Zastosowania mikroprzepływowe w diagnostyce jednorazowej

Nazywam się Catherine CloudBridge i jestem profesorem w zakresie produkcji, inżynierii i inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie Bostońskim. Pełnię również funkcję dyrektora Laboratorium Mikrourządzeń i Mikrośrodowisk Biomedycznych. Pracujemy przede wszystkim nad tworzeniem jednorazowych narzędzi diagnostycznych do zastosowań w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów.

W celu wykonania tych urządzeń wykorzystujemy mikroprzepływy. Interesują nas w rzeczywistości dwa obszary badawcze. Przede wszystkim skupiamy się na badaniu interakcji biomolekuł i komórek z powierzchniami polimerów plastikowych.

To nasz główny obszar badań. Praca ta znajduje odzwierciedlenie w zastosowaniach mikroprzepływowych dla diagnostyki jednorazowej. Zatem w laboratorium tworzymy urządzenia mikroprzepływowe.

W materiałach termoplastycznych nie stosujemy zazwyczaj PDMS, czyli elastycznego materiału, z którego większość osób wykonuje układy mikroprzepływowe w laboratorium. My tworzymy nasze urządzenia z tworzyw termoplastycznych. Dążymy do wykorzystania tych termoplastycznych urządzeń do prowadzenia biologii molekularnej w mikroskali w taki sposób, aby badania te mogły być realizowane w terenie, z dala od scentralizowanego laboratorium.

W praktyce laboratoryjnej polega to na tworzeniu małych plastikowych kart, wewnątrz których znajdują się kolumny do ekstrakcji w fazie stałej, kolumny do lizy komórek lub kolumny do mieszania. Jako technikę detekcji stosujemy również reakcję łańcuchową polimerazy na chipie. Wszystkie te elementy są zintegrowane w niewielkim urządzeniu, które w długofalowej perspektywie badawczej miałoby stać się urządzeniem zintegrowanym, przenośnym, możliwym do wykorzystania w terenie lub w warunkach, w których nie byłoby dostępu do pełnowymiarowego laboratorium z całym niezbędnym wyposażeniem, takim jak wirówki czy inkubatory.

W idealnym scenariuszu chcielibyśmy móc zacząć od ludzkiej próbki, takiej jak krew, mocz, kał lub na przykład wymaz z nosogardzieli, który jest śluzem. Następnie, na wyjściu z chipa, otrzymalibyśmy odpowiedź „tak” lub „nie”, wskazującą, czy dana osoba jest zakażona konkretnym mikroorganizmem. Osiągamy to poprzez poszukiwanie DNA lub RNA tego konkretnego mikroorganizmu w próbce pobranej od pacjenta, w zależności od rodzaju patogenu.

Wyzwania techniczne pojawiają się zatem głównie na etapie przygotowania próbek. Rozpoczynając od krwi, kału lub moczu, należy przejść z etapu posiadania zanieczyszczonej próbki ludzkiej, zawierającej wiele potencjalnych cząstek stałych lub inhibitorów PCR i innych technik amplifikacji, do uzyskania bardzo czystej, wyeluowanej próbki kwasów nukleinowych. Można ją następnie wykorzystać do amplifikacji lub poszukiwania konkretnego DNA lub RNA, co pozwoli stwierdzić, czy poszukiwany mikroorganizm był obecny w próbce.

Aby oczyścić te próbki, należy wykonać kilka czynności. Po pierwsze, próbkę trzeba przefiltrować, co w zależności od rodzaju materiału może obejmować filtrację wstępną lub krótkie wirowanie przed naniesieniem próbki na chip. Zawsze staramy się zaczynać od próbek w formie, w jakiej zostają otrzymane od klinicysty.

W przypadku próbek moczu, kału i wymazów z nosogardzieli naszym celem jest, aby klinicysta wykonał swoją pracę w standardowy sposób i pobrał próbkę zgodnie z rutynową procedurą. Następnie pobraną próbkę przenosimy na chipy. Jeśli na tym etapie wymagana jest dodatkowa filtracja, odbywa się ona bezpośrednio w chipie.

Drugi etap obejmuje lize komórek i mikroorganizmów znajdujących się w próbce, ponieważ przeprowadzamy analizy molekularne. Wykonujemy zatem etap lizy, który zazwyczaj polega na przepuśczeniu próbki przez filtr o małej wielkości porów. Czasami filtr ten zawiera również nanocząsteczki, takie jak nanorurki węglowe, które posiadają ostre krawędzie mogące rozerwać niektóre organizmy o bardziej wytrzymałych ścianach komórkowych, takie jak C difficile – bakteria gram-dodatnia, z którą pracujemy, a która jest bardzo trudna do lizy.

W związku z tym musimy zastosować bardziej wytrzymałe kolumny do lizy. Zazwyczaj przeprowadzamy połączoną lizę chemiczną i mechaniczną wewnątrz chipa. Następnie naszym celem jest pobranie lizatu i wyekstrahowanie z niego oczyszczonych kwasów nukleinowych.

Następnie przepuszczamy lizat przez kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej, która znajduje się w układzie mikroprzepływowym. Ta kolumna do ekstrakcji do fazy stałej jest wykonana z tworzywa sztucznego przy użyciu chemii inicjowanej światłem wewnątrz kanału mikroprzepływowego po jego uprzednim wykonaniu. Jest ona również zazwyczaj impregnowana cząsteczkami krzemionki, ponieważ chcemy wiązać i uwalniać kwasy nukleinowe.

