Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej
5 marca 2018
Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.
Ogólnym celem tego protokołu jest przeprowadzenie dokładnych badań próbek szpiku kostnego od pacjentów z ostrą białaczką szpikową pod kątem mierzalnej choroby resztkowej, w tym ilościowe określenie komórek macierzystych białaczki. Metoda ta może zapewnić dokładną ocenę mierzalnej choroby resztkowej w próbkach szpiku kostnego pacjentów z ostrą białaczką szpikową. Główną zaletą tego podejścia jest to, że ścisłe przestrzeganie protokołu daje wysoce powtarzalne wyniki wysokiej jakości.
Implikacje tej techniki rozciągają się na podejmowanie decyzji klinicznych, ponieważ można ją wykorzystać jako odczyt odpowiedzi pacjentów na leczenie. Procedury zademonstrują Jeroen Janssen, hematolog, Gerrit Sijm, technik z laboratorium hematologii diagnostycznej oraz Jennifer Scheick i Sander Snel, technicy zespołu MRD. Gdy pacjent znajduje się w bocznej pozycji odleżynowej, należy oznaczyć długopisem górny tylny odcinek biodrowy kręgosłupa i zdezynfekować skórę w zamierzonym obszarze biopsji 0,5 do 1% chlorheksydyny w etanolu ruchem okrężnym na zewnątrz.
Po podaniu znieczulenia miejscowego podnieś igłę o rozmiarze 15 x 2,8 cala z bliższym końcem w dłoni i palcem wskazującym przylegającym do boku metalowego trzonka igły w pobliżu końcówki w celu kontroli. Używając delikatnego, ale mocnego nacisku, wprowadź igłę szybkim, naprzemiennym, pronacyjnym, supinacyjnym ruchem przez znieczuloną skórę w kierunku kręgosłupa biodrowego. Gdy igła zetknie się z tylnym kręgosłupem biodrowym, wyjmij rurkę i przymocuj do igły pustą strzykawkę o pojemności 10 mililitrów.
Delikatnie wycofać tłok, aby wytworzyć podciśnienie w strzykawce do momentu pobrania do 10 mililitrów kolców szpiku kostnego. Nie należy przyjmować więcej niż 10 mililitrów szpiku kostnego na aspirat, aby uniknąć hemodilutacji. Wyjąć strzykawkę i umieścić rurkę z powrotem na igle.
Następnie wyrzuć około dwóch mililitrów szpiku do szkiełka zegarka i upewnij się, że pobrano wystarczającą ilość próbki, aby można ją było wstrzyknąć do ośmiomililitrowej probówki pokrytej heparyną i natychmiast odwróć probówkę. Aby zapobiec zakrzepom, ważne jest, aby zainwestować rurkę zawierającą antykoagulant zaraz po dodaniu szpiku kostnego. Aby uzyskać optymalną ocenę morfologiczną, użyj plastikowej szpatułki, aby przenieść kolce z aspiratu w szkiełku zegarkowym na szkiełko podstawowe i ostrożnie nasuń kolejny szkiełko na szkiełko.
Po wyschnięciu wybarwić kolce preparatem May-Grunwald Giemsa do analizy za pomocą mikroskopii świetlnej. Umieść rurkę szpiku kostnego w plastikowym uchwycie i umieść uchwyt w plastikowym pojemniku z wkładem żelowym i wypełnionym formularzem wniosku. Przed analizą szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej uruchom cytometr przepływowy i otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej, aby utworzyć nowy eksperyment z wykresem punktowym rozproszenia do przodu i z boku.
Aby ocenić wielkość i ziarnistość komórek, należy załadować nieoznakowane lizowane komórki krwi obwodowej od zdrowego dawcy i wybrać funkcję Pozyskaj komórki. Bramkować limfocyty i dostosować napięcia rozpraszania do przodu i boku, aby osiągnąć odpowiednie średnie wartości docelowe dla populacji bramkowanych komórek. Następnie pobierz dane dla co najmniej 10 000 zdarzeń.
Aby ustawić docelowe napięcia lampy powielacza zdjęć kanału kwiatowego, najpierw użyj ośmioszczytowych cząstek kalibracyjnych tęczowych koralików zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać 10 000 zdarzeń przy niskim natężeniu przepływu. Zbierz koraliki singletowe na wykresie kropkowym z przodu i z boku, a następnie bramkuj 7. szczyt na wykresie punktowym FITC-PE. Bramkować powstałe populacje kulek dla każdego fluoroforu.
