Name: Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do wykrywania mierzalnej choroby resztkowej w ostrej białaczce szpikowej. Metoda ta umożliwia dokładną kwantyfikację białaczkowych komórek macierzystych i wspomaga podejmowanie decyzji klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte przez Holenderskie Towarzystwo Onkologiczne (ALPE 2013-6371) i fundację Egbers dla VONK. Dziękujemy holenderskiej grupie roboczej ds. przeciwdziałania praniu pieniędzy i mrż za współpracę i owocne dyskusje na temat ciągłego doskonalenia i standaryzacji AML-MRD.

<ol><li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults%3A+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li>
<li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li>
<li>Cornelissen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+European+LeukemiaNet+AML+Working+Party+consensus+statement+on+allogeneic+HSCT+for+patients+with+AML+in+remission%3A+an+integrated-risk+adapted+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).</li>
<li>Grimwade, D., Freeman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia%3A+which+platforms+are+ready+for+%26%2334%3Bprime+time%26%2334%3B%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for &#34;prime time&#34;?</a> Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).</li>
<li>Krönke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+minimal+residual+disease+in+NPM1-mutated+acute+myeloid+leukemia%3A+a+study+from+the+German-Austrian+acute+myeloid+leukemia+study+group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group.</a> J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prognostic+impact+of+flow+cytometric+minimal+residual+disease+detection+in+acute+myeloid+leukemia%3A+data+from+the+HOVON%2FSAKK+AML+42A+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study.</a> J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).</li>
<li>van der Velden, V. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+flowcytometric+minimal+residual+disease+detection+in+pediatric+acute+myeloid+leukemia+patients+treated+according+to+the+DCOG+ANLL97%2FMRC+AML12+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol.</a> Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).</li>
<li>Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRD+in+AML%3A+time+for+redefinition+of+CR%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">MRD in AML: time for redefinition of CR?</a> Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).</li>
<li>Feller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRD+parameters+using+immunophenotypic+detection+methods+are+highly+reliable+in+predicting+survival+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
<li>Paietta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+minimal+residual+disease+%28MRD%29+in+leukemia%3A+a+changing+definition+and+concept%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept?</a> Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).</li>
<li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+disease+detected+by+multidimensional+flow+cytometry+signifies+high+relapse+risk+in+patients+with+de+novo+acute+myeloid+leukemia%3A+a+report+from+Children%27s+Oncology+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group.</a> Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).</li>
<li>Zeijlemaker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+one-tube+assay+for+immunophenotypical+quantification+of+leukemic+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).</li>
<li>Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. , 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html">https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html</a> (2017).</li>
<li>Bachas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+minor+subpopulations+within+the+leukemic+blast+compartment+of+AML+patients+at+initial+diagnosis+in+the+development+of+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse.</a> Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).</li>
<li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li>
<li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li>
</ol>

Koktajle przeciwciał używane do walidacji probówki z komórkami macierzystymi w kilku niezależnych instytutach zostały dostarczone przez BD. Autorzy nie mają nic do ujawnienia w związku z tym manuskryptem.

Dostępnych jest wiele danych, które wskazują na to, że dodatni wynik MRD jest związany ze słabym przeżyciem, a zatem ocena MRD może poprawić wyniki leczenia pacjentów, dostarczając dodatkowych informacji prognostycznych, na podstawie których można podjąć decyzje kliniczne. W związku z tym spójna i zharmonizowana metoda immunofenotypowej oceny MRD jest niezbędna, aby ostatecznie poprawić terapię pacjentów. Jest to również ważne przy porównywaniu badań klinicznych w różnych ośrodkach klinicznych i może ostatecznie pomóc w podejmowaniu decyzji klinicznych i służyć jako zastępczy kliniczny punkt końcowy dla całkowitego przeżycia. Przekonanie, że solidne wytyczne są gwarantowane dla dokładnych i spójnych pomiarów MRD, doprowadziło do wspólnego działania Europejskiej Sieci ds. Białaczki (ELN) w celu opracowania najnowocześniejszych wytycznych. Ten obszerny dokument zostanie opublikowany pod koniec 2017 r. i będzie miał zasadnicze znaczenie dla wielu grup badawczych i laboratoriów w przyszłości. 
Krytyczne kroki w ramach protokołu
Ważnym, a często pomijanym aspektem analizy MRD jest wpływ jakości próbki na dokładne określenie MRD. Jest to bardziej widoczne, gdy materiał musi zostać przetransportowany do innych instytutów w ramach globalnych badań klinicznych, biorąc pod uwagę dodatkowe względy operacyjne, które należy wziąć pod uwagę w tych warunkach. Aby zmniejszyć ryzyko pomylenia informacji o pacjencie i terminowego dostarczenia próbek, kluczowe znaczenie ma odpowiednie podawanie. Również na tym etapie transportu wymagane są odpowiednie formularze i/lub import do elektronicznych systemów szpitalnych z jasnym przyporządkowaniem żądanej analizy. Istotne jest również zwrócenie uwagi na etap leczenia pobierania próbek MRD, ponieważ może ono mieć znaczenie dla podejmowania decyzji klinicznych (na przykład po drugim cyklu leczenia) i dlatego powinno być jasno określone. Stosowanie danych pozorowanych (takich jak np. 1 stycznia na rok urodzenia) zwiększa ryzyko pomylenia pacjentów lub analiz. Jeśli jest to wymagane przez prawo, należy zastosować alternatywny, zanonimizowany sposób identyfikacji.
