Name: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ całych zarodków Drosophila melanogaster do analizy ekspresji i lokalizacji RNA. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie dynamiki genów w embriogenezie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca prowadzona w laboratorium Lécuyera jest wspierana przez fundusze z National Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), Canadian Institutes of Health Research (CIHR) oraz Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre i Gaël Moquin-Beaudry są wspierani przez stypendia naukowe NSERC, a Carole Iampietro jest wspierana przez stypendium podoktorskie Angelo Pizzagalli.

1. Przygotowanie sondy RNA
Przegląd: Poniższa sekcja opisuje kroki wymagane do stworzenia sond RNA znakowanych digoksygeniną (Dig) odpowiednich dla FISH. Pierwszy krok polega na klonowaniu lub amplifikacji PCR sekwencji odpowiadającej transkrybowanemu regionowi genu będącego przedmiotem zainteresowania, który zostanie wykorzystany do wygenerowania sondy specyficznej dla sekwencji. Można to osiągnąć, najpierw klonując segment genu do plazmidu, w którym wielokrotne miejsce klonowania jest otoczone elementami promotora bakteriofagów (T7, T3 lub Sp6), które mogą następnie służyć jako matryca do PCR przy użyciu starterów flankujących, które zawierają sekwencje promotorowe, generując w ten sposób liniowy produkt PCR z różnymi sekwencjami promotorowymi na każdym końcu (Figura 1A). Alternatywnie, aby uniknąć etapu klonowania, można również przeprowadzić amplifikację PCR z genomowego DNA lub cDNA przy użyciu oligonukleotydów, które zawierają sekwencje T7, T3 lub Sp6 na ich końcach 5' (np. T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGAGA-3'; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3'). Liniowe produkty PCR są następnie wykorzystywane jako matryce do tworzenia sond RNA z sensem lub antysensem znakowanych Dig poprzez spływ transkrypcji in vitro z odpowiednią polimerazą (Figura 1B). Podczas wykonywania sond dla określonych genów zalecamy przygotowanie zarówno sond RNA sensownych, jak i antysensownych przy użyciu odrębnych polimeraz, które będą pomocne w ocenie specyficzności sygnału FISH (tj. jeśli interesujący nas gen nie zostanie przepisany w orientacji antysensownej, sonda sensownego RNA ujawni poziom sygnału tła). We wszystkich poniższych krokach należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć potencjalnej degradacji przez zanieczyszczenie rybonukleaz (RNA), najpierw czyszcząc wszystkie obszary stołu i sprzęt 70% etanolem lub dostępnymi w handlu roztworami do odkażania RNAzy oraz używając materiałów niezawierających RNAzy (np. wody, końcówek, probówek do mikrowirówek).
Materiały
<ul>
 <li>Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (Abgene, Rochester, NY, USA Kat. Nr 0900)</li>
 <li>Zestawy do ekstrakcji żelu (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada; Kot. Nr 28706).</li>
 <li>Woda wolna od RNA (Bisent, Inc. Kat. Nr 809-115-CL)</li>
 <li>Polimerazy RNA (T7, T3 lub SP6). (20 U/ μl, Fermentas Biosciences. Kot. Nie. EP0101, EP0111, EP0131).</li>
