Zastosowania mikroprzepływowe w diagnostyce jednorazowego użytku

Nazywam się Catherine CloudBridge i jestem profesorem produkcji, inżynierii i inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie Bostońskim. Jestem dyrektorem Laboratorium Mikrourządzeń Biomedycznych i Mikrośrodowisk. Pracujemy przede wszystkim nad tworzeniem jednorazowych narzędzi diagnostycznych do zastosowań w warunkach ograniczonych zasobów.

Używamy więc mikrofluidyki do produkcji tych urządzeń. Interesują nas właściwie dwa kierunki studiów. Przede wszystkim interesuje nas to, w jaki sposób biomolekuły i komórki oddziałują z powierzchniami polimerów z tworzyw sztucznych.

To nasz główny parasol. Praca ta znajduje odzwierciedlenie w zastosowaniach mikroprzepływowych w diagnostyce jednorazowego użytku. Tak więc w laboratorium tworzymy urządzenia mikroprzepływowe.

W materiałach termoplastycznych, których nie używamy, zazwyczaj używa się PDMS, który jest gumowatym materiałem, którego większość ludzi używa do wytwarzania mikrofluidyków w laboratorium. Nasze urządzenia wykonujemy z tworzyw termoplastycznych. Jesteśmy zainteresowani wykorzystaniem tych termoplastycznych urządzeń do prowadzenia biologii molekularnej w mikroskali w taki sposób, aby biologia molekularna mogła być prowadzona w terenie, z dala od scentralizowanego laboratorium.

W laboratorium robimy małe plastikowe karteczki, a wewnątrz tych małych plastikowych kart znajdują się kolumny do ekstrakcji do fazy stałej, kolumny do lizy komórek lub kolumny do mieszania. Przeprowadzamy również reakcję łańcuchową polimerazy na chipie jako technikę wykrywania. Wszystkie te rzeczy są zintegrowane w małym urządzeniu, które ostatecznie, w długoterminowej perspektywie badań, skończyłoby się jako zintegrowane urządzenie, które mogłoby być trzymane w ręku i przenoszone w teren lub w miejsca, w których laboratorium na dużą skalę ze wszystkimi uczestniczącymi w nich centrami fuzji i inkubatorów grzewczych i tak dalej nie byłoby dostępne.

Chcielibyśmy więc móc zacząć od próbki ludzkiej, takiej jak na przykład krwawy kalec z moczu lub wymaz z nosogardzieli, który byłby śluzem. A potem na wyjściu chipa masz odpowiedź, czy tak, czy nie, ktoś jest zarażony określonym mikroorganizmem. Sposób, w jaki to robimy, polega na szukaniu DNA tego konkretnego lub RNA, w zależności od mikroorganizmu tego konkretnego mikroorganizmu w próbce pacjenta.

Tak więc wyzwania techniczne, które się pojawiają, dotyczą w dużej mierze przygotowania próbki w tym równaniu. Więc kiedy zaczynasz od krwi, stolca lub moczu, musisz przejść od sytuacji, w której masz niechlujną ludzką próbkę z dużą ilością potencjalnie cząstek stałych lub inhibitorów, do PCR lub innych technik amplifikacji. I chcesz skończyć z bardzo czystą, wymykającą się próbą kwasów nukleinowych, którą możesz następnie użyć do amplifikacji lub poszukania konkretnego DNA lub RNA, które powie ci, czy był tam mikroorganizm, którego szukasz.

Aby więc wyczyścić te próbki, musisz zrobić kilka rzeczy. Najpierw należy przefiltrować próbkę, co w zależności od próbki może obejmować filtrację kursową lub szybki krok wirowania, zanim próbka trafi na chip. Dlatego zawsze staramy się zaczynać od próbek w takiej postaci, w jakiej pochodzą od lekarza.

Tak więc w przypadku wymazów z moczu, kału i nosogardzieli naszym celem jest, aby klinicysta wykonał swoją pracę tak, jak zwykle i pobrał próbkę tak, jak normalnie. A potem bierzemy tę próbkę i umieszczamy ją na frytkach. Jeśli więc na tym etapie zajdzie potrzeba dalszej filtracji, ta filtracja nastąpi w chipie.

Drugi krok polega na tym, że ponieważ przeprowadzamy testy molekularne, musimy poddać lizie komórki i mikroorganizmy, które znajdują się w tej próbce. Następnie przeprowadzamy etap lizy, który zwykle polega na przepuszczeniu próbki przez filtr o małym rozmiarze porów. Czasami ten filtr zawiera również nanocząsteczki, takie jak nanorurki węglowe, które mają ostre krawędzie, które można wykorzystać do rozerwania niektórych organizmów, które mają bardziej wytrzymałe ściany komórkowe, takie jak C difficile, który jest bakterią Gram-dodatnią, z którą pracujemy, która jest bardzo trudna do zidentyfikowania.

Musimy więc mieć bardziej wytrzymałe kolumny do lizy. Zazwyczaj jednak przeprowadzamy połączoną chemiczną i mechaniczną lizę wewnątrz chipa. Następnie naszym celem jest pobranie lizatu, a następnie ekstrakcja oczyszczonych kwasów nukleinowych.

Więc przepuszczamy lizę, przepuszczamy lizat przez kolumnę ekstrakcyjną do fazy stałej, która rezonuje w chipie mikroprzepływowym. Kolumna ekstrakcyjna do fazy stałej jest wykonana z tworzywa sztucznego i jest wytwarzana przy użyciu chemii inicjowanej foto wewnątrz kanału mikroprzepływowego po tym, jak jest już wyprodukowana. Jest również impregnowany cząsteczkami krzemionki, ponieważ chcemy wiązać i uwalniać kwasy nukleinowe.

