Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach
22 marca 2024
Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.
Ścięgna ułatwiają ruch, przenosząc siły z mięśni na kość. Chociaż urazy ścięgien są powszechne, są one dość trudne do leczenia, a wyniki dla pacjentów są często złe. Obecnie wszystkie metody leczenia urazów ścięgien obejmują jakiś rodzaj fizjoterapii, co odzwierciedla fakt, że siły mechaniczne odgrywają tak centralną rolę w biologii ścięgien.
Dobre modele eksperymentalne do badania uszkodzeń i naprawy ścięgien tak naprawdę nie istnieją, więc moje laboratorium aktywnie opracowuje nowe modele, które mogą lepiej uchwycić ważne cechy fizjologii i patofizjologii ścięgien. W poprzednich badaniach mogliśmy wykazać, że rdzeń ścięgna, który stanowi nośną część ścięgna, sam w sobie ma bardzo ograniczoną zdolność naprawczą. W połączeniu z innymi badaniami w tej dziedzinie postawiliśmy hipotezę, że uszkodzony rdzeń będzie rekrutować komórki z zewnętrznego przedziału ścięgna, aby pomóc mu się zagoić.
System modelowania ścięgien oparty na inżynierii tkankowej może zapewniać ładowalne środowisko 3D, ale nie pasuje do zawiłości macierzy zewnątrzkomórkowej in vivo. Modele eksplantatów działają, ale często są trudne do utrzymania przy życiu i obciążają mechanicznie przez dłuższy czas lub brakuje im zewnętrznej komory, która jest kluczowa dla procesów naprawczych. Nasz unikalny system modelowy łączy w sobie zalety eksplantatów rdzeniowych pochodzących z morskich ścięgien ogonowych z zaletami systemów opartych na hydrożelu 3D.
Zapewnia ładowalną, podobną do vivo matrycę rdzenia, wraz ze sztuczną komorą zewnętrzną. Jego skład można dostosować do hipotezy badawczej i biomimetycznej bariery międzyprzedziałowej pomiędzy nimi. Nasze hybrydowe asembloidy eksplantatów hydrożelowych są w doskonałej pozycji do badania biologii rdzenia ścięgna, interakcji funkcji struktury macierzy oraz interakcji międzyprzedziałowych między określonymi populacjami komórek w precyzyjnym mikrośrodowisku.
Odkrycia poczynione w ramach badań przeprowadzonych za pomocą systemu posłużą do prowadzenia badań in vivo i opracowywania metod leczenia. Zacznij od wysterylizowania skóry myszy przy użyciu 80% etanolu i przeniesienia myszy do sterylnego kaptura bezpieczeństwa biologicznego. Aby odizolować eksplantaty rdzenia ścięgna ogonowego, użyj skalpela, aby przeciąć ogon u jego podstawy.
Następnie chwyć czubek ogona pęsetą i poruszaj nim, aby złamać skórę. Delikatnie odciągnij pęsetę, aby odsłonić eksplantaty rdzenia ścięgna. Umieść eksplantaty rdzenia ścięgien w standardowej pożywce hodowlanej i oddziel je od ogona za pomocą świeżego ostrza skalpela.
Następnie, aby wyizolować fibroblasty ścięgien, wykonaj poprzeczne nacięcie na środku stopy myszy za pomocą skalpela. Z każdego końca tego nacięcia wykonaj prostopadłe cięcie wzdłuż boków tylnych nóg, aż do bioder. Następnie za pomocą pęsety przymocuj płat skóry do stopy i złudź skórę pokrywającą mięśnie łydek.
Oddziel ścięgno Achillesa od kości piętowej świeżym ostrzem skalpela. Unieruchom luźny koniec pęsetą i oddziel drugi koniec od mięśnia brzuchatego łydki. Przenieś ścięgno do PBS i usuń pozostałą tkankę mięśniową.
Następnie przenieś ścięgno do podłoża trawiącego. Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć staw biodrowy i oddzielić tylne nogi od ciała. Umyj tylne nogi w zimnym PBS.
Usuń mięśnie skalpelem i umieść je na szalce Petriego na lodzie. Gdy szalka Petriego znajduje się na lodzie, zmiel tkankę mięśniową na kawałki mniejsze niż jeden milimetr sześcienny. Przenieś zmieloną tkankę mięśniową na pożywkę trawienną.