 <li>Inhibitory rybonukleazy RNAse-OUT (40 U/μl), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nr 10777-019).</li>
 <li>Mieszaniny nukleotydów digoksygeniny (DIG) (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Kanada. Kot. Nr 11209256910).</li>
</ul>
Wyposażenie
<ul>
 <li>Mikrowirówka stołowa</li>
 <li>Aparatura do elektroforezy żelowej</li>
</ul>
<ol>
 <li>PCR amplifikuje sekwencję specyficzną dla genu z genomowego DNA, cDNA lub plazmidowego DNA w celu wytworzenia liniowego produktu PCR otoczonego sekwencjami promotora bakteriofagów T7, T3 lub Sp6. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi warunków PCR.</li>
 <li>Sprawdź jakość i rozmiar produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wyciąć i oczyścić produkt PCR za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z zaleceniami producenta i wymyć produkt w 50 μl buforu.</li>
 <li>Wytrącić produkt PCR, dodając 5 μl octanu sodu 3M (pH 5,2) i 150 μl lodowatego 100% etanolu i umieścić probówki w temperaturze -70 °C na noc. Probówki wirować o sile 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przemyć granulki 70% etanolem. Ponownie zawiruj, usuń wszelkie ślady etanolu i wysusz granulkę na powietrzu. Zawiesić ponownie w 25-50 μl wody wolnej od RNAzy.</li>
 <li>Transkrybować sondę znakowaną Dig przy użyciu 200-500 ng oczyszczonego produktu PCR w reakcji 20 μl w następujący sposób: 2 μl 10X buforu transkrypcyjnego T7 (Invitrogen), 1 μl (20 U / μl) inhibitora RNAzy, 2 μl mieszaniny Dig-NTP i 2 μl polimerazy T7 RNA (20 U / μl). Doprowadzić ostateczną objętość do 20 μl wodą bez RNAse. Inkubować reakcję transkrypcji w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny.</li>
 <li>Dostosuj mieszaninę transkrypcyjną do 50 μl wodą wolną od RNAzy i wytrącić sondę RNA znakowaną Dig, jak opisano w kroku 4. Ponownie zawiesić przemyty osad RNA w 100 μl wody wolnej od RNAse. Zawieszone próbki należy przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
 <li>Określ ilościowo sondę za pomocą spektrofotometru nanokroplowego. Aby zweryfikować jakość sondy, należy przeprowadzić próbkę o objętości 1-2 μl na 1-2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.</li>
</ol>
2. Pobieranie i utrwalanie zarodków Drosophila
Przegląd: Ta sekcja opisuje etapy pobierania i przetwarzania zarodków Drosophila. W zależności od liczby potrzebnych zarodków muchy mogą być trzymane w klatkach populacyjnych o różnych rozmiarach. Poniższe kroki dotyczą zbiorów wykonywanych przy użyciu3 cylindrycznych klatek o długości 900 cm przy użyciu talerzy do zbierania soku jabłkowego o średnicy 100 mm. Prawidłowe utrwalenie wymaga usunięcia dwóch warstw ochronnych otaczających zarodek: kosmówki zewnętrznej i błony wewnętrznej błony witelinowej 13. Po zebraniu zarodki są najpierw kąpane w 50% roztworze wybielacza w celu usunięcia kosmówki, a następnie są mieszane w dwufazowym roztworze zawierającym heptan (przenika przez błonę witeliny) i PBS zawierającym 3,7% formaldehydu. Błona witeliny jest następnie pękana i usuwana poprzez przeniesienie zarodków do dwufazowej mieszaniny heptanu i metanolu. Prawidłowe utrwalenie zarodka i usunięcie błony witelinowej ma kluczowe znaczenie dla powodzenia dalszej procedury FISH.
