Name: Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania organoidów raka jelita grubego z linii SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej. Technika ta umożliwia badanie morfologii, żywotności i proliferacji w kontekście medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana finansowo przez Uniwersytet Nauki i Technologii Króla Abdullaha. Autorzy dziękują za przyznanie Funduszu Zalążkowego KAUST oraz Funduszu Innowacji KAUST przyznane przez Dział Innowacji i Rozwoju Gospodarczego KAUST. Autorzy pragną podziękować Laboratoriom Nauk Biologicznych i Obrazowania KAUST za wsparcie w zakresie charakterystyki biologicznej i analiz mikroskopowych.

1. Przygotowanie buforu i roztworu
UWAGA: Wszystkie podane stężenia są stężeniami końcowymi.
<ol>
	<li>Dodać płodową surowicę bydlęcą (FBS) i penicylinę-streptomycynę w końcowym stężeniu odpowiednio 10% i 1%, aby przygotować kompletną modyfikowaną pożywkę Dulbecco (IMDM) firmy Iscove. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Zmieszać MgCl2 (3 mM), sacharozę (300 mM) i Triton X-100 (0,5%) w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) w celu przygotowania buforu permeabilizacyjnego. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	<li>Połączyć albuminę surowicy bydlęcej (BSA, 1%), glicynę (0,3 M) i Tween-20 (0,1%) w PBS, aby przygotować bufor blokujący. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10x do 2x PBS ultraczystą wodą w sterylnych warunkach. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez ponad 6 miesięcy.</li>
	<li>Sterylizować 3 mg proszku peptydowego w świetle ultrafioletowym przez 30 minut. Dodać 500 μl ultraczystej wody do rozpuszczenia za pomocą mieszalnika wirowego. 
	UWAGA: Końcowe stężenie musi być dwukrotnie większe niż stężenie docelowe, tj. 6 mg/ml, ponieważ stężenie 1x wyniesie 3 mg/ml.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie organoidów raka jelita grubego z SW1222 w peptydzie
<ol>
	<li>Rozmrażać podwielokrotność przez noc w temperaturze 4 °C i przechowywać ją w lodzie do czasu, gdy będzie potrzebna do przygotowania kontroli matrycy podstawowej.</li>
	<li>Umieść 10 μl kropli 2x roztworu peptydu na środku każdej studzienki na 24-dołkowej płytce. Pozostawić płytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Alternatywnie, umieść 8-10 kropelek na studzience na płytce 6-dołkowej. 
	UWAGA: Próbki przeznaczone do stosowania w mikroskopii konfokalnej i elektronowej są bardziej dostępne do manipulowania, jeśli zostaną umieszczone na sterylnym szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Dodać 10 μL 2x PBS. Delikatnie wymieszaj roztwór PBS za pomocą końcówki. Pozwól żelom ustabilizować się przez co najmniej 20 minut, upewniając się, że kropelki pozostają prawie nienaruszone. 
	UWAGA: Celem dodawania PBS i delikatnego mieszania jest utrzymanie integralności kropli i uniknięcie rozprowadzania hydrożelu na warstwie.</li>
	<li>Odłącz komórki SW1222 za pomocą 0,125% roztworu trypsyny-EDTA (5 ml). Inkubować komórki z trypsyną w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, aż oderwą się od kolby. Powstrzymaj się od stukania w kolbę, aby uniknąć zlepiania się komórek.</li>
	<li>Dodaj 5 ml kompletnego podłoża, aby dezaktywować trypsynę. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o wielkości 30 μm. Alternatywnie, użyć strzykawki z igłą 25 G, aby rozbić agregaty.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 0,4 × 106 komórek/ml i wstrzyknąć 2 μl zawiesiny komórek do każdej kropli peptydu za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl.</li>
	<li>Inkubować kropelki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Dodać 0,5 ml uzupełnionej pożywki do każdego dołka po inkubacji.</li>
	<li>Podczas oczekiwania należy przygotować kontrolę matrycy błony podstawnej, rozcieńczając główny zapas (8-12 mg/ml, w zależności od partii) do końcowego stężenia 3 mg/ml przy użyciu uzupełnionej pożywki. Dodaj komórki do tego roztworu (800 komórek na 25 μl). 
	UWAGA: Manipulacja membraną podstawną musi być zawsze wykonywana na lodzie. Końcówki należy wypłukać w lodowatym PBS przed dotknięciem hydrożelu. W przeciwnym razie wewnątrz końcówek nastąpi polimeryzacja.</li>
	<li>Umieść 20 μl kropelek roztworu membrany podstawnej w każdej studzience. Pozostawić kropelki do zżelowania przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Po zżelowaniu materiału dodać 0,5 ml kompletnego podłoża.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 3-4 dni. Obserwuj, jak komórki organizują się i wykazują sygnały tworzenia światła już w 4 dniu.</li>
	<li>Zobrazuj komórki w jasnym polu w dniu 1, dniu 4 i dniu 7, aby ocenić wzrost organoidów.</li>
</ol>
3. Żywotność i proliferacja
<ol>
	<li>Przygotować trzy płytki doniknikowe do badania żywotności i trzy płytki doniknikowe do tezy proliferacji. Dodać 25 μl 2x roztworu peptydu do dołka i żelować, używając tej samej objętości 2x PBS. Zasiej komórki zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Przygotuj trzy studzienki dla każdej formuły hydrożelu peptydowego, który ma być użyty jako ślepe próby na płytce proliferacyjnej. Nie rozsiewaj na nich komórek.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z płytki studzienki żywotności i przemywać 1x PBS przez 3 x 5 min.</li>
	<li>Rozcieńczyć homodimer kalceiny-AM i etydyny do 8 μM z zestawu do żywotności/cytotoksyczności dla komórek ssaków (patrz tabela materiałów) do tej samej stożkowej probówki chronionej przed światłem. Aby przygotować 2 ml tego roztworu do 2 ml PBS w stożkowej probówce zabezpieczonej przed światłem, dodać 4 μl roztworu podstawowego Calcein-AM i 8 μl roztworu podstawowego homodimeru etydyny-1.</li>
	<li>Dodać roztwór homodimeru kalceiny/etydyny przygotowany w kroku 3.4 do płytki 96-dołkowej. Dodać 100 μl na studzienkę. Chronić przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Myć przez 3 x 5 min z 1x PBS. Wyobraź sobie co najmniej trzy pola (środek, góra, dół) w przypadku korzystania z obiektywu 4x lub co najmniej pięć pól (środek, lewy górny róg, prawy górny róg, lewy dolny róg, prawy dolny róg) w przypadku korzystania z obiektywu 10x i 20x pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z płytki studzienki proliferacyjnej, aby uzyskać końcową objętość 90 μl.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu Alamar Blue (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcowe stężenie 10%.</li>
	<li>Chronić przed światłem i inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2</li>
	<li>Użyj czytnika płytek dołkowych, aby zmierzyć fluorescencję (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) lub absorbancję (570 nm). Uśrednij wartości uzyskane dla pustych miejsc i odejmij je od wartości z każdej studzienki zawierającej komórki.</li>
	<li>Oblicz wartości proliferacji, uśredniając sygnał każdego stanu i odejmując średnią z ich odpowiednich ślepych prób. Twórz wykresy, generując indeksowany wykres pudełkowy sygnału względnej absorbancji/fluorescencji w funkcji czasu.</li>
</ol>
4. Test przylegania komórek do matrycy
<ol>
	<li>Przygotuj 100 μl hydrożeli peptydowych w dwóch niezależnych płytkach 96-dołkowych.</li>
