Name: Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do izolacji i analizy populacji stromalnych szpiku kostnego w modelach mysich nowotworów hematologicznych. Protokół łączy trawienie enzymatyczne z separacją magnetyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej URMC. Praca ta była wspierana przez American Society of Hematology Scholar Award, nagrodę Leukemia Research Foundation oraz granty NIH R01DK133131 i R01CA266617 przyznane J.B.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester. Myszy były hodowane i utrzymywane w placówkach opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie w Rochester. Do modelowania MDS wysokiego ryzyka wykorzystywany jest dostępny na rynku model mysi NHD1319. W tym modelu komórki zrębu szpiku kostnego są analizowane u samic myszy NHD13 w wieku 8 tygodni, przed wystąpieniem choroby. De novo AML jest generowany zgodnie z wcześniejszym opisem6,11,20. Onkogeny wykorzystywane do indukcji AML, takie jak MLL-AF9 i NRas, są znakowane GFP lub YFP, co pozwala na analizę niebiałaczkowych populacji szpiku kostnego GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Krótko mówiąc, 10-tygodniowym samicom myszy C57BL/6J przeszczepia się mysie komórki AML GFP/YFP+, a szpik kostny pobiera się 2 tygodnie po przeszczepie. Podczas gdy samice myszy są wykorzystywane w tym badaniu do celów demonstracyjnych, protokół ten można przeprowadzić zarówno na samcach, jak i samicach myszy. Można go również przeprowadzić przy użyciu jednej kości udowej lub wszystkich kości długich.
1. Pobieranie szpiku kostnego
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat protokołu sekcji zwierząt, zapoznaj się z Amend et al.26.
<ol>
	<li>Oczyść moździerz i tłuczek 70% etanolem, opłucz je schłodzonym buforem FACS (Tabela 1) i umieść na lodzie do ostygnięcia przed rozpoczęciem zbiorów. Umieść również bufor MAC (Tabela 1) na stole, aby umożliwić mu osiągnięcie temperatury pokojowej.</li>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi i protokołami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i użytkowania.</li>
	<li>Na blacie dokładnie spryskaj mysz 70% etanolem, aż jej sierść będzie mokra. Za pomocą kleszczy i zakrzywionych nożyczek podnieś skórę na brzuchu i wykonaj dwa nacięcia o długości około 0,5 mm po obu stronach myszy, po bokach brzucha. Następnie wykonaj nacięcie 0,5 mm dystalnie od brzucha. Pociągnij w dół, aby usunąć skórę i sierść z nóg myszy.</li>
	<li>Umieść nożyczki prostopadle do miednicy, dociśnij, jednocześnie ciągnąc kość udową kleszczami. Głowa kości udowej powinna odłączyć się od miednicy. Oddziel kość udową i piszczelową w stawie rzepkowo-udowym. Umieścić kości w buforze FACS na 6-dołkowej płytce na lodzie.</li>
	<li>Usunąć tkankę z kości za pomocą tkanki laboratoryjnej i umieścić oczyszczone kości na nowej 6-dołkowej płytce ze świeżym buforem FACS na lodzie.</li>
	<li>Umieść wszystkie kości w moździerzu z 2-5 ml buforu FACS, tak aby wszystkie kości były zanurzone w buforze (dostosuj objętość buforu w zależności od liczby przetwarzanych kości). Zmiażdż i zmiel kości za pomocą tłuczka okrężnymi ruchami, aż tkanka szpiku kostnego zostanie uwolniona.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml homogenizować szpik kostny, pociągając do góry i spłukując płyn z moździerza.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyciągnij płyn z moździerza i przefiltruj go przez sitko o pojemności 70 μm do probówki o pojemności 50 ml na lodzie. Wypłucz kawałki kości/tkanki z filtra z powrotem do zaprawy za pomocą buforu FACS i wróć do kroku 1.7, aby homogenizować i odcedzić po raz drugi. Jest to frakcja szpiku kostnego.</li>
	<li>Wypłucz pozostałe kawałki kości (spikule) z powrotem do moździerza za pomocą buforu FACS i przepłucz je do probówki o pojemności 15 ml za pomocą buforu FACS, aby zapewnić maksymalną wydajność komórek. Jest to frakcja kolców kostnych.</li>
</ol>
2. Trawienie szpiku kostnego
<ol>
	<li>Odwirować szpik kostny przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić szpik kostny w 2 ml mieszaniny do trawienia szpiku kostnego (Tabela 1) i przenieść go do probówki o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut na rotatorze.</li>