Materiały
<ul>
 <li>Talerze agarowe z sokiem jabłkowym (40% soku jabłkowego, 4% sacharozy, 3,5% agaru, 0,3% metyloparabenu) z pastą drożdżową wielkości dziesięciocentówki (drożdże piekarskie zmieszane z wodą do konsystencji masła)</li>
 <li>Sproszkowany paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA; Kot. Nr 19208)</li>
 <li>heptan</li>
 <li>metanol</li>
 <li>3% roztwór wybielacza</li>
 <li>Szklane fiolki scyntylacyjne o pojemności 20 ml (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada; Kot. Nr 03-337-15).</li>
</ul>
Wyposażenie
<ul>
 <li>Klatki dla populacji</li>
 <li>Kosze zbiorcze (wykonane z siatki Nitex i górnej części wyciętej rurki polipropylenowej o pojemności 50 ml, w której wycięto otwór w pokrywie).</li>
 <li>Mały pędzel</li>
 <li>Wir na blacie stołu</li>
</ul>
<ol>
 <li>Wstępnie wyczyść dobrze odżywione klatki populacyjne za pomocą świeżego soku jabłkowego/talerza drożdżowego przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.</li>
 <li>Dodaj nowy talerz soku jabłkowego/drożdży do klatki, aby zebrać zarodki we wczesnym stadium rozwoju. Inkubować klatkę przez 4 godziny w temperaturze 25 °C (należy pamiętać, że czas zbierania można dostosować w zależności od pożądanych etapów).</li>
 <li>Przygotuj świeży 37% roztwór formaldehydu, łącząc 3,7 g proszku paraformaldehydu, 70 μl 2N KOH i 7,3 ml wody miliQ w szklanej fiolce scyntylacyjnej pod kapturem chemicznym. Gotować roztwór, aż proszek paraformaldehydu całkowicie się rozpuści, następnie schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować do nowej fiolki scyntylacyjnej.</li>
 <li>Przygotować dwufazowy roztwór utrwalający, łącząc 2,25 ml 1X PBS z 250 ml 37% formaldehydu w fiolce scyntylacyjnej, a następnie dodając 7,5 ml heptanu.</li>
 <li>Zbierz talerz z sokiem jabłkowym z klatki i zbierz zarodki, dodając trochę wody z kranu o temperaturze pokojowej i delikatnie strzepując zarodki z talerza pędzlem. Przenieś zawieszone zarodki do koszyka i spłucz letnią wodą z kranu.</li>
 <li>Dekorionuj zarodki przez 90 sekund, kąpiąc kosze zbiorcze w roztworze wybielacza, a następnie dokładnie spłucz letnią wodą z kranu (aż zapach wybielacza zniknie).</li>
 <li>Zdemontuj kosz do pobierania zarodków, delikatnie zbierz zarodki za pomocą pędzla i przenieś je do dwufazowego roztworu utrwalającego. Zarodki gromadzą się na granicy między warstwami PBS i heptanu.</li>
 <li>Uszczelnić fiolki scyntylacyjne i przymocować do mieszalnika wirowego. Wstrząsaj przez 20 minut na najniższym ustawieniu.</li>
 <li>Usunąć i wyrzucić większość dolnych PBS i górnych faz heptanu za pomocą pipety Pasteura. Odessać pozostałą mieszaninę PBS/heptanu/zarodków do pipety. Kroplami wyrzuć dolną fazę PBS z pipety, uważając, aby nie wyeliminować zarodków. Umieścić zarodki w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej dwufazowy roztwór 500 μl heptanu (górna faza) i 500 μl metanolu (dolna faza).</li>
 <li>Potrząsaj energicznie probówkami ręcznie przez 30-45 sekund, aby rozbić błony witelinowe. Po pęknięciu zarodki zatopią się w metanolu.</li>
 <li>Odrzucić górną fazę heptanu i niepęknięte zarodki na skrzyżowaniu heptan/metanol i dodać 500 μl metanolu. Wstrząsaj przez 5 sekund.</li>
 <li>Umyj 3 razy metanolem i przechowuj zarodki w temperaturze -20 °C (w tym momencie zarodki mogą być przechowywane przez tygodnie/miesiące).</li>
</ol>
3. Przetwarzanie po utrwaleniu, hybrydyzacja i mycie po hybrydyzacji
Przegląd: Ta sekcja szczegółowo opisuje etapy przetwarzania permeabilizacji zarodków przed FISH, przed hybrydyzacją, hybrydyzacją za pomocą sond RNA i myciem po hybrydyzacji. W początkowych etapach przepuszczalności zarodki są traktowane jako pula w pojedynczej probówce (kroki 1-9 poniżej, dążąc do 10-15 μl osiadłych zarodków/próbki), ale są one rozdzielane na porcje do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki PCR przed przejściem do etapu wstępnej hybrydyzacji (krok 10 poniżej). Pomaga to zapewnić równomierne traktowanie wszystkich zarodków w początkowych fazach eksperymentu. Podczas przygotowywania eksperymentu FISH ważne jest, aby uwzględnić kontrole ujemne w celu określenia poziomu sygnału tła w poszczególnych eksperymentach. W tym celu zalecamy dołączenie próbki "bez sondy" i, jak wspomniano w sekcji 1, próbki zhybrydyzowanej z sondą RNA "sense", która zazwyczaj daje sygnał porównywalny do stanu "bez sondy".
