Name: Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj inżynierię asembloidów ścięgien do badania interakcji komórkowych w procesach naprawczych. Hybrydowy model łączy eksplanty z hydrogelami, umożliwiając symulację obciążeń mechanicznych i analizę komunikacji między populacjami komórkowymi w mikrośrodowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez ETH Grant 1-005733

Fabricating Mouse Tendon Assembloids to Study Cellular Interactions in Disease

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj system modeli assembloid ma kilka krytycznych kroków, na które należy zwrócić uwagę. Po pierwsze, system modelowy jest tylko tak dobry, jak jakość jego komponentów. Bardzo ważne jest, aby przed rozpoczęciem procesu składania sprawdzić rdzeń eksplantatu i populacje komórek, które mają zostać wysiane, pod mikroskopem. Równie ważne jest przynajmniej jednokrotne zweryfikowanie fenotypu izolowanych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Zwłaszcza, gdy nowa partia kolagenu-1 jest używana po raz pierwszy, korzystne jest sprawdzenie szybkości sieciowania w próbnym przebiegu przed osadzeniem w nim komórek. Montaż assembloid wymaga dużo ręcznej obsługi, co zwiększa ryzyko infekcji. Aby zminimalizować ryzyko infekcji, pracuj w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza, często wymieniaj rękawice i odkażaj rękawice oraz przestrzeń roboczą za pomocą 80% etanolu. Z podobnych powodów nie używaj wydrukowanych w 3D uchwytów zaciskowych więcej niż raz. Przed samym procesem zatapiania ważne jest, aby wszystkie składniki hydrożelu (roztwór sieciujący, roztwór kolagenu-1) znajdowały się na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu sieciowaniu. W związku z tym należy działać szybko po dodaniu komórek do roztworu sieciującego, aby ograniczyć śmierć komórek z powodu wysokiego pH i niskiej temperatury roztworu sieciującego. Aby zapobiec śmierci komórek związanej z wysuszeniem w eksplantacie rdzenia, należy zassać pożywkę pokrywającą zaciśnięte eksplantaty rdzenia bezpośrednio przed zmieszaniem roztworu sieciującego z roztworem kolagenu-1. Aby zagwarantować centralne umieszczenie eksplantatu rdzenia w hydrożelu, idealnie jest odlewać hydrożel wokół zaciśniętego eksplantatu rdzeniowego, który jest lekko napięty. W tym celu użyj kołka ustalającego i śrubowej M3 x 16 mm, aby przymocować clamp uchwyty do (wydrukowanej w 3D) płytki z otworami o odpowiednich długościach. Po 50-minutowym czasie polimeryzacji osadzony eksplant rdzeniowy może być ponownie naprężony w zależności od pożądanych warunków hodowli. Stopień napięcia, jakiego doświadcza asembloid podczas hodowli, ma głęboki wpływ na wyniki eksperymentów i musi być jednolity we wszystkich próbkach i warunkach21.
Niemniej jednak duży wpływ obciążenia mechanicznego (roz)obciążenia na wyniki eksperymentalne jest główną przewagą modelu assembloidowego nad większością alternatyw inżynierii tkankowej, zwłaszcza że zachowany skład matrycy eksplantatu rdzenia powinien również odtwarzać złożone wzorce obciążenia in vivo na poziomie komórkowym90. Podczas gdy w praktyce do tej pory wykazano jedynie pomiar liniowego modułu sprężystości sprężystości, maksymalnego odkształcenia przy rozciąganiu i maksymalnego naprężenia rozciągającego asembloidów, protokoły pomiarów wytrzymałości zmęczeniowej i relaksacji naprężeń zostały opisane dla eksplantatów rdzeni ścięgien w innym miejscu i powinny mieć zastosowanie do zespołów 91,92. Oprócz wzorców obciążenia podobnych do in vivo, prawdopodobnie największą zaletą asembloida jest jego wielopoziomowa modułowość. Dzięki indywidualnym komorom hodowlanym można ustawić kontrolowany zestaw warunków niszowych dla każdej próbki z osobna (tj. temperatura, ciśnienie tlenu, stężenie glukozy, suplementacja, stymulatory, inhibitory i rozciąganie statyczne za pomocą płytki). Następnie, sztywność matrycy i skład matrycy przedziału zewnętrznego można dostosować za pomocą kompozycji hydrożelowej i pozwoliłoby to na przykład na badanie wpływu coraz bardziej chorego mikrośrodowiska tkanek poprzez włączenie większej ilości kolagenu-3 i fibronektyny komórkowej 93,94,95. Oceniane populacje komórek w przedziale zewnętrznym można łatwo dostosować, wybierając komórki do wysiewu, ale można je również modyfikować w eksplantacie rdzenia ścięgna, wykorzystując ustalone genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe i linie myszy (tj. Zubożenie komórek ScxLin)96. Różny skład matrycy i komórek dwóch przedziałów zapewnia unikalną strukturę 3D z przedziałami, która jest kolejną centralną cechą charakterystyczną ścięgna 1,30,46.