Po usunięciu resztek tkanek mięśniowych umyj pozostałe kości w zimnym PBS. Umieść kości w świeżym, zimnym PBS i stopniowo usuwaj nasady, aby odsłonić szpik kostny. Wyposażyć strzykawkę w igłę do wstrzykiwań o wymiarach 0,4 na 25 milimetrów i napełnić ją 10 mililitrami pożywki do hodowli makrofagów.
Przytrzymaj każdą kość nad 50-mililitrową plastikową rurką i wbij igłę na głębokość około jednego milimetra do szpiku kostnego od góry. Wypłukać szpik kostny, opróżniając strzykawkę. Aby rozpocząć, przygotuj uchwyty zaciskowe i metalowe zaciski.
Umieść pasujące uchwyty zaciskowe z jednym metalowym zaciskiem każdy w stacji montażowej. Umieść mokre autoklawowane kawałki papieru na metalowych zaciskach. Przetnij papier wzdłuż wewnętrznych granic zacisków za pomocą skalpela.
Wytnij dwa dodatkowe mniejsze kawałki papieru i utrzymuj je mokre. Za pomocą spiczastej pęsety umieść osiem eksplantatów rdzenia na papierze między metalowymi zaciskami tak, aby ich końce znajdowały się na zaciskach. Przykryj punkty końcowe eksplantatów rdzenia mniejszymi kawałkami papieru i umieść metalowe zaciski na górze.
Użyj śrubokręta i małych, aby przymocować eksplantaty rdzenia między metalowymi zaciskami a clamp uchwyt. Ostrożnie przenieś zaciśnięte implanty rdzeniowe do silikonowych komór hodowlanych. I napełnij te komory dwoma mililitrami standardowej pożywki do hodowli komórkowych.
Następnie zamocuj zespół za pomocą dodatkowych. Aby przygotować hydrożel kolagenowy, najpierw usuń komórki docelowe z naczyń do hodowli tkankowych za pomocą roztworu do odrywania komórek. Następnie odwirować przy 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie zamieszać w jednym mililitrze standardowej pożywki hodowlanej.
Następnie przygotuj roztwór sieciujący, mieszając 10 mikrolitrów PBS, 1,28 mikrolitra jednego molowego NaOH i 8,72 mikrolitra podwójnie destylowanej wody na asembloid. Dodać zawiesinę komórkową do 12 asembloidów i umieścić probówkę na lodzie. Dostosuj zawiesinę komórek w taki sposób, aby uzyskać następujące stężenia końcowe.
Oddzielnie przygotuj roztwór kolagenu 1, dodając 80 mikrolitrów kolagenu 1 na asembloid i umieść probówkę na lodzie. Gdy roztwory są gotowe na lodzie, odessać pożywkę do hodowli komórkowych z komór zawierających zaciśnięte eksplantaty rdzeniowe. Dodaj roztwór kolagenu 1 do roztworu sieciującego i wymieszaj szybko pipetując, nie tworząc pęcherzyków.
Dodaj 200 mikrolitrów zmieszanego roztworu do rowków w komorach silikonowych, aby pokryć poszczególne eksplantaty rdzeni ścięgien. Pozwól hydrożelom polimeryzować przez 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie napełnij silikonowe komory hodowlane 1,5 mililitra odpowiedniej pożywki do kohodowli, pipetując ją w rogi komór.
Umieść komory na dużej szalce Petriego lub sterylnym pudełku przed umieszczeniem ich w inkubatorze. Hoduj asembloidy w odpowiednich warunkach, zmieniając pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu. Usuń zespoły z zacisków za pomocą nożyczek.
W razie potrzeby użyj pęsety, aby oddzielić eksplantaty rdzenia od zewnętrznej komory hydrożelowej. Po wyhodowaniu asembloidów w warunkach podobnych do zmian chorobowych przez ponad 21 dni zaobserwowano, że eksplant rdzeniowy pozostał mechanicznie rozciągliwy, niezmieniony pod względem wyglądu, wizualnie odróżnialny i fizycznie oddzielający się od otaczającego hydrożelu. Co więcej, otaczający hydrożel zagęszczał się z czasem, w zależności od populacji wysiewanych komórek, przy czym fibroblasty pochodzące ze ścięgna Achillesa najszybciej kurczyły otaczający je hydrożel.