	<li>Wysiej 20 000 komórek w każdym dołku i dodaj 100 μl pożywki. Inkubować płytki przez 90 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji należy wziąć tylko jedną płytkę i ostrożnie ponownie zawiesić podłoże za pomocą mikropipety P200 przez 20-30 s. Należy uważać, aby nie zakłócić działania hydrożelu, trzymając końcówkę z dala od żelu. Alternatywnie, jeśli pozwalają na to właściwości mechaniczne hydrożelu (G' > 8,000 Pa), postukaj w cztery strony płytki studzienki za pomocą ruchomego wiru. 
	UWAGA: Ponowne zawieszenie pożywki (lub stuknięcie wirem w płytkę studzienki) usunie zarówno nieprzyłączone komórki, jak i komórki o słabej przyczepności do powierzchni matrycy. Przyłączenie komórkowe nastąpi w ciągu 90 minut, chociaż siła tego przyłączenia będzie się różnić w zależności od konkretnych hydrożeli peptydowych oraz ich właściwości adhezyjnych i wiążących. Wiadomo, że wzrost organoidów jelita grubego jest preferowany w matrycach o wartościach sztywności poniżej 2,000 Pa. Stąd, ponieważ hydrożele przedstawione w tym protokole są miękkie i kruche, staramy się stosować delikatne naprężenia mechaniczne.</li>
	<li>Usuń 100 μl pożywki z obu płytek dołkowych i dodaj raz przepłukać 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór DAPI o stężeniu 1 μg/mL. Dodać 100 μl roztworu DAPI do wszystkich studzienek i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zobrazuj reprezentatywną liczbę pól pod mikroskopem fluorescencyjnym. Upewnij się, że wszystkie obrazy zostały uzyskane przy użyciu tego samego obiektywu, aby zachować stały stosunek pikseli do odległości. 
	UWAGA: Obraz dziewięciu pól dla obiektywu 10x lub 15 pól dla obiektywu 20x.</li>
	<li>Załaduj obrazy fluorescencji do oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ) i przeanalizuj cząstki na wszystkich obrazach.
	<ol>
		<li>Z menu Obraz wybierz Typ i kliknij 8-bitowy.</li>
		<li>Z menu Obraz wybierz Dostosuj i kliknij Jasność/Kontrast. Kliknij przycisk Auto | Złóż wniosek.</li>
		<li>Z menu Obraz wybierz Dostosuj i kliknij Próg. Kliknij przycisk Auto i zamknij okno.</li>
		<li>W menu Analizuj kliknij Analizuj cząstki. Zaznacz opcję podsumowania i kliknij OK.</li>
		<li>W oknie Podsumowanie najedź kursorem na menu Plik i kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać wartości podsumowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksportuj wyniki dla wszystkich obrazów do standardowego oprogramowania statystycznego.</li>
	<li>Oblicz procent powierzchni pokrytej przez komórki przed i po stresie. Utwórz indeksowany wykres pudełkowy przedstawiający procent powierzchni względem każdego warunku.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne organoidów w hydrożelu peptydowym
<ol>
	<li>Wysiewaj 800 komórek w 20 μl kropelkach hydrożelu peptydowego przez 4 dni, jak opisano w krokach 2.1-2.10.</li>
	<li>W dniu 4 usuń pożywkę i umyj każdą studzienkę 2x za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 400 μl 4% roztworu formaldehydu. Inkubować płytkę studzienki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń roztwór formaldehydu za pomocą P1000 i umyj raz 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do permeabilizacji i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń bufor przepuszczalny za pomocą P1000 i przemyj raz 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml buforu blokującego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń bufor blokujący za pomocą P1000 i umyj 1x PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Dodaj 200 μl do dwóch studzienek.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń roztwór barwiący za pomocą P200 i umyj raz 1x PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Dodać koniugat falloidyny w stosunku 1:40 do roztworu przeciwciała drugorzędowego.</li>
	<li>Chronić przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 3 godziny. Usunąć roztwór barwiący za pomocą P200 i przemyć raz 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór DAPI o stężeniu 1 μg/ml w buforze blokującym. Dodaj 300 μl roztworu DAPI do każdej studzienki.</li>
	<li>Chronić przed światłem i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń roztwór barwiący za pomocą P200 i umyj raz 1x PBS.</li>
	<li>Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 7 dni.</li>
</ol>
6. Obrazowanie i analiza obrazu organoidów w matrycy
<ol>
	<li>Zobrazuj barwione próbki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z 10-krotnym powiększeniem. Używaj tylko kanałów falloidyny i DAPI.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie Cellopose i naciśnij ctrl + L, aby załadować obraz. Ponieważ oprogramowanie będzie miało dostęp do wszystkich plików w lokalizacji wybranego obrazu, pamiętaj, aby zapisać wszystkie obrazy fluorescencyjne w dokładnej lokalizacji bez żadnych podfolderów.</li>
	<li>Wpisz średnią średnicę kolonii w panelu Segmentacja i kliknij ENTER.</li>
	<li>Wybierz niestandardowy model organoidów okrężnicy i kliknij przycisk Uruchom model. 
	UWAGA: W tym miejscu sugerujemy użycie dwóch modeli od podstaw w Cellpose2.029,30</li>
	<li>Naciśnij ctrl + s, aby zapisać maski jako plik .npy.</li>
	<li>Użyj strzałek na klawiaturze, aby poruszać się po obrazach folderu i uruchom model organoidów okrężnicy na wszystkich obrazach w folderze.</li>
	<li>Zrób kopię folderu i powtórz kroki 6.2-6.6, używając modelu światła organoidu okrężnicy.</li>
	<li>Otwórz ImageJ i kliknij Wtyczka | Makra | Uruchom..., aby uruchomić plik imagej_roi_converter.py dostępny w witrynie Cellpose Github i poczekaj, aż pojawi się okno.</li>
	<li>Wybierz pierwszy plik z folderu organoidów dwukropka i kliknij przycisk Otwórz.</li>
	<li>Wybierz plik seg.npy odpowiadający pierwszemu plikowi i kliknij Open. 
	UWAGA: ImageJ przekonwertuje maski na obszary zainteresowania i nałoży je na odpowiadające im obrazy fluorescencyjne.</li>
	<li>Kliknij opcję Zaznacz wszystko w oknie Menedżer zwrotu z inwestycji, a następnie kliknij przycisk Zmierz.</li>
	<li>Kliknij pozycję Plik | Zapisz jako... w oknie Wyniki i zapisz wyniki. 
	UWAGA: Spowoduje to utworzenie pliku .csv zawierającego wszystkie właściwości kształtu każdej kolonii w polu.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.8-6.12 dla tego samego obrazu w folderze dla światła organoidu okrężnicy.</li>
	<li>Załaduj OriginPro i naciśnij ctrl + 3, aby otworzyć Kreatora importu. Kliknij przycisk z trzema kropkami i wybierz oba .csv pliki odpowiadające właściwościom organoidu i kształtu światła dla tego samego obrazu.</li>
	<li>Skopiuj i wklej wyniki z właściwości kształtu światła w jednej kolumnie obok wyników kolonii, aby upewnić się, że każdy pomiar strumienia świetlnego jest sparowany z odpowiednią kolonią.</li>
	<li>W nowej kolumnie podziel obszary światła i kolonii, aby uzyskać względny obszar światła kolonii, która ją zawiera.</li>
	<li>Wybierz kolumnę odpowiadającą okrągłości każdej kolonii i obszarowi światła. Kliknij na Działka | Podstawowe 2D | Rozproszenie.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy okno działki i wybierz Szczegóły działki. Kliknij kartę Centroid (PRO) i zaznacz opcje czytające Pokaż punkt środka ciężkości dla podzbioru, Połącz z punktami danych i Pokaż elipsę.</li>
</ol>

