Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

W naszych badaniach skupiamy się na fizjologii siatkówki i samej chorobie. Muszą zbadać skład komórkowy i specyficzne neuroprzekaźniki w obwodzie nerwowym siatkówki. Nadrzędnym celem jest zbadanie połączeń synaptycznych i lokalizacji komórkowej neuroprzekaźników na całym szlaku.

Największym wyzwaniem związanym z technologią mikroskopów immunoelektronowych jest osiągnięcie równowagi między strukturą, integralnością i sygnałami dodatnimi. Poprzez wstępną mikroskopię immunoelektronową dostarczamy po raz pierwszy, zweryfikowane immunochemicznie dowody ultrastrukturalne na synapsę koalescencyjną. A także przegląd i wyraźna dystrybucja, nowe cechy komórek organicznych i organizacja synaptyczna lub SPIR w siatkówce myszy.

Wszystkie wyniki sugerują, że wzajemne oddziaływanie między stożkiem a szlakiem pręcików jest znacznie szersze niż wcześniej zakładano. Te neurochemicznie zidentyfikowane wyniki ultrastrukturalne sprawdzają, że sygnalizacja włączania i wyłączania może łączyć się ze sobą poprzez synapsę chemiczną w OPL siatkówki. Aby rozpocząć, złóż mikroskop preparacyjny, dwa kleszcze z cienkimi końcówkami, nożyczki, igłę strzykawki o pojemności jednego mililitra i bibułę filtracyjną na platformie roboczej.

Następnie za pomocą nożyczek łokciowych wyłuszczenie oczu ze znieczulonej myszy. Umieść oczy w szklanym naczyniu zawierającym 4% paraformaldehydu i 0,2% kwasu pikrynowego w 0,1-molowym buforze fosforanowym. Pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą jednomililitrowej strzykawki wybij otwór w rąbku rogówki i odetnij przedni odcinek nożyczkami.

Użyj kleszczyków, aby usunąć soczewkę z wewnętrznej powierzchni siatkówki. Teraz za pomocą dwóch kleszczy ostrożnie oderwij twardówkę, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana od muszli ocznej. Następnie przetnij siatkówkę na cztery części.

Po utrwaleniu przez noc w 4% roztworze paraformaldehydu, przemyj tkanki siatkówki w 0,01 molowym PBS sześć razy po 10 minut każda. Inkubować tkankę siatkówki w 1% borowodorku sodu w 0,01 molowym PBS przez 30 minut. Ponownie umyj skrawki siatkówki w 0,01 molowym PBS co najmniej sześć razy.

Następnie usuń szkliste ciało za pomocą bibuły filtracyjnej. Za pomocą obosiecznej żyletki pokrój siatkówkę na małe odcinki o wielkości od 100 do 300 mikrometrów. Przemyć paski siatkówki w 0,01 molowym PBS sześć razy przez 10 minut każdy, a następnie inkubować je z odczynnikiem A i odczynnikiem B z zestawu ABC przez dwa dni.

Następnie umyj paski siatkówki w 0,05 molowym buforze Tris trzy razy po 10 minut każdy. Wstępnie inkubować prążki siatkówki z 5% odczynnikiem 1 i 5% odczynnikiem 3 z zestawu diaminobenzydyny lub DAB i wodą destylowaną przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Aby zabarwić paski siatkówki za pomocą DAB, dodaj kolejno tę samą objętość roztworu z trzech probówek w zestawie DAB.

Pod mikroskopem preparacyjnym obserwuj stan barwienia. Przemyć paski siatkówki 0,05-molowym buforem Tris trzy razy po 10 minut każdy. Na koniec umyj paski w 0,01 molowym PBS sześć razy po 10 minut każdy.

W eksperymentach kontrolnych szypułki stożkowe z dwiema wstęgami i pręciki kuliste z jedną wstęgą nie wykazywały immunoreaktywności przy braku przeciwciał pierwotnych. Kinaza białkowa C alfa zidentyfikowała pręcikowe komórki dwubiegunowe w siatkówce. Barwienie DAB wykazuje obecność kinazy białkowej C alfa w dendrytach komórek dwubiegunowych pręcików tworzących synapsy z zakończeniami pręcików i czopków w zewnętrznej warstwie splotowatej.

Dodatkowo produkt reakcyjny DAB pomaga w identyfikacji dwubiegunowych zakończeń komórek pręcikowych i procesów aksonalnych w wewnętrznej warstwie splotowatej. Wykazano, że komórki amikornowe immunoreaktywności P są presynaptyczne w stosunku do komórek amikoronowych substancjum P ujemnych. Ponadto komórki amikoronowe immunoreaktywności substancji P były postsynaptyczne do dwubiegunowych zakończeń odpowiednio na poziomie podwarstwy trzeciej i podwarstwy piątej warstwy wewnętrznej splotowatej.