Podczas korzystania z tego systemu ważne jest, aby wziąć pod uwagę konsekwencje modułowości systemu dla szczegółowości parametrów wynikowych. Podczas gdy proliferację i rekrutację komórek można ocenić osobno dla każdego przedziału, właściwości mechaniczne, składniki sekretomu i produkty degradacji są obecnie mierzalne tylko dla całego asembloidu. Jeśli chodzi o przepustowość, jedna odpowiednio przeszkolona osoba może przygotować do 50 zespołów w ciągu zwykłego dnia pracy, przy czym głównym wąskim gardłem jest procedura zaciskania. Chociaż niektóre metody odczytu wzajemnie się wykluczają, możliwa jest powtarzalna ocena właściwości mechanicznych i składników sekretomu na tej samej próbce, a także składu populacji komórek (cytometria przepływowa), transkryptomu komórkowego (RT-qPCR, sekwencjonowanie RNA) lub matrycy i dystrybucji komórek (immunocytochemia/mikroskopia fluorescencyjna) w punktach końcowych. W poprzednich publikacjach metody te zostały zastosowane w celu obszernego scharakteryzowania interakcji międzykomórkowych, międzyprzedziałowych w zespołach rdzeniowych // fibroblastów i rdzeni // makrofagów wystawionych na niszę podobną do zmiany84,85. W niniejszej pracy zbadano zdolność systemu modelu assembloidowego do badania wzajemnych oddziaływań międzyprzedziałowych między komórkami śródbłonka rdzenia i zewnętrznymi pod wpływem różnych bodźców mikrośrodowiskowych.
Modułowość systemu modelu pozwala na przyszłe udoskonalanie metody, co jest niezbędne do przezwyciężenia następujących ograniczeń obecnej iteracji projektu. Analiza cytometrii przepływowej przedstawiona w tej pracy oraz opublikowane niedawno dane z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek wykazały, że tenocyty rezydujące w rdzeniu ścięgna i populacje pochodzące ze ścięgna Achillesa są bardziej niejednorodne niż wcześniej zakładano 24,34,59,84,97. Ponadto zachowania migracyjne populacji komórek początkowo zamieszkałych w rdzeniu lub hydrożelu zacierają podział assembloidów podczas hodowli. Oba czynniki razem sprawiają, że trudno jest przypisać różnice transkryptomiczne określonym typom komórek i oddzielić procesy proliferacji od procesów opartych na migracji. Ograniczenie to można przezwyciężyć poprzez udoskonalenie populacji wejściowej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w oparciu o skład komórkowy zdrowych lub chorych ścięgien scharakteryzowanych w ostatnich badaniach in vivo, poprawę odczytu poprzez wdrożenie sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i integrację markerów proliferacji, takich jak barwienie EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyna) podczas mikroskopii.
Przedstawione tu asembloidy mają również wspólną słabość z większością obecnie dostępnych systemów in vitro, które symulują chore narządy odłączone od reszty ciała98,99. Jednak zastosowana tutaj platforma oparta na komorze hodowlanej dobrze pozycjonuje system modelowy do integracji z platformą wielonarządową, w której połączone są asembloidy naśladujące różne narządy i można badać interakcje międzynarządowe.
W swojej istocie system modelowy opiera się na pozycyjnych ścięgnach gryzoni, co skutkuje unikalnym zestawem wad. Po pierwsze, przekładalność wyników jest utrudniona przez myszy typu dzikiego, które nie rozwijają się lub nie cierpią na choroby ścięgien 8,100,101. Integracja tkanek i komórek pochodzących od ludzi lub nowo opracowanych szczepów myszy, które wykazują aspekty choroby ścięgien, może złagodzić ten problem102. Przejście w kierunku asembloidu opartego na człowieku jest szczególnie interesujące, ponieważ umożliwiłoby badania na tkankach pochodzących od pacjentów z różnie chorych ścięgien (tj. zapalenie ścięgien, ścięgien lub zapalenie okołościęgnistych), a nawet dawców opornych na leczenie, które mogłyby odblokować bardziej spersonalizowane programy leczenia. Po drugie, eksplantaty ścięgien mysiego ogona nie radzą sobie szczególnie dobrze z mikrouszkodzeniami wywołanymi przeciążeniem, co ogranicza możliwość zastosowania systemu modelowego do badania ostrych uszkodzeń ścięgien.
Z tych wszystkich powodów asembloidy eksplantatywne // hydrożelowe są w doskonałej pozycji do badania biologii rdzenia ścięgna, interakcji struktura-funkcja macierzy oraz interakcji międzyprzedziałowych między określonymi populacjami komórek w odpowiedzi na mikrouszkodzenia wywołane przez niszę. Wnioski zebrane z tych dość wysokoprzepustowych badań mogą nadać kierunek badaniom in vivo i rozwojowi leczenia.