Wszystkie próbki do immunofenotypowania należy poddać preferencyjnej obróbce w ciągu 24 godzin od pobrania. Chociaż nie jest to zalecane, próbki szpiku kostnego i krwi obwodowej mogą być nadal przetwarzane i analizowane, jeśli są przechowywane do 72 godzin w temperaturze otoczenia. Ponadto, wszystkie czynności związane z materiałem mogą być najlepiej wykonywane w sterylnych warunkach, więc dalsza kriokonserwacja komórek w (lokalnych) biobankach pozostaje istotna: wiele badań klinicznych ma dodatkowe analizy w celu dalszego zbadania komórek białaczkowych w odniesieniu do cech molekularnych, immunofenotypowych i funkcjonalnych, które zostaną przeprowadzone na późniejszym etapie. Jednak szczegóły dotyczące biobankowania nie wchodzą w zakres tego manuskryptu.
Stosowanie MRD jako narzędzia diagnostycznego oznacza, że potrzebuje ono akredytowanego laboratorium, nie tylko do cytometrii przepływowej, ale także w zakresie kontroli jakości oceny MRD. Może to wymagać dystrybucji próbek do określonych laboratoriów referencyjnych lub (ponownej) analizy plików przepływu z pomiarami MRD przez zespoły referencyjne. 
W tym artykule opisano najważniejsze działania, od pobrania aspiratu szpiku kostnego po oznaczenie MRD w próbkach klinicznych - wymagające całego zespołu ekspertów z określonymi zadaniami, odpowiedzialnością i częstą komunikacją w celu skutecznej charakterystyki i analizy. Ponieważ każde zadanie ma kluczowe znaczenie dla procedury, zaleca się zapewnienie solidnej logistyki, w tym protokołów, w każdym laboratorium oraz wystarczającej liczby personelu pomocniczego, który został specjalnie przeszkolony do tego zadania. Ponadto, ze względu na to, że w części procedur występują pewne stosunkowo subiektywne kroki (zwłaszcza identyfikacja markerów nieprawidłowych LAIP i LSC), konieczne jest przeprowadzenie dyskusji na temat końcowego wyniku przez zespół i zatwierdzenie raportu końcowego przez zespół przełożonych. Obecnie prowadzone są prace nad oprogramowaniem komputerowym, które pomoże ustandaryzować analizę MRD (LAIP i LSC).
Modyfikacja i rozwiązywanie problemów
Każde laboratorium może mieć swój własny zestaw przeciwciał, które można wykorzystać do zdefiniowania różnych subpopulacji, chociaż posiadanie znormalizowanego szkieletu markerów jest niezbędne do uzyskania porównywalnych wyników, jak określono w dokumencie ELN State of the Art Guidelines for MRD, o którym mowa powyżej. Niezależnie od wybranych markerów, istnieją pewne kwestie, które mogą utrudnić analizę wyników i muszą być wzięte pod uwagę. 
Ograniczenia techniki
Identyfikacja ekspresji nieprawidłowych markerów LAIP i LSC jest najpierw oceniana w momencie rozpoznania i monitorowana w czasie (w trakcie i po terapii) w celu dokładnej charakterystyki fenotypu MRD. Podczas gdy ponad 95% pacjentów można ocenić za pomocą LAIP lub LSC (lub obu), nadal niektórzy pacjenci nie mają zdefiniowanych LAIP lub nie mają CD34+CD38- LSC lub mają blasty CD34 ujemne lub brakuje im próbki diagnostycznej. W takich przypadkach nadal warto spróbować zmierzyć MRD za pomocą panelu przeciwciał tak szerokiego, jak pozwala na to liczba dostępnych komórek, a następnie wybrać najbardziej wiarygodny (dający najsilniejsze rozróżnienie komórek białaczkowych) LAIP. Biorąc pod uwagę, że odsetek pacjentów, u których ostatecznie dochodzi do nawrotu, nie jest w pełni podobny do immunofenotypu rozpoznanego, ze względu na niejednorodność choroby AML, pomiar szerokiego panelu przeciwciał w MRD jest i tak zalecany. Te zmiany immunofenotypowe obejmują komórki blastyczne i LSC i wykazano, że występują podczas terapii16 , a mierzalna choroba może być oparta na tych tak zwanych nadchodzących populacjach. W tej chwili nie ustalono jednak, czy wszystkie subpopulacje immunofenotypowe doprowadzą do nawrotu choroby, a zatem nie jest powszechną praktyką zgłaszanie terapii dostosowanej do MRD opartej na tych komórkach w badaniach klinicznych. Należy zauważyć, że ryzyko braku LSC z powodu przesunięć populacji jest zmniejszone dzięki podejściu jednoprobówkowemu, w którym najważniejsze markery definiujące aberrację znajdują się w jednym kanale cytometrii przepływowej (PE)14.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Metoda opisana w tym protokole opiera się na definicji jednego lub więcej LAIP, które komórki są obserwowane podczas terapii. Wadą tej metody jest to, że niedawno wykazano, że LAIP może się zmieniać w trakcie terapii. W ten sposób niektóre nadchodzące populacje z różnymi nieprawidłowymi markerami mogą zostać pominięte. Aby tego uniknąć, najlepiej byłoby zmierzyć wszystkie nieprawidłowe markery, a nie tylko te, które stwierdzono w momencie diagnozy. Byłoby to wówczas podobne do podejścia "odmiennego od normalnego", które jest stosowane przez kilka laboratoriów17.
