Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Weź żądany plazmid w pożywce bez surowicy. Ten plazmid koduje białka specyficzne dla pęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych.

Do innej probówki weź odczynnik do transfekcji rozcieńczony w podłożu niezawierającym surowicy.

Wymieszaj dwa roztwory i inkubuj.

Odczynnik do transfekcji łączy się z plazmidem, tworząc kompleks.

Weź studzienkę zawierającą przylegające neurony w pożywce z surowicą. Dodaj kompleksy i inkubuj. Kompleks ułatwia wnikanie plazmidu do komórki.

Wyrzuć pożywkę, aby usunąć niezinternalizowane kompleksy.

Dodaj świeże podłoże, a następnie inkubuj.

Plazmid dostaje się do jądra w celu transkrypcji, a następnie jest tłumaczony na specyficzne dla pęcherzyków białka fluorescencyjne, które znakują pęcherzyki w neuronach.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w kontrolowanej temperaturze uzyskuj obrazy w określonych odstępach czasu.

Aby przeanalizować obrazy, zdefiniuj parametry śledzenia.

Zidentyfikuj interesujący Cię pęcherzyk i zapisz jego współrzędne na każdym z obrazów.

Skompiluj dane, aby zwizualizować ruch pęcherzyka.

W tej procedurze wymieszaj 4 mikrogramy plazmidu z 200 mikrolitrami pożywki bez surowicy. W osobnej probówce rozcieńczyć osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji w 200 mikrolitrach pożywki wolnej od surowicy. Następnie inkubuj roztwór przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach wymieszaj roztwór plazmidu i roztwór odczynnika do transfekcji i inkubuj mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj mieszaninę do naczyń z powlekanym szklanym dnem.

Inkubuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie zastąp pożywkę 2 mililitrami pożywki do hodowli kory mózgowej i inkubuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni.

Do obrazowania należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD z soczewkami obiektywowymi 40x. Utrzymuj temperaturę na poziomie 37 stopni Celsjusza za pomocą systemu inkubacji. Rejestruj obrazy neuronów w 1 klatce co 5 sekund przez 100-sekundowy okres kontrolowany przez oprogramowanie do akwizycji obrazu.

Aby przeanalizować obrazy, otwórz wszystkie sekwencyjne obrazy w oprogramowaniu ImageJ z ręcznym śledzeniem. Aby połączyć sekwencyjne obrazy, wybierz Obraz, następnie Stosy, a następnie Obrazy do ułożenia w stos, a następnie kliknij OK. Następnie wybierz Wtyczki, a następnie Śledzenie ręczne. Pojawi się okno śledzenia. Kliknij pole wyboru Pokaż parametry i zdefiniuj parametry śledzenia w sekcji parametrów.

Następnie kliknij przycisk Dodaj ścieżkę, aby rozpocząć nową ścieżkę. Po określeniu interesujących pęcherzyków, kliknij środek sygnałów na sekwencyjnych obrazach, aby zapisać współrzędne XY. Powtórz tę procedurę, aby zebrać współrzędne XY pęcherzyków ze wszystkich kolejnych obrazów. Każdy obraz jest automatycznie przesuwany do kolejnego obrazu po wybraniu punktu odniesienia.