Materiały:
<ul>
 <li>metanol</li>
 <li>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,1% Tween-20 (PBT)</li>
 <li>Proteinaza-K 1 mg/ml roztwór podstawowy (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Nr katalogowy P2308)</li>
 <li>Glicyna (20 mg/ml roztworu podstawowego)</li>
 <li>Roztwór hybrydyzacyjny: 50% formamidu, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 g/ml DNA nasienia strzyżenia łososia, 100 μg/ml heparyny.</li>
 <li>0,2 ml 96-dołkowe płytki PCR z półspódniczką, Abgene, Rochester, NY, USA Cat. Nr 0900)</li>
</ul>
Wyposażenie
<ul>
 <li>Piec do hybrydyzacji, cyfrowy blok grzewczy lub łaźnia wodna regulowana do 56 °C, 80 °C lub 100 °C lub maszyna do PCR.</li>
 <li>Pipety wielokanałowe (zalecane w celu uproszczenia etapów mycia)</li>
 <li>Mieszalnik nutujący</li>
</ul>
<ol>
 <li>Opłucz zarodki w metanolu, następnie w mieszaninie metanolu:PBT w stosunku 1:1, a następnie dwukrotnie w PBT.</li>
 <li>Utrwal zarodki przez 20 minut w 1 ml PBT zawierającym 3,7% formaldehydu (świeżo przygotowanym zgodnie z opisem w kroku 11) przy ciągłym kołysaniu na nutatorze.</li>
 <li>Myj zarodki 3 razy przez 2 minuty w PBT podczas bujania.</li>
 <li>Przygotować roztwór 3 μg/ml proteinazy K (PK) rozcieńczonej w PBT i dodać 500 μl roztworu do próbek. Próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Mieszaj zarodki co 2 minuty, spryskując je pipetą lub delikatnie odwracając probówki.</li>
 <li>Próbki zarodków należy przenieść na lód przez 1 godzinę.</li>
 <li>Przenieść próbki do temperatury pokojowej i usunąć roztwór farmakokineki. Przemyć 2 razy przez 2 minuty 1 ml PBT + 2 mg/ml glicyny.</li>
 <li>Utrwal próbki 20 minut w 1 ml PBT + 3,7% formaldehydu z kołysaniem. Opłucz zarodki 5 razy w PBT.</li>
 <li>Opłucz zarodki 1 ml mieszaniny PBT i roztworu Hyb w stosunku 1:1. Zastąp 0,5-1 ml 100% roztworu Hyb (na tym etapie zarodki mogą być przechowywane przez kilka dni/tygodni w temperaturze -20 °C).</li>
 <li>Podziel zarodki na pojedyncze dołki na 96-dołkowej płytce (celuj w ~10-15 μl osiadłych zarodków/studzienkę, należy uważać, aby używać końcówek o szerokim otworze, aby uniknąć uszkodzenia zarodków).</li>
 <li>Gotować 100 μl / próbkę roztworu Hyb przez 5 minut, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut. Roztwór ten służy do wstępnej hybrydyzacji próbki (Pre-Hyb).</li>
 <li>Dodać 100 μl/próbkę roztworu Pre-Hyb i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 56 °C.</li>
 <li>Dla każdej próbki rozcieńczyć ~100 ng sondy w 100 μl roztworu Hyb. Podgrzewać w temperaturze 80 °C przez 3 minuty, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut (podgrzane sondy można przechowywać na lodzie przez kilka godzin).</li>
 <li>Usuń roztwór Pre-Hyb z zarodków i zastąp go roztworem sondy RNA.</li>
 <li>Hybrydyzować w temperaturze 56 °C przez 12-16 godzin.</li>
 <li>W temperaturze 56 °C należy wstępnie podgrzać następujące roztwory do mycia: (A) 200 μl/próbkę roztworu Hyb; B) 100 μl/próbkę mieszaniny Hyb:PBT w stosunku 3:1; C) 100 μl/próbkę mieszaniny Hyb:PBT w stosunku 1:1; D) 100 μl/próbkę mieszaniny Hyb:PBT w stosunku 1:3; (E) 400 μl/próbkę PBT.</li>
 <li>Przepłukać próbki 100 μl roztworu myjącego A, a następnie przeprowadzić etap płukania roztworami A-D w temperaturze 100 μl/D w temperaturze 56 °C przez 15 minut każdy. Następnie przemywać próbki 4 razy przez 5 minut w 100 μl/próbkę roztworu E w temperaturze 56 °C.</li>
 <li>Schłodzić próbki do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
4. Wykrywanie sondy
