Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej
November 10th, 2023
Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.
Nasze badania mają na celu zbadanie, w jaki sposób zmieniające się środowisko szpiku kostnego wpływa na wzrost guza. Opracowaliśmy protokół cytometrii przepływowej do analizy komórek nieodpornościowych w szpiku kostnym i tkankach kostnych, koncentrując się na morskich nowotworach hematologicznych. Metodę tę można dostosować do badania szpiku kostnego w różnych modelach lustrzanych.
Nasze badanie koncentruje się na izolowaniu i identyfikacji zmian w populacjach zrębu szpiku kostnego podczas progresji raka. Zrozumienie ich wpływu na początek i postęp choroby może utorować drogę dla nowych metod leczenia ukierunkowanych na te nowotwory, ułatwiając zmiany w komórkach zrębu szpiku kostnego. Nasz protokół w unikalny sposób łączy trawienie mechaniczne i enzymatyczne, wyczerpanie magnetyczne i cytometrię przepływową w celu określenia składu komórkowego mikrośrodowiska szpiku kostnego.
Wyróżnia się zastosowaniem separacji magnetycznej i włączeniem komórek zarówno z kości, jak i szpiku, oferując bardziej wszechstronną reprezentację tego mikrośrodowiska. Na początek usuń tkankę z kości poddanej eutanazji myszy wypreparowanej. Umieścić oczyszczone kości na nowej sześciodołkowej płytce zawierającej bufor FACS umieszczonej na lodzie.
Przenieś kości do moździerza z dwoma do pięciu mililitrami buforu FACS. Miel kości okrężnymi ruchami, aż szpik kostny zostanie uwolniony. Za pomocą trzymililitrowej strzykawki pociągnij szpik kostny i spłucz go w dół, aby go zhomogenizować.
Przeciągnij homogenat do innej strzykawki, a następnie przefiltruj go przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Wypłucz kawałki tkanki z filtra z powrotem do zaprawy za pomocą buforu FACS przed homogenizacją po raz drugi. Przefiltruj wypłukaną tkankę jak poprzednio.
Następnie spłucz pozostałe kolce kostne z powrotem do zaprawy za pomocą buforu FACS. Następnie przepłucz kawałki do 15-mililitrowej tuby, aby zapewnić maksymalną wydajność. Aby strawić szpik kostny, najpierw odwiruj w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zawiesić osad szpiku kostnego w dwóch mililitrach mieszanki wytrawiającej. Przenieś mieszaninę do 15-mililitrowej probówki, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut na rotatorze. Teraz dodaj 10 mililitrów buforu FACS, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.
Przefiltruj mieszaninę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Odwirowywać zawiesinę o sile 400 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy RBC.
Następnie dodaj 10 mililitrów buforu FACS, aby zatrzymać lizę. Następnie przefiltruj mieszaninę jak poprzednio do 50-mililitrowej probówki. Na koniec odwiruj mieszaninę w temperaturze 300 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.
Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Aby trawić kolce kostne, najpierw zawiruj kolce kostne. Zdekantować supernatant i zachować kości na dnie.
Następnie ponownie zawieś kolce w jednym mililitrze mieszanki do trawienia spikuli kostnej. Inkubować probówkę na rotatorze przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec przerwij trawienie za pomocą 10 mililitrów buforu FACS.
Przefiltrować mieszaninę do 50-mililitrowej probówki zawierającej lizowany i trawiony szpik kostny poddany lizie RBC. Na początek wymieszaj izolowaną zawiesinę mysiego szpiku kostnego z zawiesiną kolców kostnych. Pobrać pipetę 10 mikrolitrów zawiesiny komórek na hemocytometr w celu zliczenia.
Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach bufora FACS. Aby wybarwić komórki przeciwciałami w celu wyczerpania magnetycznego, dodaj Fc-Block CD45 APC i TER-119 APC.
Następnie przemyć zawiesinę komórek buforem FACS. Po odwirowaniu pozostałej mieszaniny ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Aby zabarwić zawiesinę komórek mikrokulkami w celu wyczerpania magnetycznego, dodaj mikrokulki mysie IgG i anty-APC.
Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 20 minut. Umyj kolumnę LD dwoma mililitrami buforu MACS. Ponownie zawiesić komórki w buforze, a następnie przefiltrować je przez pięciomililitrową probówkę z 35-mikrometrową nasadką sitkową do komórek.
Następnie ustaw kolumnę LD na stojaku separatora magnetycznego i umieść pięciomililitrową probówkę pod kolumną, aby zebrać wymykający się materiał. Odpipetować zawiesinę komórek do kolumny LD i zebrać ujemną frakcję przepływającą do probówki. Przemyć kolumnę dwa razy jednym mililitrem buforu MACS i zebrać eluat do tej samej probówki.
