Name: Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Poznaj technikę wstępnego osadzenia mikroskopii immunoelektronowej do badania obwodów siatkówki i lokalizacji neuroprzekaźników u myszy. Metoda pozwala wizualizować struktury synaptyczne z zachowaniem integralności tkanek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1105503), Państwowego Kluczowego Laboratorium Neuronauki (SKLN-202103), Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Zhejiang (Y21H120019).

Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Regulamin Komisji Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou zgodnie z wytycznymi ARVO. W badaniach wykorzystano dorosłe myszy (C57BL/6J, samiec i samica, w wieku od 8 do 12 tygodni). Sprzęt i odczynniki potrzebne do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie do stabilizacji siatkówki
<ol>
	<li>Zbierz następujące materiały i narzędzia: mikroskop preparacyjny, dwa kleszcze z bardzo cienkimi końcówkami, nożyczki, igłę do strzykawki o pojemności 1 ml (rozmiar igły: G26) i bibułę filtracyjną.</li>
	<li>Głęboko znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2,2,2-tribromoetanolu w dawce 0,25 mg/g masy ciała. Następnie odetnij głowy myszom i odetnij im głowy16.</li>
	<li>Enukleować ich oczy nożyczkami łokciowymi i umieścić je w szklanym naczyniu zawierającym 4% paraformaldehydu-0,2% kwasu pikrynowego w 0,1 M buforze fosforanowym (PB; pH 7,4).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wybij otwór w rąbku rogówki za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 1 ml i odetnij przedni odcinek nożyczkami, podążając za otworem. Następnie usuń soczewkę z wewnętrznej powierzchni siatkówki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie oderwać twardówkę, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana od muszli ocznej (tkanka siatkówki bańki całkowicie oddzielona od naczyniówki). Następnie przetnij siatkówkę na cztery części.</li>
	<li>Utrwalić te skrawki w 4% paraformaldehydzie-0,2% kwasie pikrynowym w 0,1 M PB (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść tkankę do 4% paraformaldehydu w 0,1 M PB (pH 10,4) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Wstępne osadzanie barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Po przemyciu w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy, inkubować tkanki siatkówki w 1% borowodorku sodu (NaBH4) w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć skrawki siatkówki w 0,01 M PBS (pH 7,4) co najmniej sześć razy. W międzyczasie usuń ciało szkliste bibułą filtracyjną, a następnie pokrój siatkówkę na małe plasterki o średnicy 100-300 μm za pomocą obosiecznej żyletki.</li>
	<li>Po zablokowaniu 5% normalną surowicą kozią (NGS) w 0,1 M PB (pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, inkubować wycinki siatkówki z pierwszorzędowymi przeciwciałami (Anty-królicze PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) wraz z 2% NGS w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na shakerze. Następnie inkubować przez 96 godzin (5 dni) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.</li>
	<li>Po sześciokrotnym myciu przez 10 minut każdy w 0,01 M PBS (pH 7,4), inkubować plastry siatkówki z przeciwciałem drugorzędowym w stosunku 1:200, takim jak kozia anty-królicza IgG, wraz z 2% NGS w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Następnie inkubować przez 48 godzin (2 dni) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. 
	UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe stosowano samodzielnie w eksperymentach kontrolnych.</li>
	<li>Przemyć prążki siatkówki w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy przed inkubacją z odczynnikiem A i odczynnikiem B z zestawu ABC w stosunku 1:100 w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 dni w temperaturze 4°C. (Zarówno odczynnik A, jak i odczynnik B rozcieńczono 0,01 M PBS. Na przykład: Roztwór: 6 μl; roztwór B: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, łącznie 600 μl).</li>
	<li>Przemyj prążki siatkówki w 0,05 M buforze Tris (pH 7,2) trzy razy po 10 minut każdy. Następnie wstępnie inkubować paski siatkówki z 5% odczynnikiem 1 i 5% odczynnikiem 3 z zestawu DAB w wodzie destylowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. (Na przykład: odczynnik 1: 50 μl; odczynnik 3: 50 μl; woda destylowana: 900 μl, łącznie 1000 μl).</li>
	<li>Wybarwić paski siatkówki za pomocą DAB. Dodać kolejno tę samą objętość roztworu z trzech probówek z zestawu DAB (odczynnik 1-odczynnik 2-odczynnik 3). Obserwuj stan barwienia za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Zatrzymaj barwienie, gdy komórki staną się brązowe; Ten proces trwa 10-20 minut.</li>
	<li>Przemyć paski siatkówki 0,05 M buforem Tris (pH 7,2) trzy razy przez 10 minut każdy, a następnie przemyć w 0,01 M PBS sześć razy przez 10 minut każdy.</li>
</ol>
3. Po utrwaleniu i osadzeniu
<ol>
	<li>Utrwal paski siatkówki w 2% aldehydzie glutarowym przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), a następnie umyj w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować prążki siatkówki z 1% tetratlenkiem osmu (OsO4) w 0,1 M PB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowywać w ciemnym miejscu.</li>
	<li>Po przemyciu w wodzie destylowanej (ddH2O) sześciokrotnie po 10 minut, należy inkubować tkanki siatkówki z octanem uranylu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowywać je w ciemnym miejscu, aby zabarwić te tkanki.</li>
	<li>Umieść tkanki siatkówki w roztworach acetonu (50%, 70%, 80% i 90%) na 10 minut każda, a następnie w 100% dwa razy po 10 minut.</li>
	<li>Zanurzyć tkanki siatkówki w mieszaninie zawierającej taką samą objętość octanu uranylu i żywicy epoksydowej na 1 godzinę w suszarce w temperaturze 37 °C, a następnie w mieszaninie zawierającej octan uranylu i żywicę (1:4) przez noc w suszarce w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie przenieść tkanki siatkówki za pomocą wykałaczki do nowej żywicy na 1 godzinę w temperaturze 45 °C w suszarce, a następnie zorientowany pasek siatkówki jest zatapiany w płytce do zatapiania żywicy.</li>
	<li>Umieścić próbkę w suszarce w temperaturze 45 °C na 3 godziny i w suszarce w temperaturze 65 °C na 48 godzin.</li>
	<li>Uformuj bloki osadzania w trapezy i pokrój blok na odcinki o grubości 1 μm za pomocą ultramikrotomu, wybarwić te odcinki błękitem toluidynowym i wstępnie przesiać obszary zainteresowania pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Zbierz ultracienkie skrawki (70-90 nm) na miedzianych siatkach i obejrzyj je pod mikroskopem elektronowym.</li>
</ol>

