Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Ścięgna ułatwiają ruch, przenosząc siły z mięśni na kość. Chociaż urazy ścięgien są powszechne, są one dość trudne do leczenia, a wyniki dla pacjentów są często złe. Obecnie wszystkie metody leczenia urazów ścięgien obejmują jakiś rodzaj fizjoterapii, co odzwierciedla fakt, że siły mechaniczne odgrywają tak centralną rolę w biologii ścięgien.

Dobre modele eksperymentalne do badania uszkodzeń i naprawy ścięgien tak naprawdę nie istnieją, więc moje laboratorium aktywnie opracowuje nowe modele, które mogą lepiej uchwycić ważne cechy fizjologii i patofizjologii ścięgien. W poprzednich badaniach mogliśmy wykazać, że rdzeń ścięgna, który stanowi nośną część ścięgna, sam w sobie ma bardzo ograniczoną zdolność naprawczą. W połączeniu z innymi badaniami w tej dziedzinie postawiliśmy hipotezę, że uszkodzony rdzeń będzie rekrutować komórki z zewnętrznego przedziału ścięgna, aby pomóc mu się zagoić.

System modelowania ścięgien oparty na inżynierii tkankowej może zapewniać ładowalne środowisko 3D, ale nie pasuje do zawiłości macierzy zewnątrzkomórkowej in vivo. Modele eksplantatów działają, ale często są trudne do utrzymania przy życiu i obciążają mechanicznie przez dłuższy czas lub brakuje im zewnętrznej komory, która jest kluczowa dla procesów naprawczych. Nasz unikalny system modelowy łączy w sobie zalety eksplantatów rdzeniowych pochodzących z morskich ścięgien ogonowych z zaletami systemów opartych na hydrożelu 3D.

Zapewnia ładowalną, podobną do vivo matrycę rdzenia, wraz ze sztuczną komorą zewnętrzną. Jego skład można dostosować do hipotezy badawczej i biomimetycznej bariery międzyprzedziałowej pomiędzy nimi. Nasze hybrydowe asembloidy eksplantatów hydrożelowych są w doskonałej pozycji do badania biologii rdzenia ścięgna, interakcji funkcji struktury macierzy oraz interakcji międzyprzedziałowych między określonymi populacjami komórek w precyzyjnym mikrośrodowisku.

Odkrycia poczynione w ramach badań przeprowadzonych za pomocą systemu posłużą do prowadzenia badań in vivo i opracowywania metod leczenia. Zacznij od wysterylizowania skóry myszy przy użyciu 80% etanolu i przeniesienia myszy do sterylnego kaptura bezpieczeństwa biologicznego. Aby odizolować eksplantaty rdzenia ścięgna ogonowego, użyj skalpela, aby przeciąć ogon u jego podstawy.

Następnie chwyć czubek ogona pęsetą i poruszaj nim, aby złamać skórę. Delikatnie odciągnij pęsetę, aby odsłonić eksplantaty rdzenia ścięgna. Umieść eksplantaty rdzenia ścięgien w standardowej pożywce hodowlanej i oddziel je od ogona za pomocą świeżego ostrza skalpela.

Następnie, aby wyizolować fibroblasty ścięgien, wykonaj poprzeczne nacięcie na środku stopy myszy za pomocą skalpela. Z każdego końca tego nacięcia wykonaj prostopadłe cięcie wzdłuż boków tylnych nóg, aż do bioder. Następnie za pomocą pęsety przymocuj płat skóry do stopy i złudź skórę pokrywającą mięśnie łydek.

Oddziel ścięgno Achillesa od kości piętowej świeżym ostrzem skalpela. Unieruchom luźny koniec pęsetą i oddziel drugi koniec od mięśnia brzuchatego łydki. Przenieś ścięgno do PBS i usuń pozostałą tkankę mięśniową.

Następnie przenieś ścięgno do podłoża trawiącego. Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć staw biodrowy i oddzielić tylne nogi od ciała. Umyj tylne nogi w zimnym PBS.

Usuń mięśnie skalpelem i umieść je na szalce Petriego na lodzie. Gdy szalka Petriego znajduje się na lodzie, zmiel tkankę mięśniową na kawałki mniejsze niż jeden milimetr sześcienny. Przenieś zmieloną tkankę mięśniową na pożywkę trawienną.

Po usunięciu resztek tkanek mięśniowych umyj pozostałe kości w zimnym PBS. Umieść kości w świeżym, zimnym PBS i stopniowo usuwaj nasady, aby odsłonić szpik kostny. Wyposażyć strzykawkę w igłę do wstrzykiwań o wymiarach 0,4 na 25 milimetrów i napełnić ją 10 mililitrami pożywki do hodowli makrofagów.

