Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo
August 1st, 2017
Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.
Ogólnym celem tej metody jest wszczepienie myszom rusztowań przenoszących ludzkie komórki w celu stworzenia humanizowanych nisz szpiku kostnego, a następnie zobrazowanie na żywo zachowania komórek ludzkich w implantach. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie układu krwiotwórczego człowieka, ponieważ pozwala na odtworzenie i użycie obrazu w rozdzielczości pojedynczej komórki różnych składników szpiku kostnego. Wszechstronność tego systemu jest jedną z jego głównych zalet, ponieważ umożliwia implantację różnych komponentów niszowych jeden po drugim lub w połączeniu.
Metodologia ta może być potencjalnie zastosowana w innych dziedzinach badań, takich jak badania przesiewowe nad przerzutami nowotworów lub lekami. Stosując odpowiednią sterylną technikę, zacznij od pokrojenia wysterylizowanej gąbki żelatynowej na 24 kawałki o podobnej wielkości. Rusztowania żelatynowe należy rozpuścić przez zanurzenie w etanolu, a następnie w PBS.
Następnie delikatnie przetrzyj każde rusztowanie na sterylnej tkance, aby usunąć nadmiar płynu, i przenieś rusztowania do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Za pomocą strzykawki insulinowej ostrożnie wstrzyknąć jeden raz od 10 do piątego do jednego razy 10 do szóstego komórek zrębu w 50 mikrolitrach pożywki hodowlanej do każdego rusztowania i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Podczas wstrzykiwania komórek do rusztowania należy upewnić się, że nie ma wycieku z rusztowania.
Po godzinie napełnij każdą studzienkę trzema mililitrami świeżej pożywki do hodowli komórkowych i włóż rusztowania z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach wstrzyknąć jedną raz po 10 do piątej komórki krwiotwórczej do rusztowań, a następnie inkubację i dalsze dodawanie pożywki oraz 24-godzinną inkubację, jak właśnie pokazano. W celu wytworzenia rekombinowanego białka morfogenetycznego ludzkiej kości dwa rusztowania nośne, należy umieścić odtworzone rusztowania w indywidualnych studzienkach 96-dołkowej płytki z dnem U i dodać pięć mikrolitrów rekombinowanego białka morfogenetycznego ludzkiej kości po dwa do każdego rusztowania.
Następnie przykryj rusztowania 20 mikrolitrami trombiny i 20 mikrolitrami fibrynogenu. W celu chirurgicznego wszczepienia rusztowań bioinżynieryjnych, najpierw ogol obszar operacyjny z tyłu myszy eksperymentalnej i użyj bawełnianej końcówki zanurzonej w rozcieńczonej chlorheksydynie, aby oczyścić odsłoniętą powierzchnię skóry trzy razy w każdym kierunku. Następnie za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela wykonaj nacięcie skóry o długości od 0,5 do 0,7 centymetra od przodu do tyłu i włóż kleszcze pod tkankę podskórną, aby utworzyć kieszonkę.
Włóż rusztowanie głęboko do kieszeni i zamknij nacięcie klejem chirurgicznym. Pozwól wszczepionym rusztunkom rozwijać się przez osiem do 24 tygodni przed eksplantatem. Po dożylnym podaniu substancji fluorescencyjnych i eutanazji zwierząt, należy wysterylizować skórę, jak właśnie pokazano, i wykonać podłużne nacięcie skóry na grzbiecie zwierzęcia, w pobliżu pierwotnego miejsca implantacji.
Ostrożnie oddziel skórę od kieszonki podskórnej, w której wszczepiono rusztowanie, a następnie użyj pęsety, aby delikatnie chwycić rusztowanie i ostrożnie przeciąć pozostałą błonę i tkanki otaczające rusztowanie, aby odzyskać strukturę. Użyj szybko działającego kleju samoprzylepnego, aby przymocować rusztowanie do szalki Petriego o wymiarach 35 na 10 mililitrów. W przypadku dwóch rusztowań morfogenetycznych białka kostnego, przed wypełnieniem płytki PBS, należy użyć mikrowiertła chirurgicznego pod mikroskopem mikrochirurgicznym, aby rozrzedzić powierzchnię kości, umożliwiając wizualizację fluoroforów i uchwycenie obrazów w wysokiej rozdzielczości.
Zachowaj szczególną ostrożność podczas procesu wiercenia, ponieważ grubość kości zwykle różni się w zależności od rusztowania i ważne jest, aby nie naruszyć powierzchni. Napełnij naczynie PBS o temperaturze pokojowej. Aby obrazować rusztowania bioinżynieryjne za pomocą mikroskopii 2-fotonowej, umieść rusztowanie na stoliku mikroskopu konfokalnego i wybierz 20-krotną soczewkę zanurzeniową 1,0 NA.