Synaptic Circuits Analysis and Protein Localization in the Mouse Retina

<ol><li>Chua, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+reconstruction+of+the+early+visual+system+of+an+adult+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect.</a> Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).</li>
<li>Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+underlying+multi-feature+extraction+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina.</a> J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).</li>
<li>Sirivisoot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+mouse+anti-canine+PD-L1+monoclonal+antibodies+and+their+expression+in+canine+tumors+by+immunohistochemistry+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Q%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro.</a> Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).</li>
<li>Raeisi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+phage+display-derived+anti-toxin+antibodies+neutralizing+TcdA+and+TcdB+of+Clostridioides+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile.</a> Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).</li>
<li>Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DWH24%3A+A+new+antibody+for+fluorescence-based+cell+death+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis.</a> Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).</li>
<li>Jastrzebska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+rhodopsin+monomers+and+dimers+in+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents.</a> J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Shenfu+injection+in+suppressing+inflammation+and+preventing+sepsis-induced+apoptosis+in+murine+cardiomyocytes+based+on+network+pharmacology+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation.</a> J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).</li>
<li>Maheshwari, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+exporter+heterozygosity+in+mice+leads+to+brain+vascular+calcification%2C+microangiopathy%2C+and+microgliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis.</a> Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).</li>
<li>Mackiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gravity+in+long-term+vitreous+tamponade%3A+In+vivo+investigation+using+perfluorocarbon+liquids+and+semi-fluorinated+alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).</li>
<li>Luján, R., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Immunoelectron+microscopy%3A+Placing+molecular+functions+within+a+neuronal+context%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context.</a> Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).</li>
<li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+changes+and+the+response+of+microglia+in+a+light-induced+photoreceptor+degeneration+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model.</a> Mol Vis. 27, 206-220 (2021).</li>
<li>Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+route+of+the+visual+receptor+rhodopsin+along+the+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium.</a> J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).</li>
<li>Huang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+nucleocapsid+structural+forms+of+shrimp+white+spot+syndrome+virus+suggests+a+novel+viral+morphogenetic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway.</a> Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).</li>
<li>Tissarinen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+human+placental+heat+shock+protein+5+is+associated+with+spontaneous+preterm+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth.</a> Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+tract+tracing+study+on+synaptic+connections+for+cortical+glutamatergic+terminals+and+cervical+spinal+calretinin+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats.</a> Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).</li>
<li>Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+quantitative+immunogold+analysis+of+membrane+receptors+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses.</a> J Vis Exp. 108, e53547(2016).</li>
<li>Ottersen, O. P., Landsend, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+glutamate+receptors+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of glutamate receptors at the synapse.</a> Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).</li>
<li>Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+bipolar+cells+in+the+mammalian+retina+show+protein+kinase+C-like+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity.</a> J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+synaptic+organization+of+substance+P-like+immunoreactive+neurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina.</a> Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).</li>
<li>van Opbergen, C. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BOrphan%26%2334%3B+Connexin43+in+Plakophilin-2+deficient+hearts+revealed+by+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">34;Orphan&#34; Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+and+efficient+oral+allergy+immunotherapy+using+one-pot-prepared+mannan-coated+allergen+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles.</a> Biomaterials. 303, 122381(2023).</li>
<li>Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+of+dissociating+hepatocytes+from+fixed+liver+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse.</a> Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).</li>
<li>Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoelectron+microscopy+study+of+polyamines+using+a+newly+prepared+monoclonal+antibody+against+spermidine%3A+use+of+a+mixture+of+glutaraldehyde+and+paraformaldehyde+as+a+cross-linking+agent+in+the+preparation+of+the+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen.</a> J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+bipolar+cells+receive+cone+photoreceptor+inputs+through+both+invaginating+synapses+and+flat+contacts+in+the+mouse+and+guinea+pig+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas.</a> J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%CE%B1-Synuclein+in+the+mouse+retina+is+confined+to+inhibitory+presynaptic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements.</a> J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).</li>
<li>Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+substance+P-like+immunoreactive+amacrine+cells+in+goldfish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).</li>
<li>Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycinergic+synapses+in+the+rod+pathway+of+the+rat+retina%3A+cone+bipolar+cells+express+the+alpha+1+subunit+of+the+glycine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor.</a> J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).</li>
<li>Hartveit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+developmental+expression+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR2A+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina.</a> J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).</li>
<li>Perkins, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+miniSOG+in+the+localization+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins.</a> Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy+reveals+human+retinal+mitochondria+that+align+with+reflective+bands+in+optical+coherence+tomography+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited].</a> Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).</li>
<li>Johnson, J. E. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2%2B+dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Mol Vis. 13, 887-919 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W tym artykule opisano trzy kluczowe etapy pomyślnej obserwacji obwodów synaptycznych i lokalizacji białek: (1) szybkie i słabe utrwalenie, (2) wstępne zagnieżdżenie immunobarwienia oraz (3) po utrwaleniu i osadzeniu.
Sugerujemy, że fiksacja jest kluczowym krokiem dla skutecznego podejścia opartego na wstępnym osadzeniu immuno-EM. W związku z tym podkreślono tutaj znaczenie świeżego utrwalacza i szybkiej fiksacji, nazywając tę zasadę "zasadą 4F", która ma kluczowe znaczenie w przygotowaniu tka...

