Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Weź żądany plazmid w pożywce bez surowicy. Ten plazmid koduje białka specyficzne dla pęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych.

Do innej probówki weź odczynnik do transfekcji rozcieńczony w podłożu niezawierającym surowicy.

Wymieszaj dwa roztwory i inkubuj.

Odczynnik do transfekcji łączy się z plazmidem, tworząc kompleks.

Weź studzienkę zawierającą przylegające neurony w pożywce z surowicą. Dodaj kompleksy i inkubuj. Kompleks ułatwia wnikanie plazmidu do komórki.

Wyrzuć pożywkę, aby usunąć niezinternalizowane kompleksy.

Dodaj świeże podłoże, a następnie inkubuj.

Plazmid dostaje się do jądra w celu transkrypcji, a następnie jest tłumaczony na specyficzne dla pęcherzyków białka fluorescencyjne, które znakują pęcherzyki w neuronach.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w kontrolowanej temperaturze uzyskuj obrazy w określonych odstępach czasu.

Aby przeanalizować obrazy, zdefiniuj parametry śledzenia.

Zidentyfikuj interesujący Cię pęcherzyk i zapisz jego współrzędne na każdym z obrazów.

Skompiluj dane, aby zwizualizować ruch pęcherzyka.

W tej procedurze wymieszaj 4 mikrogramy plazmidu z 200 mikrolitrami pożywki bez surowicy. W osobnej probówce rozcieńczyć osiem mikrolitrów od