Name: Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę tworzenia humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy poprzez implantację rusztowań z komórkami ludzkimi i ich wizualizację za pomocą mikroskopii dwufotonowej na żywo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy personelowi w głównych obiektach Instytutu Francisa Cricka (ośrodek badań biologicznych, obrazowanie in vivo i eksperymentalna histopatologia) oraz Yolandzie Saavedra-Torres i Mercedes Sanchez-Garzon, weterynarzom z Crick i LRI, za ich cenną pomoc. Jesteśmy wdzięczni dr W. Greyowi za krytyczną lekturę manuskryptu. D.P. był wspierany przez niekliniczne stypendium badawcze od EHA. Prace te były wspierane przez Instytut Francisa Cricka, który otrzymuje podstawowe fundusze od Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045) i Welcome Trust (FC001045).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z PPL 70/8904, zatwierdzone przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych i zgodne z wytycznymi Cancer Research UK. Wykorzystanie próbek ludzkiej krwi pępowinowej (UCB) i pierwotnej ludzkiej ostrej białaczki szpikowej (AML) zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Wschodniego Londynu po uzyskaniu zgody i zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.
1. Bioinżynieryjne rusztowania oparte na kolagenie z ludzkimi komórkami krwiotwórczymi i zrębowymi
UWAGA: Cały protokół powinien być wykonany w sterylnych warunkach i z użyciem sterylnego materiału. Pożywka do hodowli komórkowych 1 odpowiada pożywce hMSC (MEM-α, P/S i 10% hMSC-FBS); pożywka do hodowli komórkowej 2 odpowiada pożywce EC (M199, 20% FBS, P/S, 10 mM HEPES, 50 μg/ml heparyny, 2 mM glutaminy i 50 μg/ml ECGS), a pożywka do hodowli komórkowej 3 odpowiada pożywce komórek krwiotwórczych (H5100 i P/S).
<ol>
	<li>Przygotuj jednojądrzaste komórki krwi pępowinowej (CB-MNC) lub pierwotną AML (MNC szpiku kostnego lub krwi obwodowej) przy użyciu gradientu gęstości Ficoll-Paque, zgodnie z dobrze znanymi protokołami53.
	<ol>
		<li>W przypadku AML należy zubożyć limfocyty T za pomocą przeciwciała OKT.3. Inkubować 4 μg OKT.3 na 1 x 106 AML MNC przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed myciem komórek w PBS. W razie potrzeby kriokonserwuj MNC w FBS z 10% DMSO przy 2 x 108 komórkach na ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować hodowle komórkowe hMSC (pożywka 1) i EC (pożywka hodowlana 2). Płytki komórek hMSC (patrz tabela materiałów) na zwykłych kolbach do hodowli komórkowych w pożywce hMSC. Płytki EC (patrz tabela materiałów) na powierzchniach pokrytych kolagenem 1 w pożywce EC.</li>
	<li>Przy 85-90% zbiegu komórek usuń pożywkę, przemyj dwukrotnie PBS i dodaj roztwór trypsyny-EDTA (20 μl nacm2).
	<ol>
		<li>Po 5 minutach sprawdź, czy komórki są odłączone. Odzyskaj komórki, rozcieńczając 1:3 pożywką do hodowli komórkowych. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w odpowiednim pożywce dla każdego typu komórek i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.</li>
		<li>Użyj komórek w proporcji 2 x 106 - 107 komórek na ml. Jeśli oba typy komórek muszą być używane razem, wymieszaj zawiesiny hMSC i EC w stosunku 1:1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do strzykawki insulinowej.</li>
	<li>Za pomocą skalpela pokrój wysterylizowane rusztowanie początkowe gąbki żelatynowej (np. żelpianki) (20 mm x 60 mm x 7 mm) na 24 części o podobnej wielkości (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm; <silna klasa="xfig">Rysunek 1A i B).</li>
	<li>Rozpuścić rusztowania żelatynowe przez zanurzenie w PBS (5 min).</li>
	<li>Jedno po drugim delikatnie umieść rusztowania na sterylnej tkance, aby usunąć nadmiar PBS. Przenieść rusztowania do jednego dołka na 24-dołkowej płytce (bardzo niska powierzchnia mocowania) i za pomocą strzykawki wstrzyknąć 50 μl zawierających 105 - 106 komórek (hMSC samodzielnie lub w połączeniu z hEC; <silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Powtórz krok 1.7 z każdym rusztowaniem, aż wszystkie wymagane rusztowania zostaną obsiane komórkami zrębu.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i CO2 5%).</li>
	<li>Napełnij każdą studzienkę 3 ml pożywki do hodowli komórkowych 1 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D) i umieść rusztowania z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i CO2 5%) w celu inkubacji przez noc. Użyj pożywki do hodowli komórkowej 2, jeśli EC są używane w rusztowaniach.</li>
	<li>Rozmrozić CB-MNC i wyizolować z nich komórki CD34+ zgodnie z odpowiednim protokołem zestawu sekcji CD34+. Zawieś wybrane komórki CD34+ w pożywce 3 i policz je w komorze Neubauera. 
	UWAGA: Tutaj użyto komórek w stężeniu 2 x 106 komórek na ml.
	<ol>
		<li>Jeśli używane są próbki pierwotne pochodzące od pacjenta z AML, rozmrozić komórki, rozcieńczyć je w stosunku 1:10 w FBS, odwirować je przez 5 minut przy 300 x g, ponownie zawiesić komórki w PBS-2% FBS, dodać przeciwciało anty-ludzkie CD3 (2 - 4 μg na 106 komórek) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. Wirować przez 5 minut przy 300 x g i ponownie zawiesić w pożywce komórek krwiotwórczych uzupełnionej cytokinami (20 ng/ml czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), 20 ng/ml IL-3 i 20 ng/ml trombopoetyny (TPO)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 1.7 - 1.9, ale w tym przypadku wysiewaj 1 x 105 ludzkich komórek krwiotwórczych zamiast składników zrębu, jak powyżej.
	<ol>
		<li>Napełnij studzienkę 3 ml pożywki do hodowli komórkowych 3 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1D) i umieść rusztowania z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i CO2 5%) w celu inkubacji przez noc. Użyć mieszanki pożywek do hodowli komórkowych w stosunku 1:1 2 i 3 Jeśli EC są używane w rusztowaniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tylko w przypadku rusztowań nośnych rekombinowanego białka morfogenetycznego ludzkiej kości-2 (rhBMP-2) należy delikatnie umieścić rusztowania jedno po drugim na sterylnej tkance, aby usunąć nadmiar PBS. Przenieś rusztowania do jednej studzienki na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1E) i dodaj 5 μl rhBMP-2, dokładnie pokrywając rusztowanie.
	<ol>
		<li>Dodaj 20 μl trombiny, a następnie 20 μl fibrynogenu, za każdym razem dokładnie pokrywając rusztowanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Powtarzać procedurę dla każdego rusztowania, aż wszystkie wymagane rusztowania zostaną poddane obróbce, a następnie inkubować przez 5 - 10 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdzić, czy koagulacja się pomyślnie wytworzyła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Chirurgiczne wszczepianie rusztowań bioinżynieryjnych
UWAGA: Tutaj, zarówno samce, jak i samice, użyto myszy NSG w wieku od 6 do 12 tygodni. Ponieważ zwierzęta mają niedobór odporności, wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. Kroki 2.10 - 2.13 są związane ze strategiami przeżycia i opieką pooperacyjną.