W niektórych przypadkach włączyliśmy kulki oligo DT, jeśli chcemy na przykład związać i uwolnić mRNA specyficznie, lub kulki, które mają na sobie określone przeciwciała, jeśli chcemy związać i uwolnić określone białka. I możemy stworzyć kolumny ekstrakcyjne, które robią wszystkie te rzeczy. Ale dzisiaj pokażemy Ci, jak zrobić kolumnę ekstrakcyjną sase z kulkami krzemionkowymi.

Więc po tym, jak to zrobimy, przepuść lizat przez kolumnę krzemionki, działa to tak, jak zestaw kyogen działałby w laboratorium w skali makro. Następnie myjemy się, aby pozbyć się wszystkich innych rzeczy, których nie chcemy, wszystkich węglowodanów, lipidów i innych rzeczy w lizacie komórkowym i w reszcie ludzkiej próbki, których nie chcemy. A potem na samym końcu, nawiązujemy do wody.

Fajne w tych mikroskalowych kolumnach do ekstrakcji do fazy stałej jest to, że możemy eluować bardzo małą ilością wody, zwykle rzędu jednego do pięciu mikrolitrów. I odzyskujemy prawie wszystkie kwasy nukleinowe, które wprowadziliśmy. Mamy około 70 do 90% wydajności i pierwsze 10 mikrolitrów, które otrzymujemy z tego kanału.

Jeśli więc przemyjemy dwa razy od dwóch do 10 mikrolitrów, odzyskamy prawie wszystkie kwasy nukleinowe, które tam umieściliśmy. Jest to więc nie tylko czysta próbka, która nadaje się do PCR, ale jest to również próbka, która jest znacznie bardziej skoncentrowana niż można by uzyskać za pomocą standardowego zestawu laboratoryjnego. Tak więc ostatecznym celem wszystkich tych technik przygotowywania próbek jest stworzenie rzeczy, które są kompatybilne z niektórymi innymi pracami, które ludzie wykonali.

Bardzo fajna praca w terenie pokazująca, że można zrobić amplifikację PCR na chipie. Możesz przeprowadzić reakcję odwrotnej transkryptazy na chipie, jeśli masz do czynienia z wirusem RNA lub jeśli chcesz przeprowadzić eksperyment z ekspresją genów. Nasze techniki przygotowywania próbek mogą być bezpośrednio sprzężone z PCR na chipie, dzięki czemu nie musisz wykonywać żadnego z tych czynności związanych z czyszczeniem i przygotowywaniem próbek na stole.

A także krok koncentracji, który musiałbyś wykonać, aby uzyskać małe objętości niezbędne do przeprowadzenia multipleksowanego PCR na małym chipie. Eksperymenty, które dzisiaj pokażemy, pokazują, jak montujemy chip mikroprzepływowy, który jest wykonany z tworzywa termoplastycznego, a nie z PDMS. Wymaga to więc nieco innego procesu produkcyjnego niż zwykle stosowany, czyli sposobu uszczelniania tych wiórów.

A następnie, w jaki sposób przeprowadzamy chemię inicjowaną światłem wewnątrz chipa, aby wytworzyć monolity polimerowe, które są używane zarówno do lizy komórek, jak i do ekstrakcji do fazy stałej. A na końcu tego procesu, który w tej chwili jest procesem modułowym w laboratorium, ale mogą i zostały zintegrowane, daje na końcu wysoce skoncentrowaną próbkę kwasów nukleinowych, RNA i DNA w wodzie, która może następnie trafić do modułu PCR lub innego modułu amplifikacji, gdzie może dojść do identyfikacji mikroorganizmu lub infekcji. Mamy grant, nad którym teraz pracujemy, zaczynamy zbierać próbki od ludzi z Boston Medical Center od pacjentów, którzy mogą, ale nie muszą być zakażeni grypą, A.So ponieważ jest sezon grypowy, to są próbki, które zbieramy.

A potem w laboratorium przeprowadzamy testy złotego standardu, aby sprawdzić, czy ktoś jest zarażony grypą A, czy nie, co jest w zasadzie testem posiewu, który trwa kilka dni. Równolegle z tym przepuszczamy te próbki przez nasze, w tej chwili, moduły naszego chipa. Przepuszczamy je więc przez kolumnę do lizy, przepuszczamy przez kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej, a następnie przeprowadzamy PCR, aby zobaczyć, jak dobrze radzimy sobie w porównaniu z metodami złotego standardu.

To jest etap, na którym się teraz znajdujemy. Jeśli te eksperymenty się powiodą, myślę, że w ciągu najbliższych czterech do sześciu lat być może znajdziemy się w sytuacji, w której będziemy mieli zintegrowany chip i kompletny test na grypę A, a także będziemy pracować nad próbkami Clostridium difficile i kału. I jesteśmy, jesteśmy, jesteśmy również bardzo blisko zintegrowania nie tylko urządzenia, ale także zintegrowania testu.

Tak więc zarówno opracowanie testu, jak i projekt chipa muszą iść w parze. Tak więc w przypadku konkretnego zastosowania, dotarcie do łóżka pacjenta, jest to naprawdę proces zorientowany na cel. Musisz znać próbkę, od której zaczynasz, i mikroorganizm, którego szukasz, aby zoptymalizować chip do użytku przy łóżku pacjenta.

Nie sądzę więc, żebyśmy byli aż tak daleko od tego, by zrobić to w prototypowy sposób. To są nasze cele końcowe, więc mam nadzieję, że je osiągniemy.