Evaluating Biofunctional Self-Assembling Peptides for Cell Adhesion and Morphology

<ol><li>Susapto, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide+bioinks+support+automated+printing+of+large-scale+constructs+assuring+long-term+survival+of+printed+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs.</a> Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+well-defined%2C+self-assembling+3D+substrate+for+long-term+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+proteins+and+peptides+as+scaffolds+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+bioink%3A+self-assembling+nanofibrous+scaffolds+for+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures.</a> Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extracellular+matrix+hydrogels+as+alternatives+to+Matrigel+for+culturing+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).</li>
<li>Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+current+status+of+three-dimensional+organoids+as+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models.</a> Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Hauser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+tri-+to+hexapeptides+self-assemble+in+water+to+amyloid+beta-type+fiber+aggregates+by+unexpected+alpha-helical+intermediate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).</li>
<li>Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+self-assembling+peptides+as+building+blocks+for+modern+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices.</a> Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+tetrameric+peptides+allow+in+situ+3D+bioprinting+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).</li>
<li>Bilalis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptide-based+photoreactive+instant+glue+for+environmental+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Moretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectively+positioned+catechol+moiety+supports+ultrashort+self-assembling+peptide+hydrogel+adhesion+for+coral+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration.</a> Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).</li>
<li>Alhattab, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+three-dimensional+bone+marrow+niche-like+acute+myeloid+Leukemia+disease+model+by+an+automated+and+controlled+process+using+a+robotic+multicellular+bioprinting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system.</a> Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+peptide-based+nanostructures%3A+smart+nanomaterials+toward+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery.</a> Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+by+a+functionalized+silk+fibroin+hydrogel+for+bone+defect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).</li>
<li>Hogrebe, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+control+of+matrix+adhesiveness+and+stiffness+within+a+3D+self-assembling+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel.</a> Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).</li>
<li>Wu, F. J., Lin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+self-assembly%2C+and+cell+responses+of+aromatic+IKVAV+peptide+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles.</a> Molecules. 27 (13), 4115(2022).</li>
<li>Cringoli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioadhesive+supramolecular+hydrogel+from+unprotected%2C+short+d%2Cl-peptides+with+Phe-Phe+and+Leu-Asp-Val+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs.</a> Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).</li>
<li>Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+functionalized+self-assembled+peptide+hydrogels+in+in+vitro+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis.</a> Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).</li>
<li>Pérez-Pedroza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+lumen-forming+colorectal+cancer+organoids+using+a+newly+designed+laminin-derived+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).</li>
<li>Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+differentiation+and+lumen+formation+in+colorectal+cancer+cell+lines+and+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors.</a> Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).</li>
<li>Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+colorectal+cancer-derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Pachitariu, M., Stringer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose+2.0%3A+how+to+train+your+own+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose 2.0: how to train your own model.</a> Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+a+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li>
<li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate adhesion assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+frontal+and+rear+cell-substrate+adhesions+in+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).</li>
<li>Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+scaffold-free+3D+organoid+model+to+study+neoplastic+progression+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).</li>
<li>Puschhof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid+cocultures+with+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid cocultures with microbes.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).</li>
<li>Matthews, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrganoID%3A+A+versatile+deep+learning+platform+for+tracking+and+analysis+of+single-organoid+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics.</a> PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+%C3%97+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).</li>
<li>Bergdorf, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+cancer+spheroids+and+fine-needle+aspiration-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).</li>
<li>Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+hydrogels+to+engineer+3D+cell+microenvironments+for+cell+constructs+formation+and+precise+oncology+remodeling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer.</a> Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).</li>
<li>Yadav, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide-based+hydrogel+for+the+healing+of+critical+bone+defects+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).</li>
<li>Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+from+self-assembling+tetrapeptides+support+3D+spreading%2C+osteogenic+differentiation%2C+and+angiogenesis+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Ogromny potencjał SAP w badaniach biomedycznych podkreśla ich plastyczność i zdolność adaptacji poprzez biofunkcjonalizację. Przy tak szerokim wachlarzu permutacji pojawia się wyzwanie w efektywnym testowaniu i określaniu najbardziej obiecujących konfiguracji dla konkretnych zastosowań, zwłaszcza w badaniach nad organoidami. Szybkie i ekonomiczne rozwiązanie ma kluczowe znaczenie. Linia komórkowa SW1222, wywodząca się z ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego, staje się kluczowym kandydatem do tak intensywnej oceny. W tym miejscu przedstawiliśmy metodę oceny i charakterystyki organoidów hodowanych w matrycy opartej na peptydach. Protokół ten obiecuje zintegrowaną, opłacalną strategię, która koncentruje się na monitorowaniu i analizie organoidów przy użyciu ocen żywotności i proliferacji, testów adhezji, analizy kształtu i immunocytochemii. Wybór różnych stężeń peptydów w naszych eksperymentach z hodowlami komórkowymi opiera się na starannie przemyślanych przesłankach, które są zgodne z konkretnymi celami eksperymentalnymi i znacząco przyczyniają się do pogłębienia naszego zrozumienia hodowli organoidów w kontekście matryc peptydowych. Nasza podróż badawcza ewoluowała z biegiem czasu, co wymagało zróżnicowanego podejścia do badania różnych preparatów. Po pierwsze, wykorzystanie zakresu stężeń peptydów, od 1,5 mg/ml do 4,5 mg/ml, było motywowane chęcią zbadania spektrum potencjalnych wyników. Stosując niższe stężenia, naszym celem była ocena minimalnego stężenia peptydów wymaganego do skutecznego wspierania wzrostu i rozwoju organoidów. Informacje te są niezbędne do zrozumienia wykonalności opłacalnych aplikacji o minimalnych zasobach. I odwrotnie, wybrano wyższe stężenia, aby zbadać górne granice stężenia peptydów i ich potencjalny wpływ na zachowanie organoidów, odpowiadając na pytania dotyczące efektów nasycenia i potencjalnych wad nadmiernych stężeń peptydów.
Po drugie, naszymi wyborami kierowały konkretne cele eksperymentalne. Na przykład, badając adhezję komórek, zastosowano stężenia peptydów, aby zmniejszyć pękanie hydrożelu pod wpływem stresu. I odwrotnie, w badaniach koncentrujących się na długoterminowej żywotności i dojrzewaniu tkanek, niższe stężenia stosowano w celu osiągnięcia najniższych możliwych wartości reologicznych przy jednoczesnym zapewnieniu żelu. Co więcej, wartości proliferacji zostały dobrane tak, aby pokazać różne profile uzyskane w czasie na kulturze organoidów przy zastosowaniu podobnych preparatów. Znaczenie tego zróżnicowanego podejścia polega na jego zdolności do uzyskania kompleksowego zestawu danych, który obejmuje szerokie spektrum warunków i wyników. Badając wpływ różnych stężeń peptydów na hodowlę organoidów, możemy lepiej zrozumieć zniuansowane zależności między właściwościami matrycy a zachowaniem organoidów.
