Name: Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj metodę izolacji sześciu podzbiorów progenitorów szpikowych z kości szczury myszy za pomocą sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia precyzyjną identyfikację komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten protokół został opracowany przy użyciu funduszy z Board of Governors Regenerative Medicine Institute w Cedars-Sinai Medical Center (dla HSG), stypendium Careers in Immunology od American Association of Immunosts (dla AY i HSG) oraz Scholar Award od American Society of Hematology (dla AY). Dziękujemy Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej w Centrum Medycznym Cedars-Sinai za pomoc w sortowaniu FACS.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Medycznego Cedars-Sinai.
1. Izolacja szpiku kostnego myszy i przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Umieść uśpioną mysz na plecach i spryskaj ją 70% etanolem (EtOH). Wykonaj małe (3 - 5 mm) nacięcie w każdej kończynie tylnej na wysokości kostki za pomocą ostrych, spiczastych nożyczek i pociągnij skórę w kierunku ciała, aby usunąć ją z nóg i odsłonić mięśnie i kości.</li>
	<li>Usuń mięśnie (mięsień czworogłowy, ścięgna podkolanowe itp.) z kości, przycinając je nożyczkami, zgodnie z kierunkiem kości. Uważaj, aby nie uszkodzić kości.</li>
	<li>Zwichnij kości udowe ze stawów biodrowych i odetnij tkankę łączną i mięśnie, aby odłączyć nogi, uważając, aby nie przeciąć kości.</li>
	<li>Usuń stopy, zwichając kostki od piszczeli, umieść kości w probówce ze sterylnym PBS lub pożywką i przetransportuj je na lodzie do pomieszczenia do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: W przypadku niektórych innych zastosowań (np. wyprowadzanie makrofagów z całkowitych komórek szpiku kostnego) możliwe jest pozostawienie kości na lodzie na jakiś czas, ale w przypadku izolacji progenitorów ważne jest, aby postępować tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć regulacji w dół ważnych markerów powierzchniowych (zwłaszcza CD115).</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń wszelkie pozostałe tkanki miękkie z kości, pocierając je bibułą. 
	Uwaga: Protokół należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego, jeśli do hodowli komórkowej lub testów in vivo po sortowaniu FACS wymagana jest sterylna próbka. Jeśli sterylne komórki nie są wymagane, cały proces można przeprowadzić na stole laboratoryjnym.</li>
	<li>Krótko zanurz kości w 70% EtOH w celu ich dezynfekcji, a następnie w sterylnym PBS, aby je umyć.</li>
	<li>Oddziel kości udowe od piszczeli i strzałkowych, przecinając kolano, i odrzuć kości strzałkowe.</li>
	<li>Odetnij końce kości ostrymi nożyczkami.</li>
	<li>Pobierać szpik kostny za pomocą zimnego sterylnego PBS w następujący sposób, aż kości staną się białe:
	<ol>
		<li>Chwyć każdą kość kleszczami i włóż igłę 26G podłączoną do strzykawki o pojemności 10 ml zawierającej zimny sterylny PBS do trzonu kości na jednym końcu.</li>
		<li>Trzymaj kość powyżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przepłucz 2-5 ml PBS przez kość, aby pobrać szpik.</li>
		<li>Zbierz szpik ze wszystkich 4 kości na mysz (2 kości udowe i 2 piszczelowe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie pipetować w górę i w dół pipetą o pojemności 1 ml, aby zdezagregować szpik kostny i utworzyć zawiesinę komórek.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę szpiku kostnego przez kawałek siatki nylonowej o grubości 30 μm, aby wyeliminować kawałki kości i agregaty komórek, generując w ten sposób zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę jednokomórkową o sile 280 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w sterylnym buforze do barwienia (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), używając 5 ml buforu barwiącego na mysz (np. 10 ml dla komórek zebranych z kości udowych i piszczelowych 2 myszy).</li>
	<li>Pobrać 10 μl podwielokrotności próbki, wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego i załadować 10 μl otrzymanej próbki znakowanej błękitem trypanowym do hemocytometru. Policz komórki za pomocą mikroskopu świetlnego. 