	<li>Dodać 10 ml buforu FACS, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne. Przefiltrować mieszaninę przez sitko o pojemności 70 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Mieszaninę osadzać w stężeniu 400 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad szpiku kostnego w 1 ml buforu do lizy RBC (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 4 minuty na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 10 ml buforu FACS, aby zatrzymać lizę. Przefiltrować mieszaninę przez sitko o pojemności 70 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Mieszaninę osadzać w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu FACS.</li>
</ol>
3. Trawienie kolców kostnych
<ol>
	<li>Odwiruj kolce kostne od kroku 1.9 i pozwól im się osadzić. Zdekantować supernatant i zatrzymać kość na dnie.</li>
	<li>Zawiesić kolce kostne w 1 ml mieszaniny do trawienia spikul kostnych (Tabela 1).</li>
	<li>Umieścić probówki na rotatorze rurowym na 60 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 10 ml buforu FACS, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne. Przefiltrować mieszaninę przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml zawierającej szpik kostny poddany lizie erytrocytów i strawiony.</li>
</ol>
4. Barwienie
<ol>
	<li>Delikatnie wymieszaj kolce kostne i zawiesinę komórek szpiku kostnego.</li>
	<li>Użyj 10 μl zawiesiny komórek, aby policzyć liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu 0,4% barwienia na bazie błękitu trypanowego, zgodnie z opisem w opublikowanych protokołach27. Zbierz 50 000 komórek do niezabarwionej kontroli z zawiesiny komórek.</li>
	<li>Odwirować pozostałe komórki przy sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić go w 100 μl buforu FACS. 
	UWAGA: Przeciwciała można miareczkować w celu określenia idealnego rozcieńczenia. Dobór przeciwciał (epitopy i fluorochromy) można dostosować.</li>
	<li>Do barwienia przeciwciałami w celu zubożenia magnetycznego dodaj blok FC (1 μL na 25 x 106 komórek), CD45-APC (10 μL na 25 x 106 komórek) i Ter119-APC (4 μL na 25 x 106 komórek) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 20 minut. Przemyć buforem FACS, usunąć 50 000 komórek (~50 μl) do kontroli barwionej APC, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 100 μl buforu FACS.</li>
	<li>Do barwienia zawiesiny komórek mikrogranulkami w celu wyczerpania magnetycznego należy dodać mIgG (8 μL na 25 x 106 komórek) i mikrogranulki anty-APC (20 μL na 25 x 106 komórek) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 20 minut. Przemyć 10 ml buforu FACS, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Zubożenie próbki przez sortowanie magnetyczne
UWAGA: Ten krok jest wykonywany za pomocą dostępnego na rynku ręcznego separatora magnetycznego zgodnie z instrukcjami producenta. Ten etap można również wykonać za pomocą automatycznego separatora (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przygotować kolumnę LD, przemłukując ją 2 ml buforu MAC (Tabela 1). Wyrzuć ścieki i wymień rurkę zbiorczą.</li>
	<li>Ponownie zawieś do 1 x 108 komórek w buforze MAC i przefiltruj je przez probówkę o pojemności 5 ml z nasadką sitową 35 μm.</li>
	<li>Umieść kolumnę LD na stojaku separatora magnetycznego. Umieść probówkę o pojemności 5 ml poniżej kolumny, aby zebrać eluat.</li>
	<li>Dodaj zawiesinę komórek do przygotowanej kolumny LD. Pozwól, aby frakcja ujemna przepłynęła do probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę dwukrotnie 1 ml buforu MAC, zbierając eluat w tej samej probówce. Jest to frakcja ujemna użyta w kroku 5.6 poniżej.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę LD ze stojaka separatora magnetycznego i umieść ją na nowej probówce o pojemności 5 ml. Za pomocą pipety dozować 3 ml buforu do kolumny, aby wypłukać komórki, które zostały pozytywnie oznakowane, za pomocą tłoka kolumny.</li>
	<li>Odwirować frakcje ujemne i dodatnie przy sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić je ponownie w 100 μl buforu FACS.</li>
	<li>Policz 10 μl frakcji ujemnej i dodatniej za pomocą 0,4% błękitu trypanowego. Objętości do poniższego barwienia osteoanalizy/panelu śródbłonka będą oparte na tej liczbie komórek.</li>
	<li>Użyj 50 000 żywych komórek z frakcji dodatniej do kontroli bramkowania cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
6. Osteoanaliza/barwienie panelu śródbłonka
UWAGA: Kompensacja powinna być wykonywana zgodnie ze standardowymi protokołami cytometrii przepływowej, w tym wszystkimi odpowiednimi kontrolami barwienia i bramkowania.