W swojej funkcji przenoszenia sił mięśniowych na kości w celu umożliwienia ruchu, ścięgna są narażone na jedne z najbardziej ekstremalnych obciążeń mechanicznych występujących w ludzkim ciele1,2,3. Ze względu na starzenie się społeczeństw, rosnące rozpowszechnienie otyłości i rosnącą popularność wymagających mechanicznie aktywności sportowych, przewiduje się, że częstość występowania chorób i urazów ścięgien wzrośnie w krajach rozwiniętych4,5,6. Opracowanie nowatorskich, opartych na dowodach naukowych i modyfikujących przebieg choroby schematów leczenia w celu przeciwdziałania temu wzrostowi było utrudnione przez ograniczenia obecnie dostępnych systemów modelowych1,7,8.
Idealnie, modele naprawy chorób i urazów pozwoliłyby badać, jak docelowy organ przetwarza zdefiniowany zestaw parametrów wejściowych (imitujących czynniki wywołujące chorobę, Tabela 1) na mierzalne parametry wyjściowe (reprezentujące cechy charakterystyczne choroby, Tabela 2), jednocześnie kontrolując czynniki zakłócające. Badania z wykorzystaniem takich systemów modelowych byłyby następnie w stanie zidentyfikować (pato-)fizjologiczne procesy leżące u podstaw choroby i naprawy urazów oraz zdobyć wiedzę, którą można by wykorzystać do zapobiegania lub zmniejszania cech charakterystycznych chorób i urazów w klinikach. Stosując tę zasadę do ścięgien, użyteczny system modelowy powinien podsumować centralne części odpowiedzi ścięgna in vivo na chorobę i uraz, które obejmują następujące cechy charakterystyczne: mikrouszkodzenia, zapalenie, neowaskularyzacja, hiperkomórkowość, przyspieszony obrót macierzy i decompartmentalizacja9,10,11,12,13,14,15. Korzystając z tych cech rozpoznawczych jako podstawy, można wywnioskować następujące wymagania dotyczące udanego systemu modelowego naprawy chorób ścięgien i urazów.
Hipotetyczne przeciążenie mechaniczne jest głównym czynnikiem w patogenezie urazów ścięgien i chorób, a zatem jest powszechnie stosowanym eksperymentalnym podejściem do tworzenia mikrouszkodzeń16. Kontrolowana obciążalność mechaniczna jest zatem podstawowym warunkiem wstępnym dla modeli naprawy chorób ścięgien i urazów. Idealnie byłoby, gdyby system modelu umożliwiał trzy główne tryby: pojedynczy załadunek rozciągający do uszkodzenia, załadunek zmęczeniowy i rozładunek8,17,18. Po odkształceniu mechanicznym komórki rezydujące w tkance doświadczają złożonej kombinacji sił rozciągających, sił ścinających (spowodowanych przesuwaniem się włókien kolagenowych otaczających komórki) i sił ściskających występujących podczas rozładunku lub w pobliżu przyczepu ścięgnistego19,20. Systemy modeli powinny jak najwierniej odtwarzać te złożone wzorce ładowania.
Alternatywnym sposobem na wprowadzenie mikrouszkodzeń matrycy jest wykorzystanie stresorów biochemicznych, które naśladują ogólnoustrojowe predyspozycje do chorób i urazów ścięgien, takich jak (pro)zapalne cytokiny, stres oksydacyjny lub wysokie stężenia glukozy21,22,23. W związku z tym kontrolowane mikrośrodowisko niszowe jest korzystne dla systemu modelowego naprawy chorób ścięgien i urazów.
Częstym warunkiem wstępnym dla systemów modelowych, które są w stanie podsumować stan zapalny, neowaskularyzację i hiperkomórkowość, jest selektywna obecność populacji komórek, które napędzają te procesy24. W przypadku procesów zapalnych populacje te obejmują neutrofile, limfocyty T i makrofagi, podczas gdy komórki śródbłonka i perycyty byłyby potrzebne do badania neowaskularyzacji25,26,27,28,29. Fibroblasty ścięgien są nie tylko niezbędne do naprawy ścięgien, ale jako komórki proliferacyjne i migrujące są również częściowo odpowiedzialne za lokalną hiperkomórkowość obserwowaną w chorobie ścięgien30,31,32,33,34,35,36.
Oprócz zmian w populacjach komórek rezydentnych, skład macierzy ścięgien zmienia się również w chorobach i urazach ścięgien7,37,38,39,40. Aby przedstawić właściwe sygnały mikrośrodowiskowe istotne dla choroby, systemy modelowe powinny być w stanie zintegrować skład macierzy zewnątrzkomórkowej dopasowany do docelowego etapu choroby lub urazu, na przykład poprzez umożliwienie odpowiednich proporcjonalnych kombinacji kolagenu-1, kolagenu-3 i fibronektyny komórkowej41.
Podział zdrowych ścięgien na rdzeń ścięgna i zewnętrzne przedziały (tj. endotenon, epitenon i paratenon) jest kluczowy dla ich funkcji i często zaburzony w chorych lub uszkodzonych ścięgnach1,42,43,44,45,46,47. Włączenie podziału ścięgien 3D do systemów modeli ścięgien jest zatem nie tylko niezbędne do dokładniejszego symulowania procesów leżących u podstaw de- i re-compartmentalizacji, ale także pomaga w ustaleniu prawidłowych gradientów czasoprzestrzennych cytokin i składników odżywczych48,49.
