Name: Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej przy użyciu ultrawirówki. Standaryzacja procesu zwiększa wydajność izolacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82202473).

Przegląd kroków protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną dla ADSC bez egzosomów, używając 450 ml podstawowej pożywki hodowlanej, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej bez egzosomów i 5 ml potrójnych antybiotyków.</li>
</ol>
2. Reanimacja i hodowla ADSC
UWAGA: Reanimuj ADSC.
<ol>
	<li>Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.</li>
	<li>Wcześniej podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pobrać 2 probówki zamrożonych ADSC (P3) z ciekłego azotu i wymieszać je w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozmrożenia. 
	UWAGA: Otwór rurki zamrażarki nie powinien mieć kontaktu z wodą, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>Zdezynfekuj probówkę do krioprezerwacji za pomocą 75% alkoholu, a następnie przenieś ją na ultra czysty stół. Odessać zawiesinę komórek za pomocą pipety i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umieścić probówkę wirówkową w wirówce wolnoobrotowej i wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj cztery 10-centymetrowe naczynia hodowlane i wlej 9 ml pożywki do każdego naczynia. Zaznacz nazwę, typ komórki, pokolenie i datę eksperymentu, a następnie podgrzej je w termostatycznym inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zdezynfekuj probówkę wirówkową i przenieś ją na ultra czysty stół. Usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 4 ml pożywki i delikatnie wymieszać roztwór (1 x 105 komórek/ml), aż do równomiernego rozproszenia. 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie usunąć osadu komórkowego podczas ekstrakcji supernatantu.</li>
	<li>Dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego naczynia. Wstrząśnij naczyniami metodą krzyżową. 
	UWAGA: Ustaw płytkę na równej powierzchni i mieszaj ją na krzyż (przesuwając ją w górę, w dół, w lewo i w prawo) przez 5-6 powtórzeń. Unikaj ruchów okrężnych, ponieważ mogą one powodować gromadzenie się komórek w środku.</li>
	<li>Obserwuj komórki w 40-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu optycznego, a następnie umieść szalki w inkubatorze. 
	UWAGA: Głównym celem obserwacji komórek jest ustalenie, czy są one równomiernie rozmieszczone, ponieważ nierównomierny rozkład wpłynie na późniejszy wzrost.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę wymienną dla komórek.
	<ol>
		<li>Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.</li>
		<li>Wcześniej podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Obserwuj stan komórki pod mikroskopem optycznym przy 40-krotnym powiększeniu. Poziom konfluencji wynosi około 50%. 
		UWAGA: Poziom konfluencji oblicza się jako stosunek powierzchni zajmowanej przez komórki do powierzchni szalki Petriego po tym, jak komórki przylegają do ściany i całkowicie się rozciągają.</li>
		<li>Po dezynfekcji przenieś naczynie hodowlane na ultra czysty stół (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2) i usuń pożywkę.</li>
		<li>Delikatnie opłucz każde naczynie hodowlane 2 ml roztworu PBS.</li>
		<li>Dodaj 10 ml podłoża do każdego naczynia. Przenieś naczynia do inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zbieranie supernatantu ADSC i ekstrakcja EV
<ol>
	<li>Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.</li>
	<li>Obserwuj stan komórki pod mikroskopem. Poziom konfluencji wynosi około 80%.</li>
	<li>Po dezynfekcji przenieś naczynie na ultra czysty stół. Ostrożnie zebrać sklarowany osad za pomocą pipety i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Komórki można zamrozić lub wyrzucić. Jeśli sterylność nie jest wymagana, na stole operacyjnym można wykonać następujące czynności. W tym momencie eksperyment można wstrzymać, a następnie wznowić później. Jeżeli eksperyment zostanie przerwany, supernatant należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień. Długotrwałe przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ może wpłynąć na aktywność pojazdów elektrycznych. Optymalnym podejściem jest natychmiastowe wyodrębnienie pojazdów elektrycznych.</li>
	<li>Odwirować (300 x g, 10 min, w temperaturze pokojowej) w celu usunięcia zawieszonych komórek. Zebrać supernatant za pomocą pipety. 
	UWAGA: Nie nalewać. Pozostawić trochę supernatantu, aby zapobiec zasysaniu osadu.</li>
	<li>Odwirować w celu usunięcia resztek komórkowych (2000 x g, 10 min, 4 °C), a następnie kontynuować zbieranie supernatantu za pomocą pipety. 
	UWAGA: Kluczowe punkty są takie same jak w kroku 3.4.</li>
	<li>Przefiltruj supernatant za pomocą membrany 0,22 μm, aby usunąć duże cząstki i resztki komórek. 
	UWAGA: Przefiltruj supernatant za pomocą 2 ml sterylnego PBS, aby zwilżyć membranę filtracyjną przed filtracją.</li>
	<li>Wirówka w ultrawirówce (10 000 x g, 30 min, 4 °C).</li>
	<li>Następnie odwirować przy 1 000 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadu i zebrania supernatantu. 
	UWAGA: Otrzymane EV zostały wielokrotnie oczyszczone przez odwirowanie w celu zwiększenia ich czystości. Śrut może nie być widoczny gołym okiem. Dlatego tak ważne jest, aby delikatnie obsługiwać pipetę i pozostawić trochę supernatantu na dnie, aby uniknąć gromadzenia się osadów.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad za pomocą PBS i odwirować (1 00 000 x g, 70 min, 4 °C). 
	UWAGA: Śrut może nie być widoczny gołym okiem. Dlatego podczas zasysania supernatantu za pomocą pipety bardzo ważne jest delikatne i dokładne usunięcie supernatantu, aby zmaksymalizować czystość EV.</li>
	<li>Usunąć supernatant i uzyskać osad EVs. Zawiesić go ponownie w 1 ml PBS, przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1 ml i przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C w celu późniejszego wykrycia. 
	UWAGA: Śrut może nie być widoczny gołym okiem. W związku z tym, podczas zasysania supernatantu za pomocą pipety, ważne jest, aby delikatnie i dokładnie usunąć supernatant, aby zmaksymalizować czystość EV. Jeśli próbki nie są potrzebne przez dłuższy czas, należy je przechowywać w lodówce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

