Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Metoda ta może być pomocna dla hematologów i immunologów badających produkcję i funkcję komórek szpikowych, w tym neutrofili, monocytów i komórek dendrytycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia bardziej precyzyjną identyfikację podzbiorów progenitorów szpiku niż poprzednie strategie. Aby wzbogacić komórki szpiku kostnego dla komórek progenitorowych przez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie lub MACS, należy osadzać komórki przez wirowanie i ponownie zawiesić osad w 40 mikrolitrach buforu barwiącego MACS na jeden raz 10 do siedmiu komórek szpiku kostnego.

Aby zubożyć zróżnicowane komórki dodatnie pod względem linii, dodaj 10 mikrolitrów koktajlu przeciwciał biotyny na jeden raz 10 do siedmiu komórek i wymieszaj przez pipetowanie przez 10-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów buforu barwiącego na jeden razy 10 do siedmiu komórek z mieszaniem, a następnie 20 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny na jeden razy 10 do siedmiu komórek. Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj komórki jednym mililitrem buforu barwiącego na jeden raz 10 do siedmiu komórek i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego do jednego razy 10 do ośmiu komórek.

Następnie należy ustawić automatyczny separator magnetyczny zgodnie z instrukcjami producenta i umieścić rurkę z oznakowanymi komórkami w separatorze. Rozpocznij program selekcji negatywnej, aby zebrać frakcję ujemną, która zawiera komórki ujemne wzbogacone o linię progenitorową. Osadzaj ujemne komórki linii przez wirowanie i ponownie zawieś osad, który jest teraz biały, w dwóch mililitrach buforu barwiącego na mysz w celu policzenia.

Aby wyizolować mieloidalne komórki progenitorowe za pomocą FACS, dodaj jeden razy 10 do ujemnych komórek piątej linii do każdej z ośmiu kontrolnych probówek mikrowirówek w celu wyboru napięcia i kompensacji koloru, a następnie dodaj resztę próbki komórek do dziewiątej probówki mikrowirówkowej w celu barwienia wszystkimi siedmioma przeciwciałami markera powierzchniowego będącymi przedmiotem zainteresowania w celu identyfikacji i sortowania progenitorów. Osadzać komórki przez wirowanie i ponownie zawieś granulki kontrolne w 100 mikrolitrach buforu barwiącego FACS, a osad próbki eksperymentalnej w 100 mikrolitrach buforu barwiącego na pięć razy 10 do sześciu komórek. Następnie dodaj przeciwciało anty-CD16 / CD32 do probówki z pojedynczym barwnikiem receptora gamma Fc i probówki z próbką.

Delikatnie wirować i inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać pozostałe przeciwciała do odpowiednich probówek z pojedynczym barwnikiem oraz do probówki z próbką, a następnie po delikatnym wirowaniu inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 900 mikrolitrów buforu barwiącego do probówek kontrolnych i jeden mililitr buforu barwiącego na jeden raz 10 do siedmiu komórek do probówki z próbką w celu odwirowania.

Zawiesić granulki kontrolne w 200 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego na probówkę, a eksperymentalne osady w 500 mikrolitrach na 2,5 razy 10 do siedmiu komórek i przenieść oznakowane komórki do indywidualnych odpowiadających im pięciomililitrowych probówek FACS. Następnie ustaw cytometr przepływowy zgodnie ze standardowymi protokołami i użyj niebarwionych i pojedynczo barwionych elementów sterujących, aby ustawić napięcia i kompensacje kolorów. Aby zidentyfikować i wyizolować mieloidalne komórki progenitorowe, załaduj eksperymentalną próbkę komórek do cytometru i utwórz wykres obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego, bramkując w celu wykluczenia szczątków i martwych komórek.

Utwórz wykres wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do szerokości rozproszenia do przodu komórek na żywo i bramy, aby wykluczyć dublety. Powtórz ten proces z wykresem wysokości rozproszenia bocznego w stosunku do szerokości rozproszenia bocznego podkoszulków i bramki rozproszenia do przodu, aby wykluczyć dublety. Utwórz wykres Sca-1 w porównaniu z c-Kit i bramkę, aby wybrać dodatnich progenitorów Sca-1 c-Kit.

Następnie utwórz wykres i bramkę receptora gamma CD-34 w porównaniu z FC, aby wybrać mieszane populacje progenitorów szpiku i monocytów mieszanych granulocytów. Ważne jest, aby jak najdokładniej bramkować mieszane populacje progenitorów szpiku szpiku i monocytów mieszanych granulocytów. Pomocne może być użycie pseudokolorowego wykresu gęstości lub wykresu konturowego w celu dokładniejszego bramkowania.

Użyj komórek w mieszanej wspólnej bramie progenitorowej szpiku, aby utworzyć wykres i bramkę CD115 w porównaniu z Flt3, aby wybrać wspólne niskie komórki progenitorowe Flt3 Flt3, wspólne progenitorowe Flt3 ujemne komórki CD115 i progenitory komórek dendrytycznych o wysokiej zawartości monocytów Flt3 CD115. Użyj komórek w mieszanej bramie progenitorowej monocytów monocytów granulocytów, aby utworzyć wykres i bramkę receptora Ly6C w porównaniu z FC Gamma, aby wybrać komórki ujemne Ly6C i komórki dodatnie Ly6C. Następnie utwórz wykres CD115 w porównaniu z Flt3 dla każdej bramkowanej subpopulacji komórek progenitorowych monocytów monocytów mieszanych granulocytów i bramuj progenitory monocytów o niskiej granulocytach Ly6C ujemne Flt3 CD115, progenitory o niskiej granulocytach Ly6C dodatnie Flt3 CD115 i progenitory Ly6C dodatnie Flt3 CD115 o wysokiej zawartości monocytów.

Maksymalne zubożenie linii jest skuteczne w zubożaniu zróżnicowanych komórek i wzbogacaniu komórek progenitorowych c-Kit dodatnich. Frakcja ujemna linii nadal zawiera pewne komórki ujemne c-Kit, ale komórki te zostaną wyeliminowane w kolejnych etapach bramkowania cytometrii przepływowej. Wydajność progenitorów po sortowaniu FACS może się różnić w zależności od zastosowanych ustawień sortownika, ale powinno być możliwe uzyskanie od jednej do czterech razy od 10 do czwartej komórki na frakcję od każdej myszy o czystości po sortowaniu większej niż 95% dla każdej frakcji.

Dobre barwienie ma kluczowe znaczenie dla czystej separacji populacji. Może być konieczne miareczkowanie przeciwciał lub wybór różnych fluoroforów, aby zapewnić optymalną separację. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji komórek progenitorowych w celu oceny różnic w składzie szpiku kostnego między próbkami, izolowania komórek progenitorowych do analizy molekularnej lub oceny ich zdolności do wytwarzania komórek szpikowych.