Kontynuuj pozyskiwanie ośmioszczytowego zawieszenia tęczowych koralików oraz dostosuj i dostrojenie napięcia PMT we wszystkich kanałach fluorescencyjnych, aby osiągnąć docelowe wartości MFI zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj Rekordu, aby zebrać dane o około 2 000 zdarzeń i sprawdź MFI dla 7. koralików szczytowych. Następnie dodaj wystarczającą objętość każdego eksperymentalnego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem, aby wybarwić kulki w odpowiednich probówkach kwiatowych minus jedna kontrola i dokładnie wymieszać probówki.
Utwórz nowy ślepy eksperyment z tymi samymi parametrami kompensacji, zwracając uwagę, że próg rozproszenia do przodu jest ustawiony na 5 000, a wartości kompensacji wszystkich fluorochromów wynoszą zero. Aby utworzyć kontrolki kompensacji, wybierz funkcję Utwórz kontrolę kompensacji i załaduj niepoplamioną rurkę kontrolną. Dostosuj bramkę P1 wokół populacji koralików singletowych i upewnij się, że bramka P1 zawiera tylko koraliki singletowe.
Kliknij prawym przyciskiem myszy bramkę P1 i wybierz polecenie Zastosuj do wszystkich kontrolek kompensacji. Następnie zapisz dane dla wszystkich pojedynczo znakowanych probówek kwiatostanowych, potwierdzając, że bramka P2 obejmuje populację dodatnią na każdym histogramie kwiatescencji. Aby wybarwić komórki do analizy cytometrii przepływowej, należy przetransportować szpik kostny do laboratorium, sprawdzić formularz wniosku w celu zweryfikowania numeru badania pacjenta i daty urodzenia oraz określenia, co należy wybarwić.
W przypadku MRD używamy panelu barwiącego składającego się z czterech probówek. Tutaj pokazujemy barwienie panelu LSC, który składa się z jednej rurki. Po zliczeniu komórek przenieś odpowiednią objętość szpiku kostnego do nowej 15-mililitrowej probówki.
Dodaj bufor do lizy przy 10-krotności eksperymentalnej objętości komórek, aby lizować czerwone krwinki. Odwróć probówkę, aby wymieszać i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu lizy osadzać komórki przez odwirowanie.
Ponownie zawiesić komórki w 15 mililitrach buforu do płukania w temperaturze pokojowej i ponownie zebrać osad komórkowy przez odwirowanie. W międzyczasie odpipetować odpowiednią ilość roztworu koktajlu przeciwciał do pięciomililitrowych probówek FACS. Na zdjęciu panel do rurki z komórkami macierzystymi.
Zawiesić osad w buforze do przemywania i dodać zawiesinę komórki do probówki FACS zawierającej roztwór koktajlu przeciwciał monoklonalnych na 15-minutową inkubację w ciemności. Następnie umyj komórki w buforze do przemywania i peletki komórek przez odwirowanie. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach świeżego buforu do płukania.
Aby przeanalizować białaczkowe komórki macierzyste, dodaj cztery mikrolitry pustych kulek do zawiesiny komórek, która jest barwiona koktajlem przeciwciał komórek macierzystych. Następnie należy odczytać próbki przy użyciu wcześniej ustawionych parametrów, uzyskując co najmniej cztery razy od 10 do 6 zdarzeń z eksperymentalnych próbek pacjentów. Aby zidentyfikować immunofenotyp związany z białaczką obserwowany u około 90% pacjentów z ostrą białaczką szpikową, ważne jest, aby bramki blastyczne były odpowiednio ustawione, jak pokazano na ilustracji.
W tym miejscu przedstawiono przykłady danych od poszczególnych pacjentów z różnymi typami aberracji w prymitywnych komórkach CD34-dodatnich. Na tych wykresach można zaobserwować pacjenta, który pozostaje w całkowitej remisji i pacjenta, u którego nastąpił nawrót choroby po uzyskaniu mierzalnych dodatnich wyników choroby resztkowej po drugim cyklu terapii indukcyjnej, co podkreśla potrzebę dokładnego ustawienia bramki przed analizą próbki. Identyfikacja i kwantyfikacja LSC wymaga dodatkowej analizy nieprawidłowości, szczególnie w przypadku CD34-dodatnich komórek blastycznych CD38-ujemnych, jak pokazano na tych wykresach.