W niektórych przypadkach stosowaliśmy kuleczki oligo DT, na przykład gdy chcieliśmy specyficznie wiązać i uwalniać mRNA, lub kuleczki z konkretnymi przeciwciałami, aby wiązać i uwalniać określone białka. Możemy tworzyć kolumny ekstrakcyjne, które realizują wszystkie te funkcje. Dzisiaj jednak pokażemy Państwu, jak wykonać kolumnę ekstrakcyjną z kuleczkami krzemionkowymi.

Po wykonaniu tych czynności przepuszczamy lizat przez kolumnę krzemionkową; działa ona analogicznie do zestawu firmy Qiagen stosowanego w laboratoriach w skali makro. Następnie przeprowadzamy płukanie, aby usunąć wszystkie niepożądane substancje, takie jak węglowodany, lipidy oraz inne zanieczyszczenia obecne w lizacie komórkowym i pozostałej części próbki ludzkiej. Na samym końcu przeprowadzamy elucję wodą.

Zaletą tych mikroskalowych kolumn do ekstrakcji w fazie stałej jest możliwość elucji przy użyciu bardzo małej ilości wody, zazwyczaj rzędu 1 do 5 µL. Odzyskujemy przy tym niemal wszystkie wprowadzone kwasy nukleinowe. Osiągamy wydajność na poziomie około 70 do 90% w pierwszych 10 µL uzyskanych z tego kanału.

Zatem, jeśli przepłuczemy próbkę dwukrotnie, używając od 2 do 10 µL, odzyskamy niemal wszystkie wprowadzone kwasy nukleinowe. W rezultacie otrzymujemy nie tylko czystą próbkę nadającą się do PCR, ale także próbkę o znacznie wyższym stężeniu, niż byłoby to możliwe przy zastosowaniu standardowego zestawu laboratoryjnego. Ostatecznym celem wszystkich tych technik przygotowania próbek jest uzyskanie wyników kompatybilnych z innymi badaniami przeprowadzonymi przez naukowców.

Bardzo wartościowe prace w tej dziedzinie pokazują, że możliwe jest przeprowadzenie amplifikacji PCR na chipie. Reakcję odwrotnej transkrypcji można również wykonać na chipie w przypadku pracy z wirusem RNA lub przy przeprowadzaniu eksperymentów dotyczących ekspresji genów. Nasze techniki przygotowania próbek mogą być bezpośrednio sprzężone z PCR na chipie, dzięki czemu nie ma konieczności przeprowadzania etapów oczyszczania i przygotowania próbek przy stole laboratoryjnym.

Oraz krok zagęszczania, który byłby konieczny do uzyskania niewielkich objętości niezbędnych do przeprowadzenia multipleksowej reakcji PCR na małym chipie. Eksperymenty, które zaprezentujemy dzisiaj, pokazują sposób montażu chipu mikroprzepływowego, wykonanego z termoplastu, a nie z PDMS. W związku z tym wymaga on nieco innego procesu wytwarzania niż ten zazwyczaj stosowany, w tym sposobu uszczelniania tych chipów.

Następnie przedstawimy sposób przeprowadzania chemii inicjowanej światłem wewnątrz układu w celu wytworzenia monolitów polimerowych, które służą zarówno do lizy komórek, jak i do ekstrakcji w fazie stałej. Na koniec tego procesu, który obecnie składa się z modułowych etapów laboratoryjnych, lecz może zostać i został zintegrowany, otrzymamy wysoce skoncentrowaną próbkę kwasów nukleinowych, RNA i DNA w wodzie. Może ona następnie trafić do modułu PCR lub innego modułu amplifikacji, w którym możliwa jest identyfikacja mikroorganizmu lub infekcji. Obecnie realizujemy grant, w ramach którego zaczynamy pobierać od pacjentów z Boston Medical Center próbki ludzkie od osób, które mogą lub nie mogą być zakażone grypą typu A. Ponieważ trwa sezon grypowy, są to próbki, które obecnie gromadzimy.

Następnie w laboratorium przeprowadzamy testy referencyjne, aby sprawdzić, czy dana osoba jest zakażona wirusem grypy A; jest to w zasadzie test hodowlany, którego wykonanie zajmuje kilka dni. Równolegle poddajemy te próbki procesom w modułach naszego chipa. Przesyłamy je przez kolumnę do lizy, następnie przez kolumnę do ekstrakcji w fazie stałej, a potem przeprowadzamy PCR, aby ocenić skuteczność tej metody w porównaniu z metodami referencyjnymi.

To jest etap, na którym obecnie się znajdujemy. Jeśli te eksperymenty zakończą się sukcesem, sądzę, że w ciągu najbliższych czterech do sześciu lat znajdziemy się w sytuacji, w której będziemy dysponować zintegrowanym chipem i kompletnym testem w kierunku wirusa grypy A; pracujemy również nad wykrywaniem Clostridium difficile w próbkach kału. Jesteśmy już bardzo blisko nie tylko integracji urządzenia, ale także integracji samego testu.

Zatem zarówno opracowanie testu, jak i projekt chipa muszą odbywać się równolegle. W przypadku konkretnego zastosowania, mającego trafić do użytku przy łóżku pacjenta, jest to proces zorientowany na konkretny cel. Należy znać próbkę wyjściową oraz mikroorganizm, którego poszukujemy, aby zoptymalizować chip do zastosowań przy łóżku pacjenta.

Sądzę, że nie jesteśmy już tak daleko od urzeczywistnienia tego w formie prototypu. Są to nasze cele końcowe, więc mam nadzieję, że uda nam się je osiągnąć.