Przyszłe zastosowania
Ostatnio MRD zyskało dodatkową uwagę w związku z nowatorskim projektem badań klinicznych. W dobie specjalistycznych opcji leczenia i celowanej terapii lekowej, zastosowanie MRD jako miary wyniku skróci czas potrzebny do ustalenia skuteczności klinicznej nowych terapii, ostatecznie umożliwiając szybsze wprowadzenie pilnie potrzebnych opcji terapeutycznych do kliniki. Znaczenie odpowiedniej logistyki i praktycznego przeprowadzenia zharmonizowanej oceny MRD ma kluczowe znaczenie dla przyszłego sukcesu leczenia AML, ponieważ FDA bada obecnie możliwość zastosowania MRD jako zastępczego punktu końcowego zamiast miar całkowitego przeżycia18.

Ostra białaczka szpikowa (AML) to złośliwość szpiku kostnego charakteryzująca się defektami w programie dojrzewania, z nieprawidłową proliferacją i akumulacją mieloidalnych komórek progenitorowych, zahamowaniem prawidłowej hematopoezy i ostatecznie niewydolnością szpiku kostnego. Choroba jest wysoce niejednorodna pod względem morfologii, immunofenotypu, cytogenetyki, aberracji molekularnych i sygnatur ekspresji genów, a także odpowiedzi na leczenie i wyniku leczenia1,2. Obecne postępowanie obejmuje chemioterapię indukcyjną w celu osiągnięcia całkowitej remisji (CR), a następnie leczenie po remisji, które w dużej mierze opiera się na wynikach badań molekularnych, cytogenetycznych i immunofenotypowych i składa się z kilku cykli dodatkowej chemioterapii lub (autologicznego lub allogenicznego) przeszczepu komórek macierzystych3. Pomimo wysokich wskaźników remisji po intensywnej chemioterapii wynoszących do 90%, 5-letnie przeżycie u dorosłych wynosi tylko około 30%-40%, głównie ze względu na rozwój nawrotów, które są powszechnie oporne na chemioterapię, a tym samym bardzo trudne do leczenia. Wyniki u dzieci są lepsze, chociaż około jedna trzecia z nich również dochodzi do nawrotu choroby. Dlatego wczesne wykrycie zbliżającego się nawrotu choroby wypełni niezaspokojoną potrzebę medyczną i może ukierunkować terapię po remisji4. 
Choroba resztkowa po terapii może odzwierciedlać sumę wszystkich mechanizmów/czynników oporności diagnozy i po diagnozie; stąd jej pomiar może być prognostyczny i pomocny w kierowaniu leczeniem. Możliwość zdefiniowania choroby resztkowej (dawniej nazywanej minimalną chorobą resztkową, a obecnie określanej jako mierzalna choroba resztkowa lub MRD) znacznie poniżej kryterium morfologicznego 5% komórek blastycznych zmienia krajobraz klasyfikacji ryzyka. Obecnie dwie metody najczęściej stosowane do wykrywania MRD to cytometria przepływowa i metoda molekularna, przy czym ta ostatnia jest oceniana za pomocą PCR z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR)5 lub, choć na wczesnym etapie, za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Wiele badań zarówno u dorosłych, jak i u dzieci wykazało już, że różne podejścia MRD dostarczają silnych informacji prognostycznych w AML zarówno po terapii indukcyjnej, jak i konsolidacyjnej6,7, a obecnie pojawia się nowa definicja obciążenia chorobą (lepsza od morfologicznej CR)8. Sugeruje to, że MRD oceniane za pomocą technik przepływowych i/lub molekularnych powinno stać się, a w rzeczywistości już się staje, standardem w każdym badaniu klinicznym w AML. 