Wstępna ocena obejmuje monitorowanie progresji komórek SW1222 przez tydzień na 24-dołkowej płytce za pomocą obrazowania w jasnym polu. Ogólna analiza morfologii i gęstości komórek jest rutynową techniką dla linii organoidowych9 , która jest stosowana do linii komórkowej. Nieinwazyjny charakter tego protokołu pozwala na nieprzerwaną obserwację hodowli komórkowej, co pozwala nam na uchwycenie kluczowych danych na temat zmian morfologicznych i gęstości komórek dla każdej konkretnej kolonii. Ta wstępna analiza może dostarczyć cennych informacji na temat przydatności ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej. Obserwacje te stanowią podstawę do dalszych dogłębnych analiz, wykazując przydatność matrycy peptydowej jako skutecznego rusztowania wspomagającego rozwój i wzrost organoidów raka jelita grubego. Co więcej, interesujące obserwacje mogą wynikać z monitorowania wzrostu i zmian w każdej rodzinie. Na przykład na rysunku 4 możemy zaobserwować, że kolonie rosnące w Matrigel mogą ze sobą kolidować, ale wydaje się, że granica jest konsekwentnie zachowana. Jednak komórki hodowane w peptydach reorganizują peptyd w taki sposób, że do 7 dnia lokalizacje komórek nie są dokładnie takie same, jak wcześniej. Jest to coś, co należy wziąć pod uwagę, jeśli ten protokół został wyeksportowany do zautomatyzowanego systemu, który oznaczałby i śledził wzrost organoidów.
Późniejsza kontrola obejmuje ocenę żywotności i proliferacji komórek za pomocą testu żywotności opartego na homodimerze kalceiny i etydyny. Test żywotności dostarczy jakościowych informacji na temat populacji żywych komórek w porównaniu z martwymi komórkami. Test proliferacji dostarczy informacji ilościowych dotyczących stanu metabolicznego komórek w celu oceny podziału komórek31. Są to standardowe testy szeroko stosowane w hodowlach komórkowych i zapewniają ogólny przegląd statusu proliferacyjnego komórek. Podczas gdy wykazano, że matryce SAP są biokompatybilne, wiadomo, że organoidy wykazują zmniejszoną żywotność z powodu nieoptymalnych warunków hodowli, w tym matrycy, w której są osadzone. Ponadto właściwości mechaniczne matryc peptydowych mogą wpływać na żywotność komórek. Jeśli matryca jest zbyt sztywna lub sztywna, może narażać ogniwa na naprężenia mechaniczne, co może prowadzić do ich uszkodzenia. I odwrotnie, jeśli matryca jest zbyt miękka lub niestabilna, może nie zapewniać wystarczającego wsparcia dla adhezji i przeżycia komórek. Ponadto motywy bioaktywne lub grupy funkcyjne obecne w peptydach mogą wchodzić w interakcje z określonymi receptorami komórkowymi lub szlakami sygnałowymi, potencjalnie prowadząc do śmierci komórki. Dlatego tak ważne jest ciągłe monitorowanie żywotności i proliferacji komórek.
We wcześniejszych badaniach25 peptyd 1 i peptyd 2 wykazywały podobny poziom śmierci komórki w porównaniu z Matrigelem (ryc. 5). Zaobserwowano jednak fluktuacje w profilach proliferacji komórek peptydu macierzystego o różnych stężeniach. Warto zauważyć, że tempo proliferacji od 4 do 7 dnia pozostało stałe, a nie wzrosło, co sugeruje, że komórki mogą wchodzić w mniej aktywną fazę. Co więcej, zmiany w żywotności komórek obserwowane między 4. a 7. dniem również pozostały stosunkowo spójne, co wskazuje na potencjalne plateau we wzroście i reprodukcji.
Aby kontynuować ocenę i charakterystykę, zastosowaliśmy test adhezji dostosowany do hodowli 3D, który opiera się na naprężeniach mechanicznych w celu oceny efektów oderwania komórek32. Metodę wywoływania naprężeń mechanicznych należy dobrać na podstawie właściwości mechanicznych hydrożelu. Skuteczność metody jest nierozerwalnie związana z wybranym systemem modelowym, a uzyskane spostrzeżenia zależą od tego, jak dobrze reprezentuje on kontekst biologiczny. Zmienność przyczepności i charakterystyki organoidów może wynikać z licznych interakcji fizycznych i chemicznych, na które mogą mieć wpływ takie czynniki, jak skład hydrożelu i właściwości adhezyjne nanowłókien. Czynniki te mogą potencjalnie wpływać na możliwość uogólnienia naszych ustaleń33. Jeśli jednak czytelnik miałby dostosować ten protokół do sztywniejszych lub bardzo plastycznych hydrożeli, rozważ użycie bardziej wytrzymałej metody naprężania.
Wykorzystaliśmy tę technikę do oceny ogólnej przyczepności zapewnianej SAP przez motyw biofunkcjonalny (ryc. 6). Zaobserwowaliśmy dwa zjawiska. Po pierwsze, peptydy wykazywały różne początkowe właściwości adhezyjne. W szczególności stwierdzono, że motyw IKVAV i hydrożele zawierające wysokie stężenie biofunkcjonalizowanego peptydu przylegają do komórek na ponad 40% ich powierzchni. Po drugie, po zastosowaniu indukowanego stresu, niektóre peptydy doświadczyły znacznej utraty przylegających komórek. Warto zauważyć, że zdolność zatrzymywania była stosunkowo wysoka w peptydach, które zawierały wysokie stężenia niebiofunkcjonalizowanego peptydu. W ten sposób ligand IKVAV i SAP oferują różne rodzaje przylegania komórek do matrycy. Metoda ta pozwala na znalezienie wzorców i wyjaśnienie mechanizmu przylegania do materiału. Można zastosować dalsze techniki, takie jak pomiar przyczepności za pomocą mikroskopii sił atomowych, która może być wykorzystana do zbadania sił adhezji między końcówką sondy a powierzchnią próbki na poziomie nanoskali, dostarczając cennych informacji na temat właściwości adhezyjnych materiałów i próbek biologicznych.
Zdolność różnych materiałów peptydowych do indukowania tworzenia organoidów oceniono za pomocą okrągłości kolonii i względnej powierzchni światła organoidów hodowanych w takich hydrożelach peptydowych. Okrągłość odnosi się do krągłości lub kształtu obiektu. W kontekście organoidów cyrkularność może być wykorzystana do oceny morfologii i symetrii struktury. W kilku badaniach wspomniano o kolistych morfologiach organoidów. Na przykład organoidy raka piersi mają zwykle ścisłą kolistą morfologię z pępowinowatymi brzegami podstawno-bocznymi34. Sugeruje to, że cyrkularność może być wykorzystana jako parametr do oceny kształtu organoidów. Wielkość światła odnosi się do centralnej wnęki lub przestrzeni w organoidzie. Jest to istotna cecha, ponieważ odzwierciedla różnicowanie i dojrzewanie organoidu. Podczas procesu różnicowania organoidy ulegają zmniejszeniu wielkości światła i zwiększeniu grubości warstwy nabłonkowej35. Oznacza to, że wielkość światła może być używana jako wskaźnik etapu rozwoju organoidu. Ocena cyrkularności i wielkości światła może dostarczyć cennych informacji na temat cech strukturalnych i funkcjonalnych organoidów. Okrągłe organoidy z dobrze zdefiniowanymi światłami są bardziej reprezentatywne dla natywnej architektury tkankowej i mogą lepiej naśladować funkcję narządów36.
Właściwości te można ocenić, uzyskując obrazy fluorescencyjne cytoszkieletu i jąder z wcześniej wybarwionych próbek. Obrazy podzielono na segmenty za pomocą Cellpose, a pomiary kształtu powstałych masek uzyskano za pomocą ImageJ. Analiza kształtu próbek wybarwionych cytoszkieletem po 4 dniach hodowli ujawniła dalsze cechy organoidów. Podobne metody, skoncentrowane głównie na obrazowaniu w jasnym polu, zostały wykorzystane do określenia reakcji organoidów na ich środowisko w oparciu o analizę kształtu i określenie cech organoidu za pomocą analizy obrazu 36,37,38. Na koniec wykorzystaliśmy immunocytochemię do oceny polarności komórek za pomocą różnych markerów polarności. Warto zauważyć, że zastosowanie hydrożelu peptydowego ograniczy obchodzenie się z próbką, ponieważ nie wymaga to usuwania matrycy i pobierania organoidów39.
Znaczenie tej metody opiera się na wszechstronności biofunkcjonalnych hydrożeli SAP w porównaniu z innymi matrycami pochodzenia zwierzęcego w celu opracowania metod, które umożliwiają translację hydrożeli peptydowych na matryce do hodowli organoidów. Porównanie ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej z tradycyjnymi matrycami, takimi jak Matrigel czy kolagen, ujawnia wiele zalet. Po pierwsze, matryca peptydowa zapewnia doskonałą odtwarzalność, ponieważ sekwencja peptydowa może być precyzyjnie kontrolowana i syntetyzowana, zapewniając spójne właściwości i wydajność w różnych partiach40. Dodatkowo wykazuje wysoką stabilność pod względem właściwości mechanicznych i odporności na degradację, zachowując integralność strukturalną przez dłuższy czas i zapewniając stabilne mikrośrodowisko do wzrostu organoidów41. Co więcej, ultrakrótka matryca peptydowa umożliwia precyzyjną kontrolę i precyzyjne dostrojenie mikrośrodowiska. Sekwencja peptydowa może być modyfikowana w celu włączenia określonych motywów bioaktywnych lub grup funkcyjnych, prezentując pożądane wskazówki dotyczące różnicowania komórek42.
Podsumowując, znaczenie tej metody polega na jej potencjale w zakresie racjonalnego projektowania hydrożeli na bazie peptydów w celu wspierania hodowli organoidów. Poprzez systematyczną ocenę zachowań komórek, protokół ten ułatwia identyfikację obiecujących kompozycji peptydowych w celu optymalizacji wzrostu organoidów. Takie spostrzeżenia mogą zostać rozszerzone na szersze obszary badawcze, przyczyniając się do postępu badań opartych na organoidach i podejść medycyny regeneracyjnej.