Podczas wykonywania tego protokołu bardzo ważne jest, aby mieć wyspecjalizowany i zapasowy personel do pobierania próbek szpiku kostnego, transportu, prac eksperymentalnych i etapów analizy tej procedury. Procedura ta może być również wykorzystana do przeprowadzenia analizy cytogenetycznej i molekularnej w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące korelacji między określonymi populacjami komórek a aberracjami molekularnymi będącymi przedmiotem zainteresowania lub w celu doprecyzowania grupy ryzyka pacjenta w celu przewidywania wyniku klinicznego. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie hematologii do zbadania choroby resztkowej u pacjentów z AML po leczeniu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób dokładnie identyfikujemy i określamy ilościowo chorobę resztkową za pomocą cytometrii przepływowej, w tym pobierania i transportu próbek szpiku kostnego od pacjentów z AML.
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół dokładnego badania próbek szpiku kostnego pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML) w celu wykrycia oznaczalnej choroby resztkowej (MRD). Metoda podkreśla reprodukowalność i wysoką jakość wyników, które są kluczowe dla podejmowania decyzji klinicznych dotyczących leczenia AML.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Hematologia
- Onkologia
- Diagnostyka kliniczna
Tło
- MRD jest istotnym biomarkerem prognostycznym w AML.
- Dokładne wykrywanie MRD może doprecyzować ocenę ryzyka.
- Wytyczne dotyczące wykrywania MRD mogą pomóc w decyzjach leczenia.
- Pobranie szpiku kostnego jest krytyczne dla oceny MRD.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodny protokół do wykrywania MRD u pacjentów z AML.
- Aby sprecyzować liczbę komórek macierzystych białaczki w próbkach szpiku kostnego.
- Aby poprawić podejmowanie decyzji klinicznych na podstawie oceny MRD.
Stosowane metody
- Nabór szpiku kostnego za pomocą igły 15-gage.
- Cytometria przepływowa do analizy populacji komórek.
- Procedury barwienia do identyfikacji komórek.
- Zastosowanie specyficznych przeciwciał do wykrywania komórek macierzystych białaczki.
Główne wyniki
- Protokół daje wyniki o wysokiej reprodukowalności.
- Można osiągnąć dokładne sprecyzowanie MRD.
- Cytometria przepływowa zapewnia szczegółowe informacje o populacjach komórek.
- Skuteczne monitorowanie reakcji pacjenta na leczenie.
Wnioski
- Konsekwentne wykrywanie MRD jest istotne dla zarządzania AML.
- Opisany protokół może poprawić wyniki leczenia.
- Zachęca się do dalszej walidacji metody.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of measurable residual disease (MRD) and leukemic stem cells (LSC) in acute myeloid leukemia (AML) bone marrow samples is critical for predictive risk assessment and therapeutic decision-making in discovery and translational pipelines. Standardized, reproducible MRD and LSC measurement enables robust biomarker-driven stratification, supporting risk-adjusted portfolio advancement and reducing late-stage biological uncertainty. Harmonized protocols for bone marrow sampling and flow cytometry analysis strengthen cross-study comparability and enterprise-level data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of disease-relevant cell populations through precise MRD and LSC quantification.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing residual leukemic cells post-treatment.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated flow cytometry gating strategies for reproducible detection of rare cell populations.
- Standardizes sample processing and staining panels for scalable assay deployment.
- Delivers quantitative outputs essential for downstream compound evaluation and screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns MRD and LSC measurement with translational biomarker strategies for clinical outcome prediction.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by linking cellular phenotypes to molecular aberrancies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust residual disease assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through translational research, providing a standardized workflow for MRD and LSC quantification in AML bone marrow samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by enabling detection of residual leukemic and stem cell populations.
- Screening: Ensures assay reproducibility and quantitative readouts through harmonized flow cytometry procedures.
- Analytics: Delivers high-fidelity measurements and gating strategies for comparative analysis across patient samples and studies.
- Translational Research: Connects cellular and molecular data to clinical risk stratification and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for MRD and LSC assessment across research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in AML research.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in sample processing and analysis.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of AML therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires specialized expertise in bone marrow sampling and multi-color flow cytometry analysis.
- Demands access to calibrated flow cytometers, validated antibody panels, and robust analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, gating strategies, and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different AML subtypes or evolving immunophenotypic markers.
- Sample quality and hemodilution risk must be managed to ensure reliable MRD and LSC quantification.