<ol>
	<li>60 - 120 min przed zabiegiem podskórnie podać leki przeciwbólowe (karprofen, 5 mg/kg masy ciała/mysz).</li>
	<li>Wywołać znieczulenie w komorze z 0,5% izofluranem i 2 l/minO2. Myszy powinny być stale monitorowane podczas zabiegu. Przenieś zwierzę na obszar operacyjny w pozycji leżącej, aby mieć łatwy dostęp do pleców. Zwierzę należy przechowywać w znieczuleniu za pomocą stożka nosowego dostarczającego 1,5% izofluranu i 2 l/minO2. Trzymaj mysz pod narkozą podczas zabiegu chirurgicznego i często sprawdzaj stan zwierzęcia.</li>
	<li>Podczas znieczulenia użyj żelu okulistycznego na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymuj mysz w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ogol obszar chirurgiczny z tyłu myszy za pomocą trymera elektrycznego. Aby wysterylizować skórę, zanurz bawełnianą końcówkę w rozcieńczonej kreksydynie (rozcieńczonej 1:10 w PBS) i użyj tej końcówki do oczyszczenia powierzchni skóry. Powtórz tę procedurę dwukrotnie.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela (lub nożyczek) wykonaj pełne nacięcie skóry od 0,5 do 0,7 cm od przodu do tyłu. Za pomocą kleszczy wprowadzonych pod tkankę podskórną wykonaj kieszonkę.</li>
	<li>Włóż rusztowanie podskórnie, upewniając się, że jest umieszczone głęboko w kieszeni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G i H). Zamknij nacięcie klejem chirurgicznym (<silna klasa="xfig">Ryc. 1I i J).</li>
	<li>W leczeniu bólu pooperacyjnego należy podawać podskórnie buprenorfinę (0,1 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Podczas rekonwalescencji umieść zwierzę na boku we wstępnie ogrzanej klatce i monitoruj powrót do zdrowia, aż do zaobserwowania normalnego zachowania.</li>
	<li>Rozcieńczyć leki przeciwbólowe w wodzie (karprofen, 0,1 mg/ml wody) i podawać zwierzętom jako wodę pitną przez 4 dni po zabiegu.</li>
	<li>Często sprawdzaj zwierzę i ranę w ciągu 48 godzin po operacji pod kątem możliwych działań niepożądanych.</li>
</ol>
3. Leczenie myszy, eutanazja i pobieranie próbek do obrazowania
UWAGA: Analiza rusztowań jest wykonywana między 8 a 24 tygodniem po implantacji.
<ol>
	<li>60 minut przed obrazowaniem należy utrzymać wszczepioną mysz w cieple w pomieszczeniu grzewczym w temperaturze 37 °C i podać dożylnie 100 μl ludzkiej immunoglobuliny w celu zablokowania niespecyficznych miejsc.</li>
	<li>30 minut przed obrazowaniem należy podać dożylnie 10 μg (na mysz) specyficznych przeciwciał w celu oznaczenia interesujących komórek.</li>
	<li>5 minut przed obrazowaniem podać dożylnie 15 μl (rozcieńczonych w 100 μl PBS) znakowanego fluoroforem środka do gromadzenia naczyń krwionośnych 655 nm (655-VPA) w celu uwidocznienia struktur naczyniowych.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj podłużne nacięcie skóry z tyłu myszy, w pobliżu pierwotnego miejsca implantacji.</li>
	<li>Za pomocą pęsety i nożyczek ostrożnie oddziel skórę od kieszonki podskórnej, w którą wszczepiono rusztowanie.</li>
	<li>Przytrzymaj rusztowanie pęsetą i delikatnie usuń je ze skóry, przecinając resztki błony i tkanki otaczającej rusztowanie za pomocą nożyczek. Zobacz przykłady rusztowań do odzyskania w Rysunek 2.</li>
	<li>Przymocuj rusztowanie za pomocą szybko działającego kleju samoprzylepnego do płytki obrazowej (szalka Petriego 35 mm x 10 mm) i napełnij roztworem soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W przypadku rusztowań BMP, przed wypełnieniem płytki PBS, należy użyć mikrowiertła chirurgicznego, aby rozrzedzić powierzchnię kości pod mikroskopem mikrochirurgicznym; umożliwia to wizualizację fluoroforu i uchwycenie obrazu w wysokiej rozdzielczości. Użyj zadziorów o średnicy 1,2 lub 1,6 mm, w zależności od rozmiaru rusztowania. 
	UWAGA: Użytkownik zda sobie sprawę, ile należy wiercić w zależności od grubości kości. Ogólnie rzecz biorąc, gdy rusztowania BMP są unaczynione, kość nieznacznie zmieni kolor i stanie się bardziej czerwona, gdy zbliży się do odpowiedniej grubości do obrazowania.</li>
	<li>Włóż płytkę na stolik mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo za pomocą mikroskopii dwufotonowej
UWAGA: Podczas korzystania z detektorów NDD, zawsze używaj suwaka NDD do obrazowania, aby skierować fluorescencję do NDD. Konfiguracja mikroskopu jest przedstawiona w Rysunek 3.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop i komputer, uruchom oprogramowanie, klikając "Uruchom system" i przejdź do trybu "Akwizycja".</li>
	<li>Zaznacz pole "Pokaż narzędzia ręczne". W menu "Laser" włącz laser dwufotonowy i pozwól mu się rozgrzać i ustabilizować.</li>
	<li>W menu "Ustawienia obrazowania" aktywuj jednocześnie "Tryb kanałów" i "Przełącz ścieżkę co klatkę". W menu "Ścieżka światła" wybierz "Non Descanned" i "Main Beam Splitter MBS 760+". Zaznacz, aby aktywować cztery NDD i ustawić konfigurację zgodnie z ilustracją w Rysunek 3. 
UWAGA: Przy tej konfiguracji sygnał kolagenowy ze struktur kostnych (generacja drugiej harmonicznej, SHG) jest zbierany przy 380 - 485 nm, ludzkich komórkach śródbłonka FITC-hCD31+ i ludzkich komórkach krwiotwórczych AF488-hCD45+ przy 500-550 nm i 655-VPA przy 640 - 690 nm.</li>
	<li>W menu "Kanały" ustaw "długość fali lasera" na 890 nm, a moc na 50%. Ustaw "Wzmocnienie (Master)" na 500-600, "Digital Offset" na 0, a "Digital Gain" na 15 dla każdego kanału. Dostosuj te wartości po rozpoczęciu pobierania.</li>
	<li>W "Trybie akwizycji" ustaw wymagane parametry, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości bez uszkadzania tkanki i wybielania fluoroforów. Ustaw "Tryb skanowania" na "Ramka", "Rozmiar ramki" na "x512 y512", Krok linii" na 1, "Prędkość" na 9, "Liczba uśredniania" na 8, "Głębia bitowa" na "8 bitów", "Tryb" na "linia", "Kierunek" na "dwukierunkowy", " i "Metoda" na "średnia".