<ol>
	<li>Do barwienia frakcji ujemnej CD45/Ter119 (1 μl każdego przeciwciała na 1 x 106 komórek) dodać CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE i CD140a-PE-Cy5 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 20 minut. Przemyć 2 ml buforu FACS, następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS i rozcieńczyć PI w stosunku 1:1000 do barwienia żywego/martwego, a następnie przefiltrować próbkę przez probówkę o pojemności 5 ml z nasadką sitową o wielkości 35 μm.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki na wielokolorowym cytometrze przepływowym.</li>
</ol>

Isolation and Characterization of Bone Marrow Microenvironment in Myeloid Neoplasms

<ol><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li>
<li>Pinho, S., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+activity+and+interactions+with+the+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).</li>
<li>Kfoury, Y., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+contributions+to+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).</li>
<li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li>
<li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd98-mediated+adhesive+signaling+enables+the+establishment+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).</li>
<li>Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+stem+cells+and+microenvironment%3A+Biology+and+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting.</a> J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).</li>
<li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+notch+activation+in+microenvironment+leads+to+myeloproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease.</a> Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microenvironment-induced+myeloproliferative+syndrome+caused+by+retinoic+acid+receptor+gamma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency.</a> Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+%CE%B2-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Hanoun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myelogenous+leukemia-induced+sympathetic+neuropathy+promotes+malignancy+in+an+altered+hematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Frisch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inhibition+of+osteoblastic+cells+in+an+in+vivo+mouse+model+of+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia.</a> Blood. 119 (2), 540-550 (2012).</li>
<li>Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cells in cancer initiation and progression.</a> J Cell Biol. 219 (1), e201911053(2020).</li>
<li>Sekeres, M. A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+myelodysplastic+syndromes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Jama%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review.</a> Jama. 328 (9), 872-880 (2022).</li>
<li>Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot%3A+Acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Snapshot: Acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).</li>
<li>Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mll+translocations%2C+histone+modifications+and+leukaemia+stem-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development.</a> Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).</li>
<li>Yoshimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+alterations+in+rna+splicing+and+epigenetic+regulation+drive+leukaemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis.</a> Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup98-hoxd13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Kwon, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+3+is+required+for+the+development+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).</li>
<li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+genome-wide+crispr+screen+identifies+the+rna-binding+protein+staufen2+as+a+key+regulator+of+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia.</a> Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+mll-af9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).</li>
<li>Tikhonova, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+microenvironment+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.</a> Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).</li>
<li>Balderman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+bone+marrow+microenvironment+improves+outcome+in+a+murine+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 127 (5), 616-625 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> JoVE. 110, e53936(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).</li>
<li>Passaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vascular+permeability+in+the+bone+marrow+microenvironment+contributes+to+acute+myeloid+leukemia+progression+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response.</a> Blood. 128 (22), 2662(2016).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nat Commun. 9 (1), 2449(2018).</li>
<li>Baccin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+single-cell+and+spatial+transcriptomics+reveal+the+molecular%2C+cellular+and+spatial+bone+marrow+niche+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization.</a> Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).</li>
<li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).</li>
<li>Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+IV+in+normal+skin+and+in+pathological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Collagen IV in normal skin and in pathological processes.</a> N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Modele białaczki mysiej są szeroko stosowane do identyfikacji wewnętrznych i niszowych sygnałów komórkowych, które sprzyjają postępowi agresywnej białaczki szpikowej 6,19,21. W artykule przedstawiono kompleksowy protokół oparty na cytometrii przepływowej w celu określenia składu komórkowego mikrośrodowiska szpiku kostnego w mysich modelach MDS i AML.