Następnie w trybie akwizycji oprogramowania do obrazowania zaznacz pole Pokaż narzędzia ręczne. W menu lasera włącz laser 2-fotonowy i pozwól laserowi rozgrzać się i ustabilizować. Gdy laser jest gotowy, w menu ustawień obrazowania aktywuj tryb kanału i przełączaj ścieżkę co klatkę.
W menu ścieżki światła wybierz rozdzielacz świateł drogowych bez kąta i MBS 760 plus. Aktywuj cztery nieuszkodzone detektory i ustaw konfigurację zgodnie ze schematem. W menu kanałów ustaw długość fali lasera na 890 nanometrów, a moc na 50%Ustaw wzorzec wzmocnienia na 500 do 600, przesunięcie cyfrowe na zero, a wzmocnienie cyfrowe na 15 dla każdego kanału.
W trybie akwizycji ustaw odpowiednie parametry, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości bez uszkadzania tkanki i wybielania fluoroforów. Następnie ustaw powiększenie na jeden, aby rozpocząć skanowanie obrazu. Po ustawieniu wszystkich parametrów opuść obiektyw, aż dotknie roztworu soli fizjologicznej, a następnie ręcznie ustaw ostrość obiektywu za pomocą lampy jako źródła światła.
Teraz aktywuj menu Z-stack i wybierz przedostatnią funkcję. Ustaw wymagany odstęp między dwoma sekwencyjnymi warstwami i wybierz opcję na żywo, aby zobrazować skan próbki na żywo, dostosowując wzmocnienie cyfrowe i przesunięcie cyfrowe w razie potrzeby w celu uzyskania optymalnej ekspozycji. Aby wyświetlić wizualizację wielu kanałów w tym samym czasie, wybierz funkcję podziału.
W menu sceny, w trybie na żywo, zeskanuj obraz i zaznacz obszary zainteresowania, takie jak lokalizacja ubytków kostnych. Po zakończeniu skanowania próbki przejdź do pierwszego obszaru zainteresowania i użyj funkcji ustaw pierwszy i ustaw ostatni w trybie na żywo, aby ustawić górną i dolną część stosu 3D Z otaczającego obszar zainteresowania. Następnie ustaw środek, C, i kliknij przycisk rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć akwizycję obrazu Z-stack w interesującym Cię regionie.
Po zakończeniu akwizycji zapisz obrazy w wyznaczonym folderze i zeskanuj następny obszar zainteresowania. Na tych reprezentatywnych obrazach można zaobserwować ogólną morfologię różnych rusztowań odzyskanych od myszy z niedoborem odporności NSG osiem tygodni po implantacji. Współsiewanie z ludzkimi komórkami śródbłonka zwiększa unaczynienie rusztowania, podczas gdy dodanie rekombinowanego białka morfogenetycznego ludzkiej kości dwa indukuje tworzenie kości.
Rusztowania te zobrazowane za pomocą żywej mikroskopii 2-fotonowej ujawniają obecność naczyń krwionośnych w rusztowaniach oraz długotrwałe wszczepienie ludzkich komórek krwiotwórczych w miąższ rusztowania. Rusztowania wysiane ludzkimi komórkami śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami zrębu ilustrują udział ludzkich komórek śródbłonka w tworzeniu naczyń w rusztowaniu, co skutkuje mystooką chymeryczną człowieka. Powstawanie tkanki kostnej można uwidocznić za pomocą mikroskopii 2-fotonowej, a także powstawanie ubytków w humanizowanym unaczynieniu w tkance śródkostnej, która bardzo przypomina tkankę śródkostną szpiku kostnego.
Co więcej, w rekombinowanych rusztowaniach nośnych z morfogenetycznego białka kości ludzkiej, morfologia tkanki w rusztowaniu przypomina dojrzały szpik kostny z tkanką tłuszczową, co sugeruje, że ludzkie mezenchymalne komórki zrębu również przyczyniają się do tworzenia tkanki tłuszczowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć wszystkich bioinżynierów i główne rusztowania mysie. Zawsze pamiętaj o utrzymaniu ascetycznego środowiska i zachowaniu szczególnej ostrożności podczas obsługi rusztowań.