W ostatnich latach samoorganizujące się peptydy (SAP) okazały się obiecującymi biomateriałami do zastosowań w inżynierii tkankowej. SAP posiadają unikalne właściwości, w tym spontaniczne tworzenie nanowłókien, biokompatybilność, biodegradowalność i nieimmunogenność, co czyni je atrakcyjnymi kandydatami do rozwoju rusztowań1. SAP były wcześniej używane razem z różnymi typami komórek, a w szczególności zgłoszono, że ultrakrótkie SAP ułatwiły enkapsulację komórek macierzystych, jednocześnie utrzymując ich pluripotencję przez długi czas obejmujący ponad 30 pasaży i przy minimalnym występowaniu aberracji chromosomowych2,3,4. W związku z tym dostosowanie SAP do ich stosowania w hodowlach organoidów stanowiło racjonalny kolejny krok.
Organoidy to złożone trójwymiarowe struktury, które powstają z pojedynczych komórek pluripotencjalnych. Struktury te dają początek różnym typom komórek, które następnie samoorganizują się, aby odtworzyć procesy rozwojowe wzrostu embrionalnego i tkankowego in vitro5. Ta innowacyjna struktura przekształciła się w potężne narzędzie do badań in vitro, skutecznie zachowując genetyczne, fenotypowe i behawioralne atrybuty charakterystyczne dla narządów in vivo6. Niemniej jednak główną przeszkodą w przejściu od laboratorium do łóżka pacjenta w przypadku wyników opartych na organoidach jest potrzeba odtwarzalności7. Ta różnica w wynikach jest przede wszystkim przypisywana trudnościom w pełnym różnicowaniu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w wyspecjalizowane linie komórkowe, spotęgowane brakiem autentycznej architektury tkankowej i nieodłączną złożonością spotykaną w modelach organoidowych. Biorąc pod uwagę wzrost popularności badań opartych na komórkach macierzystych i organoidach8, wzrosło zapotrzebowanie na biomateriały o dynamicznych właściwościach mechanicznych i miejscach adhezji podobnych do integryn lub rusztowaniach o kontrolowanej degradacji7,9. Atrybuty te można skutecznie dostroić poprzez strategiczne wykorzystanie biofunkcjonalizowanych SAP.
SAP to krótkie sekwencje aminokwasów z wrodzoną zdolnością do spontanicznego organizowania się w dobrze zdefiniowane struktury10. Peptydy te często zawierają naprzemienne reszty hydrofobowe i hydrofilowe, które napędzają ich samoorganizację poprzez oddziaływania niekowalencyjne, w tym wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne i efekty hydrofobowe11,12. Proces samoorganizacji tych peptydów jest napędzany przede wszystkim potrzebą zminimalizowania swobodnej energii układu. W środowisku wodnym pozostałości hydrofobowe mają tendencję do grupowania się, aby zminimalizować ich narażenie na wodę, podczas gdy pozostałości hydrofilowe oddziałują z otaczającymi cząsteczkami wody. Zjawisko to prowadzi do powstawania różnych nanostruktur. W tym przypadku ultrakrótkie, samoorganizujące się peptydy tworzą nanowłókna o właściwościach zależnych od sekwencji peptydów i warunków środowiskowych2,12,13,14,15,16. Peptydy te przyjmują konformację β-zwojową, w której poszczególne nici peptydowe ustawiają się równolegle lub antyrównolegle do siebie, stabilizowane wiązaniami wodorowymi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Obecność jonów dodatnich przyspiesza procesy samoorganizacji, które prowadzą do powstawania nanowłókien.
Nanowłókna peptydowe zostały zidentyfikowane jako posiadające wrodzoną zdolność do zatrzymywania znacznych ilości wody. Ta cecha ułatwia wytwarzanie hydrożelu, który następnie objawia się jako biokompatybilna i biodegradowalna trójwymiarowa przestrzeń sprzyjająca proliferacji i wzrostowi komórek. Te samoorganizujące się nanowłókna peptydowe misternie naśladują cechy topograficzne nieodłącznie związane ze środowiskiem naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)1. To podobieństwo nadaje komórkom środowisko, które imituje ich fizjologiczne środowisko, dodatkowo promując optymalną aktywność komórkową17. Co więcej, wszechstronność nieodłącznie związana z tymi peptydami pozwala na znaczny stopień przestrajalności4. Taka zdolność adaptacji umożliwia zmiany właściwości matrycy, takich jak sztywność, kinetyka żelowania i porowatość. Adaptacje te osiąga się poprzez modyfikacje sekwencji peptydowej. W związku z tym samoorganizujące się peptydy (SAP) stały się kluczowymi składnikami współczesnej nauki o biomateriałach, szeroko stosowanymi jako rusztowania do regeneracji tkanek i hodowli komórkowych13,17.
Jedną z kluczowych zalet peptydów samoorganizujących się jest ich zdolność do łatwej syntezy i modyfikacji na poziomie molekularnym. Ta zaleta pozwala na włączenie określonych grup funkcyjnych lub motywów bioaktywnych do sekwencji peptydowej, umożliwiając projektowanie peptydów o dostosowanych właściwościach i funkcjonalnościach18,19,20 (Rysunek 1B). Na przykład biofunkcjonalizowane SAP można zaprojektować tak, aby naśladować ECM i promować różnicowanie za pomocą peptydu RGD19,21. Doniesiono również, że peptyd Ben-IKVAV znacznie zwiększa ekspresję markerów specyficznych dla neuronów ze względu na jego specyficzną dla ligandu motiety22. Peptydy te mogą być również zmodyfikowane tak, aby wyświetlały bioaktywne cząsteczki, takie jak peptydy wiążące integryny, w celu zwiększenia przeżywalności komórek23. Wreszcie, inne biofunkcjonalizowane SAP zostały opracowane w celu promowania angiogenezy poprzez włączenie motywów IKVAV i YIGSR do ich struktur24.
Biofunkcjonalizowane SAP opisane we wcześniejszej publikacji pokazują, że samoorganizacja może być dalej modyfikowana poprzez włączenie naiwnego peptydu, z którego pochodzi biofunkcjonalizowany SAP25. Te mieszaniny SAP mogą również zapewnić szeroką gamę preparatów SAP, które różnią się aktywnością biochemiczną i właściwościami fizykochemicznymi. Na przykład amfifilowy peptyd IIFK jest ultrakrótkim SAP, który może wytrzymać biofunkcjonalizację z różnymi motywami, czego przykładem jest włączenie motywu IKVAV (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Oba peptydy mogą tworzyć nanowłókna, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu. W wyniku każdej formuły powstają hydrożele o różnych właściwościach fizycznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
Jednakże, ze względu na szeroki wachlarz potencjalnych permutacji i alternatyw uzyskanych dzięki biofunkcjonalizacji SAP, istnieje potrzeba zapewnienia szybkiej i opłacalnej opcji do testowania organoidów. Jednym z kandydatów do tak intensywnej i opłacalnej oceny organoidów jest linia komórkowa SW1222, pochodząca z ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego26,27. Komórki SW1222 posiadają cechy, które umożliwiają ich agregację w struktury 3D przypominające organoidy, co czyni je idealnym modelem do badania rozwoju tkanek i zastosowań medycyny regeneracyjnej. Komórki SW1222 zostały zidentyfikowane jako zdolne do generowania organoidów ze względu na ich wewnętrzną nadekspresję genu LGR5 27. Tworzenie organoidów z pojedynczych komórek macierzystych LGR5+ zostało już wcześniej przekonująco wykazane, podobnie jak skłonność komórek SW1222 do osiągania cech morfologicznych organoidu raka jelita grubego28.
W tym artykule metodycznym prezentujemy szczegółowe protokoły oceny i charakterystyki wpływu różnych biofunkcjonalnych peptydów na adhezję komórek i tworzenie światła przy użyciu komórek SW1222 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Przedstawiając procedury krok po kroku i metody analizy obrazowej, mamy nadzieję zaoferować cenne informacje na temat biofabrykacji organoidów i oceny uproszczonych matryc SAP do hodowli organoidów.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa, poddana obróbce kultur tkankowych</td><td>Corning</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyd (w/v), bez metanolu</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa, poddana obróbce kultur tkankowych</td><td>Corning</td><td>09-761-146</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka, poddana hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>07-200-565</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue Odczynnik do żywotności komórek</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ezrin, monoklonalne królicze</td><td>Abcam</td><td>ab40839</td><td>Wtórne zastosowanie: anty-królik Dylight 633</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-pan Kadheryna, poliklonalne królik</td><td>Abcam</td><td>ab16505</td><td>Wtórne zastosowanie: anty-królik Alexa 488</td></tr><tr><td>Przeciwciało o ścisłym połączeniu anty-ZO1, koza poliklonalna</td><td>Abcam</td><td>ab190085</td><td>Wtórnie stosowane: anty-koza Alexa 488</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellpose 2.0</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Otrzymane z</td></tr><tr><td>konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego https://github.com/MouseLand/cellpose z Airyscan</td><td>ZEISS</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe przeciw koziej IgG (H+L) osła, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Cytiva</td><td>GE17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Drugorzędowe, DyLight 633</td><td>Invitrogen</td><td>35562</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (HI FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.54f</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY zestaw żywotności/cytotoksyczności, dla komórek ssaków</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, sześciowodny (MgCl2 6 H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel do hodowli organoidów, wolny od czerwieni fenolowej</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Określany w manuskrypcie jako Matrigel lub matryca błony podstawnej.</td></tr><tr><td>Mikroskop, mikroskop jasnego pola</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, EVOS</td><td>Thermo Scientific</td><td>EVOS M7000</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2023 (64-bitowy) 10.0.0.154</td><td>OriginLab Corp</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)</td><td>Laboratoryjny</td><td>NA</td><td>Może być wykonany na zamówienie przez peptyd producentów takich jak Bachem.</td></tr><tr><td>Peptyd P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)</td><td>Laboratoryjnie wyprodukowany</td><td>NA</td><td>Może być wytwarzany na zamówienie przez producentów peptydów, takich jak Bachem.</td></tr><tr><td>Peptyd P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)</td> <td>Wyprodukowany w laboratorium</td><td>NA</td><td>Może być wytwarzany na zamówienie przez producentów peptydów, takich jak Bachem.</td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe, średnica 10 mm</td><td>VWR</td><td>631-0170</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Thermo Fisher - FEI</td><td>TENEO VS</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 30 &mu; m sitko</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SW1222 linia komórkowa</td><td>ECACC</td><td>12022910</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25%</td><td>Gibco</td><td>25200056 Tween</td><td></td></tr><tr><td>20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure woda</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej sw1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Ultrakrótkie samoorganizujące się peptydy (SAP) mogą spontanicznie tworzyć nanowłókna, które przypominają macierz zewnątrzkomórkową. Włókna te umożliwiają tworzenie hydrożeli, które są biokompatybilne, biodegradowalne i nieimmunogenne. Wcześniej udowodniliśmy, że SAP, gdy są biofunkcjonalizowane motywami pochodzącymi z białek, mogą naśladować cechy macierzy zewnątrzkomórkowej, które wspierają tworzenie organoidów jelita grubego. Te biofunkcjonalne hydrożele peptydowe zachowują właściwości mechaniczne, przestrajalność i drukowalność oryginalnego peptydu macierzystego, jednocześnie zawierając wskazówki, które umożliwiają interakcje komórka-macierz w celu zwiększenia adhezji komórek. W artykule przedstawiono protokoły potrzebne do oceny i scharakteryzowania wpływu różnych biofunkcjonalnych hydrożeli peptydowych na adhezję komórek i tworzenie światła przy użyciu linii komórkowej raka gruczolakoraka zdolnej do tworzenia organoidów raka jelita grubego w sposób opłacalny. Protokoły te pomogą ocenić wpływ biofunkcjonalnego hydrożelu peptydowego na adhezję komórek i tworzenie światła przy użyciu barwienia immunologicznego i analizy obrazu fluorescencyjnego. Linia komórkowa wykorzystana w tym badaniu była wcześniej wykorzystywana do generowania organoidów w matrycach pochodzenia zwierzęcego.