Przed uzyskaniem danych cytometrii przepływowej z p...

Mikrośrodowisko szpiku kostnego składa się z komórek krwiotwórczych, niekrwiotwórczych komórek zrębowych oraz macierzy zewnątrzkomórkowej1,2. To mikrośrodowisko może sprzyjać samoodnawianiu się krwiotwórczych komórek macierzystych, regulować różnicowanie linii oraz zapewniać strukturalne i mechaniczne wsparcie tkance kostnej1,2,3,4,5. Wnęka zrębu obejmuje komórki osteolineage, fibroblasty, komórki nerwowe i komórki śródbłonka6, podczas gdy nisza krwiotwórcza składa się z populacji limfoidalnej i szpikowej1,2,3. Mikrośrodowisko szpiku kostnego może nie tylko wspierać prawidłowe HSC, ale także odgrywać rolę w rozwoju zaburzeń krwiotwórczych komórek macierzystych, takich jak MDS i AML7,8,9,10,11. Wykazano, że mutacje w komórkach osteolineage sprzyjają rozwojowi MDS, AML i innych nowotworów mieloproliferacyjnych10,12,13,14.
Zespoły mielodysplastyczne to grupa zaburzeń przedbiałaczkowych, które powstają w wyniku mutacji w krwiotwórczych komórkach macierzystych. MDS jest często związany z blokadą różnicowania HSC i wytwarzaniem komórek dysplastycznych, co często może prowadzić do niewydolności szpiku kostnego. MDS jest najczęściej diagnozowanym nowotworem szpiku w Stanach Zjednoczonych i wiąże się z 3-letnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 35%-45%15. MDS często wiąże się z wysokim ryzykiem transformacji w ostrą białaczkę szpikową. Może to być śmiertelne powikłanie, ponieważ AML wywodząca się z MDS jest oporna na większość terapii i istnieje prawdopodobieństwo nawrotu. Ostra białaczka szpikowa, która powstaje de novo w wyniku translokacji lub mutacji w krwiotwórczym trzonie układu krwiotwórczego i przodkach, jest również często oporna na standardową chemioterapię16,17. Ponieważ MDS i AML są przede wszystkim chorobami osób starszych, z których większość diagnozuje się w wieku powyżej 60 lat, większość pacjentów nie kwalifikuje się do leczniczego przeszczepu szpiku kostnego. W związku z tym istnieje istotna potrzeba zidentyfikowania nowych regulatorów postępu choroby. Ponieważ mikrośrodowisko szpiku kostnego może stanowić wsparcie dla komórek nowotworowych14, zdefiniowanie zmian w niszy szpiku kostnego wraz z postępem choroby może prowadzić do identyfikacji nowych terapii mających na celu zahamowanie przebudowy niszy nowotworowej. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych regulatorów progresji choroby. W tym celu kluczowe znaczenie ma zidentyfikowanie i scharakteryzowanie zmian w populacjach komórek zrębu szpiku kostnego, które mogą stanowić wsparcie dla komórek nowotworowych.
Wygenerowano kilka mysich modeli AML i MDS, które mogą być używane do badania zmian w mikrośrodowisku szpiku kostnego podczas inicjacji i progresji choroby6,1,19,20,21,22. W tym miejscu opisano protokoły identyfikacji zmian w populacjach komórek zrębu szpiku kostnego przy użyciu mysich modeli retrowirusowo indukowanej AML6,20, a także dostępny na rynku model Nup98-HoxD13 (NHD13) transformacji MDS wysokiego ryzyka do AML19. Myszy przeszczepione komórkami AML de novo zapadają na chorobę w ciągu 20-30 dni6. Myszy NHD13 rozwijają cytopenię i dysplazję szpiku kostnego około 15-20 tygodni, która ostatecznie przekształca się w AML, a prawie 75% myszy zapada na chorobę około 32 tygodnia. Aby przeanalizować populacje mikrośrodowiska szpiku kostnego w modelu mysim, pobiera się kości, szpik kostny i kolce kostne są trawione za pomocą trawienia enzymatycznego, a następnie komórki są wzbogacane o populacje niehematopoetyczne CD45-/Ter119- przez sortowanie magnetyczne. Chociaż podobne analizy zostały już wcześniej opisane11,13,22,23,24,25, często koncentrują się one na szpiku kostnym lub kości i nie uwzględniają w swoich analizach komórek z obu źródeł. Połączona charakterystyka tych populacji, w połączeniu z analizami ekspresji genów, może zapewnić kompleksowe zrozumienie, w jaki sposób komórkowe mikrośrodowisko krwiotwórcze zapewnia wsparcie dla inicjacji i progresji choroby (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Podczas gdy opisany poniżej protokół koncentruje się na retrowirusowo indukowanym modelu AML i genetycznym modelu MDS, strategie te można łatwo dostosować do badania zmian w niszy szpiku kostnego dowolnego interesującego nas modelu mysiego.