Ten manuskrypt omawia szczegółową procedurę cytometrii przepływowej w celu uzyskania dokładnej i powtarzalnej charakterystyki immunofenotypowej MRD w próbkach szpiku kostnego, w tym pobieranie szpiku kostnego i procedury przetwarzania poprzedzające cytometrię przepływową. Dostępność dobrej jakości próbek szpiku kostnego w momencie diagnozy i obserwacji ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego pomiaru w ośrodkach klinicznych i badaniach klinicznych. W rzeczywistości te względy przedanalityczne mają również kluczowe znaczenie dla molekularnych (PCR i NGS) podejść MRD. W celu charakterystyki immunofenotypowej MRD, markery o nieprawidłowej ekspresji są łączone z prawidłowymi markerami szpikowymi i progenitorowymi, w celu identyfikacji immunofenotypu związanego z białaczką (LAIP)<klasa sup='xref'>9. MRD mierzy wypadkową wielu czynników wpływających na odpowiedź na leczenie, takich jak wrodzona lub nabyta oporność na leki w białaczce, farmakodynamika i kinetyka terapii, nadzór immunologiczny i przestrzeganie zaleceń. W związku z tym MRD jest bardzo silnym parametrem prognostycznym po diagnozie związanym z wynikiem klinicznym, gdy jest dychotomiczny na poziomie odcięcia określonym przez analizę charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Dla naszej dorosłej kohorty AML w badaniu HOVON 42a poziom odcięcia ustalono na 0,1% komórek LAIP dodatnich/całkowitej liczby białych krwinek. Korzystając z tego kryterium do określenia negatywnego i dodatniego statusu MRD, można zidentyfikować grupę pacjentów, którzy mają znacznie gorszą częstość nawrotów, wolne od nawrotów i całkowite przeżycie6. Dodatkowo opisujemy pomiar niedojrzałych, lekoopornych komórek białaczkowych o cechach podobnych do komórek macierzystych (CD34 + CD38- komórki macierzyste białaczki lub LSC), które oferują silny predyktor wyniku pacjenta10. Podejścia LAIP i LSC tworzą razem podejście MRD oparte na cytometrii przepływowej. Podejście LAIP jest odpowiednie dla około 90% pacjentów, podczas gdy podejście LSC może być stosowane u około 80% pacjentów. Łącznie ponad 95% pacjentów może być ocenianych pod kątem jednego parametru lub obu. 
Na koniec, ta publikacja zawiera szczegółowy opis operacyjny do oceny MRD za pomocą cytometrii przepływowej. Obejmuje to: 1) harmonizację i/lub standaryzację procedur pobierania próbek szpiku kostnego, 2) wytyczne dotyczące transportu próbek, 3) szczegółowy opis wykrywania komórek białaczkowych za pomocą FACS przy użyciu kilku paneli przeciwciał, w tym podejść z pojedynczą rurką komórkową w celu scharakteryzowania LSC, 4) ustawienie maszyn FACS do standardowych pomiarów, 5) programy analityczne do pomiarów MRD i 6) programy analityczne do wykrywania LSC.
Staramy się pokazać wszystkie aspekty procedury, w tym przygotowanie próbki, ponieważ rzadko się o tym mówi, podczas gdy jest to ważna kwestia dla jakości końcowego wyniku. Aspiracja szpiku kostnego i biopsja to procedury kliniczne stosowane do oceny komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym. Wykonuje się je razem z pełną morfologią krwi (CBC) i rozmazem krwi. Optymalna metoda aspiracji szpiku kostnego ma kluczowe znaczenie dla dokładnej diagnozy i obserwacji pomiaru MRD. Ponadto udany aspirat szpiku kostnego powinien zawierać wystarczającą liczbę komórek do przeprowadzenia analizy przepływu LAIP i LSC (co najmniej 10 milionów żywych komórek). W tym miejscu opisujemy sposób wykonania aspiracji szpiku kostnego i podajemy wytyczne, które powinny skutkować odpowiednim pobraniem próbek komórek (i ograniczeniem potencjału hemodilucji) potrzebnym do dokładnej diagnostyki i dodatkowych badań. Te rozważania przedanalityczne mają również zasadnicze znaczenie dla molekularnych (PCR i NGS) podejść MRD. Wszystkie próbki do immunofenotypowania należy poddać preferencyjnej obróbce w ciągu 24 godzin od pobrania. Chociaż nie jest to zalecane, próbki szpiku kostnego i krwi obwodowej mogą być nadal przetwarzane i analizowane, jeśli są przechowywane do 72 godzin w temperaturze otoczenia. Ponadto wszystkie czynności związane z materiałem powinny być wykonywane w sterylnych warunkach, aby umożliwić kriokonserwację sterylnych komórek do późniejszych badań/oceny jakości itp.