Należy pamiętać o ograniczeniach związanych z tą metodą, takich jak chimery ludzko-mysie w tkankach. Pamiętaj, że po zobrazowaniu próbki można wykorzystać do dalszych badań, ponieważ rusztowania mogą być trawione, a co za tym idzie, można z nich pobrać żywe komórki.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę tworzenia i obrazowania na żywo nisz szpiku kostnego u ludzi w myszy. Podejście polega na implantacji ludzkich struktur nośnych komórek, umożliwiającej obserwację zachowania ludzkich komórek w obrębie implantów.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Badania szpiku kostnego
- Obrazowanie komórkowe
Tło
- Ludzkie nisze szpiku kostnego są kluczowe dla badań krwiotwórczego.
- Interakcja między ludzkimi komórkami mezenchymalnymi a komórkami śródbłonka jest istotna dla unaczynienia.
- Obrazowanie na żywo w rozdzielczości pojedynczej komórki dostarcza informacji o dynamice komórkowej.
- Ta metodologia ma potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach badań.
Cel badania
- Rozwój metody implantacji ludzkich struktur nośnych do myszy.
- Umożliwienie obrazowania na żywo ludzkich komórek w kontrolowanym środowisku.
- Badanie formowania się chimerycznego tkanki kostnej człowiek-mysz.
Stosowane metody
- Przygotowanie szkieletu żelatynowego do implantacji komórek.
- Wstrzyknięcie komórek stromalnych i krwiotwórczych do szkieletu.
- Chirurgiczna implantacja szkieletu do myszy.
- Mikroskopia 2-fotonowa do obrazowania na żywo zaimplantowanych szkieletu.
Główne wyniki
- Udana kreacja ludzkich nisz szpiku kostnego u myszy.
- Poprawiona unaczynienie obserwowana z ludzkimi komórkami śródbłonka.
- Potwierdzone utworzenie chimerycznej dojrzałej tkanki kostnej.
- Metodologia pozwala na wszechstronne eksperymenty z komponentami niski.
Wnioski
- Metoda dostarcza cennego narzędzia do badania ludzkiego krwiotwórstwa.
- Obrazowanie na żywo umożliwia obserwację interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.
- To podejście może być dostosowane do innych obszarów badań, w tym przesiewowych badań leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to model human hematopoietic stem cell interactions within a tunable bone marrow microenvironment, supporting target validation and mechanistic de-risking in hematologic drug discovery. Live imaging at single-cell resolution provides quantitative readouts for assessing compound effects on cell engraftment, differentiation, and niche interactions, improving predictive confidence in preclinical models. The system’s versatility allows for systematic interrogation of stromal components, facilitating assay development and translational biomarker discovery in leukemia, lymphoma, and bone marrow failure disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of human hematopoietic stem cell behavior in response to stromal signals, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible system to assess how niche components influence HSC quiescence, self-renewal, and differentiation.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing human-mouse chimeric tissue formation and cellular crosstalk in situ.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable imaging outputs such as vascularization density, engraftment levels, and cavity formation for compound screening.
- Operational Value: Standardized scaffold preparation and implantation enable scalable, reproducible assays across multiple conditions.
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream drug screening and phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant human bone marrow microenvironment to study malignant hematopoiesis and therapy resistance.
- Operational Value: Supports longitudinal tracking of human cell engraftment over 8–24 weeks, enabling chronic preclinical studies.
- Scientific Value: Enhances translational continuity by allowing retrieval of live cells post-imaging for further functional analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, particularly for hematologic malignancies and bone marrow-targeted therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal factors influencing HSC fate decisions and malignant transformation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, vascularized humanized niches with quantifiable imaging endpoints.
- Analytics: Provides high-resolution, multiplexed imaging data on cell localization, vessel formation, and tissue architecture for comparative condition analysis.
- Translational Research: Models human-specific niche interactions relevant to preclinical validation of hematopoietic therapies.
- Enterprise Reuse: Platform adaptability allows reuse across multiple projects by varying stromal, endothelial, or hematopoietic cell inputs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on xenograft models lacking human stromal context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized scaffold fabrication and implantation procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insights into drug effects on niche-HSC interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on engraftment, differentiation, and niche remodeling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell culture, microsurgical implantation, and two-photon microscopy operation.
- Dependent on access to two-photon microscopes with non-descanned detectors and appropriate laser tuning (e.g., 890 nm).
- Necessitates cross-team standardization between cell biology, imaging, and animal surgery teams for consistent scaffold preparation.
- Adaptation considerations include varying human cell sources (e.g., patient-derived HSCs, stromal lines) and niche components (BMP2, endothelial cells).
- Practical limitations include human-mouse chimera formation and variability in scaffold integration, which may affect imaging consistency.