Ultracentrifuge-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Human ADSCs

<ol><li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+Looking+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).</li>
<li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2FmiRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li>
<li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li>
<li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375%2Ffoxf1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).</li>
<li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li>
<li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p%2FTGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK%2FNF-%CE%BAB+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway.</a> Cytokine. 172, 156386(2023).</li>
<li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482(2018).</li>
<li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).</li>
<li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma%3A+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).</li>
<li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnego interesu finansowego do deklaracji.

Podczas formalnego procesu eksperymentalnego kilka punktów ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia najlepszych wyników eksperymentalnych. Opierając się na naszych wcześniejszych doświadczeniach, zaleca się wybór pasażowych 3-6 ADSC, ponieważ zapewniają one najlepszy możliwy stan komórek. Przed P3 czerwone krwinki, komórki śródbłonka i inne różne komórki mogły nie zostać odsiane. Po P6 komórki mogą stopniowo się starzeć, co może wpływać na stan wydzielanych EV. Po drugie, supernatant musi zostać pobrany, gdy stopień konfluencji komórek wynosi od 80% do 90%, aby zapewnić wystarczające wydzielanie jak największej liczby EV. Aby utrzymać maksymalną czystość pojazdów elektrycznych, naukowcy muszą zachować ostrożność podczas pierwszych trzech wirowania i upewnić się, że nie pozostały żadne pozostałości płynów, aby zapobiec aspiracji zanieczyszczeń i granulek. Podczas ostatnich dwóch wirowań należy upewnić się, że supernatant został całkowicie usunięty, jednocześnie chroniąc osad.
Ultrawirowanie jest opłacalne i nie wymaga dalszej obróbki. Technika ta jest szeroko stosowana w badaniach EV i wykazała zadowalającą skuteczność w uzyskiwaniu EV, co potwierdzają eksperymenty charakteryzacyjne. Niemniej jednak istnieją pewne nieuniknione wady. Po pierwsze, wskaźnik odzysku pojazdów elektrycznych jest niski. Po drugie, pojazdy elektryczne mają tendencję do agregacji. Dodatkowo można wyizolować komponenty niekomórkowe, a niektóre pojazdy elektryczne mogą pęknąć podczas tego procesu, prowadząc do akumulacji odłamków 14,15,16. Aby zaradzić tym wadom, większość badań koncentruje się na oczyszczaniu pojazdów elektrycznych12,13. Jednak protokół ten obejmuje cały proces, od hodowli komórkowej po oczyszczanie egzosomów, ponieważ uważamy, że cały proces wpływa na stan i czystość końcowych wyekstrahowanych EV. Bardzo ważne jest przestrzeganie wyżej wymienionych wytycznych podczas pracy. Dodatkowo, pobranie większej ilości supernatantu i wdrożenie hodowli komórkowej 3D może być korzystne, ponieważ liczne badania wykazały, że hodowla 3D jest bardziej skuteczna w stymulowaniu wydzielania EV w porównaniu z hodowlą 2D 17,18.
Protokół ten przedstawia proces ekstrakcji EV z ADSC za pomocą ultrawirowania. Dostarcza praktycznych wskazówek i umożliwia eksperymentatorom unikanie szczegółów podczas operacji w jak największym stopniu. Podsumowując, protokół pomaga eksperymentatorom w poprawie jakości próbek i służy jako przypomnienie, że powinniśmy nie tylko skupiać się na szczegółach każdego kroku, ale także rozpatrywać eksperyment jako całość.