	UWAGA: Jeśli komórki są zbyt skoncentrowane, aby można było je wiarygodnie policzyć, należy rozcieńczyć próbkę przed dodaniem błękitu trypanowego.</li>
</ol>
2. Wzbogacanie progenitorów przez magnetyczne sortowanie komórek (MACS)
<ol>
	<li>Odwirować całą zawiesinę pojedynczej komórki (lub tyle komórek, ile jest potrzebnych do uzyskania pożądanej wydajności) przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C i ponownie zawiesić osad komórek w 40 μl buforze barwiącym (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) na 107 komórek. 
	UWAGA: Możliwe jest również użycie bufora MACS od producenta zestawu do zmniejszania pochodzenia (patrz Tabela materiałów) jako alternatywy dla bufora do barwienia.</li>
	<li>Wykonaj zubożenie linii zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z zestawem do zmniejszania linii. Poniższe instrukcje dotyczą zestawu widocznego w tabeli materiałów. Jeśli używany jest inny zestaw, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przejdź do kroku 2.3.
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał na 10-7 komórek, wymieszać pipetując i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodaj 30 μl buforu barwiącego/buforu MACS na 107 komórek i wymieszaj.</li>
		<li>Dodaj 20 μl mikrogranulek antybiotyny na 10-7 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Zwiruj mikrogranulki przed dodaniem ich do komórek, aby upewnić się, że są całkowicie rozproszone.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu barwiącego/buforu MACS na 107 komórek, odwirować komórki przy 280 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforze barwiącym/buforze MACS dla maksymalnie 108 komórek. W przypadku więcej niż 108 komórek odpowiednio zwiększ objętość buforu do barwienia/buforu MACS.</li>
		<li>Automatyczny separator magnetyczny należy przygotować zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Umieść probówkę zawierającą oznaczone komórki w separatorze i wybierz program selekcji negatywnej.</li>
		<li>Zbierz frakcję ujemną, która zawiera komórki ujemne (Lin) wzbogacone w komórki progenitorowe. Odrzuć frakcję dodatnią, która zawiera znakowane magnetycznie komórki dodatnie pod względem linii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować komórki Lin przy 280 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu barwiącego/buforze MACS na mysz (np. 4 ml, jeśli szpik kostny został połączony od 2 myszy). 
	Uwaga: Osadka powinna być teraz biała, a nie czerwona, ponieważ erytrocyty zostały wyczerpane.</li>
	<li>Pobrać 10 μl podwielokrotności komórek Lin-, wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego i załadować 10 μl otrzymanej próbki znakowanej błękitem trypanowym do hemocytometru. Policz komórki za pomocą mikroskopu świetlnego. 
	UWAGA: Jeśli komórki są zbyt skoncentrowane, aby można było je wiarygodnie policzyć, należy rozcieńczyć próbkę przed dodaniem błękitu trypanowego.</li>
</ol>
3. Identyfikacja i izolacja mieloidalnych progenitorów za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>Oznaczyć 9 probówek do mikrowirówek (1,5 lub 2 ml) dla: 1) komórek niebarwionych, 2-8) komórek pojedynczo barwionych przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem przeciwko FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C i CD115 do wyboru napięcia i kompensacji koloru oraz 9) komórek próbki, które mają być wybarwione wszystkimi 7 przeciwciałami w celu identyfikacji i sortowania progenitorów.</li>
	<li>Rozprowadź 100 000 komórek do każdej z probówek kontrolnych (probówki 1 - 8), a wszystkie pozostałe komórki (lub mniej, jeśli jest to pożądane) do probówki z próbką (probówka 9). 