<table><tbody><tr><td>Końcówki do pipet 1 ml&nbsp;</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml probówki do mikrowirówek</td><td>AVANT</td><td>L211511-CS</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-140RL</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pojedynczo pakowane sterylne pipety serologiczne</td><td>Globe scientific</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Termos do filtracji próżniowej</td><td>NEST</td><td>344021</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>VWR</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta aspiracyjna 2 mL</td><td>NEST</td><td>325011</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-150-RL</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Sterylne pipety serologiczne pakowane pojedynczo</td><td>Globe scientific</td><td>1780</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Sterylne pipety serologiczne pakowane pojedynczo</td><td>Globe scientific</td><td>1740</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna&nbsp; 12 x 75 mm</td><td>styl Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitka do komórek 12 x 75 mm styl</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa, płaska denna z pokrywką o niskiej parowaniu</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Chłonne podkładki z wodoodporną barierą przeciwwilgociową</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki APC</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>4425745</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Oczyszczony szczurzy anty-mysi CD16/CD32 (mysi blok BD Fc)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>0,5 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>66.000 g/mol</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 przeciwciało anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1) (D7)</td><td>Invitrogen</td><td>404-5981</td><td>0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>C57BL/6J Myszy</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik dwutlenku węgla Airgas</td><td></td><td>CD50</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) Przeciwciało monoklonalne (390), PE-cyjanina7</td><td>Invitrogen</td><td>25-0311-82</td><td>0,2 mg / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD45 (30-F11), APC</td><td>Invitrogen</td><td>17-0451-82</td><td>0,2 mg / ml</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 70 i mikro; m Nylon&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials Moździerz i tłuczek; Agat, 125 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-63100-62</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>STEMCELL</td><td>7415</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka Corning</td><td>CORNING</td><td>6770</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipet Corning Stripettor Ultra Corning</td><td></td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, proszek</td><td>Gibco</td><td>117105041</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x bufor do lizy RBC</td><td>Invitrogen</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol, KOPTEC, spełnia specyfikację analityczną BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td><td>VWR</td><td>89125-174</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - ostre</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Foundation B Płodowa surowica bydlęca</td><td>GeminiBio</td><td>900-208</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; Zestawy startowe do pipet PIPETMAN L</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>F167370G</tr><tr><td>Graefe Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) 10x</td><td>gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator&nbsp;</td><td>BINDER</td><td>C150-UL</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>K222101</td><td></td></tr><tr><td>LABGARD Class II, Type A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>LD Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LSE Mieszalnik wirowy</td><td>CORNING</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td><td>Becton, Dickinson i spółka</td><td>647800L6</td><td></td></tr><tr><td>MACS MULTI PODSTAWKA&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy MACsmix&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>mIgG</td><td>Millipore-Sigma</td><td>18765-10mg</td><td>2 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 (NHD13) Laboratorium Jacksona Myszy</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>010505</tr><tr><td>PE