Większość ADSC pochodzi z tkanki tłuszczowej i wykazano, że wspomaga regenerację i rekonstrukcję różnych tkanek i organów, w tym mięśnia sercowego, kości i skóry1. Ostatnie badania sugerują, że funkcja regeneracyjna ADSC może być spowodowana kontaktem międzykomórkowym i parakrynnym działaniem komórek2. Efekt parakrynny jest ważnym środkiem interakcji komórek i przekazywania informacji na krótkie odległości, a funkcja ta jest osiągana przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV).
EVs to dwuwarstwowe struktury błonowe wytwarzane przez komórki, o średnicy od 40 nm do 160 nm (średnio około 100 nm). Wpływają na różne funkcje komórkowe, takie jak produkcja cytokin, proliferacja komórek, apoptoza i metabolizm3,4. Przeprowadzono liczne badania nad funkcjami ADSC EV, w tym wspomaganiem regeneracji kości, regeneracją tkanki błony śluzowej jamy ustnej, przeżywalnością tkanki tłuszczowej po przeszczepie tkanek oraz gojeniem ran skóry5,6,7,8. Ogromny potencjał pojazdów elektrycznych ADSC w medycynie regeneracyjnej jest oczywisty. Istnieją różne metody ekstrakcji i oddzielania EV od supernatantu, takie jak techniki oparte na wirowaniu, wytrącaniu, wielkości cząsteczkowej, powinowactwie i mikrofluidyce. Metoda ultrawirowania jest powszechnie uważana za złoty standard izolowania EVs9. Podstawowa zasada ultrawirowania w celu separacji EV opiera się na fakcie, że cząstki w próbce mają różne współczynniki sedymentacji, co powoduje ich sedymentację i agregację w odrębnych warstwach separacji. Niemniej jednak nie ustalono jeszcze szczegółowego protokołu podkreślającego środki ostrożności podczas ultrawirowania.
Dlatego to badanie obiektywnie przedstawia kulturę ADSC, pobieranie supernatantów i procedury ultrawirowania EVs oraz kluczowe punkty za pomocą logicznego przepływu informacji i jasnego, formalnego języka. Stanowi to cenne odniesienie dla przyszłych eksperymentów.

<table><tbody><tr><td>Acrodisc Filtr igłowy, membrana Supor</td><td>Acros Organics</td><td>4652</td><td>0,22 &mu; </td></tr> m <tr><td>Podłoże bazowe do hodowli komórkowych</td><td>OriCell</td><td>BHDM-03011</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca bez EXO + suplement hodowlany (do ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej)</td><td>OriCell</td><td>HUXMD-05002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>OLYMPUS</td><td>Lx70-S8F2</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka wolnoobrotowa</td><td>Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.</td><td>SC-3612</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-NR-05</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP Ultrawirówka stołowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>roztworem penicyliny, streptomycyny i gentamycyny (100x)</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

Mezenchymalne komórki macierzyste (ADSC) pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej mogą wspomagać regenerację i rekonstrukcję różnych tkanek i narządów. Ostatnie badania sugerują, że ich funkcję regeneracyjną można przypisać kontaktowi komórka-komórka i efektom parakrynnym komórki. Efekt parakrynny jest ważnym sposobem interakcji komórek i przekazywania informacji na krótkie odległości, w których pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) odgrywają funkcjonalną rolę jako nośniki. W medycynie regeneracyjnej istnieje znaczny potencjał dla pojazdów elektrycznych ADSC. Wiele badań wykazało skuteczność tych metod. Obecnie opisano różne metody ekstrakcji i izolacji EV w oparciu o takie zasady, jak wirowanie, wytrącanie, wielkość cząsteczki, powinowactwo i mikrofluidyka. Ultrawirowanie jest uważane za złoty standard izolowania pojazdów elektrycznych. Niemniej jednak nadal brakuje skrupulatnego protokołu podkreślającego środki ostrożności podczas ultrawirowania. W niniejszym badaniu przedstawiono metodologię i kluczowe kroki związane z hodowlą ADSC, zbieraniem supernatantów i ultrawirowaniem EV. Jednak mimo że ultrawirowanie jest opłacalne i nie wymaga dalszej obróbki, nadal istnieją pewne nieuniknione wady, takie jak niski wskaźnik odzysku i agregacja pojazdów elektrycznych.

