Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Nasze badania koncentrują się na przygotowaniu i oczyszczaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiej tkanki tłuszczowej. Problemem, który chcemy rozwiązać, jest to, jak ustandaryzować ten proces i poprawić wydajność oczyszczania. Obecnie istnieje wiele technologii stosowanych do ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, takich jak ultrawirowanie, ultrafiltracja, chromatografia wykluczania objętości, wytrącanie polimerów, wychwytywanie powinowactwa immunologicznego, technologia mikroprzepływowa i tak dalej.

Trzeba jednak przyznać, że ultrawirowanie jest uznawane za złoty standard. W przyszłości skupimy się na zastosowaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako wektorów, w tym przenoszeniu mRNA, plazmidów i innych małych cząsteczek oraz transfekowaniu ich do komórek. Na początek pobierz dwie probówki do kriokonserwacji zawierające zamrożone mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej w trzecim przejściu z ciekłego azotu.

Mieszaj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do całkowitego rozmrożenia. Następnie zdezynfekuj probówki za pomocą 75% alkoholu. Umieść zdezynfekowane probówki na ultra czystym stole.

Za pomocą pipety odessać zawiesinę komórek i przenieść ją do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować probówkę w wirówce wolnoobrotowej o stężeniu 250 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. W międzyczasie przygotuj cztery 10-centymetrowe naczynia hodowlane i dodaj dziewięć mililitrów pożywki do każdego naczynia.

Zaznacz nazwę, typ komórki, pokolenie i datę eksperymentu na każdym talerzu. Następnie podgrzej je w inkubatorze termostatycznym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu pięciominutowego wirowania zdezynfekuj probówkę wirówkową przed przeniesieniem jej na bardzo czysty stół.

Za pomocą pipety usuń supernatant i dodaj cztery mililitry pożywki, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek. Delikatnie mieszaj roztwór, aż zostanie równomiernie rozprowadzony. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego podgrzanego naczynia i potrząśnij nim, mieszając to samo na równej powierzchni w układzie krzyżowym.

Obserwuj komórki w 40-krotnym powiększeniu pod mikroskopem optycznym przed umieszczeniem szalek w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W drugim dniu obserwuj stan komórek pod mikroskopem optycznym przy 40-krotnym powiększeniu przed przystąpieniem do przygotowania pożywki wymiennej. Po dezynfekcji przenieś szalki hodowlane na ultra czysty stół o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego.

Usuń pożywkę z każdego naczynia hodowlanego. Delikatnie opłucz naczynie dwoma mililitrami roztworu PBS dwukrotnie i dodaj 10 mililitrów pożywki do każdego naczynia. Przenieś komórki do inkubatora, aż będą gotowe do pobrania w supernatencie.

Na początek zbierz supernatant z hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiej tkanki tłuszczowej, gdy komórki zlewają się w 80%. Ostrożnie zebrać supernatant za pomocą pipety i przenieść go do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować probówkę o sile 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia zawieszonych komórek.

Następnie za pomocą pipety zebrać supernatant bez naruszania osadu. Odwirować supernatant o stężeniu 2 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia resztek komórkowych. Zbierz otrzymany supernatant za pomocą pipety i przefiltruj go przez membranę o grubości 0,22 mikrona, aby usunąć duże cząstki i resztki komórek.

Poddać filtrat ultrawirowaniu w temperaturze 10 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przeprowadzić końcowe odwirowanie w temperaturze 100 000 G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety usunąć supernatant bez zbierania osadu.

Ponownie zawiesić osad w PBS przed odwirowaniem probówki o stężeniu 100 000 G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić otrzymaną osadkę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV w jednym mililitrze PBS. Na koniec przenieś zawieszenie EV do jednomililitrowej probówki wirówkowej i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa wyraźnie ujawniła strukturę EV w kształcie miseczki z dwuwarstwową membraną. Analiza śledzenia nanocząstek wykazała, że mają one rozkład wielkości cząstek od około 50 do 150 nanometrów. Analiza Western blot wykazała, że charakterystyczne białka markerowe EV ulegały płynnej ekspresji.