W pierwszej kolejności oceniliśmy komórki hodowane w płytce 24-dołkowej przez 7 dni, wykorzystując obrazowanie w polu jasnym. Zidentyfikowano małe skupiska komórek łączące się w organoidy w ciągu tygodnia, co przedstawiono na Rysunku 4. Metoda kontrolowanego skanowania pozwala śledzić mobilność komórek i organoidów pomiędzy poszczególnymi dniami. Ogólnie analizowano ewolucję morfologii komórek w ciągu całego tygodnia. Organoidy pochodzące z linii SW1222 powinny mieć okrągłą morfologię i jasny wygląd. Ciemniejszy wygląd wskazuje na niepożądaną, wyższą gęstość komórek, co widoczne jest w niektórych koloniach hodowanych w Peptydzie P w 7. dniu (Rysunek 4).
Rysunek 5 przedstawia wyniki analiz żywotności komórek (Rysunek 5A) oraz proliferacji (Rysunek 5B), które wskazują odpowiednio na liczbę komórek martwych i żywych oraz na aktywność metaboliczną. W tym przypadku zastosowano analizę żywotności opartą na kalceinie i homodimerze etydyny, w wyniku której zauważono, że w komórkach hodowanych w Matrigelu do 7. dnia obecna była niewielka populacja komórek martwych. Zjawisko to wystąpiło również we wszystkich hydrożelach peptydowych, natomiast nie zaobserwowano go w hodowli 2D. Wyniki proliferacji wykazały całkowity wzrost aktywności metabolicznej między 1. a 7. dniem. Ponadto w kilku warunkach odnotowano niewielkie spadki aktywności między 4. a 7. dniem. Obserwacja ta koreluje ze wzrostem populacji komórek martwych widocznym w analizie żywotności (Rysunek 5A).
W celu wstępnej oceny interakcji między komórkami a biofunkcjonalizacją hydrożeli peptydowych przeprowadzono test adhezji oparty na stresie mechanicznym w celu wywołania odrywania się komórek. Jak widać na Rysunku 6, zastosowanie różnych stężeń biofunkcjonalnego peptydu P2 znacząco wpłynęło na liczbę komórek utrzymujących się przed i po procesie odrywania. W tym przypadku jako kontrolę pozytywną wykorzystano peptyd zawierający wyłącznie motyw biofunkcjonalny peptydu P2. Jako kontrolę negatywną zastosowano peptyd niebiofunkcjonalny P. Jak wynika z wykresu, komórki wysiane na peptyd P wykazywały stosunkowo niską adhezję początkową, a także niską wartość retencji. Ponadto zmiana stosunku biofunkcjonalnego peptydu P2 korelowała z liczbą komórek utrzymujących się po zastosowaniu stresu. Zatem na podstawie tego testu można wywnioskować, że peptyd P2 wpłynął na adhezję komórek, co mogło być, lecz nie musiało być, spowodowane motywem biofunkcjonalnym, jednak proces ten korelował z ilością biofunkcjonalnego peptydu obecnego w mieszaninie.
Następnie zbadaliśmy wpływ macierzy na wytworzone organoidy. Przeanalizowaliśmy kolistość kolonii oraz względną wielkość światła w stosunku do wielkości kolonii, przeprowadzając analizę kształtu próbek z barwieniem cytoszkieletu hodowanych przez 4 dni. Punkty danych wykazały określony rozkład wzdłuż osi x i y, a każdy z warunków posiadał centroid o konkretnej wartości kolistości i względnej powierzchni światła. Rysunek 7 pokazuje, że komórki hodowane w 2D wykazywały bardzo dużą zmienność kolistości kolonii. Z kolei komórki hodowane w Matrigelu charakteryzowały się szerszym rozkładem względnej wielkości światła.
Co ciekawe, wartości centroidów dla wszystkich hydrożeli zawierających peptydy znajdowały się w bardzo zbliżonych pozycjach. Jednakże odległość między punktami danych wykazała różne profile rozkładu. Na przykład peptyd P3 charakteryzował się mniejszym rozrzutem spośród trzech hydrożeli peptydowych, podczas gdy punkty danych dla niebiofunkcjonalnego peptydu P wykazywały tendencję do większego rozrzutu. Dane te sugerują, że oba hydrożele z P1 i P3 mają potencjał do optymalizacji pod kątem hodowli organoidów.
Na koniec oceniono ekspresję specyficznych markerów za pomocą immunocytochemii na próbce barwionej pod kątem markerów apikalnych ZO-1 i ezryny. Markery te pozwoliły na ocenę polaryzacji komórek w obrębie każdego organoidu. Oceniono również markery pankadheryn w celu wizualizacji połączeń międzykomórkowych oraz marker specyficzny dla cytoszkieletu (faloidynę) w celu wizualizacji światła organoidu. Rysunek 8A przedstawia organoidy obecne w niebiofunkcjonalnym peptydzie P, biofunkcjonalizowanym peptydzie P1 oraz Matrigelu w 4. i 7. dniu. Markery ZO-1 i ezryna powinny lokalizować się w błonach apikalnych i bazolateralnych organoidu; prawidłowa polaryzacja komórek pozwoli na zaobserwowanie ekspresji obu cząsteczek do 4. dnia w pobliżu obszaru światła, w przeciwnym razie pozostają one niewidoczne. Rzeczywiście, jak pokazano na Rysunku 8, markery ZO-1 i ezryna znajdowały się w błonach apikalnych organoidów hodowanych w Matrigelu. Co ciekawe, markery ezryny były ledwie widoczne w niebiofunkcjonalnym peptydzie P. Na tej podstawie wnioskujemy, że nieefektywna polaryzacja komórek doprowadziła do niskiej ekspresji tych cząsteczek w peptydzie P.
Ponadto dyspersja jąder miała tendencję do bycia nieregularną w hydrożelach peptydowych, podczas gdy organoidy zatopione w Matrigelu tworzyły pojedynczą, asymetryczną warstwę jąder. Opis ten odpowiada idealnej morfologii organoidu jelita grubego; jednakże, mimo że orientacja jąder w hydrożelach peptydowych nie była całkowicie asymetryczna, gęstsze kolonie z wielowarstwowymi jądrami występowały głównie w niebiofunkcjonalnym peptydzie P. W przeciwieństwie do tego, złącza międzykomórkowe muszą być zlokalizowane prostopadle do błon apikalnej i bazolateralnej (Rycyna 8B). Marker ten pozwolił nam zaobserwować krawędzie wszystkich komórek znajdujących się w kolonii. W przypadku hodowli w Matrigelu, do 7 dnia komórki wykazywały niemal idealny radialny rozkład pan-kadheryny (złącza międzykomórkowe). Z kolei kolonie niepolaryzowane, takie jak te w peptydzie P, wykazywały nieuporządkowany układ komórek oraz ekspresję złączy międzykomórkowych w pobliżu błony bazalnej i apikalnej.
<img alt="Tworzenie hydrożelu poprzez montaż nanowłókien; schemat sekwencji peptydowej; proces biosyntezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ultrashortkie peptydy samomontujące tworzące nanowłókna. (A) Przedstawienie procesu samomontażu alifatycznych peptydów ultrashortkich. (B) Struktura chemiczna ultrashortkiego SAP IIFK biofunkcjonalizowanego ligandem IKVAV. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Loo i wsp.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żelowanie peptydów; struktury chemiczne; wyniki żelowania; obrazy mikroskopowe; spektroskopia, wykres." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Struktura i właściwości peptydów. (A) Przedstawiono struktury chemiczne peptydów macierzystego IIFK oraz biofunkcjonalnego P2. (B) Wyniki testu odwróconej probówki ujawniają różnice w krytycznym stężeniu żelowania i czasie żelowania. P2 tworzy przeźroczysty żel o wyższym CGC niż peptyd macierzysty IIFK. Co istotne, mieszanina IIFK:P2 (1:1) wykazuje jeszcze wyższe CGC i dłuższy czas żelowania niż każdy z peptydów osobno. (C) Skaningowe mikrografie elektronowe dostarczają wizualnych informacji o charakterystyce strukturalnej IIFK, P2 oraz mieszaniny IIFK:P2 (1:1). (D) Obrazy topografii wysokości z mikroskopii sił atomowych przedstawiają żelowane peptydy przy stężeniu 8 mM, oferując szczegółowy widok ich cech powierzchniowych. (E) Spektroskopia dichroizmu kołowego ujawnia zmiany konformacyjne mieszaniny IIFK:P2 przy różnych stężeniach, rzucając światło na zmiany w ich strukturze drugorzędowej. (F) Analizy reologiczne mierzą sztywność żelowanych peptydów przy różnych stężeniach, dostarczając cennych informacji o ich właściwościach mechanicznych. Rycina została powielona z pracy Perez-Pedroza i wsp.25. Paski skali = 1 µm (C), 200 nm (D). Skrót: CGC = krytyczne stężenie żelowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu żelowania peptydów: przygotowanie roztworu peptydowego, żelowanie kropli, wysiew komórek, dodawanie pożywki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat przedstawiający przygotowanie peptydów i wysiew komórek do wytwarzania organoidów oraz ich charakteryzację pod kątem żywotności, adhezji, zdolności do tworzenia organoidów i immunobarwienia w hydrożelach peptydowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost komórek w ciągu 7 dni w Matrigelu, Peptydzie P i Peptydzie P1; wyniki eksperymentu mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazy z mikroskopii w polu jasnym przedstawiające komórki SW1222 hodowane w hydrożelach peptydowych oznaczonych jako P i P1 w porównaniu z kontrolą w Matrigelu. Co ciekawe, organoidy hodowane w hydrożelach peptydowych wykazują w siódmym dniu morfologię głównie sferyczną. W przeciwieństwie do nich, organoidy znajdujące się w Matrigelu wydają się wykazywać niższą gęstość komórkową, co można stwierdzić po ich jasnym wnętrzu w porównaniu do ciemniejszego wnętrza organoidów hodowanych w SAP (czarne groty strzałek). Niemniej jednak wykazują one wyraźne skupianie się między sąsiednimi koloniami. Co więcej, staje się oczywiste, że zdolność migracyjna komórek w środowisku Matrigelu jest stosunkowo mniejsza. Paski skali = 650 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna proliferacji komórek w macierzach 3D i 2D, analiza wykresów słupkowych w ciągu 7 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Testy żywotności i proliferacji komórek SW1222 w biofunkcjonalizowanym SAP przy różnych stężeniach. (A) Ocena żywotności komórek hodowanych w biofunkcjonalnych peptydach P1 i P2 w porównaniu do Matrigelu i 2D. (B) Ocena proliferacji hodowli komórkowych w niebiofunkcjonalnym peptydzie P1 i biofunkcjonalnym peptydzie P2 w porównaniu do kontroli w Matrigelu i 2D. W teście żywotności/śmierci obserwuje się zachowanie podobne do komórek rosnących w Matrigelu. W kilku warunkach, głównie w Matrigelu, stwierdzono niewielki wzrost liczby martwych komórek (żółte groty strzałek). W przypadku proliferacji tendencje różnią się w zależności od rodzaju i stężenia peptydu, lecz ogólnie widoczny jest trend wzrostowy. Paski skali = 250 µm. Rycina została zaadaptowana z pracy Perez-Pedroza i wsp.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii i wykres słupkowy ilustrują wpływ związku IKAV i P2 na stopień pokrycia powierzchni (%)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wpływ peptydu na liczbę odspojonych komórek. (A) Obrazy fluorescencyjne komórek barwionych DAPI przed i po stresie mechanicznym. Zastosowano peptyd P, zmodyfikowany peptyd P2 oraz motyw IKVAV. (B) Zmianę adhezji komórek określono poprzez pomiar powierzchni pokrycia w programie ImageJ. Analiza porównawcza wykazała, że biofunkcjonalny peptyd P2 posiadał zwiększoną zdolność retencji w porównaniu z niebiofunkcjonalnym peptydem P. Paski skali = 100 µm. Rycina została zaadaptowana z pracy Perez-Pedroza i wsp.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres powierzchni światła w zależności od kolistości kolonii dla 2D, P1, Matrigel; porównanie danych i analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Ocena zdolności do tworzenia organoidów poprzez obliczenie centroidu względnej powierzchni światła w stosunku do kolistości. Centroid i rozproszenie danych różniły się w zależności od zastosowanych zabiegów. Zgodnie z oczekiwaniami, najgorsze wyniki uzyskano w pomiarach 2D, które wykazały szeroki zakres wartości kolistości i najniższą względną powierzchnię światła. Matrigel charakteryzował się nie tylko najwyższą kolistością, ale także największym światłem. W warunkach z użyciem peptydów obie wartości różniły się nieznacznie, przy czym w przypadku P3 odnotowano najmniejszą zmienność danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna kultur komórkowych; ZO1, Ezryna, DAPI, Faloidyna, Kadheryna; Dzień 4, 7; porównanie rusztowań biomateriałowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Obrazy z mikroskopii konfokalnej organoidów w 4. i 7. dniu dla różnych markerów. (A) Markery ZO-1 (zielony), ezryna (czerwony) i DAPI (niebieski) zostały wykorzystane do określenia apikalnego rozkładu komórek w obrębie organoidów. Jak widać w kontroli Matrigel, cząsteczki te lokalizują się zazwyczaj w błonach apikalnych i basolateralnych. Niebiofunkcjonalny peptyd P wykazuje ekspresję tych cząsteczek dopiero w 7. dniu. (B) Markery połączeń międzykomórkowych barwione przeciwciałami przeciwko pan-kadherynie (zielony) powinny być prostopadłe do błon basolateralnych i apikalnych organoidów. Jądra komórkowe (niebieski) i cytoszkielet (czerwony) posłużyły jako przeciwbarwienie. Niebiofunkcjonalny peptyd P indukował ekspresję połączeń międzykomórkowych w błonie basolateralnej, w przeciwieństwie do dwóch pozostałych wariantów (P3 i Matrigel). Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół ma na celu ocenę biofunkcjonalnych, samoorganizujących się peptydów pod kątem adhezji komórek, morfologii organoidów i ekspresji genów poprzez barwienie immunologiczne. Wykorzystamy linię komórkową raka jelita grubego, aby zapewnić opłacalny sposób pozyskiwania organoidów do intensywnych testów.