W pierwszej kolejności przeprowadzono charakterystykę i identyfikację ADSCs, obejmującą ich morfologię10 oraz przeciwciała powierzchniowe. Na podstawie Rysunku 2A widać wyraźnie, że ADSCs mają kształt wrzecionowaty i tworzą wiry po gęstym wzroście. Hodowane komórki zróżnicowano w kierunku adipogennym, osteogennym i chondrogennym, a następnie zabarwiono Oil Red O, Alizarin Red oraz Alcian Blue11. Eksperyment z indukcją różnicowania oraz cytometria przepływowa potwierdziły, że są to rzeczywiście ADSCs z potencjałem do różnicowania wielokierunkowego. Jednak w wynikach 22% komórek wykazuje pozytywny wynik dla CD45, co nie wpływa na sformułowany wniosek, ponieważ wspierają go odpowiednie przeciwciała pozytywne i negatywne (Rysunek 2A,B).
Następnie niezbędna jest identyfikacja wyizolowanych EV. Obejmuje ona głównie trzy aspekty: morfologię, wielkość cząstek oraz białka markerowe. Wyniki TEM wyraźnie ukazują strukturę EV w kształcie filiżanki z dwuwarstwową błoną12 (Rysunek 3A). NTA wskazuje, że EV mają rozkład wielkości cząstek w zakresie około 50-150 nm, przy stężeniu wynoszącym w przybliżeniu 1.6 x 1010 cząstek/mL (Rysunek 3B). Analiza Western Blot wykazuje również, że białka markerowe EV, w tym CD9, CD63 oraz TSG10113, ulegają prawidłowej ekspresji (Rysunek 3C).
<img alt="Przygotowanie egzosomów ADSC, schemat blokowy, etapy wirowania, hodowla komórek, proces filtracji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd etapów protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Barwienie i wyniki cytometrii przepływowej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej; analiza różnicowania, markery macierzystości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Charakterystyka ADSCs. (A) Morfologia ADSCs jest wrzecionowata. ADSCs hodowano odpowiednio w pośrodkach do różnicowania adipogennego, osteogennego i chondrogennego. Różnicowanie adipogenne zidentyfikowano za pomocą barwienia Oil Red O. Różnicowanie osteogenne i chondrogenne potwierdzono odpowiednio barwieniem Alizarin Red oraz barwieniem Alcian Blue. Pasek skali: 100 µm. (B) Analiza cytometrii przepływowej ADSCs pod kątem markerów powierzchniowych MSC (CD90, CD105, CD29 i CD73) oraz markerów specyficznych dla komórek krwiotwórczych (CD31, CD34, CD45 i HLA-DR). Strategia bramkowania: najpierw obrysowano grupę kontrolną (blank). Na tej podstawie kolejno obrysowano CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 i HLA-DR zgodnie z przeciwciałami znakującymi każdą z grup. Rysunek został opracowany na podstawie pracy Han, Y. D. et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Badanie nanocząstek: obraz TEM, wykres rozkładu wielkości, analiza Western blot białek pod kątem biomarkerów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Charakterystyka EV. (A) Wyniki TEM wyraźnie ukazują wklęsłą, przypominającą filiżankę strukturę EV błony dwuwarstwowej. Pasek skali: 200 nm. (B) NTA wskazuje, że EV mają rozkład wielkości cząstek w zakresie około 50-150 nm, przy stężeniu wynoszącym około 1,6 x 1010 cząstek/ mL. (C) Detekcja ekspresji TSG101, CD9 i CD63 w egzosomach za pomocą metody Western blot. Rycina została opracowana na podstawie pracy Han, Y. D. et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...