	<ol>
		<li>Ustaw "Zoom" na 1 dla początkowego skanowania obrazu i zwiększ go, jeśli jest to wymagane, aby ustawić ostrość na określonych obszarach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść płytkę zawierającą rusztowanie na stoliku mikroskopu pod soczewką zanurzeniową 20X, 1.0 NA i opuść soczewkę, aż dotknie roztworu soli fizjologicznej. Ustaw ostrość soczewki na rusztowaniu za pomocą okularów mikroskopu, używając lampy jako źródła światła.</li>
	<li>Aktywuj menu "Z-stack", wybierz funkcję "First/Last" i ustaw żądany interwał między dwoma podsekwencyjnymi plasterkami (np. 2-μm Z-stack). Utrzymuj stałe interwały w stosie Z.</li>
	<li>Wybierz "Na żywo", aby zobrazować skan próbki na żywo i dostosuj "Wzmocnienie cyfrowe" i "Przesunięcie cyfrowe" w celu uzyskania optymalnej ekspozycji. Aby wyświetlić wiele kanałów w tym samym czasie, wybierz funkcję "Split".</li>
	<li>W menu "Stage", w trybie "Live", zeskanuj obraz i "Oznacz" obszary zainteresowania (ROI), takie jak lokalizacja ludzkich komórek krwiotwórczych i struktur naczyniowych. Po zakończeniu skanowania próbki przejdź do pierwszego zwrotu z inwestycji, aby rozpocząć obrazowanie.</li>
	<li>W trybie "Na żywo" ustaw górną i dolną część stosu Z 3D otaczającego obszar zainteresowania za pomocą funkcji "Ustaw najpierw" i "Ustaw ostatni". Po zakończeniu ustaw środek na "C". Rozpocznij pozyskiwanie ROI za pomocą przycisku "rozpocznij eksperyment". Zobacz przykłady obrazów w Rysunek 4, Rysunek 5 i Rysunek 6.</li>
	<li>Po zakończeniu akwizycji zapisz obraz w wyznaczonym folderze. Przejdź do następnego zwrotu z inwestycji i powtórz krok 4.10. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij płytkę obrazową z mikroskopu, ostrożnie odłącz próbkę od płytki i wyczyść resztki kleju.</li>
	<li>Przygotować próbkę do następnej techniki analizy.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie próbek do badań histologicznych i immunologicznych
UWAGA: Próbki są przetwarzane zgodnie z protokołem opisanym w ogólnych technikach laboratoryjnych JoVE54 opisującym procesy utrwalania, osadzania i cięcia próbek. Próbki kościotwórcze należy poddawać działaniu środka odwapniającego na bazie EDTA przez 7 dni pomiędzy procesem utrwalania i zatapiania. Roztwór blokujący/przepuszczalny to 10 mM bufor PBS pH 7,4 z 1% Triton X-100, 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 10% normalną surowicą kozią (NGS).
<ol>
	<li>Plastry włożyć do ksylenu na 10 min), ksylenu na 5 min, 100% etanolu na 5 min, 70% etanolu na 5 min, 50% etanolu na 5 min iH2Ona 5 min.</li>
	<li>Przenieś plastry do roztworu roboczego demaskującego antygen na bazie cytrynianu.</li>
	<li>Gotuj plastry przez 15 minut i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umyj plastry w 10 mM roztworze PBS o pH 7,4 z 1% Triton X-100 (5 min, 3 razy).</li>
	<li>Przenieść próbki do roztworu blokującego/przepuszczalnego i inkubować przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym/przepuszczalnym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj plastry w 10 mM roztworze PBS o pH 7,4 z 1% Triton X-100 (5 min, 3 razy).</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym/permeabilizacyjnym przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć za pomocą H2O (5 min, 3 razy).</li>
	<li>Aby zmniejszyć fluorescencję tła, zanurz plastry w roztworze roboczym Sudan Black na 10 minut, w ciemności i w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj plastry w H2O(5 min, 3 razy).</li>
	<li>Plastry należy umocować za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego z DAPI (0,5 μg/ml).</li>
	<li>Przechowywać plastry w temperaturze 4 °C i sprawdzić, czy podłoże montażowe jest suche przed przystąpieniem do obrazowania fluorescencyjnego. Zobacz przykładowe obrazy w Rysunek 7.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod:
W tym protokole opisaliśmy metodę generowania różnych humanizowanych mikrośrodowisk u myszy i wizualizacji ich architektury za pomocą mikroskopii dwufotonowej i histologii. Dostarczone reprezentatywne dane pokazują wykonalność tego podejścia, wykorzystującego różne komórki zrębu do inżynierii humanizowanych tkanek. Protokół ma specyficzne zastosowania w badaniu ludzkich komórek krwiotwórczych i komórek pochodzących z niszy szpiku kostnego w warunkach normalnych i patologicznych. Zastosowania te obejmują badanie ewolucji klonów, badania przesiewowe leków i przesłuchy między ludzkimi HSC a komponentami zrębu. W rozwijającej się dziedzinie inżynierii tkankowej zaproponowano kilka alternatywnych podejść. Podejścia godne uwagi obejmują rozwój humanizowanych struktur BM 3D in vitro 55,56,57,58,59,60,61,62,63 oraz ortotopowy przeszczep humanizowanych rusztowań BM u myszy64. Nasze podejście ma tę zaletę, że łączy w sobie zarówno złożoność systemu in vivo, jak i łatwą dostępność anatomiczną humanizowanego przeszczepu tkankowego.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:
Źródłem zmienności w tym protokole może być wybór komórek używanych do zasiewania rusztowań. W naszej pracy wykorzystaliśmy hMSC pochodzące od BM. Jednak komórki mezenchymalne można uzyskać z kilku tkanek, które mogą wykazywać charakterystyczne właściwości w zależności od pochodzenia. W związku z tym można rozważyć zastosowanie hMSC pochodzących z różnych narządów. Jednak ich zdolność do tworzenia tkanki kostnej in vivo powinna zostać przetestowana przed zastosowaniem w tym protokole. Protokół ten wykorzystuje komercyjnie dostępne źródło ludzkich komórek śródbłonka (tj. HUVEC transdukowany przez E4ORF1). Ostatnio odnotowano wykorzystanie komórek śródbłonka specyficznych dla narządów do różnych celów65,66. Co więcej, zastosowanie pierwotnych heC pochodzących z BM może stanowić interesujące ulepszenie protokołu. W związku z tym stosowanie różnych źródeł komórek śródbłonka może dawać różne wyniki in vivo.
Użyliśmy myszy biorców NSG z obniżoną odpornością, aby sprzyjać implantacji humanizowanych rusztowań i uniknąć odrzucenia tkanki. Nie wykluczamy możliwości wykorzystania tego protokołu do inżynierii ektopowych tkanek szpiku kostnego w innych szczepach myszy. Rzeczywiście, rhBMP-2 może indukować tworzenie kości w różnych modelach ssaków 47,48,49,50,52. Jednak różnice w żywotności komórek i długotrwałym przeszczepie mogą być obserwowane przy użyciu różnych szczepów/modeli.
Czas odzyskiwania rusztowania może być również elastyczny, w zależności od ostatecznego celu eksperymentu. W przedstawionym protokole pobieramy próbki po 8 - 12 tygodniach od implantacji w celu oceny długotrwałego wszczepienia krwiotwórczego. Aby zbadać wczesne etapy tworzenia się niszy BM u człowieka (np. tworzenie tkanki kostno-chrzęstnej47 lub rozwój naczyniowy), można wybrać różne punkty czasowe.
Technika obrazowania na żywo, którą opisaliśmy w tym protokole, jest wskazana do krótkotrwałego obrazowania eksplantatów. W przypadku długotrwałego obrazowania, takiego jak badanie zachowań motorycznych, należy rozważyć zastosowanie komory równowagi w celu utrzymania temperatury fizjologicznej, napięcia tlenu i stężenia CO2 .