<table><tbody><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>120995496,060996589 oraz 013729</td><td>FACS Canto II&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555360</td><td>CD7 FITC</td></tr><tr><td></td><td>DAKO</td><td>F076701</td><td>CD2 FITC</td></tr><tr><td></td><td>Sanquin</td><td>M1613</td><td>CD36 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332778</td><td>CD15 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>335039</td><td>CD45RA FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345785</td><td>CD14 PE</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-801</td><td>CD133 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562566</td><td>Clec12a PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>565568</td><td>Tim-3 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332774</td><td>CD7 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>333142</td><td>CD11b PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>347222</td><td>CD34 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>558714</td><td>CD123 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>B49221</td><td>CD117 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>562854</td><td>CD33 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345791</td><td>CD19 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>333143</td><td>CD11b APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345800</td><td>CD33 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345807</td><td>CD38 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>641411</td><td>HLA-DR APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>560532</td><td>CD44 APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562596</td><td>CD13 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>348811</td><td>CD34 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>A96416</td><td>CD45 Krome Orange</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655873</td><td>CD45 HV500c</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>koraliki CST&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Pharm roztwór</td></tr><tr><td></td> lizujący <td>BD Biosciences</td><td>644204</td><td>Multicolor CompBeads</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>Koraliki</td></tr><tr><td></td> CST <td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva oprogramowanie</td></tr><tr><td></td><td>Cytognos</td><td></td><td>Infinicyt&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>Euroflow RCP-30-5a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rozwiązanie</td><td></td>Sigma-Aldrich <td></td> Tuerk</tr><tr><td>Spherotech</td><td>BCP-100-5</td><td>Puste kulki kalibracyjne cząstek</td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Przepisy HSA</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Azydek</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>ddH2O</td></tr></tbody></table>

kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Kryteria odpowiedzi w ostrej białaczce szpikowej (AML) zostały niedawno ponownie ustalone, a badanie morfologiczne zostało wykorzystane do określenia, czy pacjenci osiągnęli całkowitą remisję (CR). U około połowy dorosłych pacjentów, którzy weszli do CR, dojdzie do nawrotu choroby w ciągu 12 miesięcy z powodu przerostu resztkowych komórek AML w szpiku kostnym. Kwantyfikacja tych pozostałych komórek białaczkowych, znana jako minimalna lub mierzalna choroba resztkowa (MRD), może być solidnym biomarkerem do przewidywania tych nawrotów. Co więcej, retrospektywna analiza kilku badań wykazała, że obecność MRD w szpiku kostnym pacjentów z AML koreluje ze słabym przeżyciem. Nie tylko cała populacja chorych na białaczkę, odzwierciedlona przez komórki zawierające fenotyp immunologiczny związany z białaczką (LAIP), jest związana z wynikiem klinicznym, ale także niedojrzała subpopulacja komórek macierzystych białaczki o niskiej częstotliwości (LSC), z których obie mogą być monitorowane za pomocą cytometrii przepływowej MRD lub podejść podobnych do MRD. Dostępność czułych testów, które umożliwiają wykrywanie resztkowych komórek białaczkowych (macierzystych) na podstawie cech specyficznych dla choroby lub związanych z chorobą (nieprawidłowe markery molekularne lub nieprawidłowe immunofenotypy) znacznie poprawiła ocenę MRD w AML. Biorąc jednak pod uwagę nieodłączną heterogeniczność i złożoność AML jako choroby, metody pobierania próbek szpiku kostnego i przeprowadzania analiz MRD i LSC powinny być zharmonizowane, gdy tylko jest to możliwe. W tym manuskrypcie opisano szczegółową metodologię odpowiedniego pobierania próbek aspiratu szpiku kostnego, transportu, przetwarzania próbek w celu optymalnej oceny wielokolorowej cytometrii przepływowej oraz strategii bramkowania do oceny MRD i LSC, aby pomóc w podejmowaniu decyzji terapeutycznych u pacjentów z AML.

U 90% pacjentów z AML można zidentyfikować co najmniej jeden LAIP. Aby uzyskać dokładne wartości procentowe komórek LAIP+ wśród prymitywnych blastów w momencie diagnozy, kluczowe jest odpowiednie ustawienie bramki dla blastów, co wymaga weryfikacji, zgodnie z obrazowaniem na Rysunku 3. Przykład pacjenta z konkretnym typem aberracji w prymitywnych komórkach CD34+ przedstawiono na Rysunku 5. Do pomiaru MRD podczas obserwacji gatedowane są wcześniej zdefiniowane komórki LAIP+, a wynik definiuje się jako procent komórek LAIP+ w obrębie WBC. Zatem ustawienie tej bramki jest kluczowe dla uzyskania prawidłowych wyników MRD. Rysunek 6 przedstawia pacjenta pozostającego w całkowitej remisji oraz pacjenta, u którego nastąpił nawrót po uzyskaniu dodatnich wyników MRD (≥ 0.1 %) po drugim cyklu terapii indukcyjnej.