Ocena pod kątem żywotności, morfologii i rozprzestrzeniania się komórek w hydrożelu kolagenowym 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazała, że żywotność została zachowana podczas hodowli asembloidów co najmniej do siódmego dnia. Co więcej, ekspresja genów Vegfa i Mmps znacznie wzrosła w eksplantatach rdzeniowych, co widać w analizie transkryptomu. Podobnie, analiza sekretomu wykryła obecność cytokin, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych w eksplantatach rdzeniowych.
Overview
This study introduces an innovative assembloid model system designed to replicate the cellular interactions within tendons, particularly focusing on the load-bearing core tissue and the extrinsic compartment influenced by injury. The model allows for the investigation of disease-related activation of endothelial cells, providing insights into tendon repair mechanisms.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Biology
- Tissue Engineering
Background
- Tendons are crucial for force transmission from muscles to bones.
- Tendon injuries are prevalent and challenging to treat, often resulting in poor patient outcomes.
- Existing models for tendon research are limited in their ability to mimic in vivo conditions.
- The study aims to develop a model that captures the complexities of tendon biology and repair.
Purpose of Study
- To create a hybrid model that combines the advantages of tendon explants and 3D hydrogel systems.
- To investigate the interactions between tendon core cells and extrinsic cell populations during repair.
- To enhance understanding of tendon physiology and pathophysiology.
Methods Used
- Isolation of tendon core explants from mouse tails.
- Development of a collagen hydrogel to support cell culture.
- Mechanical loading of the assembloid to simulate in vivo conditions.
- Co-culture of tendon cells with extrinsic cell populations.
Main Results
- The assembloid model successfully mimics the tendon environment.
- It allows for the study of cellular interactions relevant to tendon repair.
- Findings will inform future in vivo research and treatment strategies.
- The model demonstrates potential for fine-tuning experimental conditions.
Conclusions
- The hybrid hydrogel explant assembloid is a promising tool for tendon research.
- It bridges the gap between traditional models and in vivo systems.
- Future studies using this model could lead to improved tendon injury treatments.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Engineering tendon assembloids enables systematic investigation of multicellular crosstalk and matrix interactions critical for tendon disease modeling and repair pathway discovery. This 3D explant-hydrogel system addresses the translational gap between simplistic in vitro assays and complex in vivo models, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. The platform's tunability and reproducibility position it as a reusable asset for portfolio-wide interrogation of tendon biology and therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular crosstalk and matrix remodeling relevant to tendon pathology.
- Supports mechanistic de-risking by modeling disease-activated cell populations in a controlled 3D context.
- Facilitates functional target validation through manipulation of defined microenvironmental stimuli.
- Provides a platform for hypothesis-driven exploration of repair mechanisms and pathway dependencies.
Screening & Assay Development
- Delivers a physiologically relevant, loadable 3D system for quantitative assessment of cell behavior and matrix responses.
- Enables standardization and reproducibility in multicellular assay development for tendon research.
- Supports screening of compounds or biologics targeting specific cell populations or signaling axes.
- Allows for scalable preparation of explants and hydrogels, facilitating downstream assay integration.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant multicellular interactions and extracellular matrix dynamics for translational continuity.
- Aligns with biomarker discovery efforts by enabling transcriptomic and secretomic profiling under defined conditions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive data on repair and degeneration pathways.
- Bridges the gap between in vitro mechanistic studies and in vivo validation in tendon biology.
Pipeline & Workflow Integration
This assembloid system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic studies, assay development, and translational modeling of tendon disease and repair.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on cellular recruitment, crosstalk, and matrix remodeling in tendon injury models.
- Screening: Provides a reproducible, quantitative platform for evaluating cellular and matrix responses to candidate interventions.
- Analytics: Supports transcriptomic, secretomic, and imaging-based readouts for comparative analysis of experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro findings with in vivo repair mechanisms and biomarker profiles.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable system adaptable to diverse tendon research and therapeutic discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tendon target validation.
- Operational Value: Standardizes multicellular 3D assays with scalable explant and hydrogel preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tendon-focused therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, primary cell isolation, and 3D culture systems.
- Demands access to confocal microscopy, transcriptomic, and secretomic analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of explant preparation and hydrogel formulation protocols.
- Adaptable to various cell populations and microenvironmental stimuli for model customization.
- Limited by the need for murine tissue sources and specialized handling for long-term culture viability.