Nasze badania koncentrują się na przygotowaniu i oczyszczaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiej tkanki tłuszczowej. Problemem, który chcemy rozwiązać, jest to, jak ustandaryzować ten proces i poprawić wydajność oczyszczania. Obecnie istnieje wiele technologii stosowanych do ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, takich jak ultrawirowanie, ultrafiltracja, chromatografia wykluczania objętości, wytrącanie polimerów, wychwytywanie powinowactwa immunologicznego, technologia mikroprzepływowa i tak dalej.Trzeba jednak przyznać, że ultrawirowanie jest uznawane za złoty standard. W przyszłości skupimy się na zastosowaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako wektorów, w tym przenoszeniu mRNA, plazmidów i innych małych cząsteczek oraz transfekowaniu ich do komórek. Na początek pobierz dwie probówki do kriokonserwacji zawierające zamrożone mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej w trzecim przejściu z ciekłego azotu.Mieszaj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do całkowitego rozmrożenia. Następnie zdezynfekuj probówki za pomocą 75% alkoholu. Umieść zdezynfekowane probówki na ultra czystym stole.Za pomocą pipety odessać zawiesinę komórek i przenieść ją do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować probówkę w wirówce wolnoobrotowej o stężeniu 250 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. W międzyczasie przygotuj cztery 10-centymetrowe naczynia hodowlane i dodaj dziewięć mililitrów pożywki do każdego naczynia.Zaznacz nazwę, typ komórki, pokolenie i datę eksperymentu na każdym talerzu. Następnie podgrzej je w inkubatorze termostatycznym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu pięciominutowego wirowania zdezynfekuj probówkę wirówkową przed przeniesieniem jej na bardzo czysty stół.Za pomocą pipety usuń supernatant i dodaj cztery mililitry pożywki, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek. Delikatnie mieszaj roztwór, aż zostanie równomiernie rozprowadzony. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego podgrzanego naczynia i potrząśnij nim, mieszając to samo na równej powierzchni w układzie krzyżowym.Obserwuj komórki w 40-krotnym powiększeniu pod mikroskopem optycznym przed umieszczeniem szalek w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W drugim dniu obserwuj stan komórek pod mikroskopem optycznym przy 40-krotnym powiększeniu przed przystąpieniem do przygotowania pożywki wymiennej. Po dezynfekcji przenieś szalki hodowlane na ultra czysty stół o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego.Usuń pożywkę z każdego naczynia hodowlanego. Delikatnie opłucz naczynie dwoma mililitrami roztworu PBS dwukrotnie i dodaj 10 mililitrów pożywki do każdego naczynia. Przenieś komórki do inkubatora, aż będą gotowe do pobrania w supernatencie.Na początek zbierz supernatant z hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiej tkanki tłuszczowej, gdy komórki zlewają się w 80%. Ostrożnie zebrać supernatant za pomocą pipety i przenieść go do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować probówkę o sile 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia zawieszonych komórek.Następnie za pomocą pipety zebrać supernatant bez naruszania osadu. Odwirować supernatant o stężeniu 2 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia resztek komórkowych. Zbierz otrzymany supernatant za pomocą pipety i przefiltruj go przez membranę o grubości 0,22 mikrona, aby usunąć duże cząstki i resztki komórek.Poddać filtrat ultrawirowaniu w temperaturze 10 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przeprowadzić końcowe odwirowanie w temperaturze 100 000 G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety usunąć supernatant bez zbierania osadu.Ponownie zawiesić osad w PBS przed odwirowaniem probówki o stężeniu 100 000 G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić otrzymaną osadkę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV w jednym mililitrze PBS. Na koniec przenieś zawieszenie EV do jednomililitrowej probówki wirówkowej i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy.Transmisyjna mikroskopia elektronowa wyraźnie ujawniła strukturę EV w kształcie miseczki z dwuwarstwową membraną. Analiza śledzenia nanocząstek wykazała, że mają one rozkład wielkości cząstek od około 50 do 150 nanometrów. Analiza Western blot wykazała, że charakterystyczne białka markerowe EV ulegały płynnej ekspresji.

purification-characterization-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.

Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Protokół wykorzystuje specyficzną dla adipocytów linię myszy raportującej CD63-GFP do wizualizacji i ilościowej wydzieliny pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów (EV) oraz wykazania ich przyjmowania przez komórki progenitorowe, ujawniając szlak parakrynowy w tkance tłuszczowej.

Charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera CD63-GFP in vivo i in vitro

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Poznaj metodę oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej przy użyciu ultrawirówki. Standaryzacja procesu zwiększa wydajność izolacji.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Przeglądaj więcej filmów