Niniejszy protokół nadaje się wyłącznie do definiowania komórek macierzystych w komórkach CD34+, ponieważ szczegółowa charakterystyka tej frakcji wykazała, że populacja CD38- zawiera najbardziej potencjalną frakcję o charakterze komórek macierzystych. W celu oddzielenia LSC od HSC w obrębie tej frakcji stosuje się dodatkowe markery. Najczęściej wybieranymi markerami do rozróżniania LSC są CD45RA oraz kanał kombinowany zawierający 6 specyficznych markerów LSC znakowanych PE. Na podstawie dalszych ocen klinicznych poziom odcięcia ≥ 0,004% zdefiniowano jako LSC-dodatni, co wiązało się z gorszym przeżyciem w momencie diagnozy, natomiast w badaniach kontrolnych stosowano poziom odcięcia 0,0001%10.
<img alt="Morfologia komórek, obrazy mikroskopowe barwionych komórek w skali 10µm do analizy histopatologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Rozmaz szpiku kostnego. A) zdrowy dawca i B) pacjent z AML (podtyp FAB 5). Barwienie Giemsą, powiększenie 100x. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat pakowania preparatów biologicznych; warstwy obejmują opakowanie zewnętrzne, wkład chłodzący i główny pojemnik." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Prawidłowe materiały do pakowania płynów biologicznych. Więcej szczegółów na temat zasad i przepisów dotyczących transportu płynów biologicznych można znaleźć na stronie internetowej15 Centers for Disease Control and Prevention. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej z CD45 PerCP i CD34 APC; analiza wykresu rozrzutu populacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Strategia bramkowania w celu zdefiniowania blastów. A) Bramkowanie CD45dim, B) Bramkowanie blastów CD34+.
<img alt="Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej A-E analizujące populacje komórkowe, identyfikację leukocytów oraz markery CD." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Gating limfocytów. A) Niebieskie komórki to WBC przedstawione na wykresie FSC/SSC, B) Zielone komórki to limfocyty charakteryzujące się CD45high/SSClow, C) Przykłady negatywności dla CD34, D) negatywność dla CD117 oraz E) negatywność dla CD13, F) Różne typy komórek przedstawiono w zbiorczym drzewie populacyjnym. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy rozproszenia cytometrii przepływowej dla analizy markerów powierzchni komórkowych; diagramy przedstawiające markery CD34, CD33." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: LAIP w momencie diagnozy AML. A) LAIP oparty na aberracji międzywydajowej (CD7 na komórkach wykazujących ekspresję CD33), B) LAIP oparty na asynchronicznym różnicowaniu (CD11b na komórkach wykazujących ekspresję CD13), C) LAIP oparty na nadekspresji w porównaniu z komórkami prawidłowymi (CD34bardzo wysoka na komórkach wykazujących ekspresję CD13), D) LAIP oparty na niedoekspresji w porównaniu z komórkami prawidłowymi (HLA-DRniska na komórkach wykazujących ekspresję CD33). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy rozproszenia z cytometrii przepływowej przedstawiające analizę blastów, markery CD, diagnozę oraz wyniki obserwacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: LAIP monitorowany podczas terapii. A) Definicja LAIP w momencie diagnozy (CD34+/CD13+/CD33-) i zanik LAIP podczas obserwacji u pacjenta, u którego utrzymywała się całkowita remisja, B) Definicja LAIP w momencie diagnozy (CD117+/CD7+/CD33+) i utrzymywanie się LAIP podczas obserwacji u pacjenta z nawrotem choroby. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej pokazujący populacje komórek CD34/CD38; analiza biomarkerów z użyciem CD45RA FITC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Gating komórek macierzystych. A) Gating różnych populacji CD34+/CD38 w oparciu o kulek kalibracyjnych (CD38low znajduje się poniżej górnej granicy kulek, natomiast CD38very low definiuje się jako prawdziwe komórki negatywne reprezentujące LSC, które znajdują się poniżej mediany kulek), B) dwa przykłady pacjentów z rozróżnieniem między HSC a LSC w badaniu kontrolnym na podstawie ekspresji CD45RAneg oraz CD45RApos. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Ogólnym celem tego protokołu jest przeprowadzenie dokładnych badań próbek szpiku kostnego od pacjentów z ostrą białaczką szpikową pod kątem mierzalnej choroby resztkowej, w tym ilościowe określenie komórek macierzystych białaczki. Metoda ta może zapewnić dokładną ocenę mierzalnej choroby resztkowej w próbkach szpiku kostnego pacjentów z ostrą białaczką szpikową. Główną zaletą tego podejścia jest to, że ścisłe przestrzeganie protokołu daje wysoce powtarzalne wyniki wysokiej jakości.Implikacje tej techniki rozciągają się na podejmowanie decyzji klinicznych, ponieważ można ją wykorzystać jako odczyt odpowiedzi pacjentów na leczenie. Procedury zademonstrują Jeroen Janssen, hematolog, Gerrit Sijm, technik z laboratorium hematologii diagnostycznej oraz Jennifer Scheick i Sander Snel, technicy zespołu MRD. Gdy pacjent znajduje się w bocznej pozycji odleżynowej, należy oznaczyć długopisem górny tylny odcinek biodrowy kręgosłupa i zdezynfekować skórę w zamierzonym obszarze biopsji 0,5 do 1% chlorheksydyny w etanolu ruchem okrężnym na zewnątrz.Po podaniu znieczulenia miejscowego podnieś igłę o rozmiarze 15 x 2,8 cala z bliższym końcem w dłoni i palcem wskazującym przylegającym do boku metalowego trzonka igły w pobliżu końcówki w celu kontroli. Używając delikatnego, ale mocnego nacisku, wprowadź igłę szybkim, naprzemiennym, pronacyjnym, supinacyjnym ruchem przez znieczuloną skórę w kierunku kręgosłupa biodrowego. Gdy igła zetknie się z tylnym kręgosłupem biodrowym, wyjmij rurkę i przymocuj do igły pustą strzykawkę o pojemności 10 mililitrów.Delikatnie wycofać tłok, aby wytworzyć podciśnienie w strzykawce do momentu pobrania do 10 mililitrów kolców szpiku kostnego. Nie należy przyjmować więcej niż 10 mililitrów szpiku kostnego na aspirat, aby uniknąć hemodilutacji. Wyjąć strzykawkę i umieścić rurkę z powrotem na igle.Następnie wyrzuć około dwóch mililitrów szpiku do szkiełka zegarka i upewnij się, że pobrano wystarczającą ilość próbki, aby można ją było wstrzyknąć do ośmiomililitrowej probówki pokrytej heparyną i natychmiast odwróć probówkę. Aby zapobiec zakrzepom, ważne jest, aby zainwestować rurkę zawierającą antykoagulant zaraz po dodaniu szpiku kostnego. Aby uzyskać optymalną ocenę morfologiczną, użyj plastikowej szpatułki, aby przenieść kolce z aspiratu w szkiełku zegarkowym na szkiełko podstawowe i ostrożnie nasuń kolejny szkiełko na szkiełko.Po wyschnięciu wybarwić kolce preparatem May-Grunwald Giemsa do analizy za pomocą mikroskopii świetlnej. Umieść rurkę szpiku kostnego w plastikowym uchwycie i umieść uchwyt w plastikowym pojemniku z wkładem żelowym i wypełnionym formularzem wniosku. Przed analizą szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej uruchom cytometr przepływowy i otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej, aby utworzyć nowy eksperyment z wykresem punktowym rozproszenia do przodu i z boku.Aby ocenić wielkość i ziarnistość komórek, należy załadować nieoznakowane lizowane komórki krwi obwodowej od zdrowego dawcy i wybrać funkcję Pozyskaj komórki. Bramkować limfocyty i dostosować napięcia rozpraszania do przodu i boku, aby osiągnąć odpowiednie średnie wartości docelowe dla populacji bramkowanych komórek. Następnie pobierz dane dla co najmniej 10 000 zdarzeń.Aby ustawić docelowe napięcia lampy powielacza zdjęć kanału kwiatowego, najpierw użyj ośmioszczytowych cząstek kalibracyjnych tęczowych koralików zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać 10 000 zdarzeń przy niskim natężeniu przepływu. Zbierz koraliki singletowe na wykresie kropkowym z przodu i z boku, a następnie bramkuj 7. szczyt na wykresie punktowym FITC-PE. Bramkować powstałe populacje kulek dla każdego fluoroforu.Kontynuuj pozyskiwanie ośmioszczytowego zawieszenia tęczowych koralików oraz dostosuj i dostrojenie napięcia PMT we wszystkich kanałach fluorescencyjnych, aby osiągnąć docelowe wartości MFI zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj Rekordu, aby zebrać dane o około 2 000 zdarzeń i sprawdź MFI dla 7. koralików szczytowych. Następnie dodaj wystarczającą objętość każdego eksperymentalnego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem, aby wybarwić kulki w odpowiednich probówkach kwiatowych minus jedna kontrola i dokładnie wymieszać probówki.Utwórz nowy ślepy eksperyment z tymi samymi parametrami kompensacji, zwracając uwagę, że próg rozproszenia do przodu jest ustawiony na 5 000, a wartości kompensacji wszystkich fluorochromów wynoszą zero. Aby utworzyć kontrolki kompensacji, wybierz funkcję Utwórz kontrolę kompensacji i załaduj niepoplamioną rurkę kontrolną. Dostosuj bramkę P1 wokół populacji koralików singletowych i upewnij się, że bramka P1 zawiera tylko koraliki singletowe.Kliknij prawym przyciskiem myszy bramkę P1 i wybierz polecenie Zastosuj do wszystkich kontrolek kompensacji. Następnie zapisz dane dla wszystkich pojedynczo znakowanych probówek kwiatostanowych, potwierdzając, że bramka P2 obejmuje populację dodatnią