Złożoność obwodów neuronalnych w siatkówce stanowi wyzwanie do zbadania, biorąc pod uwagę różnorodność typów komórek w jej strukturze1,2. Pierwszym krokiem jest identyfikacja połączeń synaptycznych między różnymi komórkami i określenie lokalizacji komórkowej określonych neuroprzekaźników lub neuropeptydów. Wraz z postępem biologii molekularnej wprowadzającym nowe białka, precyzyjna lokalizacja w siatkówce staje się kluczowa dla zrozumienia ich funkcji i analizy obwodów siatkówki i połączeń synaptycznych3,4,5.
Ze względu na ograniczoną rozdzielczość mikroskopii świetlnej, mikroskopia elektronowa (EM) jest powszechnie stosowana do wykrywania subkomórkowych struktur komórek nerwowych. EM ma różne klasyfikacje, z konwencjonalną transmisyjną mikroskopią elektronową (TEM) wykorzystywaną do obserwacji ultrastruktur komórek6,7,8,9. Mikroskopia immunoelektronowa (immuno-EM), która łączy rozdzielczość przestrzenną EM ze zdolnością identyfikacji chemicznej przeciwciał wiążących się specyficznie z białkami10, wyróżnia się jako optymalna i wyjątkowa metoda badania połączeń synaptycznych i lokalizacji białek subkomórkowych w siatkówce11,12.
Techniki immuno-EM można podzielić na metody pre-embedding i post-embedding w oparciu o kolejność osadzania i inkubacji przeciwciał. W porównaniu z metodą po osadzaniu, podejście pre-embedding jest zdolne do identyfikacji na dużą skalę i na duże odległości13,14,15, oferując optymalne podejście do badania procesów komórkowych, takich jak aksony i dendryty. Dodatkowo technika ta zapewnia silny sygnał i szerokie pole widzenia, dzięki czemu jest korzystna dla kompleksowych badań ekspresji białek i lokalizacji molekularnej w cytoplazmie. Metoda ta okazuje się szczególnie cenna w zapewnieniu chemicznie zidentyfikowanych struktur, które są widoczne w całej cytoplazmie, komórkach czy siatkówce.
Jednak metoda po osadzeniu, choć ma mniejszą penetrację lub dyfuzję w porównaniu do metody przed osadzaniem, nie jest tak czuła16,17. Mówiąc prościej, jeśli celem jest zbadanie lokalizacji określonych neuroprzekaźników w cytoplazmie lub zakończeniach synaptycznych, preferowaną metodą jest wstępne osadzenie immuno-EM. I odwrotnie, w celu identyfikacji lokalizacji receptorów błonowych, bardziej zaleca się stosowanie immunogold EM po zasadzeniu.
Biorąc pod uwagę te rozważania, decydujemy się na metodę wstępnego osadzenia immuno-EM, aby zagłębić się w obwody siatkówki, w tym interakcję między szlakami czopków i pręcików oraz lokalizację molekularną, taką jak dystrybucja i organizacja synaptyczna substancji P-podobnej immunoreaktywności (SP-IR) w siatkówce myszy.

<table><tbody><tr><td>1 ml igła do strzykawki</td><td>kangdelai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% OsO4</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>8% aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>8% paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td> <td>acetonu</td> Science <td>10000</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królik PKC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4334</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit SP</td><td>Abcam</td><td>ab67006</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw podłoży DAB</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9701/9702/9703</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do łokci</td><td>Suzhou66 wizja firmy</td><td>54010</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy</td><td>Phillips</td><td>CM120</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Epon</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>14910</td><td></td></tr><tr><td>kleszcz</td><td>Suzhou66 firma wizyjna</td><td>S101A Bibuła</td><td></td></tr><tr><td>filtracyjna Millipore</td><td>Merck Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>PR05538</tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Składnik buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Składnik buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>Kwas pikrynowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>19550</td><td></td></tr><tr><td>Borowodorek sodu (NaBH4)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>215511</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>917R071</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ABC VACTASTAIN, Peroksydaza (IgG królika)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4001</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Investigating Retinal Circuits and Molecular Localization by Pre&#45;Embedding Immunoelectron Microscopy