Kluczowe kroki w ramach Protokołu:
Wśród wyzwań związanych z protokołem zwrócilibyśmy uwagę na umiejętności techniczne wymagane do wykonania niektórych kroków. Komórki mezenchymalne i śródbłonka powinny być używane przy niskich liczbach pasaży komórkowych; W przeciwnym razie nie będą w stanie wspierać wszczepiania ludzkich komórek krwiotwórczych in vivo ani uczestniczyć w tworzeniu naczyń krwiotwórczych de novo i kości in vivo. Zalecamy stosowanie hMSC i hEC w przejściach 1 - 5. Etapy przygotowania rusztowania i wysiewu komórek wymagają podstawowych umiejętności w zakresie hodowli komórkowych oraz wiedzy na temat właściwości konkretnych komórek wykorzystywanych w procedurze. Protokół chirurgiczny jest dość prosty, ale wymaga pewnej praktyki. Utrzymanie aseptycznego środowiska w celu uniknięcia zanieczyszczenia wszczepionych rusztowań u myszy z niedoborem odporności ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia powodzenia eksperymentu. Eksplantat próbki i obrazowanie na żywo wymagają praktyki chirurgicznej (zwłaszcza w przypadku użycia mikrowiertła) i znajomości systemu mikroskopowego. Wreszcie, przetwarzanie próbek i histologia wymagają podstawowej wiedzy na temat technik, które mają być stosowane.
Ograniczenia techniki:
Opisywane przez nas podejście pozwala na wizualizację żywych ludzkich komórek krwiotwórczych zasiewających humanizowane mikrośrodowisko szpiku kostnego, z ludzkimi komórkami śródbłonka tworzącymi struktury naczyniowe i komórkami mezenchymalnymi tworzącymi przestrzeń kości/szpiku kostnego. Ponieważ tkanka jest formowana in vivo, końcowe zmodyfikowane rusztowanie nadal będzie chimeryczne (ludzkie i mysie). Kwestię tę należy wziąć pod uwagę, ponieważ tkanka chimeryczna może nie w pełni naśladować złożoność ludzkiego szpiku kostnego i środowisko.
Wszczepiane rusztowania mają ograniczony rozmiar (próbowaliśmy maksymalnie 6,6 x 7,5 x 7 mm), a zatem są w stanie pomieścić ograniczoną liczbę komórek do ksenotransplantacji. Ograniczona będzie również bezwzględna liczba odzyskanych komórek; W związku z tym liczba wszczepionych rusztowań powinna być obliczana jako funkcja liczby komórek wymaganych do eksperymentu.
Opisana przez nas aplikacja do obrazowania jest szczególnie przydatna do obserwacji dużych obszarów żywych tkanek na głębokości 150-200 μm od powierzchni bez naruszania architektury i uszkadzania komórek. W związku z tym nie pozwala na wizualizację całego rusztowania. Jeśli wymagane jest pełne skanowanie tkanki, bardziej odpowiednie byłyby standardowe metody immunofluorescencji.
Przyszłe aplikacje:
Przyszłym kierunkiem tego bioinżynieryjnego modelu byłoby zwiększenie złożoności ludzkich komponentów w tkance. Wiedza i charakterystyka ludzkiej niszy BM poczyniła postępy w ostatnich latach67 , a opisany protokół może być interesującą platformą do badania funkcji tych nowych składników komórkowych i rozpuszczalnych czynników, a także ich roli we wspieraniu normalnych/złośliwych HSC.
Co więcej, technika obrazowania zapewnia potencjał obrazowania przyżyciowego rusztowań w badaniach podłużnych, co wymagałoby ulepszeń technicznych w obrazowaniu rusztowań u żywych, znieczulonych myszy, z rekonwalescencją po operacji. Takie podejście wymagałoby dodatkowych kroków i jest obecnie badane w laboratorium.

Decyzje dotyczące losu komórek obserwowane w komórkach macierzystych są ściśle regulowane zarówno przez czynniki wewnętrzne, jak i zewnętrzne. W szczególności powszechnie uznaje się, że mikrośrodowisko BM odgrywa fundamentalną rolę w kontrolowaniu przełączania HSC ze stanu spoczynku do stanu aktywnego, a także w podejmowaniu decyzji o ich samoodnawianiu się lub różnicowaniu losu1. Co więcej, ostatnie odkrycia wskazują, że nowotwory hematologiczne wpływają na funkcjonowanie mikrośrodowiska BM, co wskazuje na istnienie aktywnego przesłuchu między dwoma przedziałami2,3,4,5,6. Pomimo ostatnich postępów, pozostaje wiele kluczowych pytań dotyczących tego, w jaki sposób aktywność określonych komponentów niszowych BM przyczynia się do zachowania HSC i złośliwej transformacji.
Mikrośrodowisko BM jest wysoce heterogeniczną i złożoną mieszaniną wielu różnych typów komórek, z których każda ma wyspecjalizowane funkcje. Obfity śródbłonek (EC) i składnik naczyniowy regulują obrót składników odżywczych i metabolitów, wchodzenie i wychodzenie różnych komórek do i z BM oraz kilka funkcji HSC7,8. Mezenchymalne komórki zrębu (MSC), niejednorodna populacja niezróżnicowanych komórek macierzystych i progenitorów zaangażowanych przez trzy różne linie (tj. osteogenną, chondrogeniczną, adipogenną), są kolejnym podstawowym składnikiem niszy BM. Te MSCs lokalizują się zarówno w centralnych obszarach BM, jak i w pobliżu regionu śródkostnego. Mogą być związane ze strukturami naczyniowymi i są zaangażowane w regulację funkcji HSC9,10,11,12,13,14,15.
Wiele raportów sugeruje, że HSC znajdują się w różnych zdefiniowanych miejscach w szpiku kostnym i że ich funkcja może zależeć od ich dokładnej lokalizacji. Większość obecnej wiedzy na temat HSC i ich interakcji z mikrośrodowiskiem BM pochodzi z badań na myszach1. Zastosowanie modeli ksenoprzeszczepów rozszerzyło tę wiedzę na ludzkie normalne i złośliwe HSC, wszczepiając się w mysi BM myszy z niedoborem odporności16,17,18,19,20. Chociaż jest to prawidłowy model, nadal wiąże się z wieloma wyzwaniami, takimi jak konieczność kondycjonowania myszy biorcy w większości przypadków, aby umożliwić naprowadzanie i wszczepienie ludzkiego HSC lub bariera międzygatunkowa i jej słabo poznany wpływ na interakcje i funkcje komórka-komórka.
Użycie przeciwciał neutralizujących i genetycznie modyfikowanych myszy, wraz z ksenotransplantacją, odegrało kluczową rolę w podkreśleniu złożonego dialogu, jaki ludzkie HSC nawiązują ze swoimi mikrośrodowiskami. Wprowadzenie i rozwój dwufotonowej mikroskopii konfokalnej w trybie przyżyciowym posunęło te badania o krok naprzód, umożliwiając bezpośrednie, dynamiczne obrazowanie szpiku kostnego w wysokiej rozdzielczości19,20,21,22 i zapewnia potężne narzędzie do funkcjonalnej charakterystyki mikrośrodowiska BM i jego roli w regulacji funkcji HSC. W celu obejścia niektórych problemów pojawiających się w klasycznych modelach ksenotransplantacji, na pierwszy plan wysunęła się koncepcja inżynierii humanizowanej struktury BM. Łącząc biomateriały i koncepcje implantacji komórek, raporty wykazały możliwość naśladowania mikrośrodowiska ludzkiego szpiku kostnego w regionach heterotopowych23,24,25,26,27. Otwiera to możliwość wykorzystania bioinżynierii w modelach mysich do badania prawidłowej i złośliwej hematopoezy u ludzi28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, nowotworzenie i przerzuty40,41,42,43,44.