	UWAGA: Jeśli objętość próbki jest większa niż 1,5 - 2 ml, może być konieczne rozprowadzenie komórek próbki do probówki o pojemności 15 ml, odwirowanie ich i ponowne zawieszenie osadu (krok 3.3 poniżej), a następnie przeniesienie komórek do probówki mikrowirówkowej w celu przeprowadzenia kolejnych etapów barwienia.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić granulki probówki kontrolnej w 100 μl buforze barwiącym (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), a osad z probówki z próbką w 100 μl buforu barwiącego na 5 x 106 komórek (np. 200 μl dla 1 x 107 komórek).</li>
	<li>Dodać 2 μg/ml anty-CD16/CD32-APC-Cy7 do probówki z pojedynczym barwnikiem FcγR i probówki na próbkę. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ważne jest, aby wybarwić próbki komórek przeciwciałem FcγR (CD16/32) przed dodaniem innych przeciwciał, aby zapobiec konkurencji spowodowanej niespecyficznym wiązaniem przeciwciał za pośrednictwem Fc. Nie inkubować komórek z odczynnikiem blokującym FcγR.</li>
	<li>Dodaj pozostałe przeciwciała do odpowiednich pojedynczych probówek barwiących (po 1 przeciwciałie każda) i probówki z próbką (wszystkie 6 przeciwciał): 10 μg/ml c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/ml Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/ml CD34-FITC, 10 μg/ml Flt3-APC, 2 μg/ml Ly6C-PerCP-Cy5,5 i 4 μg/ml CD115-PE. Delikatnie przetrząsać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 900 μl buforu barwiącego do probówek kontrolnych i 1 ml buforu barwiącego na 10-7 komórek do probówki z próbką. Odwirować komórki przy 1 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórek w buforze do barwienia: 200 μl na probówkę kontrolną i 500 μl na 25 x 106 komórek w probówce z próbką. Przenieś zawieszone komórki do probówek FACS o pojemności 5 ml. 
	UWAGA: Jeśli objętość próbki jest większa niż 1,5 - 2 ml, może być konieczne przeniesienie komórek do probówki o pojemności 15 ml w celu odwirowania.</li>
	<li>Przygotuj cytometr przepływowy (analizator lub sorter) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przepuść niebarwione i pojedynczo barwione komórki kontrolne przez cytometr przepływowy, aby ustawić napięcia i kompensacje kolorów.</li>
	<li>Uruchom próbki komórek, bramkują podzbiory progenitorów, jak opisano poniżej i podsumować w Rysunek 2, a jeśli to konieczne, wykonaj sortowanie FACS, aby wyizolować odpowiednie podzbiory progenitorów. 
	UWAGA: Zazwyczaj konieczne jest pozyskanie około 200 000 komórek, aby uzyskać co najmniej 1 000 zdarzeń w każdej bramie progenitorowej.
	<ol>
		<li>Utwórz wykres punktowy wszystkich komórek, wyświetlając FSC-A (oś x) i SSC-A (oś y) oraz bramkę, aby wykluczyć zanieczyszczenia i martwe komórki => "żywe" komórki.</li>
		<li>Utwórz wykres punktowy komórek "na żywo", wyświetlając FSC-H (oś x) i FSC-W (oś y) oraz bramkę, aby wykluczyć dublety => bramkę na żywo/singlet (FSC).</li>
		<li>Utwórz wykres punktowy komórek na żywo/singlet (FSC), wyświetlając SSC-H (oś x) i SSC-W (oś y) oraz bramkę, aby wykluczyć dublety => bramka na żywo/singlet (FSC)/singlet (SSC).</li>
		<li>Utwórz wykres punktowy komórek live/singlet (FSC)/singlet (SSC), wyświetlając Sca-1 (oś x) i c-Kit (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać komórki c-Kit+ Sca-1- => LKS-.</li>
		<li>Utwórz wykres punktowy komórek LKS-, wyświetlając CD34 (oś x) i FcγR (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać komórki CD34+ FcγR lo => "CMPs" i komórki hi CD34+ FcγR => "GMPs". >
