Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Ogólnym celem tego protokołu jest przeprowadzenie dokładnych badań próbek szpiku kostnego od pacjentów z ostrą białaczką szpikową pod kątem mierzalnej choroby resztkowej, w tym ilościowe określenie komórek macierzystych białaczki. Metoda ta może zapewnić dokładną ocenę mierzalnej choroby resztkowej w próbkach szpiku kostnego pacjentów z ostrą białaczką szpikową. Główną zaletą tego podejścia jest to, że ścisłe przestrzeganie protokołu daje wysoce powtarzalne wyniki wysokiej jakości.

Implikacje tej techniki rozciągają się na podejmowanie decyzji klinicznych, ponieważ można ją wykorzystać jako odczyt odpowiedzi pacjentów na leczenie. Procedury zademonstrują Jeroen Janssen, hematolog, Gerrit Sijm, technik z laboratorium hematologii diagnostycznej oraz Jennifer Scheick i Sander Snel, technicy zespołu MRD. Gdy pacjent znajduje się w bocznej pozycji odleżynowej, należy oznaczyć długopisem górny tylny odcinek biodrowy kręgosłupa i zdezynfekować skórę w zamierzonym obszarze biopsji 0,5 do 1% chlorheksydyny w etanolu ruchem okrężnym na zewnątrz.

Po podaniu znieczulenia miejscowego podnieś igłę o rozmiarze 15 x 2,8 cala z bliższym końcem w dłoni i palcem wskazującym przylegającym do boku metalowego trzonka igły w pobliżu końcówki w celu kontroli. Używając delikatnego, ale mocnego nacisku, wprowadź igłę szybkim, naprzemiennym, pronacyjnym, supinacyjnym ruchem przez znieczuloną skórę w kierunku kręgosłupa biodrowego. Gdy igła zetknie się z tylnym kręgosłupem biodrowym, wyjmij rurkę i przymocuj do igły pustą strzykawkę o pojemności 10 mililitrów.

Delikatnie wycofać tłok, aby wytworzyć podciśnienie w strzykawce do momentu pobrania do 10 mililitrów kolców szpiku kostnego. Nie należy przyjmować więcej niż 10 mililitrów szpiku kostnego na aspirat, aby uniknąć hemodilutacji. Wyjąć strzykawkę i umieścić rurkę z powrotem na igle.

Następnie wyrzuć około dwóch mililitrów szpiku do szkiełka zegarka i upewnij się, że pobrano wystarczającą ilość próbki, aby można ją było wstrzyknąć do ośmiomililitrowej probówki pokrytej heparyną i natychmiast odwróć probówkę. Aby zapobiec zakrzepom, ważne jest, aby zainwestować rurkę zawierającą antykoagulant zaraz po dodaniu szpiku kostnego. Aby uzyskać optymalną ocenę morfologiczną, użyj plastikowej szpatułki, aby przenieść kolce z aspiratu w szkiełku zegarkowym na szkiełko podstawowe i ostrożnie nasuń kolejny szkiełko na szkiełko.

Po wyschnięciu wybarwić kolce preparatem May-Grunwald Giemsa do analizy za pomocą mikroskopii świetlnej. Umieść rurkę szpiku kostnego w plastikowym uchwycie i umieść uchwyt w plastikowym pojemniku z wkładem żelowym i wypełnionym formularzem wniosku. Przed analizą szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej uruchom cytometr przepływowy i otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej, aby utworzyć nowy eksperyment z wykresem punktowym rozproszenia do przodu i z boku.

Aby ocenić wielkość i ziarnistość komórek, należy załadować nieoznakowane lizowane komórki krwi obwodowej od zdrowego dawcy i wybrać funkcję Pozyskaj komórki. Bramkować limfocyty i dostosować napięcia rozpraszania do przodu i boku, aby osiągnąć odpowiednie średnie wartości docelowe dla populacji bramkowanych komórek. Następnie pobierz dane dla co najmniej 10 000 zdarzeń.

Aby ustawić docelowe napięcia lampy powielacza zdjęć kanału kwiatowego, najpierw użyj ośmioszczytowych cząstek kalibracyjnych tęczowych koralików zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać 10 000 zdarzeń przy niskim natężeniu przepływu. Zbierz koraliki singletowe na wykresie kropkowym z przodu i z boku, a następnie bramkuj 7. szczyt na wykresie punktowym FITC-PE. Bramkować powstałe populacje kulek dla każdego fluoroforu.

Kontynuuj pozyskiwanie ośmioszczytowego zawieszenia tęczowych koralików oraz dostosuj i dostrojenie napięcia PMT we wszystkich kanałach fluorescencyjnych, aby osiągnąć docelowe wartości MFI zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj Rekordu, aby zebrać dane o około 2 000 zdarzeń i sprawdź MFI dla 7. koralików szczytowych. Następnie dodaj wystarczającą objętość każdego eksperymentalnego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem, aby wybarwić kulki w odpowiednich probówkach kwiatowych minus jedna kontrola i dokładnie wymieszać probówki.