Wreszcie, modułowość jest kolejnym kluczowym atutem systemów modelowych, pozwalającym badaczom na połączenie prawidłowego względnego udziału i wzajemnych oddziaływań między wcześniej opisanymi stresorami podczas badanych procesów8,17.
Oprócz wyboru optymalnych metod wejściowych, ważnym krokiem jest możliwość mierzenia, obserwowania i śledzenia zmian w wyniku. Właściwości mechaniczne układu modelowego (tj. długość obszaru zbieżności, liniowy moduł sprężystości, maksymalne odkształcenie rozciągające, maksymalne naprężenie rozciągające, wytrzymałość zmęczeniowa i relaksacja naprężeń) są tutaj kluczowe, ponieważ charakteryzują główną funkcję ścięgna50,51,52. Aby powiązać te zmiany funkcjonalne ze zmianami na poziomie tkanki, ważne jest, aby umożliwić metody wykrywania uszkodzeń macierzy strukturalnej (kolagenu) oraz śledzenia proliferacji i rekrutacji populacji komórek istotnych dla chorób i napraw30,53,54,55,56,57,58,59,60.
Aby badać powstające przesłuchy komórka-komórka i matryca komórkowa, powinno być w stanie wyizolować lub oznaczyć białka w odpowiednich ilościach do kwantyfikacji (np. ELISA, proteomika, immunohistochemia, cytometria przepływowa)14,21,61,62. Powinna być również możliwa analiza ekspresji genów specyficzna dla populacji lub przynajmniej przedziału (tj. sortowanie komórek aktywowane fluorescencją [FACS], sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki/masowej oraz ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR))21,24,27,63. System modelowy powinien umożliwiać pomiar jak największej liczby wyżej wymienionych parametrów wyjściowych na tej samej próbce i na wielu próbkach w sposób wystarczająco szybki, aby odblokować badania o wysokiej przepustowości.
Wśród obecnie dostępnych systemów modelowych do badania chorób ścięgien u ludzi i naprawy urazów, ludzkie ciało jest oczywiście najbardziej reprezentatywne. Jest również najmniej kompatybilny z interwencją eksperymentalną. Podczas gdy pacjenci z ostrymi urazami ścięgien są obficie dostępni do badań klinicznych, pacjenci z wczesną tendinopatią (najczęstszą chorobą ścięgien) są w dużej mierze bezobjawowi i często pozostają klinicznie niewykryci, dopóki nie pojawią się poważniejsze zmiany14,64,65. To sprawia, że trudno jest wskazać krytyczny moment, w którym dochodzi do wykolejenia homeostazy ścięgien i mechanizmy stojące za tym wykolejeniem16,66,67,68,69. Ponadto pobieranie biopsji ze zdrowych ścięgien jest wyzwaniem etycznym, ponieważ może skutkować trwałym uszkodzeniem. Pozostałości ścięgna ścięgna podkolanowego po operacji rekonstrukcji więzadła krzyżowego przedniego są często używane jako zdrowa kontrola, ale prawdopodobnie różnią się funkcją, właściwościami mechanicznymi, populacjami komórek i składem macierzy w porównaniu z stożkiem rotatorów, ścięgnami Achillesa i ścięgnami rzepki często dotkniętymi chorobami i urazami ścięgien70,71,72,73.
Modele zwierzęce in vivo są bardziej dostępne i łatwiejsze w obsłudze, ale ich użycie nakłada znaczne obciążenie etyczne na zwierzęta i koszty ekonomiczne dla badaczy. Ponadto większość popularnych zwierząt modelowych albo nie rozwija zmian tendinopatycznych spontanicznie (tj. szczury, myszy, króliki), albo brakuje im starterów i genetycznie zmodyfikowanych szczepów niezbędnych do śledzenia wielokomórkowych szlaków komunikacyjnych zaangażowanych w to (tj. konie, króliki).
Proste systemy modeli 2D in vitro znajdują się po drugiej stronie spektrum złożoności/wykonalności i lepiej pozwalają na kontrolowane, efektywne czasowo badanie specyficznych szlaków komunikacji międzykomórkowej w odpowiedzi na bardziej kontrolowany zestaw wyzwalaczy8,74. Jednak te uproszczone systemy często nie są w stanie podsumować wielowymiarowego obciążenia mechanicznego (tj. rozciągania, ściskania i ścinania), które ma kluczowe znaczenie dla funkcjonalności ścięgien. Ponadto (zbyt) wysoka sztywność plastiku do hodowli tkankowych ma tendencję do zastępowania wszelkich wskazówek matrycy dostarczanych przez powłoki mające naśladować stan choroby będący przedmiotem zainteresowania75,76.