		Uwaga: Ważne jest, aby jak najdokładniej określić "CMPs" i "GMPs". Pomocne jest użycie wykresu gęstości pseudokoloru lub wykresu konturowego w celu dokładnego bramkowania.</li>
		<li>Utwórz wykres punktowy "CMPs", wyświetlając CD115 (oś x) i Flt3 (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać: 
		Komórki lo Flt3+ CD115 => CMP-Flt3+ komórki lo CD115, 
		Komórki Flt3>- CD115lo => CMP-Flt3- komórki, 
		Komórki>hi Flt3 + CD115 => MDP.</li>
		<li>Utwórz wykres punktowy "GMPs", wyświetlając Ly6C (oś x) i FcγR (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać komórki Ly6C => "GMP-Ly6C- komórki" i komórki Ly6C+ => "komórki GMP-Ly6C+".</li>
		<li>Utwórz wykres punktowy "GMP-Ly6C- cells", wyświetlając CD115 (oś x) i Flt3 (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać: 
		Komórki Lo Flt3-CD115 => GMP.</li>
		<li>Utwórz wykres punktowy "komórek GMP-Ly6C+", wyświetlając CD115 (oś x) i Flt3 (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać: 
		Komórki lo Flt3- CD115 => GPs, 
		Flt3>- CD115hi komórki => MPs+cMoPs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li>
<li>Yáñez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li>
<li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Yáñez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Strategia bramkowania Weissmana do identyfikacji progenitorów szpiku myszy1 jest złotym standardem dla immunologów i hematologów od prawie 20 lat, ale obecnie jest oczywiste, że bramki "CMP" i "GMP" są bardzo niejednorodne i potrzebne są bardziej precyzyjne strategie bramkowania. Protokół, który tutaj opisaliśmy, pozwala na identyfikację podzbiorów oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię u myszy C57BL / 6J w celu bardziej precyzyjnej kwantyfikacji specyficznych przodków szpiku i mapowania szla...

Monocyty, neutrofile i komórki dendrytyczne (DCs) to komórki mieloidalne, które powstają z progenitorów hematopoetycznych, głównie w szpiku kostnym, w procesie zwanym mielopoezą. Wspólne progenitory mieloidalne (CMPs) mają potencjał do wytwarzania komórek mieloidalnych, a także megakariocytów i erytrocytów, ale nie komórek limfoidalnych. Progenitory granulocytowo-monocytarne (GMPs), pochodzące z CMPs, wytwarzają granulocyty i monocyty, lecz utraciły potencjał do tworzenia megakariocytów i erytrocytów. Uważa się również, że monocyty oraz klasyczne i plazmacytoidalne komórki dendrytyczne (cDCs/pDCs) wywodzą się ze wspólnych progenitorów znanych jako progenitory monocytów i komórek dendrytycznych (MDPs), które są wytwarzane przez CMPs. Stopniowe ograniczanie potencjału linii komórkowej prowadzi ostatecznie do powstania progenitorów zróżnicowanych w konkretne linie: progenitorów granulocytów, progenitorów monocytów i progenitorów komórek dendrytycznych (Rysunek 1).
Weissman i współpracownicy wykazali, że CMP znajdują się w frakcji Lin- c-Kit+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRlo szpiku kostnego myszy, podczas gdy GMP znajdują się w frakcji LKS- CD34+ FcγRhi1. Jednakże frakcje te, „CMP” i „GMP”, są bardzo heterogeniczne. Na przykład frakcja „GMP” zawiera również progenitorów granulocytów i progenitorów monocytów o zdeterminowanej linii1,2. W oddzielnych doniesieniach wskazano, że MDP to progenitorzy CX3CR1+ Flt3+ CD15+, które wykazują również ekspresję CD34 i FcγR3,4. MDP dają początek wspólnym progenitorom komórek dendrytycznych (CDP) produkującym cDC/pDC, o których poinformowano, że wykazują niższą ekspresję c-Kit (CD17) i nie są wliczane do frakcji LKS-5.