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...

Nasze badania mają na celu ocenę ultrakrótkich, samoorganizujących się peptydów jako matryc dla kultur organoidów raka jelita grubego. Zajmujemy się pytaniami dotyczącymi morfologii organoidów pod kątem żywotności, proliferacji oraz adhezji i wpływu biofunkcjonalizacji. Celem jest optymalizacja kompozycji matryc peptydowych w celu efektywnego wzrostu organoidów i przyczynienie się do rozwoju medycyny regeneracyjnej.Najnowocześniejsze technologie w naszej dziedzinie obejmują biodruk 3D do precyzyjnego wytwarzania organicznego, platformy mikroprzepływowe do dynamicznych środowisk hodowlanych oraz zaawansowane narzędzia do obrazowania, takie jak mikroskopia sił atomowych i mikroskopia wielofotonowa. Edycja genów CRISPR-Cas9 udoskonala modyfikację genetyczną, podczas gdy sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki zapewnia dogłębny wgląd molekularny. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują zwiększenie odtwarzalności organoidów, udoskonalenie unaczynienia dla większych konstruktów oraz naśladowanie złożonej architektury tkankowej.Przezwyciężenie tych ograniczeń w długotrwałej hodowli i włączenie składników immunologicznych do modeli to obszary aktywne. Osiągnięcie ustandaryzowanych protokołów i rozwiązywanie problemów etycznych stanowi ciągłe wyzwania w tej dziedzinie. Do istotnych odkryć w naszej dziedzinie należy wykazanie przydatności ultrakrótkich, samoorganizujących się peptydów do hodowli organoidów.Wykazaliśmy wszechstronność, powtarzalność i stabilność tych peptydów, zapewniając platformę do precyzyjnego dostrajania mikrośrodowisk. Przyczynia się to do postępu badań opartych na organoidach, medycynie regeneracyjnej i badaniach nad biofunkcjonalizowanymi hydrożelami. Nasz protokół wypełnia lukę badawczą, zapewniając systematyczne podejście do oceny organoidów w ultrakrótkich, samoorganizujących się matrycach peptydowych.Odpowiada na potrzebę ustandaryzowanych metod oceny zachowania komórek w tych matrycach, pomagając w racjonalnym projektowaniu hydrożeli na bazie peptydów w celu optymalnego wzrostu organoidów i posuwając naprzód badania nad medycyną regeneracyjną. Na początek pipetuj 10-mikrolitrowe kropelki 2x roztworu peptydu do środków studzienek na 24-dołkowej płytce. Po inkubacji odpipetować 10 mikrolitrów 2x PBS do każdej studzienki.Użyj końcówki pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór. Pozwól, aby kropelki żelu ustabilizowały się przez co najmniej 20 minut, upewniając się, że kropelki są nienaruszone. Następnie odpipetuj 2,5 mililitra 0,0125% trypsyny-EDTA do kolby zawierającej dwa miliony komórek ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego SW1222.Inkubować komórki z trypsyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut, aż oderwą się od kolby. Dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki, aby dezaktywować trypsynę. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą sitka o długości 30 mikrometrów.Za pomocą mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów wstrzyknij dwa mikrolitry zawiesiny komórek w każdej kropli peptydu. Wysiewaj 800 komórek z linii komórkowej SW1222 do każdej studzienki przez cztery dni. Inkubuj kropelki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla.Następnie dodaj 0,5 mililitra uzupełnionej pożywki do każdej studzienki. Aby przygotować kontrolę, należy rozcieńczyć zapas kontroli macierzy błony podstawnej z uzupełnioną pożywką. Załaduj zawiesinę komórkową do rozcieńczonego roztworu podstawowego membrany.Odpipetować 20 mikrolitrów rozcieńczonej matrycy błony podstawnej do każdej studzienki z komórkami. Inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zestaleniu się kropelek dodaj 0,5 mililitra kompletnego podłoża.Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu jasnego pola w pierwszym, czwartym i siódmym dniu, aby ocenić wzrost organoidów. Tygodniowe obrazowanie komórek w jasnym polu wykazało, że małe skupiska komórek łączyły się w organoidy. Organoidy pochodzące z SW1222 hodowane w hydrożelach peptydowych miały okrągłą morfologię o jasnym wyglądzie.Ciemniejszy wygląd wskazywał na niepożądaną wyższą gęstość, jak obserwowano w koloniach peptydu P w siódmym dniu. Na początek odpipetuj 20-mikrolitrowe kropelki hydrożelu peptydowego do 24-dołkowej płytki. Wysiewaj 800 komórek z linii komórkowej SW1222 do każdej studzienki przez cztery dni.Czwartego dnia odpipetować pożywkę. Umyj każdą studzienkę dwa razy za pomocą PBS. Następnie dodaj 400 mikrolitrów 4% roztworu formaldehydu do studzienek.Po zakończeniu inkubacji użyj końcówki pipety P-1000, aby zassać roztwór formaldehydu. Następnie ponownie umyj studzienki PBS. Inkubować komórki w jednym mililitrze buforu przepuszczalności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po odpipetowaniu buforu i umyciu studzienek PBS, dodać 0,5 mililitra buforu blokującego. Teraz umyj studzienki PBS po usunięciu buforu blokującego. Następnie pipetować 200 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do studzienek.Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą końcówki do pipety P-200 usuń roztwór. Następnie umyj studzienki roztworem PBS.Następnie dodać koniugat falloidyny do fiolki z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym w stosunku jeden do 40. Odpipetuj tę mieszaninę do dołków płytki. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez trzy godziny w ciemności.Po zassaniu roztworu i umyciu studzienek PBS, należy odpipetować 300 mikrolitrów roztworu DAPI do każdej studzienki. Po inkubacji ponownie przemyć studzienki PBS po odpipetowaniu roztworu. Przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do siedmiu dni.Barwienie immunologiczne wykazało, że organoidy znajdujące się w niebiofunkcjonalnym peptydzie P, biofunkcjonalizowanym peptydzie P1 i Matrigelu były zlokalizowane w błonach wierzchołkowych i podstawno-bocznych. Niebiofunkcjonalny peptyd P indukował ekspresję połączenia komórka-komórka w błonie podstawno-bocznej. Aby rozpocząć, zobrazuj barwione próbki organoidów pochodzących z SW1222 za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego pod kątem 10x.Używaj tylko kanałów RHOD i DAPI. Uruchom oprogramowanie ImageJ i kliknij Wtyczka, a następnie Makra, a następnie Uruchom, aby uruchomić imagej_roi_converter. py z witryny CellPose GitHub.Gdy pojawi się okno, wybierz pierwszy plik z folderu organoidów dwukropka i kliknij Otwórz. Następnie wybierz sekcję. npy odpowiadający pierwszemu plikowi i kliknij przycisk Otwórz.Następnie naciśnij Zaznacz wszystko w oknie menedżera ROI i naciśnij Zmierz. Teraz kliknij Plik, a następnie Zapisz jako w oknie wyników, aby zapisać wyniki. Powtórz konwersję obrazu dla tego samego obrazu w folderze dla światła organoidu okrężnicy.Następnie załaduj oprogramowanie OriginPro. Kliknij Dane, a następnie Importuj plik, aby zlokalizować Kreatora importu. Zaznacz oba pliki CSV odpowiadające właściwościom organoidu i kształtu światła dla tego samego obrazu.Skopiuj właściwości kształtu światła do kolumny wyników kolonii, aby sparować każdy pomiar strumienia świetlnego z odpowiadającą mu kolonią. W nowej kolumnie podziel obszary światła i kolonii, aby uzyskać względny obszar światła odpowiadającej mu kolonii. Wybierz kolumnę odpowiadającą okrągłości każdej kolonii i obszarowi światła.Następnie kolejno kliknij Wykres, Podstawowe 2D i Punktowe. Kliknij prawym przyciskiem myszy okno wykresu i wybierz Szczegóły działki. Kliknij kartę Centroid Pro i wybierz opcje czytające Pokaż punkt środka ciężkości dla podzbioru, Połącz z punktami danych i Pokaż elipsę.Komórki hodowane w 2D miały bardzo dużą zmienność w okrągłości kolonii. Komórki hodowane w Matrigel miały bardziej rozległy rozkład w stosunku do względnej wielkości światła.

