Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej
10 listopada 2023
Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.
Nasze badania mają na celu zbadanie, w jaki sposób zmieniające się środowisko szpiku kostnego wpływa na wzrost guza. Opracowaliśmy protokół cytometrii przepływowej do analizy komórek nieodpornościowych w szpiku kostnym i tkankach kostnych, koncentrując się na morskich nowotworach hematologicznych. Metodę tę można dostosować do badania szpiku kostnego w różnych modelach lustrzanych.
Nasze badanie koncentruje się na izolowaniu i identyfikacji zmian w populacjach zrębu szpiku kostnego podczas progresji raka. Zrozumienie ich wpływu na początek i postęp choroby może utorować drogę dla nowych metod leczenia ukierunkowanych na te nowotwory, ułatwiając zmiany w komórkach zrębu szpiku kostnego. Nasz protokół w unikalny sposób łączy trawienie mechaniczne i enzymatyczne, wyczerpanie magnetyczne i cytometrię przepływową w celu określenia składu komórkowego mikrośrodowiska szpiku kostnego.
Wyróżnia się zastosowaniem separacji magnetycznej i włączeniem komórek zarówno z kości, jak i szpiku, oferując bardziej wszechstronną reprezentację tego mikrośrodowiska. Na początek usuń tkankę z kości poddanej eutanazji myszy wypreparowanej. Umieścić oczyszczone kości na nowej sześciodołkowej płytce zawierającej bufor FACS umieszczonej na lodzie.
Przenieś kości do moździerza z dwoma do pięciu mililitrami buforu FACS. Miel kości okrężnymi ruchami, aż szpik kostny zostanie uwolniony. Za pomocą trzymililitrowej strzykawki pociągnij szpik kostny i spłucz go w dół, aby go zhomogenizować.
Przeciągnij homogenat do innej strzykawki, a następnie przefiltruj go przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Wypłucz kawałki tkanki z filtra z powrotem do zaprawy za pomocą buforu FACS przed homogenizacją po raz drugi. Przefiltruj wypłukaną tkankę jak poprzednio.
Następnie spłucz pozostałe kolce kostne z powrotem do zaprawy za pomocą buforu FACS. Następnie przepłucz kawałki do 15-mililitrowej tuby, aby zapewnić maksymalną wydajność. Aby strawić szpik kostny, najpierw odwiruj w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zawiesić osad szpiku kostnego w dwóch mililitrach mieszanki wytrawiającej. Przenieś mieszaninę do 15-mililitrowej probówki, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut na rotatorze. Teraz dodaj 10 mililitrów buforu FACS, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.
Przefiltruj mieszaninę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Odwirowywać zawiesinę o sile 400 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy RBC.
Następnie dodaj 10 mililitrów buforu FACS, aby zatrzymać lizę. Następnie przefiltruj mieszaninę jak poprzednio do 50-mililitrowej probówki. Na koniec odwiruj mieszaninę w temperaturze 300 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.
Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Aby trawić kolce kostne, najpierw zawiruj kolce kostne. Zdekantować supernatant i zachować kości na dnie.
Następnie ponownie zawieś kolce w jednym mililitrze mieszanki do trawienia spikuli kostnej. Inkubować probówkę na rotatorze przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec przerwij trawienie za pomocą 10 mililitrów buforu FACS.
Przefiltrować mieszaninę do 50-mililitrowej probówki zawierającej lizowany i trawiony szpik kostny poddany lizie RBC. Na początek wymieszaj izolowaną zawiesinę mysiego szpiku kostnego z zawiesiną kolców kostnych. Pobrać pipetę 10 mikrolitrów zawiesiny komórek na hemocytometr w celu zliczenia.
Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach bufora FACS. Aby wybarwić komórki przeciwciałami w celu wyczerpania magnetycznego, dodaj Fc-Block CD45 APC i TER-119 APC.
Następnie przemyć zawiesinę komórek buforem FACS. Po odwirowaniu pozostałej mieszaniny ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Aby zabarwić zawiesinę komórek mikrokulkami w celu wyczerpania magnetycznego, dodaj mikrokulki mysie IgG i anty-APC.
Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 20 minut. Umyj kolumnę LD dwoma mililitrami buforu MACS. Ponownie zawiesić komórki w buforze, a następnie przefiltrować je przez pięciomililitrową probówkę z 35-mikrometrową nasadką sitkową do komórek.
Następnie ustaw kolumnę LD na stojaku separatora magnetycznego i umieść pięciomililitrową probówkę pod kolumną, aby zebrać wymykający się materiał. Odpipetować zawiesinę komórek do kolumny LD i zebrać ujemną frakcję przepływającą do probówki. Przemyć kolumnę dwa razy jednym mililitrem buforu MACS i zebrać eluat do tej samej probówki.
Umieść kolumnę LD nad nową pięciomililitrową probówką. Za pomocą pipety dozować trzy mililitry buforu do kolumny. Następnie wypłucz pozytywnie oznakowane komórki do pięciomililitrowej probówki.
Odwirować zarówno frakcję dodatnią, jak i ujemną. Następnie ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach bufora FACS. Utrzymaj frakcję ujemną CD45 TER-119, dodaj jeden mikrolitr każdego przeciwciała na każde 10 do 6 komórek.