Utwórz nowy ślepy eksperyment z tymi samymi parametrami kompensacji, zwracając uwagę, że próg rozproszenia do przodu jest ustawiony na 5 000, a wartości kompensacji wszystkich fluorochromów wynoszą zero. Aby utworzyć kontrolki kompensacji, wybierz funkcję Utwórz kontrolę kompensacji i załaduj niepoplamioną rurkę kontrolną. Dostosuj bramkę P1 wokół populacji koralików singletowych i upewnij się, że bramka P1 zawiera tylko koraliki singletowe.

Kliknij prawym przyciskiem myszy bramkę P1 i wybierz polecenie Zastosuj do wszystkich kontrolek kompensacji. Następnie zapisz dane dla wszystkich pojedynczo znakowanych probówek kwiatostanowych, potwierdzając, że bramka P2 obejmuje populację dodatnią na każdym histogramie kwiatescencji. Aby wybarwić komórki do analizy cytometrii przepływowej, należy przetransportować szpik kostny do laboratorium, sprawdzić formularz wniosku w celu zweryfikowania numeru badania pacjenta i daty urodzenia oraz określenia, co należy wybarwić.

W przypadku MRD używamy panelu barwiącego składającego się z czterech probówek. Tutaj pokazujemy barwienie panelu LSC, który składa się z jednej rurki. Po zliczeniu komórek przenieś odpowiednią objętość szpiku kostnego do nowej 15-mililitrowej probówki.

Dodaj bufor do lizy przy 10-krotności eksperymentalnej objętości komórek, aby lizować czerwone krwinki. Odwróć probówkę, aby wymieszać i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu lizy osadzać komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić komórki w 15 mililitrach buforu do płukania w temperaturze pokojowej i ponownie zebrać osad komórkowy przez odwirowanie. W międzyczasie odpipetować odpowiednią ilość roztworu koktajlu przeciwciał do pięciomililitrowych probówek FACS. Na zdjęciu panel do rurki z komórkami macierzystymi.

Zawiesić osad w buforze do przemywania i dodać zawiesinę komórki do probówki FACS zawierającej roztwór koktajlu przeciwciał monoklonalnych na 15-minutową inkubację w ciemności. Następnie umyj komórki w buforze do przemywania i peletki komórek przez odwirowanie. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach świeżego buforu do płukania.

Aby przeanalizować białaczkowe komórki macierzyste, dodaj cztery mikrolitry pustych kulek do zawiesiny komórek, która jest barwiona koktajlem przeciwciał komórek macierzystych. Następnie należy odczytać próbki przy użyciu wcześniej ustawionych parametrów, uzyskując co najmniej cztery razy od 10 do 6 zdarzeń z eksperymentalnych próbek pacjentów. Aby zidentyfikować immunofenotyp związany z białaczką obserwowany u około 90% pacjentów z ostrą białaczką szpikową, ważne jest, aby bramki blastyczne były odpowiednio ustawione, jak pokazano na ilustracji.

W tym miejscu przedstawiono przykłady danych od poszczególnych pacjentów z różnymi typami aberracji w prymitywnych komórkach CD34-dodatnich. Na tych wykresach można zaobserwować pacjenta, który pozostaje w całkowitej remisji i pacjenta, u którego nastąpił nawrót choroby po uzyskaniu mierzalnych dodatnich wyników choroby resztkowej po drugim cyklu terapii indukcyjnej, co podkreśla potrzebę dokładnego ustawienia bramki przed analizą próbki. Identyfikacja i kwantyfikacja LSC wymaga dodatkowej analizy nieprawidłowości, szczególnie w przypadku CD34-dodatnich komórek blastycznych CD38-ujemnych, jak pokazano na tych wykresach.

Podczas wykonywania tego protokołu bardzo ważne jest, aby mieć wyspecjalizowany i zapasowy personel do pobierania próbek szpiku kostnego, transportu, prac eksperymentalnych i etapów analizy tej procedury. Procedura ta może być również wykorzystana do przeprowadzenia analizy cytogenetycznej i molekularnej w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące korelacji między określonymi populacjami komórek a aberracjami molekularnymi będącymi przedmiotem zainteresowania lub w celu doprecyzowania grupy ryzyka pacjenta w celu przewidywania wyniku klinicznego. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie hematologii do zbadania choroby resztkowej u pacjentów z AML po leczeniu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób dokładnie identyfikujemy i określamy ilościowo chorobę resztkową za pomocą cytometrii przepływowej, w tym pobierania i transportu próbek szpiku kostnego od pacjentów z AML.