Aby przezwyciężyć tę wadę, opracowano coraz bardziej wyrafinowane systemy modeli 3D oparte na inżynierii tkankowej, które zapewniają ładowalną matrycę, której skład może być przynajmniej częściowo dopasowany do pożądanego stanu choroby77,78,79. Mimo to systemy te nie tylko mają trudności z dokładnym odtworzeniem złożonych kompozycji macierzy zewnątrzkomórkowej in vivo i wzorców obciążenia komórkowego, ale generalnie brakuje im długoterminowej obciążalności i interfejsów kompartmentowych wymaganych do badania międzyprzedziałowych szlaków komunikacyjnych, które koordynują choroby ścięgien i naprawę urazów48,49,80.
Systemy modeli eksplantacji ścięgien ex vivo mają wyraźną zaletę wbudowanej kompozycji matrycy podobnej do in vivo, która składa się z nisz okołokomórkowych, barier międzykompartmentowych, a także czasoprzestrzennych gradientów cytokin/składników odżywczych i podsumowuje złożone wzorce obciążenia po rozciągnięciu8. W wyniku zależnych od wielkości limitów dyfuzji składników odżywczych, eksplantaty z większych modeli zwierzęcych (tj. koni) są trudne do utrzymania przy życiu w długoterminowych badaniach chorób ścięgien i naprawy urazów81,82,83. Tymczasem mniejsze eksplantaty z gatunków mysich (tj. ścięgno Achillesa, ścięgno rzepki) są trudne do powtarzalnego zaciskania i mechanicznego obciążania. Ich rozmiar ogranicza również ilość materiału, który można zebrać do odczytów na poziomie komórki, białka i genów bez łączenia próbek i zmniejszania przepustowości. W tym sensie pęczki ścięgien mysiego ogona oferują potencjał do odblokowania wysokoprzepustowych badań nad chorobami ścięgien i naprawą urazów, ponieważ są one łatwo dostępne w dużych ilościach z jednej myszy, zachowują złożony skład macierzy okołokomórkowej in vivo i rekapitulują wzorce obciążenia komórkowego. Jednak podczas procesu ekstrakcji tracą większość swojego zewnętrznego przedziału, a w nim znajdują się populacje naczyniowe, immunologiczne i fibroblasty, które są obecnie uważane za napędzające choroby ścięgien i ich naprawę8,18.
Aby wypełnić tę lukę, opracowano system modelowy łączący zalety eksplantatów rdzeniowych pochodzących z mysich ścięgien ogonowych z zaletami systemów modelowych opartych na hydrożelu 3D. Ten system modelowy składa się z naładowanego komórkami (kolagen-1) hydrożelu odlewanego wokół eksplantatów ścięgna ogonowego84,85. W tym artykule szczegółowo przedstawiono niezbędne etapy produkcji wraz z przydatnymi odczytami, które można uzyskać przez kokulturę eksplantatów rdzeniowych (przedział wewnętrzny) w hydrożelu kolagenowym typu 1 obciążonym komórkami śródbłonka (przedział zewnętrzny).

<table><tbody><tr><td>Igła iniekcyjna 0,4 mm x 25 mm (G27)</td>Filament do druku 3D <td>Sterican</td><td>9186174</td><td></td></tr><tr><td>: Przezroczysty prusament z kwasu polimlekowego</td><td>Prusa</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>4% formaldehyd</td><td>Roti-Histofix</td><td>P087.4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odrywania komórek Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna</td><td>VWR</td><td>L0009-100</td><td></td></tr><tr><td>Dołączana cyfrowa kamera z mocowaniem C: Moticam 2</td><td>Motic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Śruba śrubowa M3 x 16 mm, stal nierdzewna</td><td>RS Pro</td><td>1871235</td><td></td></tr><tr><td>Śruba śrubowa M3 x 6 mm, stal nierdzewna</td><td>RS Pro</td><td>1871207</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>CD146 przeciwciało: PE anty-mysie</td><td>BioLegend</td><td>134703</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD206: Alexa Przeciwciało anty-mysie Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>141709</td><td></td></tr><tr><td>CD31: Alexa Fluor 488 anty-mysie</td><td>BioLegend</td><td>102413</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD86: PE anty-mysie</td><td>BioLegend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dializowana płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7000183</td><td></td></tr><tr><td>Dypaza II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>7002211</td><td></td></tr><tr><td>Kołek ustalający, 3 mm x 16 mm, stal nierdzewna</td><td>Accu</td><td>HDP-3-16-A1</td><td></td></tr><tr><td>Dragon Skin 10 Slow/1 silikon</td><td>KauPO</td><td>09301-004-000001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Endopan 3</td><td>Pan-Biotech</td><td>P04-0010K</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe probówki Eppendorf safe-lock (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>homodimer Ethidium, EthD-1, 2 mM zapas w DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46043-1MG-F</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 przeciwciało: Apc/fire 750 anty-mysie</td><td>BioLegend</td><td>123151</td><td></td></tr><tr><td>Falcon plastikowa tuba (15 ml)</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon plastik probówka (50 ml)</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy: LSR II Fortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>23-11617-02</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Invitrogen</td><td>D12054</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III alkaliczny koncentrat czyszczący</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Test hydroksyproliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu: Motic Images Plus 3.0 ML</td><td>Motic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy Fosforan Sól magnezu n-hydrat</td><td>Wako Chemicals</td><td>013-19641</td><td></td></tr><tr><td>LSE Low Speed Orbital Shaker</td><td>Corning</td><td>6780-FP</td><td></td></tr><tr><td>MEM endogenne aminokwasy</td><td>Sigma</td><td>7002231</td><td></td></tr><tr><td>Mysi czynnik stymulujący makrofagi ( m-CSF)</td><td>PeproTech</td><td>315-02-50ug</td><td></td></tr><tr><td>Test MSD</td><td>Mezoscale Discovery</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka sitka z siatki nylonowej, 100 i mikro; m</td><td>Corning</td><td>734-2761</td><td></td></tr><tr><td>Oryginalna drukarka 3D Prusa i3 MK3S</td><td>Prusa</td><td>i3 MK3S</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4, sterylna, 10 L</td><td>Gibco</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>VWR</td><td>786-650</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany m-CSF&nbsp;</td>Zestaw do ekstrakcji RNA <td>PeproTech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>: Rneasy plus Micro</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do krojenia: PrusaSlicer</td><td>Prusa</td><td></td><td>NA wersja 2.6.0 lub nowsza</td></tr><tr><td>Sterylne Filtry Komórkowe 100 &micro; </td><td>m Fisherbrand</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela chirurgicznego nr 21</td><td>Swann-Morton</td><td>307</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>Trizol Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5 %)</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Ścięgna umożliwiają poruszanie się, przenosząc siły mięśniowe na kości. Opierają się na twardym rdzeniu ścięgna składającym się z włókien kolagenowych i populacji komórek zrębu. Ten nośny rdzeń jest otoczony, odżywiany i naprawiany przez warstwę tkanki maziowej przypominającą tkankę składającą się z zewnętrznego przedziału ścięgna. Pomimo tej wyrafinowanej konstrukcji, urazy ścięgien są powszechne, a leczenie kliniczne nadal opiera się na fizjoterapii i chirurgii. Ograniczenia dostępnych eksperymentalnych systemów modelowych spowolniły rozwój nowych terapii modyfikujących przebieg choroby i schematów klinicznych zapobiegających nawrotom. 
Badania in vivo na ludziach ograniczają się do porównywania zdrowych ścięgien z uszkodzonymi lub uszkodzonymi tkankami pobranymi podczas operacji naprawczej i nie pozwalają na badanie podłużne podstawowej choroby ścięgien. Modele zwierzęce in vivo mają również istotne ograniczenia w zakresie nieprzejrzystej złożoności fizjologicznej, obciążenia etycznego zwierząt oraz dużych kosztów ekonomicznych związanych z ich wykorzystaniem. Co więcej, modele zwierzęce in vivo słabo nadają się do systematycznego sondowania leków i wielokomórkowych, wielotkankowych szlaków interakcji. Prostsze systemy modelowe in vitro również okazały się niewystarczające. Jednym z głównych powodów jest brak odpowiedniego odtworzenia trójwymiarowego obciążenia mechanicznego niezbędnego do sensownego badania komórek ścięgien i ich funkcji. 
Nowy system modeli 3D prezentowany tutaj łagodzi niektóre z tych problemów, wykorzystując eksplantaty rdzenia ścięgna mysiego ogona. Co ważne, te eksplantaty są łatwo dostępne w dużych ilościach z jednej myszy, zachowują wzorce ładowania 3D in situ na poziomie komórkowym i charakteryzują się macierzą zewnątrzkomórkową podobną do in vivo. W tym protokole podano instrukcje krok po kroku, jak wzmocnić eksplantaty rdzenia ścięgna hydrożelami kolagenowymi wypełnionymi komórkami śródbłonka pochodzącymi z mięśni, fibroblastami pochodzącymi ze ścięgien i makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego w celu zastąpienia populacji komórek aktywowanych chorobą i urazem w zewnętrznym przedziale ścięgna. Pokazano, w jaki sposób powstałe w ten sposób można wyzwać powstałe zespoły ścięgien mechanicznie lub za pomocą zdefiniowanych bodźców mikrośrodowiskowych w celu zbadania pojawiających się wielokomórkowych przesłuchów podczas choroby i urazu.

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell ...