Przeciwciało przeciw mysim CD51 (RMV-7)</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td>0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>PE/cyjaninina 5 przeciwciało anty-mysie CD140a (RUO)</td><td>Biolegend</td><td>135920</td><td>0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>Plastipak 3 ml strzykawka</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium - 1,0 mg/ml roztwór w wodzie</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS&nbsp; Separator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka serii Sorvall X Pro / ST Plus</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75009521</tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne TER-119 (TER-119), APC</td><td>Invitrogen</td><td>17-5921-82</td><td>0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 M EDTA, pH 8,0&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

Mikrośrodowisko szpiku kostnego składa się z odrębnych populacji komórek, takich jak mezenchymalne komórki zrębu, komórki śródbłonka, komórki osteolineage i fibroblasty, które zapewniają wsparcie dla hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Oprócz wspierania prawidłowych HSC, mikrośrodowisko szpiku kostnego odgrywa również rolę w rozwoju zaburzeń hematopoetycznych komórek macierzystych, takich jak zespoły mielodysplastyczne (MDS) i ostra białaczka szpikowa (AML). Mutacje związane z MDS w HSC prowadzą do zablokowania różnicowania i postępującej niewydolności szpiku kostnego, zwłaszcza u osób starszych. MDS może często przekształcić się w oporną na terapię AML, chorobę charakteryzującą się szybką akumulacją niedojrzałych blastów szpikowych. Wiadomo, że mikrośrodowisko szpiku kostnego jest zmienione u pacjentów z tymi nowotworami szpiku. W tym miejscu opisano kompleksowy protokół izolacji i fenotypowej charakterystyki komórek mikrośrodowiskowych szpiku kostnego z mysich modeli zespołu mielodysplastycznego i ostrej białaczki szpikowej. Wyizolowanie i scharakteryzowanie zmian w populacjach nisz szpiku kostnego może pomóc w określeniu ich roli w inicjacji i progresji choroby oraz może prowadzić do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na zmiany sprzyjające nowotworom w populacjach zrębu szpiku kostnego.

Niniejszy artykuł opisuje metodę opartą na cytometrii przepływowej do analizy populacji mikrośrodowiska szpiku kostnego, takich jak komórki śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste, w mysich modelach MDS i białaczki (Rycina 1). Rycina 2 przedstawia strategię bramkowania dla detekcji interesujących populacji, rozpoczynającą się od wyboru komórek (P1) w frakcji trawionej i pozbawionej CD45/Ter119 za pomocą profilu rozproszenia przedniego i bocznego. Przykład...

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

Nasze badania mają na celu zbadanie, w jaki sposób zmieniające się środowisko szpiku kostnego wpływa na wzrost guza. Opracowaliśmy protokół cytometrii przepływowej do analizy komórek nieodpornościowych w szpiku kostnym i tkankach kostnych, koncentrując się na morskich nowotworach hematologicznych. Metodę tę można dostosować do badania szpiku kostnego w różnych modelach lustrzanych.Nasze badanie koncentruje się na izolowaniu i identyfikacji zmian w populacjach zrębu szpiku kostnego podczas progresji raka. Zrozumienie ich wpływu na początek i postęp choroby może utorować drogę dla nowych metod leczenia ukierunkowanych na te nowotwory, ułatwiając zmiany w komórkach zrębu szpiku kostnego. Nasz protokół w unikalny sposób łączy trawienie mechaniczne i enzymatyczne, wyczerpanie magnetyczne i cytometrię przepływową w celu określenia składu komórkowego mikrośrodowiska szpiku kostnego.Wyróżnia się zastosowaniem separacji magnetycznej i włączeniem komórek zarówno z kości, jak i szpiku, oferując bardziej wszechstronną reprezentację tego mikrośrodowiska. Na początek usuń tkankę z kości poddanej eutanazji myszy wypreparowanej. Umieścić oczyszczone kości na nowej sześciodołkowej płytce zawierającej bufor FACS umieszczonej na lodzie.Przenieś kości do moździerza z dwoma do pięciu mililitrami buforu FACS. Miel kości okrężnymi ruchami, aż szpik kostny zostanie uwolniony. Za pomocą trzymililitrowej strzykawki pociągnij szpik kostny i spłucz go w dół, aby go zhomogenizować.Przeciągnij homogenat do innej strzykawki, a następnie przefiltruj go przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Wypłucz kawałki tkanki z filtra z powrotem do zaprawy za pomocą buforu