Przegląd: Ta sekcja opisuje przeciwciała i odczynniki wykrywające używane do wykrywania i wizualizacji rozkładu sygnału sondy RNA po hybrydyzacji. Kroki te przedstawiono schematycznie na rysunku 2. Tutaj przedstawiamy tylko standardowe odczynniki detekcyjne, których używamy do solidnego wzmacniania sygnału, ale istnieje wiele dostępnych na rynku odczynników, które mogą być używane jako alternatywa, zwłaszcza podczas wykonywania eksperymentów z podwójnymi FISH w celu jednoczesnego jednoczesnego wykrywania różnych RNA w celu podwójnego barwienia białka-RNA. Przykłady wyników uzyskanych za pomocą tego protokołu przedstawiono w mozaice wzorca ekspresji/lokalizacji mRNA na rysunku 3.
Materiały
<ul>
 <li>Mysi monoklonalny anty-DIG sprzężony z HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Kat. Nr 200-032-156)</li>
 <li>Mysi monoklonalny anty-DIG sprzężony z biotyną (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. Kat. Nr 200-062-156)</li>
 <li>koniugat streptawidyna-HRP (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Kat. Nr S991)</li>
 <li>Koniugaty Cy3-tyramidu (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Kat. Nie. SAT704A)</li>
 <li>Roztwór montażowy DABCO: W probówce o pojemności 50 ml rozcieńczyć 1,25 grama DABCO (1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktanu; Sigma D-2522) w 15 ml 1X PBS, następnie dodać 35 ml glicerolu i mieszać do uzyskania pełnej jednorodności. Dzięki wstępnemu zmieszaniu z PBS, proszek DABCO rozpuszcza się bardzo szybko. Roztwór montażowy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe</li>
</ul>
Wyposażenie
<ul>
 <li>Mieszalnik nutujący</li>
 <li>Pipetor wielokanałowy</li>
 <li>Mikroskop fluorescencyjny</li>
</ul>
<ol>
 <li>Przygotować roztwór PBTB, zawierający PBT + 1% odtłuszczonego mleka w proszku (zwykle 50-100 ml wystarcza na wszystkie etapy inkubacji odczynnika do wykrywania i płukania).</li>
 <li>Blokuj próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej w 100 μl PBTB/próbkę, kołysząc się na nutatorze.</li>
 <li>Usunąć roztwór blokujący z zarodków i inkubować próbki przez 1,5-2 godziny w temperaturze pokojowej ze 100 μl/próbkę roztworu przeciwciała monoklonalnego biotyny anty-DIG (rozcieńczonego w stosunku 1/400 z podstaw do PBTB) z kołysaniem.</li>
 <li>Próbki należy przemywać 6 razy przez 5 minut za pomocą 100 μl PBTB/próbkę z kołysaniem.</li>
 <li>Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej z 75 ml/próbkę roztworu streptawidyny-HRP (rozcieńczonego w stosunku 1:100 z zapasu w PBTB, 10 μg/ml stężenia końcowego) z kołysaniem.</li>
 <li>Próbki należy przemywać 6 razy przez 5 minut po każde 100 μl PBTB/próbkę z kołysaniem (w celu barwienia przeciwstawnego DNA należy rozcieńczyć DAPI do 1X stężenia roboczego w PBTB i użyć tego roztworu w pierwszym etapie mycia).</li>
 <li>Opłucz zarodki PBT, a następnie umyj 2 razy przez 5 minut PBS.</li>
 <li>Inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na nutatorze z 50 μl/próbkę roztworu Cy3-tyramidu (rozcieńczonego w stosunku 1:50 w buforze do amplifikacji tyramdu). Od tego kroku upewnij się, że przechowujesz próbki w pojemniku z osłoną światła.</li>
 <li>Przemyć próbki 6 razy przez 5 minut każda, używając 100 μl PBS/próbkę na nutatorze.</li>
 <li>Usunąć PBS i dodać 100-125 μl/próbkę roztworu montażowego zawierającego 70% glicerolu i 2,5% (DABCO). Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Próbki te mogą być przechowywane przez kilka lat.</li>
 <li>Za pomocą końcówki o szerokim otworze ponownie zawiesić zarodki, delikatnie pipetując próbki i przenieść 25 μl zarodków na szkiełko podstawowe, a następnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na zarodki i zamknąć na szkiełku lakierem do paznokci</li>.
 <li>Analizuj próbki zarodków za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+gene+expression+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li>