Ścięgna ułatwiają ruch, przenosząc siły z mięśni na kość. Chociaż urazy ścięgien są powszechne, są one dość trudne do leczenia, a wyniki dla pacjentów są często złe. Obecnie wszystkie metody leczenia urazów ścięgien obejmują jakiś rodzaj fizjoterapii, co odzwierciedla fakt, że siły mechaniczne odgrywają tak centralną rolę w biologii ścięgien.Dobre modele eksperymentalne do badania uszkodzeń i naprawy ścięgien tak naprawdę nie istnieją, więc moje laboratorium aktywnie opracowuje nowe modele, które mogą lepiej uchwycić ważne cechy fizjologii i patofizjologii ścięgien. W poprzednich badaniach mogliśmy wykazać, że rdzeń ścięgna, który stanowi nośną część ścięgna, sam w sobie ma bardzo ograniczoną zdolność naprawczą. W połączeniu z innymi badaniami w tej dziedzinie postawiliśmy hipotezę, że uszkodzony rdzeń będzie rekrutować komórki z zewnętrznego przedziału ścięgna, aby pomóc mu się zagoić.System modelowania ścięgien oparty na inżynierii tkankowej może zapewniać ładowalne środowisko 3D, ale nie pasuje do zawiłości macierzy zewnątrzkomórkowej in vivo. Modele eksplantatów działają, ale często są trudne do utrzymania przy życiu i obciążają mechanicznie przez dłuższy czas lub brakuje im zewnętrznej komory, która jest kluczowa dla procesów naprawczych. Nasz unikalny system modelowy łączy w sobie zalety eksplantatów rdzeniowych pochodzących z morskich ścięgien ogonowych z zaletami systemów opartych na hydrożelu 3D.Zapewnia ładowalną, podobną do vivo matrycę rdzenia, wraz ze sztuczną komorą zewnętrzną. Jego skład można dostosować do hipotezy badawczej i biomimetycznej bariery międzyprzedziałowej pomiędzy nimi. Nasze hybrydowe asembloidy eksplantatów hydrożelowych są w doskonałej pozycji do badania biologii rdzenia ścięgna, interakcji funkcji struktury macierzy oraz interakcji międzyprzedziałowych między określonymi populacjami komórek w precyzyjnym mikrośrodowisku.Odkrycia poczynione w ramach badań przeprowadzonych za pomocą systemu posłużą do prowadzenia badań in vivo i opracowywania metod leczenia. Zacznij od wysterylizowania skóry myszy przy użyciu 80% etanolu i przeniesienia myszy do sterylnego kaptura bezpieczeństwa biologicznego. Aby odizolować eksplantaty rdzenia ścięgna ogonowego, użyj skalpela, aby przeciąć ogon u jego podstawy.Następnie chwyć czubek ogona pęsetą i poruszaj nim, aby złamać skórę. Delikatnie odciągnij pęsetę, aby odsłonić eksplantaty rdzenia ścięgna. Umieść eksplantaty rdzenia ścięgien w standardowej pożywce hodowlanej i oddziel je od ogona za pomocą świeżego ostrza skalpela.Następnie, aby wyizolować fibroblasty ścięgien, wykonaj poprzeczne nacięcie na środku stopy myszy za pomocą skalpela. Z każdego końca tego nacięcia wykonaj prostopadłe cięcie wzdłuż boków tylnych nóg, aż do bioder. Następnie za pomocą pęsety przymocuj płat skóry do stopy i złudź skórę pokrywającą mięśnie łydek.Oddziel ścięgno Achillesa od kości piętowej świeżym ostrzem skalpela. Unieruchom luźny koniec pęsetą i oddziel drugi koniec od mięśnia brzuchatego łydki. Przenieś ścięgno do PBS i usuń pozostałą tkankę mięśniową.Następnie przenieś ścięgno do podłoża trawiącego. Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć staw biodrowy i oddzielić tylne nogi od ciała. Umyj tylne nogi w zimnym PBS.Usuń mięśnie skalpelem i umieść je na szalce Petriego na lodzie. Gdy szalka Petriego znajduje się na lodzie, zmiel tkankę mięśniową na kawałki mniejsze niż jeden milimetr sześcienny. Przenieś zmieloną tkankę mięśniową na pożywkę trawienną.Po usunięciu resztek tkanek mięśniowych umyj pozostałe kości w zimnym PBS. Umieść kości w świeżym, zimnym PBS i stopniowo usuwaj nasady, aby odsłonić szpik kostny. Wyposażyć strzykawkę w igłę do wstrzykiwań o wymiarach 0,4 na 25 milimetrów i napełnić ją 10 mililitrami pożywki do hodowli makrofagów.Przytrzymaj każdą kość nad 50-mililitrową plastikową rurką i wbij igłę na głębokość około jednego milimetra do szpiku kostnego od góry. Wypłukać szpik kostny, opróżniając strzykawkę. Aby rozpocząć, przygotuj uchwyty zaciskowe i metalowe zaciski.Umieść pasujące uchwyty zaciskowe z jednym metalowym zaciskiem każdy w stacji montażowej. Umieść mokre autoklawowane kawałki papieru na metalowych zaciskach. Przetnij papier wzdłuż wewnętrznych granic zacisków za pomocą skalpela.Wytnij dwa dodatkowe mniejsze kawałki papieru i utrzymuj je mokre. Za pomocą spiczastej pęsety umieść osiem eksplantatów rdzenia na papierze między metalowymi zaciskami tak, aby ich końce znajdowały się na zaciskach. Przykryj punkty końcowe eksplantatów rdzenia mniejszymi kawałkami papieru i umieść metalowe zaciski na górze.Użyj śrubokręta i małych, aby przymocować eksplantaty rdzenia między metalowymi zaciskami a clamp uchwyt. Ostrożnie przenieś zaciśnięte implanty rdzeniowe do silikonowych komór