Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Ogólnym celem tej metody jest wszczepienie myszom rusztowań z nośnikami ludzkich komórek w celu stworzenia humanizowanych nisz szpiku kostnego, a następnie obrazowanie na żywo zachowania ludzkich komórek wewnątrz implantów. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ludzkiej hematopoezy, ponieważ umożliwia odtworzenie i obrazowanie na żywo z rozdzielczością pojedynczej komórki różnych komponentów szpiku kostnego. Wszechstronność tego systemu jest jedną z jego głównych zalet, ponieważ pozwala na wszczepianie różnych komponentów niszy pojedynczo lub w kombinacjach.

Niniejszą metodologię można potencjalnie zastosować w innych dziedzinach badawczych, takich jak badania nad przerzutami nowotworowymi czy screening leków. Stosując odpowiednią technikę sterylną, należy rozpocząć od pocięcia wysterylizowanej gąbki żelatynowej na 24 kawałki o podobnej wielkości. Następnie należy zrekonstytuować rusztowania żelatynowe poprzez zanurzenie ich w etanolu, a następnie w PBS.

Następnie delikatnie osusz każdy rusztowanie na sterylnym ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar cieczy, i przenieś rusztowania do poszczególnych studni płytki 24-dołkowej o ultra niskim przywieraniu (ultra low attachment). Używając strzykawki insulinowej, ostrożnie wstrzyknij od 1×10⁵ do 1×10⁶ komórek zrębu w 50 µL pożywki hodowlanej do każdego rusztowania, a następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Podczas wstrzykiwania komórek do rusztowania należy upewnić się, że nie następuje ich wyciek na zewnątrz.

Po jednej godzinie należy napełnić każdą studzienkę trzema mililitrami świeżej pożywki do hodowli komórkowych i przenieść rusztowania z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach do rusztowań wstrzykuje się 1×10⁵ komórek krwiotwórczych, a następnie przeprowadza inkubację, dodaje kolejną porcję pożywki i inkubuje przez 24 godziny, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. W celu wytworzenia rusztowań nośnikowych z rekombinowanym ludzkim białkiem morfogenetycznym kości 2, zrekonstytuowane rusztowania należy umieścić w oddzielnych studzienkach płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U, a do każdego rusztowania dodać pięć mikrolitrów rekombinowanego ludzkiego białka morfogenetycznego kości 2.

Następnie pokryj rusztowania 20 µL trombiny i 20 µL fibrynogenu. W celu chirurgicznej implantacji bioinżynieryjnych rusztowań, najpierw ogól obszar operacyjny na grzbiecie myszy doświadczalnej, a następnie użyj patyczka bawełnianego nasączonego rozcieńczoną chlorheksydyną, aby trzykrotnie oczyścić odsłoniętą powierzchnię skóry w każdym kierunku. Następnie, używając sterylnej pęsety i skalpela, wykonaj nacięcie skóry o długości od 0,5 do 0,7 cm w kierunku przednio-tylnym i wprowadź pęsetę pod tkankę podskórną, aby utworzyć kieszonkę.

Wprowadź rusztowanie głęboko do kieszonki i zamknij nacięcie za pomocą kleju chirurgicznego. Pozostaw zaimplantowane rusztowania do rozwoju na okres od ośmiu do 24 tygodni przed eksplantacją. Po dożylnym podaniu substancji fluorescencyjnych i eutanazji zwierząt, wysterylizuj skórę w sposób przedstawiony powyżej i wykonaj podłużne nacięcie skóry na grzbiecie zwierzęcia, w pobliżu pierwotnego miejsca implantacji.

Ostrożnie oddziel skórę od podskórnej kieszonki, w której zaimplantowano rusztowanie, a następnie za pomocą pęsety delikatnie chwyć rusztowanie i ostrożnie przetnij pozostałą błonę oraz tkanki otaczające konstrukcję, aby ją odzyskać. Użyj szybko utwardzającego się kleju, aby przymocować rusztowanie do szalki Petriego o pojemności 35 by 10 ml. W przypadku rusztowań z białka morfogenetycznego kości 2, przed wypełnieniem szalki PBS, użyj chirurgicznego mikrowiertła pod mikroskopem chirurgicznym, aby odchudzić powierzchnię kości, co umożliwi wizualizację fluoroforów i rejestrację obrazów o wysokiej rozdzielczości.

Należy zachować szczególną ostrożność podczas procesu wiercenia, ponieważ grubość kości zazwyczaj różni się pomiędzy rusztowaniami i ważne jest, aby nie uszkodzić powierzchni. Napełnij naczynie PBS o temperaturze pokojowej. W celu obrazowania bioinżynieryjnych rusztowań za pomocą mikroskopii dwufotonowej, umieść rusztowanie na stoliku mikroskopu konfokalnego i wybierz obiektyw imersyjny wodny 20x 1.0 NA.