Siatkówka składa się z licznych komórek tworzących różnorodne obwody neuronalne, które stanowią pierwszy etap ścieżki wzrokowej. Każdy obwód charakteryzuje się unikalnymi cechami i odrębnymi neuroprzekaźnikami, co determinuje jego rolę i znaczenie funkcjonalne. Biorąc pod uwagę skomplikowane typy komórek w jego strukturze, złożoność obwodów neuronalnych w siatkówce stanowi wyzwanie dla badań. Aby lepiej zbadać obwody siatkówki i przesłuchy, takie jak związek między szlakami czopków i pręcików oraz precyzyjną lokalizację molekularną (neuroprzekaźniki lub neuropeptydy), taką jak obecność immunoreaktywności podobnej do P w siatkówce myszy, zastosowaliśmy metodę mikroskopii immunoelektronowej z wbudowanym zabudową (immuno-EM) w celu zbadania połączeń synaptycznych i organizacji. Takie podejście pozwala nam wskazać specyficzne międzykomórkowe połączenia synaptyczne i precyzyjną lokalizację molekularną oraz może odegrać wiodącą rolę w badaniu jego funkcji. W tym artykule opisano protokół, użyte odczynniki i szczegółowe etapy, w tym (1) przygotowanie do utrwalenia siatkówki, (2) wstępne zatapianie barwienia immunologicznego oraz (3) po utrwaleniu i osadzaniu.

Rysunek 1 przedstawia przykłady eksperymentów kontrolnych bez inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko kinazie białkowej C alfa (PKCα) lub SP, w których nie stwierdzono immunoreaktywności (IR).
Rysunek 2 przedstawia PKCα-IR w siatkówce myszy. PKCα służy jako marker dla wszystkich komórek bipolarnych pręcikowych (RBC) w siatkówce18. Na poziomie mikroskopii elektronowej (EM) RBC można zidentyfikować...

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

The retina comprises numerous cells forming diverse neuronal circuits, which constitute the first stage of the visual pathway. Each circuit is ...

W naszych badaniach skupiamy się na fizjologii siatkówki i samej chorobie. Muszą zbadać skład komórkowy i specyficzne neuroprzekaźniki w obwodzie nerwowym siatkówki. Nadrzędnym celem jest zbadanie połączeń synaptycznych i lokalizacji komórkowej neuroprzekaźników na całym szlaku.Największym wyzwaniem związanym z technologią mikroskopów immunoelektronowych jest osiągnięcie równowagi między strukturą, integralnością i sygnałami dodatnimi. Poprzez wstępną mikroskopię immunoelektronową dostarczamy po raz pierwszy, zweryfikowane immunochemicznie dowody ultrastrukturalne na synapsę koalescencyjną. A także przegląd i wyraźna dystrybucja, nowe cechy komórek organicznych i organizacja synaptyczna lub SPIR w siatkówce myszy.Wszystkie wyniki sugerują, że wzajemne oddziaływanie między stożkiem a szlakiem pręcików jest znacznie szersze niż wcześniej zakładano. Te neurochemicznie zidentyfikowane wyniki ultrastrukturalne sprawdzają, że sygnalizacja włączania i wyłączania może łączyć się ze sobą poprzez synapsę chemiczną w OPL siatkówki. Aby rozpocząć, złóż mikroskop preparacyjny, dwa kleszcze z cienkimi końcówkami, nożyczki, igłę strzykawki o pojemności jednego mililitra i bibułę filtracyjną na pl

investigating-retinal-circuits-molecular-localization-pre-embedding

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015).W niniejszym filmie zaprezentowano metodę dostarczania genów za pomocą AAV do siatkówki transgenicznej myszy, a następnie sekcję tkanek i barwienie w celu oceny integralności wewnętrznej błony ograniczającej.

Dostarczanie genów za pomocą AAV w celu wizualizacji zaburzeń integralności błony siatkówki

Techniki wizualizacji cytoarchitektury siatkówki bezpośrednio przylegającej do pojedynczych elektrod w stymulatorze siatkówki.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Metanol może być używany jako pomocnicze stałe podłoże do przygotowania całej siatkówki i długoterminowego przechowywania, co jest przydatne do badania komórek zwojowych siatkówki.

Preparat na bazie metanolu do badania komórek zwojowych siatkówki

Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.

Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj technikę wstępnego osadzenia mikroskopii immunoelektronowej do badania obwodów siatkówki i lokalizacji neuroprzekaźników u myszy. Metoda pozwala wizualizować struktury synaptyczne z zachowaniem integralności tkanek nerwowych.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Przeglądaj więcej filmów