Na podstawie wcześniejszych doświadczeń w inżynierii tkanki kostnej i obrazowaniu in vivo19,22,45,46,47,48,49,50,51,52, opisujemy protokół do bioinżynierii i organotypowego obrazu na żywo ludzkich tkanek BM. Struktury te pochodzą z implantacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z BM do rusztowań na bazie kolagenu przeszczepionych podskórnie u myszy z niedoborem odporności. W poprzednim raporcie wykazaliśmy, że ludzkie MSCs zapewniają tworzenie ludzkiego mikrośrodowiska odpowiedniego do wszczepienia ludzkich komórek krwiotwórczych45. Ponadto w tym miejscu opisujemy, w jaki sposób koimplantacja innych ludzkich składników komórkowych BM, takich jak ludzkie komórki śródbłonka (hEC) i/lub cytokiny ważne dla tworzenia kości (np. hBMP2), współpracują z hMSC w celu wytworzenia różnych humanizowanych mikrośrodowisk, które można obrazować na żywo in situ.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Ge Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Cd34 pozytywna selekcja Zestaw</td><td>Stemcell</td><td>18056</td><td>Przechowywać 4&deg;C.</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD3, klon OKT-3</td><td>Bioxcell</td><td>BE0001-2</td><td>Przechowywać w temperaturze 4&stopieC. Stosowany do zubożenia limfocytów T w pierwotnych próbkach AML.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytokiny (IL3, G-CSF i TPO)</td><td>PeproTech</td><td>200-03, 300-23 i 300-18</td><td>Do przygotowania zapasu: Rozcieńczyć każdą z cytokin w 100 &mu; L wody i wymieszaj je. Dodaj 200 &mu; L, do alicuots 45 &mu; L i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Technologie DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life</td><td>10270106</td><td>Inaktywacja termiczna przy 56 stopniach; C przez 30 minut, zrób porcje i zamroź. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>MEM-&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>32571-028</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ciepło w temperaturze 37 stopni Celsjusza. C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Myelocult H5100</td><td>corning</td><td>5100</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>199</td><td>Gibco</td><td>41150-020</td><td>Przechowywać w 4 & st; C. Ciepło w 37 & st.; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>hMSC-FBS, Inaktywowany termicznie</td><td>Gibco</td><td>12662-029</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & st. C. Ciepły w 37 & st; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Ciepło w temperaturze 37 stopni Celsjusza. C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>Rozcieńczyć w pożywce hodowlanej i użyć filtra 0,22 mm.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1558-50ML</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kolagen 1 powlekana płytka do hodowli komórkowej</td><td>corning</td><td>354505</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25200056</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 °C. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>hMSC</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Alternatywnie, hMSC jesteśmy również uprzejmie dostarczyli Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) z ludzkiego szpiku kostnego uzyskanego podczas operacji ortopedycznej na podstawie zgody etycznej 10-038 z IRB00006477.&nbsp;</td></tr><tr><td>VeraVec HUVEC śródbłonek</td><td>Angiocrine biologia</td><td>hVera101</td><td>Alternatywnie można użyć innego źródła ludzkich komórek śródbłonka.</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki</td><td></td><td></td> krwiotwórcze <td>Próbki krwi pępowinowej lub pierwotnej ostrej białaczki szpikowej (AML) uzyskano z Royal London Hospital (Londyn, Wielka Brytania) po uzyskaniu świadomej zgody i zatwierdzeniu protokołu użycia przez Komitet Etyczny Wschodniego Londynu i przeprowadzeniu zgodnie z Deklaracją Helsińską.</td></tr><tr><td>Pianka żelowa, rozmiar 12 - 7 mm</td><td>Pfizer</td><td>00009-0315-08</td><td>Alternatywny dostawca: Febelco</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Materiał chirurgiczny</td><td>Wiele</td><td></td><td>sterylnych kleszczy, pęset i ostre nożyczki.</td></tr><tr><td>Chusteczki</td><td></td><td></td> sterylne <td>Chusteczki papierowe sterylizowane termicznie.</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka z igłą 25G</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe o ultra niskim nasadce</td><td>Corning</td><td>3473 lub 3471</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Noricum</td><td>rhBMP-2</td><td>Rozcieńczyć w 5 mg/ml w kwasie octowym 50 mM i przechowywać w temperaturze 4 °C.</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma</td><td>T8885</td><td>Rozcieńczyć w CaCl2 2%, 500 ml na fiolkę i przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td>Rozcieńczyć w stężeniu 4 mg/100 ml w PBS. Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Przed użyciem rozgrzać się.</td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowych 35 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>U-Botton 96-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>myszy NSG</td><td>Myszy Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NSG były miłym prezentem od dr Leonarda Shultza (The Jackson Laboratory).</td></tr><tr><td>Chlorheksydyna</td><td>G9</td><td></td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:10 przed użyciem</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl</td><td>5 mg/kg myszy</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Alstoe</td><td>Vetergesic</td><td>0,1 mg/kg masy ciała myszy</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>Indukcja znieczulenia 2%, utrzymanie 1%</td></tr><tr><td>Trymer</td><td>Wella</td><td>Contura HS61</td><td></td></tr><tr><td>Klej chirurgiczny</td><td>3M</td><td>Vetbond</td><td></td></tr><tr><td>karbomer (kwas poliakrylowy) jako żel okulistyczny</td><td>Novartis</td><td>Viscotears Liquid Gel</td><td></td></tr><tr><td>Human Normal Immunoglobulin</td><td>Gammaplex</td><td>10g fiolka</td><td>100 ml / mysz dożylnie, 30 minut przed infuzją specyficznego przeciwciała.</td></tr><tr><td>NT-QTracker</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>Agent poolingu statków. Podawać 15 ml / mysz dożylnie 5 minut przed obrazowaniem.</td></tr><tr><td>AF488-hCD45</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>100 ml / mysz dożylnie, 30 minut przed obrazowaniem.</td></tr><tr><td>FITC-hCD31</td><td>BD Pharmigen</td><td>555445</td><td>100 ml / mysz dożylnie, 30 minut przed obrazowaniem.</td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Loctite</td><td>Super Glue</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Drill Kit</td><td>IDEALNY - Fisher Scientific</td><td>NC9010016</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> mikrochirurgiczny <td>Nie jest zalecana żadna konkretna marka/firma.</td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Pionowy mikroskop konfokalny z zmotoryzowanym stolikiem, laserem dwufotonowym i soczewką zanurzeniową 20X 1.0 NA. Alternatywnie można użyć mikroskopu o podobnych parametrach.</td></tr><tr><td>MaiTai " Wysoka wydajność" w pełni zautomatyzowany 1-skrzynkowy laser Ti:Sapphire 1-box 517 z blokadą trybu z kompensacją dyspersji DeepSee</td> Roztwór formaliny <td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>buforowany neutralnie, 10%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32294</td><td></td></tr><tr><td>Osteosoft</td><td>Millipore</td><td>1.01728.1000</td><td></td></tr><tr><td>Plastry polisynowe</td><td>Thermo scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do demaskowania antygenu</td><td>Vector</td><td>H-3300</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć w stosunku 1:100 w H2O do roztworu roboczego.</td></tr><tr><td>Triton 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A96470</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & C.</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Endomucyna Przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-65495</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko hVimentin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Przeciwciało hCD31</td><td>DAKO</td><td>M0823</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & C.</td></tr><tr><td>Przeciwciało hCD45</td><td>DAKO</td><td>M0701</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>Przeciwciała ADRP (Perilipin2)</td><td>-online</td><td>ABIN283918</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni C.</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała wtórne przeciwko mysim</td><td>Invitrogen</td><td>A11029 lub A11005</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała drugorzędowe przeciwko królikowi</td><td>Invitrogen</td><td>A11037 lub A11008</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała drugorzędowe anty szczurze</td><td>Invitrogen</td><td>A11007 lub A21247</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma</td><td>S2380</td><td>Przygotuj zapas 1% sudan black w etanolu 70%. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór roboczy 0,1% sudan black w etanolu 70% i przed użyciem przefiltrować za pomocą bibuły filtracyjnej.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>Przygotować zapas w H20 w stężeniu 100 mg/mg. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne media montażowe</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dodaj DAPI przed użyciem (1:400 z magazynu DAPI).</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>VWR</td><td>631-0147</td><td></td></tr></tbody></table>

bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) znajdują się w niszy szpiku kostnego (BM), skomplikowanej, wieloczynnikowej sieci składników wytwarzających cytokiny, czynniki wzrostu i macierz zewnątrzkomórkową. Zdolność HSC do pozostawania w stanie spoczynku, samoodnawiania się lub różnicowania oraz nabywania mutacji i stawania się złośliwymi zależy od złożonych interakcji, które ustanawiają z różnymi składnikami zrębu. Aby zaobserwować wzajemne oddziaływanie między ludzkimi HSC a ludzką niszą BM w warunkach fizjologicznych i patologicznych, zaprojektowaliśmy protokół ektopowego modelowania i obrazowania humanizowanej niszy BM u myszy z niedoborem odporności. Pokazujemy, że zastosowanie różnych składników komórkowych pozwala na tworzenie humanizowanych struktur i możliwość utrzymania długotrwałego wszczepienia krwi człowieka. Korzystając z mikroskopii dwufotonowej, możemy obrazować te struktury na żywo in situ w rozdzielczości pojedynczej komórki, dostarczając potężnego nowego narzędzia do funkcjonalnej charakterystyki mikrośrodowiska ludzkiego BM i jego roli w regulacji prawidłowej i złośliwej hematopoezy.