Umieścić zawiesinę na lodzie na 20 minut. Następnie przemyj zawiesinę dwoma mililitrami buforu FACS przed odwirowaniem. Dodać jeden mililitr buforu do osadu i odpipetować jodek propidyny do barwienia żywych komórek.
Na koniec przefiltruj próbkę przez sitko o średnicy 35 mikrometrów do pięciomililitrowej probówki przed analizą komórek na wielokolorowym cytometrze przepływowym. Komórki śródbłonka tętnic znacznie się rozszerzyły w mikrośrodowisku ostrej białaczki szpikowej, z jednoczesnym ubytkiem w populacjach śródbłonka sinusoidalnego. Niewielkie rozszerzenie mezenchymalnych komórek zrębu zaobserwowano w wieku ośmiu tygodni.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania populacji mikrośrodowiska szpiku kostnego w mysich modelach zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpiku. Badanie koncentruje się na analizie nieimmunologicznych komórek szpiku kostnego oraz ich zmianach podczas progresji nowotworu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Hematologia
- Biologia raka
Wstęp
- Mikrośrodowisko szpiku kostnego odgrywa kluczową rolę w rozwoju nowotworu.
- Podczas progresji raka zapadają zmiany w komórkach niehematopoetycznych, w tym w populacjach stromalnych.
- Zrozumienie tych zmian może doprowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych.
- W badaniu wykorzystano modele mysie do naśladowania ludzkich nowotworów hematologicznych.
Cel badania
- Izolacja i identyfikacja zmian w populacjach zrębu szpiku kostnego.
- Zrozumienie wpływu środowiska szpiku kostnego na wystąpienie i progresję choroby.
- Opracowanie protokołu cytometrii przepływowej, który można dostosować do różnych modeli.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do analizy komórek nieimmunologicznych.
- Połączenie trawienia mechanicznego i enzymatycznego.
- Techniki usuwania komórek za pomocą kulek magnetycznych.
- Charakterystyka składu komórkowego mikrośrodowiska szpiku kostnego.
Główne wyniki
- Identyfikacja zmian w populacjach zrębu szpiku kostnego podczas progresji nowotworu.
- Wgląd w rolę niszy szpiku kostnego w rozwoju guza.
- Ustanowienie solidnego protokołu do przyszłych badań.
- Potencjalne implikacje dla celowanych terapii nowotworowych.
Wnioski
- Mikrośrodowisko szpiku kostnego znacząco wpływa na nowotwory hematologiczne.
- Zrozumienie zmian w zrębie jest kluczowe dla opracowania nowych metod leczenia.
- Niniejszy protokół można zastosować w różnych modelach nowotworowych w celu prowadzenia dalszych badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza mikrośrodowiska szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym (MDS) i ostrej białaczce szpikowej (AML) pozwala stawić czoła kluczowemu wyzwaniu w zrozumieniu inicjacji i progresji choroby. Wysokorozdzielcze fenotypowanie populacji stromy i śródbłonka umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka i dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celów terapeutycznych ukierunkowanych na niszę wspierającą nowotwór. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w punkcie przejścia z fazy odkryć do badań przedklinicznych w ramach portfela terapii nowotworów hematologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie udziału komórek zrębowych i śródbłonka w transformacji nowotworowej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie zmian w niszy związanych ze stanami chorobowymi.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do potencjalnych celów terapeutycznych w mikrośrodowisku szpiku kostnego.
- Stanowi platformę do eksploracji interakcji między guzem a mikrośrodowiskiem w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, zdefiniowane fenotypowo populacje komórek do dalszych analiz funkcjonalnych.
- Standaryzuje procesy izolacji i charakterystyki w celu uzyskania powtarzalnych wyników ilościowych.
- Umożliwia skalowalne przesiewanie związków modulujących niszę z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
- Wspiera wiarygodną ocenę potencjalnych interwencji celujących w komponenty zrębowe lub śródbłonkowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do istotnych zmian w mikrośrodowisku obserwowanych w MDS i AML.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację strategii ukierunkowanych na niszę.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój terapii modulujących stromę wspierającą guz.
- dostarcza wglądu w mechanizmy niezbędne do opracowania translacyjnych biomarkerów w nowotworach hematologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając wysokowierną izolację i analizę populacji nisz szpiku kostnego w mysich modelach MDS i AML.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących roli komórek zrębowych i śródbłonka w progresji choroby.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe fenotypowanie na potrzeby opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia uzyskanie wyników opartych na cytometrii przepływowej do analizy porównawczej zmian w mikrośrodowisku.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje ustandaryzowany, adaptowalny schemat postępowania dla różnych modeli nowotworów hematologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w wyborze celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność izolacji oraz analizy komórek niszowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie mikrośrodowiskowych czynników napędzających chorobę.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów terapeutycznych ukierunkowanych na niszę z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie cytometrii przepływowej, izolacji komórek oraz pracy z modelami mysimi.
- Wymaga dostępu do infrastruktury wielokolorowej cytometrii przepływowej oraz separacji magnetycznej.
- Konieczna jest standaryzacja strategii bramkowania i fenotypowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana do różnych modeli mysich, lecz może wymagać optymalizacji dla konkretnych jednostek chorobowych.
- Przepustowość i wydajność komórkowa mogą być ograniczone przez dostępność tkanki oraz złożoność techniczną.