Wcześniej zakładano, że monocyty powstają poprzez jedną ścieżkę (CMP-GMP-MDP-monocyt). Zgodnie z tym modelem, progenitorzy zcommittedowani do linii monocytów wytwarzani przez GMP (nazwani progenitorami monocytów, MP)2 oraz MDP (nazwani wspólnymi progenitorami monocytów, cMoP)6 wydają się być tymi samymi komórkami na podstawie wspólnej ekspresji markerów powierzchniowych. Jednak niedawno wykazaliśmy, że monocyty są produkowane niezależnie przez GMP i MDP, a dzięki sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek udało nam się odróżnić MP od cMoP7.
Niedawno zmodyfikowaliśmy strategię bramkowania „CMP” i „GMP” według Weissmana w celu zidentyfikowania 6 subfrakcji szpiku kostnego myszy C57BL/6J zawierających różne oligopotentne i zróżnicowane liniowo podzbiory progenitorów mieloidalnych. Wykazaliśmy uprzednio, że barwienie na Ly6C i CD15 umożliwia izolację oligopotentnych GMP, a także progenitorów granulocytów (GPs) i progenitorów monocytów (zarówno MPs, jak i cMoPs, których obecnie nie jesteśmy w stanie rozdzielić) z frakcji „GMP”2 (brama LKS- CD34+ FcγRhi; Rysunek 1). Następnie udowodniliśmy, że MDP znajdują się przeważnie w frakcji „CMP” (brama LKS- CD34+ FcγRlo), która zawiera również podzbiory Flt3+ CD115lo oraz Flt3-7 (Rysunek 1). Frakcja CMP-Flt3+ CD15lo po transferze adoptywnym daje zarówno GMP, jak i MDP. Podzbiór CMP-Flt3- zawiera progenitorów, które wydają się być formami pośrednimi między komórkami CMP-Flt3+ CD15lo a GMP. W przeciwieństwie do MDP, zarówno frakcja CMP-Flt3+ CD15lo, jak i CMP-Flt3- posiadają również potencjał do przekształcania się w megakariocyty i erytrocyty.
Należy jednak zauważyć, że obecnie nie jest jasne, czy frakcje „CMP” zawierają progenitorów, które są rzeczywiście oligopotencjalne (np. pojedyncze komórki w obrębie frakcji CMP-Flt3+ CD15lo posiadające potencjał do różnicowania się w neutrofile, monocyty, komórki DC, megakariocyty i erytrocyty), czy alternatywnie składają się z mieszaniny progenitorów o bardziej ograniczonym potencjale linii. Testy tworzenia kolonii (hodowle na metylocelulozie) wykazały obecność komórek o potencjale granulocytarnym (neutrofilowym), erytrocytarnym, monocytozy i megakariocytarnym (komórki GEMM) we frakcjach „CMP”, CMP-Flt3+ CD15lo oraz CMP-Flt3-1,7, jednak nie pozwalają one na ocenę potencjału DC. W przeciwieństwie do tego, testy tworzenia kolonii wykazały istnienie oligopotencjalnych GMP (progenitorów o potencjale zarówno neutrofilowym, jak i monocytarnym) we frakcji „GMP”1,2, co znajduje potwierdzenie w niedawnych analizach transkrypomicznych pojedynczych komórek8. Obecnie nie wiadomo jednak, czy te oligopotencjalne GMP wytwarzają również inne granulocyty (eosinofile, bazofile i komórki tuczne).
Na podstawie tych badań demonstrujemy obecnie, w jaki sposób 7 markerów powierzchniowych (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C oraz CD15) może zostać wykorzystanych do identyfikacji i izolacji tych 6 podgrup oligopotencjalnych i zróżnicowanych liniowo prekursorów mieloidalnych. Opisany tutaj protokół może zostać zastosowany w testach hodowli in vitro (hodowle na metylocelulozie lub w podłożach płynnych), eksperymentach z adoptywnym transferem in vivo u myszy oraz w analizach molekularnych (sekwencjonowanie RNA z całej populacji komórek i pojedynczych komórek, Western blotting itd.).
