Hodowla biofilmu prątków jako model do badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Nasze badania koncentrują się na metabolizmie bakterii, zwłaszcza metabolizmie energetycznym, który ma kluczowe znaczenie dla wzrostu i przetrwania. Pomimo obszernych danych biochemicznych i strukturalnych, zrozumienie na poziomie systemów i mechanizmy adaptacyjne pozostają niejasne. Naszym celem jest pogłębienie tej wiedzy i zajęcie się kwestią oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Nasz protokół zwiększa fizjologiczne znaczenie eksperymentów laboratoryjnych poprzez wykorzystanie biofilmów, które naśladują naturalny wzrost bakterii lepiej niż metody planktonowe. Adaptacja biofilmów prątków zapewni doskonały system do zrozumienia stylu życia rodzaju, a także zapewni system badań przesiewowych pod kątem środków przeciwdrobnoustrojowych. Nie jesteśmy pierwszymi, którzy produkują biofilmy prątków.

Istnieje kilka grup, które używają tego jako modelu. Naszą motywacją do stworzenia tego protokołu było maksymalne uproszczenie procedur, aby wiele laboratoriów mogło zaadaptować ten system jako model. Na początek za pomocą pipety serologicznej dozuj dwa mililitry autoklawu bulionu lizogenicznego do dwóch sterylnych 14-mililitrowych probówek wewnątrz kaptura laminarnego.

Dodaj 20 mikrolitrów sterylizowanego filtrem 5%TWEEN 80 do probówek za pomocą mikropipety. Następnie dodaj kriostock Mycobacterium smegmatis do probówki z pętlą do zaszczepiania. Inkubować probówki przez 48 godzin w inkubatorze z wytrząsarką przy 300 obrotach na minutę i 37 stopniach Celsjusza.

Aby przygotować kultury wtórne, dozuj dwa mililitry pożywki bulionowej z lizogenii autoklawu do dwóch sterylnych 14-mililitrowych probówek. Następnie za pomocą mikropipety dodaj do probówek 20 mikrolitrów sterylizowanego filtrem 5%TWEEN 80. Następnie za pomocą mikropipety przenieś 20 mikrolitrów kultury pierwotnej do jednej z probówek.

Inkubuj kultury w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 300 obrotów na minutę i w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną OD600 od 0,6 do 0,8. Na początek w okapie laminarnym dozuj sześć mililitrów pożywki Saautona, uzupełnionej 2% glukozą, do dołków sześciodołkowej płytki. Zaszczep studzienki 120 mikrolitrami wtórnych kultur Mycobacterium smegmatis.

Trzymaj jeden niezaszczepiony dobrze jako kontrolę pożywki. Następnie pipetuj kulturę w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby uzyskać równomierne wymieszanie. Przykryj pokrywkę i ostrożnie uszczelnij płytkę folią parafinową.

Inkubować płytkę w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Aby uzyskać wizualną ocenę wzrostu biofilmu, umieść płytki w systemie dokumentacji żelowej pod oświetleniem światłem białym epi. Aby zmierzyć suchą masę, zważ arkusz bibuły.

Wyodrębnij biofilm z płytki sześciodołkowej i przenieś go na papier za pomocą szpatułki. Ostrożnie zbierz większość biofilmu z kultury. Umieść biofilm na bibułce.

Umieść bibułę w inkubatorze, aż biofilm całkowicie wyschnie. Następnie zmierz łączną wagę papieru i biofilmu. Błonki biofilmu były widoczne od trzeciego dnia.

Siateczkowa hodowla poprawiła się po dodaniu 2% glukozy do pożywki Saautona. Rozwój biofilmu był widoczny między trzecim a szóstym dniem. W trzecim dniu zaobserwowano film z lekką siateczkowatą siateczką.

Ten film dojrzał w piątym dniu i rozpadł się w szóstym dniu.