hodowlanych. I napełnij te komory dwoma mililitrami standardowej pożywki do hodowli komórkowych.Następnie zamocuj zespół za pomocą dodatkowych. Aby przygotować hydrożel kolagenowy, najpierw usuń komórki docelowe z naczyń do hodowli tkankowych za pomocą roztworu do odrywania komórek. Następnie odwirować przy 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie zamieszać w jednym mililitrze standardowej pożywki hodowlanej.Następnie przygotuj roztwór sieciujący, mieszając 10 mikrolitrów PBS, 1,28 mikrolitra jednego molowego NaOH i 8,72 mikrolitra podwójnie destylowanej wody na asembloid. Dodać zawiesinę komórkową do 12 asembloidów i umieścić probówkę na lodzie. Dostosuj zawiesinę komórek w taki sposób, aby uzyskać następujące stężenia końcowe.Oddzielnie przygotuj roztwór kolagenu 1, dodając 80 mikrolitrów kolagenu 1 na asembloid i umieść probówkę na lodzie. Gdy roztwory są gotowe na lodzie, odessać pożywkę do hodowli komórkowych z komór zawierających zaciśnięte eksplantaty rdzeniowe. Dodaj roztwór kolagenu 1 do roztworu sieciującego i wymieszaj szybko pipetując, nie tworząc pęcherzyków.Dodaj 200 mikrolitrów zmieszanego roztworu do rowków w komorach silikonowych, aby pokryć poszczególne eksplantaty rdzeni ścięgien. Pozwól hydrożelom polimeryzować przez 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie napełnij silikonowe komory hodowlane 1,5 mililitra odpowiedniej pożywki do kohodowli, pipetując ją w rogi komór.Umieść komory na dużej szalce Petriego lub sterylnym pudełku przed umieszczeniem ich w inkubatorze. Hoduj asembloidy w odpowiednich warunkach, zmieniając pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu. Usuń zespoły z zacisków za pomocą nożyczek.W razie potrzeby użyj pęsety, aby oddzielić eksplantaty rdzenia od zewnętrznej komory hydrożelowej. Po wyhodowaniu asembloidów w warunkach podobnych do zmian chorobowych przez ponad 21 dni zaobserwowano, że eksplant rdzeniowy pozostał mechanicznie rozciągliwy, niezmieniony pod względem wyglądu, wizualnie odróżnialny i fizycznie oddzielający się od otaczającego hydrożelu. Co więcej, otaczający hydrożel zagęszczał się z czasem, w zależności od populacji wysiewanych komórek, przy czym fibroblasty pochodzące ze ścięgna Achillesa najszybciej kurczyły otaczający je hydrożel.Ocena pod kątem żywotności, morfologii i rozprzestrzeniania się komórek w hydrożelu kolagenowym 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazała, że żywotność została zachowana podczas hodowli asembloidów co najmniej do siódmego dnia. Co więcej, ekspresja genów Vegfa i Mmps znacznie wzrosła w eksplantatach rdzeniowych, co widać w analizie transkryptomu. Podobnie, analiza sekretomu wykryła obecność cytokin, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych w eksplantatach rdzeniowych.

engineering-tendon-assembloids-to-probe-cellular-crosstalk-disease

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ścięgna zginaczy w dłoni są często uszkadzane, co prowadzi do upośledzenia funkcji ręki. Jednak reakcja gojenia się tkanki bliznowatej nie jest dobrze scharakteryzowana. Przedstawiono tutaj mysi model gojenia ścięgien zginaczy. Model ten może przyczynić się do lepszego zrozumienia procesu gojenia i oceny podejść terapeutycznych w celu poprawy gojenia.

Uraz ścięgna zginacza myszy i chirurgia naprawcza

Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Ten protokół przedstawia nowatorską metodę tworzenia przestrzennie szczegółowego modelu elementów skończonych wewnątrzkomórkowej architektury kardiomiocytów na podstawie obrazów z mikroskopii elektronowej i mikroskopii konfokalnej. Moc tego szczegółowego przestrzennie modelu została zademonstrowana na podstawie studiów przypadków z zakresu sygnalizacji wapniowej i bioenergetyki.

Stworzenie strukturalnie realistycznego modelu geometrycznego kardiomiocytów metodą elementów skończonych w celu zbadania roli architektury komórkowej w biologii układów kardiomiocytów

W tym artykule prezentujemy protokół in vitro i in situ do naprawy szczeliny ścięgna do 1,5 cm poprzez wypełnienie jej zmodyfikowanym przeszczepem kolagenu. Osiągnięto to poprzez opracowanie zmodyfikowanej techniki szwów, która przejmie obciążenie mechaniczne do momentu, gdy przeszczep dojrzeje do tkanki gospodarza.

Nowatorska technika szwów tenorrhaphy z przeszczepem kolagenu modyfikowanym tkankowo w celu naprawy dużych ubytków ścięgien

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Poznaj inżynierię asembloidów ścięgien do badania interakcji komórkowych w procesach naprawczych. Hybrydowy model łączy eksplanty z hydrogelami, umożliwiając symulację obciążeń mechanicznych i analizę komunikacji między populacjami komórkowymi w mikrośrodowisku.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Przeglądaj więcej filmów