Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Procedura ta opisuje zoptymalizowaną metodę na rybach do oceny cech ekspresji i lokalizacji RNA w całych zarodkach Drosophila. Osiąga się to poprzez uprzednią syntezę znakowanej sondy RNA, uzupełniającej Mr NA lub niepokrywającego RNA będącego przedmiotem zainteresowania, poprzez transkrypcję in vitro odpowiednio dobranej matrycy DNA. Równolegle klatki populacyjne much służą do zbierania, utrwalania i przepuszczania zarodków w pożądanym stadium rozwojowym.

Po kilku etapach po utrwaleniu zarodki są hybrydyzowane za pomocą znakowanej antysensownej sondy RNA. Wreszcie, po dokładnym umyciu próbek, zhybrydyzowana sonda jest wykrywana przez znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznego przeciwciała i odczynników detekcyjnych sprzężonych z fluorochromem, zapewniając w ten sposób czuły odczyt docelowego rozkładu RNA. Ostatecznie wyniki dają sygnały fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości, które są analizowane za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej w celu udokumentowania przestrzennych i czasowych cech ekspresji docelowego RNA podczas embriogenezy drosophila.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak Northern blot lub R-T-P-C-R, jest możliwość oceny ekspresji RNA w nienaruszonej próbce tkanki. Chociaż metoda ta jest przeznaczona do analizy właściwości ekspresji RNA we wczesnych zarodkach Drosophila, może być również stosowana do analizy zarodków w późniejszych stadiach rozwojowych tkanek wypreparowanych z larw lub dorosłych muszek. Ważnym aspektem naszej procedury jest zwiększenie liczby próbek, co możemy osiągnąć poprzez wykonanie badania ryb w miejscu PCR, co znacznie zwiększa wydajność podejścia.

Członkowie laboratorium demonstrujący tę procedurę to studenci studiów licencjackich, doktoranci i stypendyści podoktoranccy. Zacznij od dobrze odżywionych klatek dla populacji. Zastąp talerz talerzem drożdżowym z sokiem jabłkowym i pozostaw muchy na godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie wymień talerz drożdży z sokiem jabłkowym, aby zebrać zarodki we wczesnym stadium. Inkubuj klatkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza i poczekaj, aż pożądany etap rozwoju zarodków zostanie osiągnięty, czekając w kapturze chemicznym, wymieszaj chemikalia, aby uzyskać 37% formaldehydu w szklanej fiolce do inhalacji. Gotować roztwór, aż proszek PFA całkowicie się rozpuści.

Następnie schłodzić go do temperatury pokojowej i przefiltrować do nowej fiolki scyntylacyjnej. Następnie przygotuj dwufazowy roztwór utrwalający. Połącz PBS z 37% formaldehydem w fiolce scyntylacyjnej, a następnie dodaj heptan, gdy będzie gotowy.

Zbierz zarodki z talerza soku jabłkowego w temperaturze pokojowej, wodzie z kranu i delikatnie zamiataj drobnym pędzlem. Przenieś zawieszone zarodki do koszyka i spłucz je letnią wodą z kranu. Teraz otocz zarodki przez 90 sekund, kąpiąc kosz w świeżym 3% roztworze wybielacza.

Następnie usuń wybielacz letnią wodą z kranu, aż zapach wybielacza zniknie. Aby pobrać zarodki, zdemontuj kosz do pobierania i delikatnie przenieś zarodki do dwufazowego roztworu utrwalającego. Za pomocą pędzla zarodki zgromadzą się na granicy między warstwami PBS i heptanu.

Teraz zamknij fiolki scyntylacyjne, przymocuj je do mieszalnika wirowego i potrząsaj nimi przez 20 minut na najniższym ustawieniu. Po wstrząśnięciu należy wyrzucić większość dolnej fazy PBS i górnej fazy heanu za pomocą pipety pastwiskowej. Następnie odessać pozostałą mieszaninę do pipety i ostrożnie usunąć dolną fazę, nie tracąc zarodków.

Umieść zarodki w 1,5 mililitrowej probówce zawierającej dwufazowy roztwór 500 mikrolitrów heptanu i 500 mikrolitrów metanolu. Energicznie potrząsaj rurką przez 30 do 45 sekund, aby rozbić błony rzepki. Po pęknięciu zarodki zatopią się w metanolu.

Wyrzuć górną fazę i niepęknięte zarodki i dodaj jeden mililitr metanolu. Teraz krótko potrząsaj probówką przez pięć sekund i umyj zarodki trzy razy metanolem. Po umyciu zarodki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Rozpocznij od dodania 500 mikrolitrów PK do każdego z zarodków i inkubuj próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uszkodzić próbki poprzez nadmierne trawienie ich białkiem a k lub poprzez niechlujną manipulację. Podczas inkubacji farmakokinetycznej należy mieszać zarodki co dwie minuty, rozpylając je pipetą.