Przytrzymaj każdą kość nad 50-mililitrową plastikową rurką i wbij igłę na głębokość około jednego milimetra do szpiku kostnego od góry. Wypłukać szpik kostny, opróżniając strzykawkę. Aby rozpocząć, przygotuj uchwyty zaciskowe i metalowe zaciski.

Umieść pasujące uchwyty zaciskowe z jednym metalowym zaciskiem każdy w stacji montażowej. Umieść mokre autoklawowane kawałki papieru na metalowych zaciskach. Przetnij papier wzdłuż wewnętrznych granic zacisków za pomocą skalpela.

Wytnij dwa dodatkowe mniejsze kawałki papieru i utrzymuj je mokre. Za pomocą spiczastej pęsety umieść osiem eksplantatów rdzenia na papierze między metalowymi zaciskami tak, aby ich końce znajdowały się na zaciskach. Przykryj punkty końcowe eksplantatów rdzenia mniejszymi kawałkami papieru i umieść metalowe zaciski na górze.

Użyj śrubokręta i małych, aby przymocować eksplantaty rdzenia między metalowymi zaciskami a clamp uchwyt. Ostrożnie przenieś zaciśnięte implanty rdzeniowe do silikonowych komór hodowlanych. I napełnij te komory dwoma mililitrami standardowej pożywki do hodowli komórkowych.

Następnie zamocuj zespół za pomocą dodatkowych. Aby przygotować hydrożel kolagenowy, najpierw usuń komórki docelowe z naczyń do hodowli tkankowych za pomocą roztworu do odrywania komórek. Następnie odwirować przy 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie zamieszać w jednym mililitrze standardowej pożywki hodowlanej.

Następnie przygotuj roztwór sieciujący, mieszając 10 mikrolitrów PBS, 1,28 mikrolitra jednego molowego NaOH i 8,72 mikrolitra podwójnie destylowanej wody na asembloid. Dodać zawiesinę komórkową do 12 asembloidów i umieścić probówkę na lodzie. Dostosuj zawiesinę komórek w taki sposób, aby uzyskać następujące stężenia końcowe.

Oddzielnie przygotuj roztwór kolagenu 1, dodając 80 mikrolitrów kolagenu 1 na asembloid i umieść probówkę na lodzie. Gdy roztwory są gotowe na lodzie, odessać pożywkę do hodowli komórkowych z komór zawierających zaciśnięte eksplantaty rdzeniowe. Dodaj roztwór kolagenu 1 do roztworu sieciującego i wymieszaj szybko pipetując, nie tworząc pęcherzyków.

Dodaj 200 mikrolitrów zmieszanego roztworu do rowków w komorach silikonowych, aby pokryć poszczególne eksplantaty rdzeni ścięgien. Pozwól hydrożelom polimeryzować przez 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie napełnij silikonowe komory hodowlane 1,5 mililitra odpowiedniej pożywki do kohodowli, pipetując ją w rogi komór.

Umieść komory na dużej szalce Petriego lub sterylnym pudełku przed umieszczeniem ich w inkubatorze. Hoduj asembloidy w odpowiednich warunkach, zmieniając pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu. Usuń zespoły z zacisków za pomocą nożyczek.

W razie potrzeby użyj pęsety, aby oddzielić eksplantaty rdzenia od zewnętrznej komory hydrożelowej. Po wyhodowaniu asembloidów w warunkach podobnych do zmian chorobowych przez ponad 21 dni zaobserwowano, że eksplant rdzeniowy pozostał mechanicznie rozciągliwy, niezmieniony pod względem wyglądu, wizualnie odróżnialny i fizycznie oddzielający się od otaczającego hydrożelu. Co więcej, otaczający hydrożel zagęszczał się z czasem, w zależności od populacji wysiewanych komórek, przy czym fibroblasty pochodzące ze ścięgna Achillesa najszybciej kurczyły otaczający je hydrożel.

Ocena pod kątem żywotności, morfologii i rozprzestrzeniania się komórek w hydrożelu kolagenowym 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazała, że żywotność została zachowana podczas hodowli asembloidów co najmniej do siódmego dnia. Co więcej, ekspresja genów Vegfa i Mmps znacznie wzrosła w eksplantatach rdzeniowych, co widać w analizie transkryptomu. Podobnie, analiza sekretomu wykryła obecność cytokin, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych w eksplantatach rdzeniowych.