na każdym histogramie kwiatescencji. Aby wybarwić komórki do analizy cytometrii przepływowej, należy przetransportować szpik kostny do laboratorium, sprawdzić formularz wniosku w celu zweryfikowania numeru badania pacjenta i daty urodzenia oraz określenia, co należy wybarwić.W przypadku MRD używamy panelu barwiącego składającego się z czterech probówek. Tutaj pokazujemy barwienie panelu LSC, który składa się z jednej rurki. Po zliczeniu komórek przenieś odpowiednią objętość szpiku kostnego do nowej 15-mililitrowej probówki.Dodaj bufor do lizy przy 10-krotności eksperymentalnej objętości komórek, aby lizować czerwone krwinki. Odwróć probówkę, aby wymieszać i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu lizy osadzać komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić komórki w 15 mililitrach buforu do płukania w temperaturze pokojowej i ponownie zebrać osad komórkowy przez odwirowanie. W międzyczasie odpipetować odpowiednią ilość roztworu koktajlu przeciwciał do pięciomililitrowych probówek FACS. Na zdjęciu panel do rurki z komórkami macierzystymi.Zawiesić osad w buforze do przemywania i dodać zawiesinę komórki do probówki FACS zawierającej roztwór koktajlu przeciwciał monoklonalnych na 15-minutową inkubację w ciemności. Następnie umyj komórki w buforze do przemywania i peletki komórek przez odwirowanie. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach świeżego buforu do płukania.Aby przeanalizować białaczkowe komórki macierzyste, dodaj cztery mikrolitry pustych kulek do zawiesiny komórek, która jest barwiona koktajlem przeciwciał komórek macierzystych. Następnie należy odczytać próbki przy użyciu wcześniej ustawionych parametrów, uzyskując co najmniej cztery razy od 10 do 6 zdarzeń z eksperymentalnych próbek pacjentów. Aby zidentyfikować immunofenotyp związany z białaczką obserwowany u około 90% pacjentów z ostrą białaczką szpikową, ważne jest, aby bramki blastyczne były odpowiednio ustawione, jak pokazano na ilustracji.W tym miejscu przedstawiono przykłady danych od poszczególnych pacjentów z różnymi typami aberracji w prymitywnych komórkach CD34-dodatnich. Na tych wykresach można zaobserwować pacjenta, który pozostaje w całkowitej remisji i pacjenta, u którego nastąpił nawrót choroby po uzyskaniu mierzalnych dodatnich wyników choroby resztkowej po drugim cyklu terapii indukcyjnej, co podkreśla potrzebę dokładnego ustawienia bramki przed analizą próbki. Identyfikacja i kwantyfikacja LSC wymaga dodatkowej analizy nieprawidłowości, szczególnie w przypadku CD34-dodatnich komórek blastycznych CD38-ujemnych, jak pokazano na tych wykresach.Podczas wykonywania tego protokołu bardzo ważne jest, aby mieć wyspecjalizowany i zapasowy personel do pobierania próbek szpiku kostnego, transportu, prac eksperymentalnych i etapów analizy tej procedury. Procedura ta może być również wykorzystana do przeprowadzenia analizy cytogenetycznej i molekularnej w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące korelacji między określonymi populacjami komórek a aberracjami molekularnymi będącymi przedmiotem zainteresowania lub w celu doprecyzowania grupy ryzyka pacjenta w celu przewidywania wyniku klinicznego. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie hematologii do zbadania choroby resztkowej u pacjentów z AML po leczeniu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób dokładnie identyfikujemy i określamy ilościowo chorobę resztkową za pomocą cytometrii przepływowej, w tym pobierania i transportu próbek szpiku kostnego od pacjentów z AML.

comprehensive-protocol-to-sample-process-bone-marrow-for-measuring

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę pobierania szpiku kostnego z kręgosłupa biodrowego i przygotowania wymazu do biopsji. W tym przykładzie przeprowadzamy aspirację szpiku kostnego od pacjenta z ostrą białaczką szpikową (AML) i badamy komórki, aby sprawdzić, czy nie ma mierzalnej choroby resztkowej (MRD), ważnego biomarkera prognostycznego.

Aspiracja szpiku kostnego: metoda pozyskiwania szpiku kostnego w celu zbadania morfologii komórek

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Poznaj protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do wykrywania mierzalnej choroby resztkowej w ostrej białaczce szpikowej. Metoda ta umożliwia dokładną kwantyfikację białaczkowych komórek macierzystych i wspomaga podejmowanie decyzji klinicznych.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej (Wideo) | JoVE Journal

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Przeglądaj więcej filmów