Na Rysunku 1 przedstawiono reprezentatywne obrazy procesów zasiewania komórek na rusztowaniu oraz jego implantacji. Na Rysunku 1C należy zwrócić uwagę, że komórki są wstrzykiwane bezpośrednio do rusztowania. Na Rysunku 1G widać nacięcie na grzbiecie myszy, w którym utworzono kieszeń podskórną i zaimplantowano rusztowanie. Rysunek 2 przedstawia morfologię makroskopową różnych rusztowań zaimplantowanych u myszy NSG i pobranych po 8 tygodniach. Należy zauważyć lekką unaczynienie w rusztowaniach zasiewanych hMSC (Rysunek 2A). Współzasiewanie ludzkich EC z hMSC w rusztowaniu umożliwia powstanie bardziej funkcjonalnego unaczynienia w rusztowaniach (Rysunek 2B). Wreszcie, obecność rhBMP-2 indukuje kostnienie. W tym przypadku pobrane rusztowania są większe i składają się z twardej tkanki przypominającej kość.
Rysunek 3 przedstawia konfigurację kanałów mikroskopu do obrazowania na żywo z użyciem NDD (szczegóły w legendzie do rysunku). Rysunek 4 oraz Wideo 1 przedstawiają ludzkie komórki krwiotwórcze w rusztowaniach pokrytych hMSC. Rusztowania wyeksplantowano 8 tygodni po implantacji, po dożylnym podaniu przeciwciała AF48-hCD45 oraz 655-VPA. Procedura ta umożliwia wizualizację wszczepionych ludzkich komórek krwiotwórczych oraz struktury naczyniowej za pomocą dwufotonowej mikroskopii konfokalnej. W tym przypadku obrazy pokazują naczynia krwionośne (65-VPA) w rusztowaniach oraz długoterminowe przyjęcie ludzkich komórek krwiotwórczych (AF48-hCD45) w miąższu rusztowania. Rysunek 5 oraz Wideo 2 dotyczą ludzkich rusztowań zasianych hECs i hMSCs. 8 tygodni po zabiegu rusztowania wyeksplantowano po dożylnym podaniu przeciwciała FITC-hCD31 oraz 65-VPA, a obrazy pozyskano za pomocą dwufotonowego mikroskopu konfokalnego, jak wspomniano wcześniej. Obrazy pokazują udział hECs w tworzeniu naczyń w rusztowaniu, co skutkuje powstaniem mysio-ludzkiej chimerycznej sieci naczyniowej.
Rysunek 6A przedstawia reprezentatywne dane dotyczące podejścia zastosowanego w celu stymulacji tworzenia kości w rusztowaniach z MSC. Podobnie jak na poprzednich rysunkach, 8 tygodni po implantacji przeprowadzono dożylną inokulację 65-VPA, wyjęto rusztowania i wykonano obrazy za pomocą dwufotonowej mikroskopii konfokalnej. Rusztowania stymulowane rhBMP-2 indukują tworzenie tkanki kostnej, którą można było zwizualizować dzięki SHG (kolor cyjan na obrazach) generowanemu przez wapń w kości. Przedstawione obrazy pokazują również tworzenie się jam oraz unaczynionej tkanki endostealnej, która wykazuje duże podobieństwo do tkanki endostealnej szpiku kostnego. Na Rysunku 6B oraz w Wideo 3 hECs zostały implantowane wspólnie z hMSCs. Rusztowania wyjęto po dożylnej inokulacji przeciwciałami FITC-hCD31 oraz 655-VPA, a obrazy z dwufotonowej mikroskopii konfokalnej wykazują udział hECs w neowaskularyzacji w rusztowaniu tworzącym kość.
Rysunek 7 przedstawia reprezentatywne obrazy histologiczne, będące wynikiem procedury wykonanej w celu potwierdzenia wcześniej opisanych rezultatów. Obrazy immunofluorescencyjne ukazują naczynia krwionośne myszy, hECs, hMSCs oraz długoterminowo przeszczepione ludzkie komórki krwiotwórcze w strukturach rusztowania. Rusztowania wyjęte z myszy zostały utrwalone i poddane immunofluorescencji. W rusztowaniach kostwotwórczych z nośnikiem rhBMP-2 (Rysunek 7D-F>) należy zwrócić uwagę na morfologię tkanki, przypominającą dojrzały szpik kostny z tkanką tłuszczową. W tym kostwotwórczym rusztowaniu wykazano, że hMSCs są fibroblastami, co wskazuje na ich udział w tworzeniu nowej tkanki jako komórek stropmalnych. Wykazano również ekspresję markerów ludzkich adypocytów, co sugeruje, że hMSCs przyczyniają się także do tworzenia tkanki tłuszczowej.