<li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li>
<li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li>
<li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li>
<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li>
<li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEISHA%2C+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li>
<li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryo+dechorionation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+gene+collection%3A+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%25+of+D.+melanogaster+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+complementary+DNA+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li>
<li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846(2004).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Na etapach syntezy sondy zwykle generujemy spływające antysensowne sondy RNA przez transkrypcję in vitro z pełnowymiarowych cDNA Drosophila amplifikowanych z plazmidów znalezionych w Drosophila Gene Collection (DGC), zasobu szczegółowo opisanym na następującej stronie internetowej: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www.fruitfly.org/DGC/index.html</a> 14,15. Podejście to jest szeroko stosowane w badaniach ISH na dużą skalę, mających na celu mapowa...

<table><tbody><tr><td>Polimeraza RNA T7, T3 lub SP6 </td><td>Fermentas Life Sciences</td><td>EP0101,EP0111,EP0131</td><td>Zestawy zawierają bufor reakcyjny. </td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Mix Roche </td><td>Applied Science</td><td>11 277 073 910</td><td></td></tr><tr><td>RNAguard </td><td>Amersham Biosciences</td><td>27-0816-01</td><td></td></tr><tr><td>3M octan </td><td></td><td></td><td></td>sodu</tr> <tr><td>Zimny 100% etanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zimny 70% etanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wybielacza chlorowego rozcieńczony wodą w stosunku 1:1. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heptan </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteinaza K </td><td>Sigma Aldrich Oakville, ON, Kanada</td><td>Nr katalogowy P2308</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór formaldehydu, świeżo przygotowany </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór PBS-Tween (PBT) </td><td></td><td>1xPBS, 0,1% Tween-20</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór </td><td></td> glicyny <td>2 mg / ml glicyny w monoklonalnym</td> anty-DIG myszy sprzężonym z PBT <td></td></tr><tr><td>HRP </td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc</td><td>200-032-156</td> <td>(1/400 rozcieńczenie roztworu podstawowego 1 mg / ml w PBTB </td></tr><tr><td>HRP-sprzężonym z owcami monoklonalnym anty-DIG </td><td>Roche Applied Science, Laval, QC</td><td>1 207 733</td><td>1/500 rozcieńczenie roztworu podstawowego w PBTB </td></tr><tr><td>Monoklonalny anty-DIG </td><td>myszy sprzężony z biotynąJackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td><td>200-062-156</td> <td>(1/400 rozcieńczenie roztworu podstawowego 1 mg / ml w </td></tr><tr><td>sprzężonych sondach molekularnych</td> <td>PBTB Streptawidyna-HRP</td>, Eugene OR, USA <td>S991</td> <td>(1/100 rozcieńczenie 1 &mu; g/ml zapasu </td></tr></tbody></table>

fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków drosophila z całą górą rna