Umieść kolumnę LD nad nową pięciomililitrową probówką. Za pomocą pipety dozować trzy mililitry buforu do kolumny. Następnie wypłucz pozytywnie oznakowane komórki do pięciomililitrowej probówki.
Odwirować zarówno frakcję dodatnią, jak i ujemną. Następnie ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach bufora FACS. Utrzymaj frakcję ujemną CD45 TER-119, dodaj jeden mikrolitr każdego przeciwciała na każde 10 do 6 komórek.
Umieścić zawiesinę na lodzie na 20 minut. Następnie przemyj zawiesinę dwoma mililitrami buforu FACS przed odwirowaniem. Dodać jeden mililitr buforu do osadu i odpipetować jodek propidyny do barwienia żywych komórek.
Na koniec przefiltruj próbkę przez sitko o średnicy 35 mikrometrów do pięciomililitrowej probówki przed analizą komórek na wielokolorowym cytometrze przepływowym. Komórki śródbłonka tętnic znacznie się rozszerzyły w mikrośrodowisku ostrej białaczki szpikowej, z jednoczesnym ubytkiem w populacjach śródbłonka sinusoidalnego. Niewielkie rozszerzenie mezenchymalnych komórek zrębu zaobserwowano w wieku ośmiu tygodni.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół do izolowania i charakteryzowania populacji mikrośrodowiska szpiku kostnego w myszych modelach zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Badanie koncentruje się na analizie nieimmunologicznych komórek w szpiku kostnym i ich zmianach podczas progresji raka.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Hematologia
- Biologia raka
Tło
- Mikrosrodowisko szpiku kostnego odgrywa kluczową rolę w wzroście guzów.
- Komórki niehemopoetyczne, w tym populacje stromalne, są dotknięte podczas progresji raka.
- Rozumienie tych zmian może prowadzić do nowych strategii terapeutycznych.
- Badanie wykorzystuje mysze modele do naśladowania ludzkich hematologicznych nowotworów złośliwych.
Cel badania
- Izolować i zidentyfikować zmiany w populacjach stromalnych szpiku kostnego.
- Zrozumieć wpływ środowiska szpiku kostnego na początek i progresję choroby.
- Opracować protokół cytometrii przepływowej przystosowany do różnych modeli.
Stosowane metody
- Cytometria przepływowa do analizy nieimmunologicznych komórek.
- Połączenie mechanicznych i enzymatycznych dygescji.
- Techniki magnetycznego wyczerpywania.
- Charakterystyka składu komórkowego mikrośrodowiska szpiku kostnego.
Główne wyniki
- Identyfikacja zmian w populacjach stromalnych szpiku kostnego podczas progresji raka.
- Wgląd w rolę niszy szpiku kostnego w wzroście guza.
- Ustanowienie solidnego protokołu dla przyszłych badań.
- Potencjalne implikacje dla ukierunkowanych terapii raka.
Wnioski
- Mikrosrodowisko szpiku kostnego znacząco wpływa na nowotwory hematologiczne.
- Rozumienie zmian stromalnych jest istotne dla opracowania nowych terapii.
- Ten protokół może być zastosowany do różnych modeli raka w dalszych badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Dissecting the bone marrow microenvironment in myelodysplastic syndrome (MDS) and acute myeloid leukemia (AML) addresses a critical challenge in understanding disease initiation and progression. High-resolution phenotyping of stromal and endothelial populations enables mechanistic de-risking and informs target validation for therapies aimed at the tumor-supportive niche. This capability strengthens predictive confidence at the discovery-to-preclinical inflection point for hematological malignancy portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stromal and endothelial cell contributions to malignant transformation.
- Supports functional target validation by mapping niche alterations associated with disease states.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate targets within the bone marrow microenvironment.
- Provides a platform for hypothesis-driven exploration of tumor-microenvironment interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, phenotypically defined cell populations for downstream functional assays.
- Standardizes isolation and characterization workflows for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable flow cytometry-based screening of niche-modulating compounds.
- Supports reliable evaluation of candidate interventions targeting stromal or endothelial compartments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant microenvironmental changes observed in MDS and AML.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of niche-targeted strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of therapies modulating the tumor-supportive stroma.
- Provides mechanistic insights for translational biomarker development in hematological malignancies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-fidelity isolation and analysis of bone marrow niche populations in murine models of MDS and AML.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of stromal and endothelial cells in disease progression.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative phenotyping for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides flow cytometry-based readouts for comparative analysis of microenvironmental alterations.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse hematological malignancy models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of niche cell isolation and analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying microenvironmental drivers of disease.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of niche-targeted therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell isolation, and murine model handling.
- Demands access to multicolor flow cytometry and magnetic separation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of gating and phenotyping strategies.
- Adaptable to various murine models but may require optimization for specific disease contexts.
- Throughput and cell yield may be limited by tissue availability and technical complexity.