Następnie w trybie akwizycji oprogramowania do obrazowania zaznacz pole pokaż narzędzia ręczne. W menu lasera włącz laser dwufotonowy i odczekaj, aż laser się rozgrzeje i ustabilizuje. Gdy laser będzie gotowy, w menu konfiguracji obrazowania aktywuj tryb kanału i opcję przełączaj ślad w każdej klatce.

W menu ścieżki świetlnej wybierz opcję non descanned oraz główny dzielnik wiązki MBS 760 plus. Aktywuj cztery detektory non descanned i ustaw konfigurację zgodnie z przedstawionym schematem. W menu kanałów ustaw długość fali lasera na 890 nanometrów, a moc na 50%. Dla każdego kanału ustaw gain master w zakresie od 500 do 600, offset cyfrowy na zero oraz wzmocnienie cyfrowe (digital gain) na 15.

W trybie akwizycji ustaw odpowiednie parametry, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości bez uszkadzania tkanki i wybielania fluoroforów. Następnie ustaw powiększenie (zoom) na 1 dla wstępnego skanowania obrazu. Po ustawieniu wszystkich parametrów opuść obiektyw, aż dotknie on roztworu soli fizjologicznej, a następnie ręcznie ustaw ostrość obiektywu, używając lampy jako źródła światła.

Teraz aktywuj menu Z-stack i wybierz funkcję first last. Ustaw wymagany odstęp między dwiema następującymi po sobie sekcjami i wybierz opcję live, aby przeprowadzić skanowanie próbki na żywo, dostosowując w razie potrzeby wzmocnienie cyfrowe (digital gain) oraz przesunięcie cyfrowe (digital offset) w celu uzyskania optymalnej ekspozycji. Aby wizualizować wiele kanałów jednocześnie, wybierz funkcję split.

W menu stolika, będąc w trybie na żywo, przeskanuj obraz i zaznacz obszary zainteresowania, takie jak lokalizacja jam kostnych. Po zakończeniu skanowania próbki przejdź do pierwszego obszaru zainteresowania i użyj funkcji „set first” oraz „set last” w trybie na żywo, aby ustawić górną i dolną granicę stosu 3D Z-stack obejmującego obszar zainteresowania. Następnie ustaw centrum, C, i kliknij przycisk „start experiment”, aby rozpocząć akwizycję obrazów Z-stack dla wybranego obszaru zainteresowania.

Po zakończeniu akwizycji zapisz obrazy w wyznaczonym folderze i zeskanuj kolejny obszar zainteresowania. Na tych reprezentatywnych obrazach można zaobserwować morfologię makroskopową różnych rusztowań odzyskanych z immunodeficyjnych myszy NSG osiem tygodni po implantacji. Współhodowla z ludzkimi komórkami śródbłonka zwiększa unaczynienie rusztowania, natomiast dodatek rekombinowanego ludzkiego białka morfogenetycznego kości dwa indukuje kostnienie.

Rusztowania te, obrazowane za pomocą dwufotonowej mikroskopii żywych komórek, ujawniają obecność naczyń krwionośnych wewnątrz rusztowań oraz długoterminowe przyjęcie ludzkich komórek krwiotwórczych w miąższu rusztowania. Rusztowania zasiane ludzkimi komórkami śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ilustrują udział ludzkich komórek śródbłonka w tworzeniu naczyń w obrębie rusztowania, co prowadzi do powstania mysio-ludzkiego układu naczyniowego chimerycznego. Za pomocą mikroskopii dwufotonowej można zwizualizować tworzenie się tkanki kostnej, a także powstawanie jam w zhumanizowanym układzie naczyniowym w tkance endostealnej, która w dużym stopniu przypomina tkankę endostealną szpiku kostnego.

Ponadto w rusztowaniach nośnikowych z rekombinującym ludzkim białkiem morfogenetycznym kości 2, morfologia tkanki wewnątrz rusztowania przypomina dojrzały szpik kostny z tkanką tłuszczową, co sugeruje, że ludzkie mezenchymalne komórki stromalne przyczyniają się również do tworzenia tkanki tłuszczowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat całej bioinżynierii oraz głównych rusztowań mysich. Należy zawsze pamiętać o zachowaniu aseptycznego środowiska i zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z rusztowaniami.

Należy wziąć pod uwagę ograniczenia związane z tą metodą, takie jak powstawanie chimer ludzko-mysich w tkankach. Pamiętaj, że po obrazowaniu próbki mogą zostać wykorzystane do dalszych badań, ponieważ rusztowania można poddać trawieniu, co pozwala na odzyskanie z nich żywych komórek.