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Ocena wzorca ekspresji genu, jak również właściwości lokalizacji subkomórkowej jego transkrybowanego RNA, są kluczowymi cechami dla zrozumienia jego biologicznej funkcji podczas rozwoju. Hybrydyzacja RNA in situ (RNA-ISH) to potężna metoda stosowana do wizualizacji właściwości dystrybucji RNA, zarówno na poziomie organizmu, komórki, jak i subkomórkowym 1. RNA-ISH opiera się na hybrydyzacji znakowanej sondy kwasu nukleinowego (np. antysensownego RNA, oligonukleotydów) komplementarnej do sekwencji mRNA lub niekodującego celu RNA będącego przedmiotem zainteresowania 2. Ponieważ procedura wymaga samych informacji o sekwencji pierwotnej do wygenerowania sond specyficznych dla sekwencji, może być uniwersalnie stosowana do szerokiego zakresu organizmów i próbek tkanek 3. Rzeczywiście, wdrożono szereg badań ISH na dużą skalę w celu udokumentowania ekspresji genów i dynamiki lokalizacji RNA w różnych organizmach modelowych, co doprowadziło do ustanowienia ważnych zasobów społecznościowych 4-11. Chociaż na przestrzeni lat opracowano wiele strategii znakowania i wykrywania sond, połączone zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie odczynników detekcyjnych i etapów enzymatycznego wzmacniania sygnału zapewnia znaczne zwiększenie czułości i rozdzielczości procedury 12. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) wykorzystującą wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA) do wizualizacji ekspresji i dynamiki lokalizacji RNA w stadizowanych zarodkach Drosophila. Procedura przeprowadzana jest w formacie 96-dołkowej płytki PCR, co znacznie ułatwia jednoczesne przetwarzanie dużej liczby próbek.

Prawidłowo wykonana procedura ta zapewnia znacznie wyższy poziom szczegółowości w analizie czasowo-przestrzennej dynamiki ekspresji genów i lokalizacji mRNA podczas wczesnej embriogenezy Drosophila. Rzeczywiście, jak zilustrowano na Rysunku 3A dla klasycznego genu parzystego runt (run), za pomocą tego protokołu można obserwować zdarzenia ekspresji genów poprzez detekcję ognisk powstających transkrypty w grupach eksponujących ją jąder. Ponadto, jak pokazano na mozaice embrionów ...

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Procedura ta opisuje zoptymalizowaną metodę na rybach do oceny cech ekspresji i lokalizacji RNA w całych zarodkach Drosophila. Osiąga się to poprzez uprzednią syntezę znakowanej sondy RNA, uzupełniającej Mr NA lub niepokrywającego RNA będącego przedmiotem zainteresowania, poprzez transkrypcję in vitro odpowiednio dobranej matrycy DNA. Równolegle klatki populacyjne much służą do zbierania, utrwalania i przepuszczania zarodków w pożądanym stadium rozwojowym.Po kilku etapach po utrwaleniu zarodki są hybrydyzowane za pomocą znakowanej antysensownej sondy RNA. Wreszcie, po dokładnym umyciu próbek, zhybrydyzowana sonda jest wykrywana przez znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznego przeciwciała i odczynników detekcyjnych sprzężonych z fluorochromem, zapewniając w ten sposób czuły odczyt docelowego rozkładu RNA. Ostatecznie wyniki dają sygnały fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości, które są analizowane za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej w celu udokumentowania przestrzennych i czasowych cech ekspresji docelowego RNA podczas embriogenezy drosophila.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak Northern blot lub R-T-P-C-R, jest możliwość oceny

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Całkowite barwienie fluorescencyjne RNA in situ embrionów Drosophila

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Poznaj metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ całych zarodków Drosophila melanogaster do analizy ekspresji i lokalizacji RNA. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie dynamiki genów w embriogenezie.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Przeglądaj więcej filmów