Protokół składa się z 3 etapów: 1) przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek szpiku kostnego, 2) wzbogacenia frakcji progenitorów krwiotwórczych (magnetyczne sortowanie komórek – MACS) oraz 3) identyfikacji i, w razie potrzeby, izolacji subpopulacji progenitorów za pomocą cytometrii przepływowej (przy użyciu analizatora lub sortera, w zależności od potrzeb). Pierwszym krokiem jest izolacja komórek szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych eutanazowanych myszy, co jest analogiczne do innych wcześniej opisanych protokołów9. Następnie próbkę wzbogaca się w komórki macierzyste i progenitorowe, wykorzystując koktajl przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym erytrocytów, neutrofili, monocytów, limfocytów itp., w celu usunięcia komórek zróżnicowanych. Etap ten nie jest obowiązkowy, lecz jest wysoce zalecany w celu optymalizacji wykrywania subpopulacji progenitorów, a także zmniejszenia ilości przeciwciał potrzebnych do ich identyfikacji oraz skrócenia czasu analizy cytometrycznej. Opisany poniżej protokół usuwania linii komórkowych wykorzystuje magnetyczne sortowanie komórek (MACS) z zastosowaniem zestawu Mouse Lineage Cell Depletion Kit (zawierającego biotynylowane przeciwciała przeciwko CD5, CD45R (B20), CD1b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 i Ter-19 oraz mikrokulki antybiotynowe) i automatyczny separator magnetyczny. Ostatnim krokiem jest identyfikacja (i sortowanie, jeśli jest wymagane) subpopulacji progenitorów za pomocą cytometrii przepływowej. Panel przeciwciał opisany poniżej (patrz również Tabela 1) został zaprojektowany do użytku w cytometrze przepływowym (analizatorze lub sorterze) wyposażonym w 4 lasery (405 nm, 48 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Schemat hematopoezy z przebiegami CMP, GMP i MDP przedstawiający różnicowanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Progenitory neutrofili, monocytów i komórek dendrytycznych oraz szlaki różnicowania. Niedawno zrewidowany model mielopoezy7 przedstawiono, z bramkami Weissmana dla „CMPs” (niebieskie) i „GMPs” (zielone)1 nałożone. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie opracowania Yáñeza i wsp. 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Mysz: typ dziki C57BL/6J (CD45.2)</td><td>The Jackson Laboratories</td><td>Cat#JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD34 (klon RAM34) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#553733</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD16/CD32 (Fc&gamma; R; klon 93) APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#101327</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ly6A/E (Sca-1; klon 108113) PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#108114</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD117 (c-Kit; klon 2B8) Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>Cat#105820</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ly6C (klon HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>Cat#128012</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD115 (klon AFS98) PE</td><td>BioLegend</td><td>Kot#135506</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD135 (Flt3; klon A2F10.1) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#560718</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolutne koraliki do liczenia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#C36950</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Użyj programu "zubożenie"</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 laserów, 15 kolorów</td></tr><tr><td>Sortownik komórek BD FACS Aria III</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 laserów, 13 kolorów</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>https://www.flowjo.com</td><td>Do dalszej analizy plików .fcs</td></tr></tbody></table>

identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Mieloidalne komórki progenitorowe, które wytwarzają neutrofile, monocyty i komórki dendrytyczne (DC), mogą być zidentyfikowane i wyizolowane ze szpiku kostnego myszy do analiz hematologicznych i immunologicznych. Na przykład badania właściwości komórkowych i molekularnych populacji przodków szpiku mogą ujawnić mechanizmy leżące u podstaw transformacji białaczki lub pokazać, jak układ odpornościowy reaguje na ekspozycję na patogeny. Wcześniej opisane strategie cytometrii przepływowej do identyfikacji progenitorów szpiku umożliwiły znaczne postępy w wielu dziedzinach, ale zidentyfikowane przez nie frakcje są bardzo niejednorodne. Najczęściej stosowane strategie bramkowania definiują frakcje szpiku kostnego, które są wzbogacone dla pożądanych populacji, ale zawierają również dużą liczbę "zanieczyszczających" komórek progenitorowych. Nasze ostatnie badania rozwiązały wiele z tej niejednorodności, a protokół, który tutaj prezentujemy, pozwala na izolację 6 subpopulacji oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku z 2 wcześniej opisanych frakcji szpiku kostnego. Protokół opisuje 3 etapy: 1) izolację komórek szpiku kostnego, 2) wzbogacenie komórek progenitorowych hematopoetycznych poprzez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (zubożenie linii przez MACS) oraz 3) identyfikację podzbiorów progenitorów szpiku za pomocą cytometrii przepływowej (w tym sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, FACS, w razie potrzeby). Podejście to pozwala na ilościową identyfikację i izolację progenitorów dla różnych zastosowań in vitro i in vivo, a także dostarczyło już nowych informacji na temat szlaków i mechanizmów różnicowania neutrofili, monocytów i DC.