fabrication-characterization-colorectal-cancer-organoids-from-sw1222

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organoidów 3D z komórek raka jelita grubego pochodzących z mysiego modelu poprzez rozmnażanie ich na sztucznych płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową. Te organoidy CRC mogą być wykorzystane jako model do badania pierwotnego wzrostu ludzkich komórek nowotworowych i przerzutów.

Hodowla organoidów CRC: metoda uzyskiwania organoidów 3D z komórek raka jelita grubego

Ten film opisuje technikę generowania organoidów CRC transdukowanych przez cząsteczki lentiwirusowe GFP w celu umożliwienia obrazowania fluorescencyjnego. Te organoidy oznaczone GFP, po umieszczeniu w modelach zwierzęcych, pomagają w badaniu inwazji guza i przerzutów.

Znakowanie komórek organoidowych CRC: metoda generowania komórek organoidowych raka jelita grubego transdukowanych przez GFP lentiwirusem

Ten film opisuje protokół tworzenia mysiego modelu spontanicznych przerzutów ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego lub PDX. Te modele ksenoprzeszczepów częściowo naśladują cechy ludzkich nowotworów i rozumieją krytyczne aspekty nowotworów złośliwych u ludzi, w tym inwazję i przerzuty.

Mysie modele spontanicznych przerzutów: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek raka jelita grubego wstrzykiwanych ortotopowo

Film opisuje laserową sekcję 3D organotypowego modelu współhodowli z precyzją na poziomie mikronów. W modelach organotypowych 3D składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są trójwymiarowo współhodowane z komórkami nabłonka nowotworowego. Model 3D służy jako narzędzie eksperymentalne, które umożliwia badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa: technika izolowania inwazyjnych komórek raka jelita grubego z modelu hodowli organotypowej 3D

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Ten protokół opisuje ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności. Model podsumowuje zaawansowany rak jelita grubego, chorobę z przerzutami i pozwala na ocenę nowych leków terapeutycznych w klinicznie istotnym scenariuszu przerzutów do płuc i wątroby.

Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Protokół opisuje metodę tworzenia modelu organoidowego raka jelita grubego (CRC) pochodzącego od pacjenta, współhodowanego z limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL) w celu zbadania ich interakcji i potencjału terapeutycznego. Model ten stanowi platformę przedkliniczną do badania odpowiedzi immunologicznych w mikrośrodowisku guza oraz do przewidywania skuteczności terapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu raka jelita grubego.

Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Poznaj metodę wytwarzania organoidów raka jelita grubego z linii SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej. Technika ta umożliwia badanie morfologii, żywotności i proliferacji w kontekście medycyny regeneracyjnej.

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

Przeglądaj więcej filmów