<img alt="Proces inżynierii tkankowej; przygotowanie rusztowania i hodowla komórkowa; etapy eksperymentu w warunkach laboratoryjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywne obrazy procesów wysiewania komórek i implantacji. A) Pierwotny rusztowanie oraz metoda jego wycinania za pomocą skalpela. B) 24 fragmenty uzyskane z początkowego rusztowania. C) Metoda zasiewania komórek na rusztowaniu przy użyciu strzykawki. D) Rusztowania zasiane komórkami z pożywką hodowlaną, gotowe do implantacji. E-F) Szczegółowe kroki przygotowania rusztowań kostnotwórczych: E) rusztowanie przenoszone do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U i F) reprezentatywny obraz metody stosowanej do dodania rhBMP2, trombiny i fibrynogenu do rusztowania. G-J) Procedura chirurgicznej implantacji w znieczuleniu ogólnym: G) wykonanie rany w skórze i implantacja rusztowania, H) metoda implantacji oraz I-J) procedura zamykania rany z użyciem kleju chirurgicznego. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Porównanie rusztowań do inżynierii tkankowej, MSC, MSC+EC, MSC+EC+BMP2, wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Różne rusztowania odzyskane z myszy. Reprezentatywne obrazy rusztowań MSC (lewo), rusztowań MSC+EC (środek) oraz rusztowań MSC+EC+BMP (prawo). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat optyczny mikroskopu z analizą widm emisji dla obrazowania fluorescencyjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Konfiguracja kanałów. Przedstawiono konfigurację filtrów mikroskopu. A) Znajdują się cztery moduły detektora NDD: w pierwszym module znajdują się dwie kostki filtrujące; drugi i trzeci moduły posiadają po jednej kostce filtrującej; natomiast ostatni moduł nie posiada kostki (nie jest używany). Pierwsza fotopowielacz (PMT) służy do kanału dalekiej czerwieni (640–690 nm), odbijając niższe długości fal; kolejne to 380–485 nm, 50–50 nm oraz 55–625 nm (kolejność zawsze prowadzi od niższych do wyższych długości fal). B) Emisje fluoroforów wykrywalne przy powyższych konfiguracjach (oznaczone kolorami). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, znakowanie komórek, AF48-hCD45, 65-VPA, obraz złożony, analiza immunofluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Rusztowania z MSC umożliwiają tworzenie niszy dla ludzkich komórek krwiotwórczych. A) i B) Rekonstrukcje 3D stosów Z (Z-stacks) wykonane po wyjęciu eksplantatu, po dożylnym podaniu AF48-hCD45 (zielony) w celu znakowania ludzkich komórek krwiotwórczych oraz 655-VPA (magenta) w celu znakowania naczyń krwionośnych. Paski skali oznaczają 20 µm w A i B (panele górne) oraz 5 µm w B (panele dolne). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający strukturę komórki, z zaznaczoną lokalizacją białek, analiza komórkowa." src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo 1"> 
Wideo 1. Rusztowania z MSC umożliwiają tworzenie niszy dla ludzkich komórek krwiotwórczychRekonstrukcja 3D ludzkich komórek krwiotwórczych (AF488-hCD45) związanych z układem naczyniowym (65-VPA) w rusztowaniu z MSC (struktury kolagenowe: SHG, kolor cyjan). Każdy stos ma wymiary 140 x 140 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, FITC-hCD31 i VPA-65, struktura komórkowa, obraz mikroskopowy, znakowanie białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Ludzkie komórki śródbłonka uczestniczą w tworzeniu unaczynienia o charakterze ludzkim w rusztowaniach z MSC. Rekonstrukcja 3D układu naczyniowego (65-VPA) wyścielonego komórkami śródbłonka pochodzenia ludzkiego (FITC-hCD31) w rusztowaniach MSC+EC. Paski skali oznaczają 20 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; struktura tkanki wykazująca czerwony i zielony wzór barwienia do analizy komórkowej." src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo 2"> 
Wideo 2. Ludzkie komórki śródbłonka uczestniczą w tworzeniu unaczynienia typu humanizowanego w rusztowaniach z MSC. Rekonstrukcja 3D ludzkich EC (FITC-hCD31) wyściełających naczynia krwionośne (655-VPA) w rusztowaniach MSC+EC. Każdy stos mierzy 240 x 240 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj w celu wyświetlenia tego filmu. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa tkanek z wykorzystaniem SHG, znakowania FITC-cd31 oraz wizualizacji fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6. Rusztowania nośne rhBMP-2 wykazują powierzchnie kostne i unaczynienie zhumanizowane podobne do szpiku kostnego. A) Rekonstrukcja 3D rusztowań MSC+BMP pokazująca tworzenie struktur kostnych (SHG-cyjan) i naczyń krwionośnych (655-VPA). Paski skali oznaczają 100 µm (lewo), 70 µm (środek), oraz 50 µm (prawo). B) Rekonstrukcja 3D rusztowań MSC+EC+BMP przedstawiająca humanizowane naczynia (65-VPA) wyściełane ludzkimi EC (FITC-hCD31). Paski skali reprezentują 50 µm (po lewej) i 30 µm (środek i prawa strona). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig6large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy białek fluorescencyjnych w strukturach komórkowych; badanie procesów komórkowych." src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo 3"> 
Film 3. Rusztowania nośne rhBMP-2 posiadają powierzchnie kostne i unaczynienie zhumanizowane podobne do szpiku kostnego. Rekonstrukcja 3D rusztowania MSC+VERA+BMP (kość: SHG; naczynia: 65-VPA; ludzkie EC: FITC-hCD31). Każdy stos ma wymiary 60 x 600 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek barwionych DAPI i znakowanych białkowo; identyfikacja typu komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencji wykonanej na utrwalonych rusztowaniach. A-F) Badania immunofluorescencyjne przeprowadzone w celu zlokalizowania ludzkich komórek wszczepionych w rusztowania. A-C) Rusztowania zaimplantowane z hEC, hMSC i hHSC. D-F) Rusztowania kostnotwórcze z implantowanymi hEC, hMSC i hHSC. Kanały kolorystyczne są następujące: A-D) ludzkie EC (hCD31) i mysia struktura naczyniowa (endomucyna, ENDOM), B-E) hMSC (hVimentyna, hVIM) oraz mysie komórki naczyniowe (endomucyna, ENDOM), C) ludzkie komórki krwiotwórcze (hCD45) oraz naczynia krwionośne myszy (endomucyna, ENDOM), oraz F) białko związane z różnicowaniem tkanki tłuszczowej u ludzi (hADRP) i naczynia krwionośne myszy (endomucyna, ENDOM). Paski skali oznaczają 10 µm (A i C), 20 µm (B i E) oraz 40 (D i F) µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego schematu.</a>

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Ogólnym celem tej metody jest wszczepienie myszom rusztowań z nośnikami ludzkich komórek w celu stworzenia humanizowanych nisz szpiku kostnego, a następnie obrazowanie na żywo zachowania ludzkich komórek wewnątrz implantów. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ludzkiej hematopoezy, ponieważ umożliwia odtworzenie i obrazowanie na żywo z rozdzielczością pojedynczej komórki różnych komponentów szpiku kostnego. Wszechstronność tego systemu jest jedną z jego głównych zalet, ponieważ pozwala na wszczepianie różnych komponentów niszy pojedynczo lub w kombinacjach.Niniejszą metodologię można potencjalnie zastosować w innych dziedzinach badawczych, takich jak badania nad przerzutami nowotworowymi czy screening leków. Stosując odpowiednią technikę sterylną, należy rozpocząć od pocięcia wysterylizowanej gąbki żelatynowej na 24 kawałki o podobnej wielkości. Następnie należy zrekonstytuować rusztowania żelatynowe poprzez zanurzenie ich w etanolu, a następnie w PBS.Następnie delikatnie osusz każdy rusztowanie na sterylnym ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar cieczy, i przenieś rusztowania do poszczególnych studni płytki 24-dołkowej o ultra niskim przywieraniu (ultra low attachment). Używając strzykawki insulinowej, ostrożnie wstrzyknij od 1×10⁵ do 1×10⁶ komórek zrębu w 50 µL pożywki hodowlanej do każdego rusztowania, a następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Podczas wstrzykiwania komórek do rusztowania należy upewnić się, że nie następuje ich wyciek na zewnątrz.Po jednej godzinie należy napełnić każdą studzienkę trzema mililitrami świeżej pożywki do hodowli komórkowych i przenieść rusztowania z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach do rusztowań wstrzykuje się 1×10⁵ komórek krwiotwórczych, a następnie przeprowadza inkubację, dodaje kolejną porcję pożywki i inkubuje przez 24 godziny, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. W celu wytworzenia rusztowań nośnikowych z rekombinowanym ludzkim białkiem morfogenetycznym kości 2, zrekonstytuowane rusztowania należy umieścić w oddzielnych studzienkach płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U, a do każdego rusztowania dodać pięć mikrolitrów rekombinowanego ludzkiego białka morfogenetycznego kości 2.Następnie pokryj rusztowania 20 µL trombiny i 20 µL fibrynogenu. W celu chirurgicznej implantacji bioinżynieryjnych rusztowań, najpierw ogól obszar operacyjny na grzbiecie myszy doświadczalnej, a następnie użyj patyczka bawełnianego nasączonego rozcieńczoną chlorheksydyną, aby trzykrotnie oczyścić odsłoniętą powierzchnię skóry w każdym kierunku. Następnie, używając sterylnej pęsety i skalpela, wykonaj nacięcie skóry o długości od 0,5 do 0,7 cm w kierunku przednio-tylnym i wprowadź pęsetę pod tkankę podskórną, aby utworzyć kieszonkę.Wprowadź rusztowanie głęboko do kieszonki i zamknij nacięcie za pomocą kleju chirurgicznego. Pozostaw zaimplantowane rusztowania do rozwoju na okres od ośmiu do 24 tygodni przed eksplantacją. Po dożylnym podaniu substancji fluorescencyjnych i eutanazji zwierząt, wysterylizuj skórę w sposób przedstawiony powyżej i wykonaj podłużne nacięcie skóry na grzbiecie zwierzęcia, w pobliżu pierwotnego miejsca implantacji.Ostrożnie oddziel skórę od podskórnej kieszonki, w której zaimplantowano rusztowanie, a następnie za pomocą pęsety delikatnie chwyć rusztowanie i ostrożnie przetnij pozostałą błonę oraz tkanki otaczające konstrukcję, aby ją odzyskać. Użyj szybko utwardzającego się kleju, aby przymocować rusztowanie do szalki Petriego o pojemności 35 by 10 ml. W przypadku rusztowań z białka morfogenetycznego kości 2, przed wypełnieniem szalki PBS, użyj chirurgicznego mikrowiertła pod mikroskopem chirurgicznym, aby odchudzić powierzchnię kości, co umożliwi wizualizację fluoroforów i rejestrację obrazów o wysokiej rozdzielczości.Należy zachować szczególną ostrożność podczas procesu wiercenia, ponieważ grubość kości zazwyczaj różni się pomiędzy rusztowaniami i ważne jest, aby nie uszkodzić powierzchni. Napełnij naczynie PBS o temperaturze pokojowej. W celu obrazowania bioinżynieryjnych rusztowań za pomocą mikroskopii dwufotonowej, umieść rusztowanie na stoliku mikroskopu konfokalnego i wybierz obiektyw imersyjny wodny 20x 1.0 NA.Następnie w trybie akwizycji oprogramowania do obrazowania zaznacz pole pokaż narzędzia ręczne. W menu lasera włącz laser dwufotonowy i odczekaj, aż laser się rozgrzeje i ustabilizuje. Gdy laser będzie gotowy, w menu konfiguracji obrazowania aktywuj tryb kanału i opcję przełączaj ślad w każdej klatce.W menu ścieżki świetlnej wybierz opcję non descanned oraz główny dzielnik wiązki MBS 760 plus. Aktywuj cztery detektory non descanned i ustaw konfigurację zgodnie z przedstawionym schematem. W menu kanałów ustaw długość fali lasera na 890 nanometrów, a moc na 50%. Dla każdego kanału ustaw gain master w zakresie od 500 do 600, offset cyfrowy na zero oraz wzmocnienie cyfrowe (digital gain) na 15.W trybie akwizycji ustaw odpowiednie parametry, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości bez uszkadzania tkanki i wybielania fluoroforów. Następnie ustaw powiększenie (zoom) na 1 dla wstępnego skanowania obrazu. Po ustawieniu wszystkich parametrów opuść obiektyw, aż dotknie on roztworu soli fizjologicznej, a następnie ręcznie ustaw ostrość obiektywu, używając lampy jako źródła światła.Teraz aktywuj menu Z-stack i wybierz funkcję first last. Ustaw wymagany odstęp między dwiema następującymi po sobie sekcjami i wybierz opcję live, aby przeprowadzić skanowanie próbki na żywo, dostosowując w razie potrzeby wzmocnienie cyfrowe (digital gain) oraz przesunięcie cyfrowe (digital offset) w celu uzyskania optymalnej ekspozycji. Aby wizualizować wiele kanałów jednocześnie, wybierz funkcję split.W menu stolika, będąc w trybie na żywo, przeskanuj obraz i zaznacz obszary zainteresowania, takie jak lokalizacja jam kostnych. Po zakończeniu skanowania próbki przejdź do pierwszego obszaru zainteresowania i użyj funkcji „set first” oraz „set last” w trybie na żywo, aby ustawić górną i dolną granicę stosu 3D Z-stack obejmującego obszar zainteresowania. Następnie ustaw centrum, C, i kliknij przycisk „start experiment”, aby rozpocząć akwizycję obrazów Z-stack dla wybranego obszaru zainteresowania.Po zakończeniu akwizycji zapisz obrazy w wyznaczonym folderze i zeskanuj kolejny obszar zainteresowania. Na tych reprezentatywnych obrazach można zaobserwować morfologię makroskopową różnych rusztowań odzyskanych z immunodeficyjnych myszy NSG osiem tygodni po implantacji. Współhodowla z ludzkimi komórkami śródbłonka zwiększa unaczynienie rusztowania, natomiast dodatek rekombinowanego ludzkiego białka morfogenetycznego kości dwa indukuje kostnienie.Rusztowania te, obrazowane za pomocą dwufotonowej mikroskopii żywych komórek, ujawniają obecność naczyń krwionośnych wewnątrz rusztowań oraz długoterminowe przyjęcie ludzkich komórek krwiotwórczych w miąższu rusztowania. Rusztowania zasiane ludzkimi komórkami śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ilustrują udział ludzkich komórek śródbłonka w tworzeniu naczyń w obrębie rusztowania, co prowadzi do powstania mysio-ludzkiego układu naczyniowego chimerycznego. Za pomocą mikroskopii dwufotonowej można zwizualizować tworzenie się tkanki kostnej, a także powstawanie jam w zhumanizowanym układzie naczyniowym w tkance endostealnej, która w dużym stopniu przypomina tkankę endostealną szpiku kostnego.Ponadto w rusztowaniach nośnikowych z rekombinującym ludzkim białkiem morfogenetycznym kości 2, morfologia tkanki wewnątrz rusztowania przypomina dojrzały szpik kostny z tkanką tłuszczową, co sugeruje, że ludzkie mezenchymalne komórki stromalne przyczyniają się również do tworzenia tkanki tłuszczowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat całej bioinżynierii oraz głównych rusztowań mysich. Należy zawsze pamiętać o zachowaniu aseptycznego środowiska i zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z rusztowaniami.Należy wziąć pod uwagę ograniczenia związane z tą metodą, takie jak powstawanie chimer ludzko-mysich w tkankach. Pamiętaj, że po obrazowaniu próbki mogą zostać wykorzystane do dalszych badań, ponieważ rusztowania można poddać trawieniu, co pozwala na odzyskanie z nich żywych komórek.

bioengineering-humanized-bone-marrow-microenvironments-mouse-their

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Poznaj metodę tworzenia humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy poprzez implantację rusztowań z komórkami ludzkimi i ich wizualizację za pomocą mikroskopii dwufotonowej na żywo.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Przeglądaj więcej filmów