Stosując opisany powyżej protokół, możliwe jest uzyskanie ~10 milionów komórek (wliczając erytrocyty, lub ~50 milionów komórek jądrastych) z obu kości udowych i piszczelowych (2 nogi) jednej myszy C57BL/6J (w wieku 6 – 8 tygodni, samca lub samicy). Za pomocą MACS można wyizolować od 1 do 2 milionów komórek Lin- na mysz poprzez usunięcie komórek Lin+.
Każda z 6 subpopulacji prekursorów mieloidalnych stanowi ...

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Metoda ta może być pomocna dla hematologów i immunologów badających produkcję i funkcję komórek szpikowych, w tym neutrofili, monocytów i komórek dendrytycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia bardziej precyzyjną identyfikację podzbiorów progenitorów szpiku niż poprzednie strategie. Aby wzbogacić komórki szpiku kostnego dla komórek progenitorowych przez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie lub MACS, należy osadzać komórki przez wirowanie i ponownie zawiesić osad w 40 mikrolitrach buforu barwiącego MACS na jeden raz 10 do siedmiu komórek szpiku kostnego.Aby zubożyć zróżnicowane komórki dodatnie pod względem linii, dodaj 10 mikrolitrów koktajlu przeciwciał biotyny na jeden raz 10 do siedmiu komórek i wymieszaj przez pipetowanie przez 10-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów buforu barwiącego na jeden razy 10 do siedmiu komórek z mieszaniem, a następnie 20 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny na jeden razy 10 do siedmiu komórek. Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj komórki jednym mililitrem buforu barwiącego na jeden raz 10 do siedmiu komórek i ponownie zawieś osad w 500 m

identification-isolation-oligopotent-lineage-committed-myeloid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Tutaj opisujemy zoptymalizowany, wysoce powtarzalny protokół izolacji mezodermalnych komórek progenitorowych (MPC) od ludzkiego szpiku kostnego (hBM). MPC scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji gniazdyny. Wykazali oni zdolność do tworzenia wykładniczo rosnących kultur komórkowych podobnych do MSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich potencjału angiogennego.

Izolowanie mezangiogennych komórek progenitorowych (MPC) z ludzkiego szpiku kostnego

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Tutaj przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli mysiego prekursora mieloidu linii komórkowej 32D/G-CSF-R, przeprowadzania infekcji wirusowych oraz przeprowadzania testów proliferacji i różnicowania. Ta linia komórkowa nadaje się do badania rozwoju komórek szpikowych oraz roli genów będących przedmiotem zainteresowania we wzroście komórek szpikowych i różnicowaniu neutrofilów.

Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Poznaj metodę izolacji sześciu podzbiorów progenitorów szpikowych z kości szczury myszy za pomocą sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia precyzyjną identyfikację komórek macierzystych.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Przeglądaj więcej filmów