FACS przed homogenizacją po raz drugi. Przefiltruj wypłukaną tkankę jak poprzednio.Następnie spłucz pozostałe kolce kostne z powrotem do zaprawy za pomocą buforu FACS. Następnie przepłucz kawałki do 15-mililitrowej tuby, aby zapewnić maksymalną wydajność. Aby strawić szpik kostny, najpierw odwiruj w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zawiesić osad szpiku kostnego w dwóch mililitrach mieszanki wytrawiającej. Przenieś mieszaninę do 15-mililitrowej probówki, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut na rotatorze. Teraz dodaj 10 mililitrów buforu FACS, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.Przefiltruj mieszaninę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Odwirowywać zawiesinę o sile 400 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy RBC.Następnie dodaj 10 mililitrów buforu FACS, aby zatrzymać lizę. Następnie przefiltruj mieszaninę jak poprzednio do 50-mililitrowej probówki. Na koniec odwiruj mieszaninę w temperaturze 300 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Aby trawić kolce kostne, najpierw zawiruj kolce kostne. Zdekantować supernatant i zachować kości na dnie.Następnie ponownie zawieś kolce w jednym mililitrze mieszanki do trawienia spikuli kostnej. Inkubować probówkę na rotatorze przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec przerwij trawienie za pomocą 10 mililitrów buforu FACS.Przefiltrować mieszaninę do 50-mililitrowej probówki zawierającej lizowany i trawiony szpik kostny poddany lizie RBC. Na początek wymieszaj izolowaną zawiesinę mysiego szpiku kostnego z zawiesiną kolców kostnych. Pobrać pipetę 10 mikrolitrów zawiesiny komórek na hemocytometr w celu zliczenia.Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach bufora FACS. Aby wybarwić komórki przeciwciałami w celu wyczerpania magnetycznego, dodaj Fc-Block CD45 APC i TER-119 APC.Następnie przemyć zawiesinę komórek buforem FACS. Po odwirowaniu pozostałej mieszaniny ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Aby zabarwić zawiesinę komórek mikrokulkami w celu wyczerpania magnetycznego, dodaj mikrokulki mysie IgG i anty-APC.Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 20 minut. Umyj kolumnę LD dwoma mililitrami buforu MACS. Ponownie zawiesić komórki w buforze, a następnie przefiltrować je przez pięciomililitrową probówkę z 35-mikrometrową nasadką sitkową do komórek.Następnie ustaw kolumnę LD na stojaku separatora magnetycznego i umieść pięciomililitrową probówkę pod kolumną, aby zebrać wymykający się materiał. Odpipetować zawiesinę komórek do kolumny LD i zebrać ujemną frakcję przepływającą do probówki. Przemyć kolumnę dwa razy jednym mililitrem buforu MACS i zebrać eluat do tej samej probówki.Umieść kolumnę LD nad nową pięciomililitrową probówką. Za pomocą pipety dozować trzy mililitry buforu do kolumny. Następnie wypłucz pozytywnie oznakowane komórki do pięciomililitrowej probówki.Odwirować zarówno frakcję dodatnią, jak i ujemną. Następnie ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach bufora FACS. Utrzymaj frakcję ujemną CD45 TER-119, dodaj jeden mikrolitr każdego przeciwciała na każde 10 do 6 komórek.Umieścić zawiesinę na lodzie na 20 minut. Następnie przemyj zawiesinę dwoma mililitrami buforu FACS przed odwirowaniem. Dodać jeden mililitr buforu do osadu i odpipetować jodek propidyny do barwienia żywych komórek.Na koniec przefiltruj próbkę przez sitko o średnicy 35 mikrometrów do pięciomililitrowej probówki przed analizą komórek na wielokolorowym cytometrze przepływowym. Komórki śródbłonka tętnic znacznie się rozszerzyły w mikrośrodowisku ostrej białaczki szpikowej, z jednoczesnym ubytkiem w populacjach śródbłonka sinusoidalnego. Niewielkie rozszerzenie mezenchymalnych komórek zrębu zaobserwowano w wieku ośmiu tygodni.

identifying-bone-marrow-microenvironmental-populations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Ten protokół służy jako schemat do tworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON w liniach komórek nowotworowych i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania roli białek pochodzących z komórek nowotworowych w rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza.

Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do izolacji i analizy populacji stromalnych szpiku kostnego w modelach mysich nowotworów hematologicznych. Protokół łączy trawienie enzymatyczne z separacją magnetyczną.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Przeglądaj więcej filmów