizualizacja ekspresji receptorów węchowych w tych neuronach jest bardzo trudna. Nasz protokół wykorzystuje połączenie leczenia chitynazami i najnowocześniejszym protokołem fluorescencji in situ, aby przezwyciężyć te wyzwania. Na początek podgrzej rozcięte głowy komarów Anopheles w buforze CCD w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bloku grzewczym przez pięć minut.

Przenieś rurkę z główkami komarów do pieca do hybrydyzacji w celu obracania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś całą zawartość rurki do szkiełka do zegarka preparacyjnego. Za pomocą kleszczy podnieś główki lub odłączone czułki i zamocuj je w jednym mililitrze utrwalacza.

W nutatorze obracaj głowice w utrwalaczu wstępnym przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić sekcję tkanek, najpierw opłucz głowy jednym mililitrem 0,1% PBS Tween na lodzie. Następnie przenieś głowice do szkiełka do preparacji.

Pod mikroskopem preparacyjnym usuń interesujące Cię tkanki z głowy za pomocą ostrych kleszczy. Przytrzymaj przednią część głowy kleszczami i chwyć antenę innymi kleszczami od podstawy. Podobnie, usuń palpy, przenieś czułki i palpy do pustych probówek wolnych od DNRNaz umieszczonych na lodzie.

Odwodnić tkankę w 400 mikrolitrach odczynnika odwadniającego przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp odczynnik odwadniający 400 mikrolitrami metanolu absolutnego i odwodnij tkanki przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po zakończeniu utrwalania należy ponownie nawodnić tkanki w czteroetapowej serii stopniowanych roztworów nawadniających przez 10 minut na lodzie.

Następnie umyj chusteczki w 400 mikrolitrach PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować tkanki w 400 mikrolitrach roztworu proteinazy K przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj tkanki dwa razy w 400 mikrolitrach PBST, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.

Po dodaniu utrwalacza po ponownym umyciu tkanki PBST przed hybrydyzacją sondy. Zanurz tkankę w 400 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego sondy na pięć minut. Następnie usuń bufor i wstępnie zhybrydyzuj tkankę w 400 mikrolitrach podgrzanego buforu do hybrydyzacji sondy przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zastąp podgrzany bufor hybrydyzacyjny sondy 400 mikrolitrami podgrzanego roztworu sondy. Umieść probówkę w nutatorze na dwie noce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umieść nutator w inkubatorze pokrytym pudełkiem.

Następnie zindywiduanować tkankę w 400 mikrolitrach buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Po umyciu tkanek w pięciokrotnym SSCT, inkubować w 400 mikrolitrach buforu amplifikacyjnego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować bufor wzmacniający z probówki.

Następnie dodaj mieszankę podgrzanych spinek do włosów H1 i H2. Następnie odpipetować sto mikrolitrów buforu amplifikacyjnego. Nutuj tkankę przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Aby zamontować chusteczkę, najpierw umieść pięć kropli roztworu montażowego na szklanym szkiełku.

Następnie za pomocą kleszczy chwyć umyte próbki tkanek za ich podstawę. Delikatnie zanurz i spłucz w serii kropelek roztworu montażowego. Następnie zamontuj za pomocą roztworu montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce.

Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Analizy HCR-FISHed tkanki węchowej samicy komara Anopheles wykazały, że IR41t. 1, IR75d i IR7t były mniej obfite w czułkach.

IR64a był trzy razy liczniejszy niż reszta genów kandydujących. Kolokalizację rodzin receptorów Orco i IR25a zaobserwowano w czułce, a także w palpie szczękowym komara. Wzorce kolokalizacji sugerują, że komórki dodatnie IR76b wyrażają IR25a, podczas gdy komórki dodatnie IR8a częściowo kolokalizują się z IR76b i IR25a.