Po 10 minutach umieść zarodki na lodzie na godzinę. Po godzinie usunąć roztwór PK w temperaturze pokojowej. Umyj zarodki dwukrotnie glicyną w PBT przez dwie minuty.

Teraz utrwal próbki przez 20 minut w jednym mililitrze 3,7% formaldehydu w PBT z kołysaniem. Wypłukać formaldehyd pięcioma płukaniami w PBT. Następnie przepłucz zarodki jednym mililitrem równych objętości roztworu PBT i HI i zastąp mieszaninę 0,5 do jednego mililitra czystego roztworu.

W tym momencie zarodki mogą być przechowywane przez kilka dni do tygodni w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W 96-dołkowej płytce podwielokrotność od 10 do 15 mikrolitrów osiadłych zarodków na studzienkę. Użyj końcówki o szerokim otworze, aby uniknąć uszkodzenia zarodków.

Teraz przygotuj roztwór przed hybrydyzacją, gotując 100 mikrolitrów roztworu hype na próbkę. Dobrze przez pięć minut, schłodzić roztwór Pre-Hype na lodzie przez pięć minut, a następnie dodać 100 mikrolitrów do każdej płytki, która zawiera próbki zarodków. Pobrać przygotowaną sondę RNA oznaczoną ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop.

Ponadto, aby zweryfikować jakość sondy, przelej od jednego do dwóch mikrolitrów na agrożel. Teraz dla każdej próbki rozcieńczyć około 100 nanogramów sondy w 100 mikrolitrach roztworu HI. Niezbędna jest praca w warunkach wolnych od RNA.

Podczas obchodzenia się z sondą. Podgrzej roztwór do 80 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie schłodzić na lodzie przez co najmniej pięć minut.

Można go przechowywać w chłodzie przez kilka godzin. Pobrać płytkę i usunąć roztwór Pre-Hype z zarodków przez aspirację. Następnie dodaj do każdego 100 mikrolitrów roztworu hype z sondą RNA.

Dobrze zhybrydyzuj sondę w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin następnego dnia. Seria pięciu roztworów jest wstępnie podgrzewana w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Pierwszym z nich jest czyste rozwiązanie hype'owe, a ostatnim czysty PBT.

Pozostałe trzy to rozcieńczenie HI do PBT. Po podgrzaniu szybko przepłucz próbki w czystym roztworze hype. Następnie wykonaj trzy 15-minutowe płukania, zaczynając od najmniej rozcieńczonego roztworu hype, a następnie każdego z kolejnych rozcieńczeń.

Na koniec umyć próbki cztery razy przez pięć minut w czystym PBT. Następnie doprowadzić próbki do temperatury pokojowej. Teraz przystąp do aplikacji przeciwciał, aby wykryć sondę w celu poprawy mieszania próbek.

Podczas tych etapów płytkę można umieścić w małym pudełku, które można podłączyć do mutującego miksera za pomocą opisanego protokołu, klasyczny gen reguły par był analizowany na różnych etapach embriogenezy. Analiza ryb ujawniła, w jaki sposób początkowa szeroka ekspresja w środkowej części zarodka w czwartym stadium embrionalnym jest udoskonalana w segmentowy wzór pasków. W późniejszych etapach badania ryb przeprowadzono przy użyciu różnych diggenów i znakowanych antysensownych sond RNA zhybrydyzowanych z zarodkami drosophila w wieku od zera do czterech godzin.

Zhybrydyzowane sondy wykryto w sekwencyjnych inkubacjach z biotynylowanym antygenem i przeciwciałem paciorkowym w HRP i Ceramidzie. Próbki zostały zamontowane i przeanalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tych stadium od czterech do siedmiu zarodków zaobserwowano szeroką mozaikę wyników ryb Podczas próby tej procedury ważne jest, aby zachować środki ostrożności na różnych etapach, takich jak ochrona sond RNA i degradacja poprzez pracę w warunkach wolnych od RNA i stosowanie zapasów wolnych od RNA.

Po opanowaniu tej podstawy można dodać dodatkowe kroki do metody, aby przeprowadzić doświadczenie w wielokrotnym znakowaniu w celu wizualizacji różnych RNA lub specyficznych markerów białkowych w tej samej próbce. Po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobry pomysł na to, jak przeprowadzić fluorescencyjną hybrydyzację w C dwóch, aby udokumentować ekspresję lub dynamikę lokalizacji subkomórkowej Twojego ulubionego RNA podczas embriogenezy Drosophila Happy Fishing.