Hodowla biofilmu prątków jako model do badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe
12 lipca 2024
Ten protokół opisuje solidną metodę tworzenia biofilmu błonki. Metoda jest skalowalna do różnych objętości hodowli, co pozwala na łatwe zastosowanie do różnych celów eksperymentalnych. Konstrukcja metody umożliwia jakościową lub ilościową ocenę potencjału biofilmotwórczego kilku gatunków prątków.
Nasze badania koncentrują się na metabolizmie bakterii, zwłaszcza metabolizmie energetycznym, który ma kluczowe znaczenie dla wzrostu i przetrwania. Pomimo obszernych danych biochemicznych i strukturalnych, zrozumienie na poziomie systemów i mechanizmy adaptacyjne pozostają niejasne. Naszym celem jest pogłębienie tej wiedzy i zajęcie się kwestią oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.
Nasz protokół zwiększa fizjologiczne znaczenie eksperymentów laboratoryjnych poprzez wykorzystanie biofilmów, które naśladują naturalny wzrost bakterii lepiej niż metody planktonowe. Adaptacja biofilmów prątków zapewni doskonały system do zrozumienia stylu życia rodzaju, a także zapewni system badań przesiewowych pod kątem środków przeciwdrobnoustrojowych. Nie jesteśmy pierwszymi, którzy produkują biofilmy prątków.
Istnieje kilka grup, które używają tego jako modelu. Naszą motywacją do stworzenia tego protokołu było maksymalne uproszczenie procedur, aby wiele laboratoriów mogło zaadaptować ten system jako model. Na początek za pomocą pipety serologicznej dozuj dwa mililitry autoklawu bulionu lizogenicznego do dwóch sterylnych 14-mililitrowych probówek wewnątrz kaptura laminarnego.
Dodaj 20 mikrolitrów sterylizowanego filtrem 5%TWEEN 80 do probówek za pomocą mikropipety. Następnie dodaj kriostock Mycobacterium smegmatis do probówki z pętlą do zaszczepiania. Inkubować probówki przez 48 godzin w inkubatorze z wytrząsarką przy 300 obrotach na minutę i 37 stopniach Celsjusza.
Aby przygotować kultury wtórne, dozuj dwa mililitry pożywki bulionowej z lizogenii autoklawu do dwóch sterylnych 14-mililitrowych probówek. Następnie za pomocą mikropipety dodaj do probówek 20 mikrolitrów sterylizowanego filtrem 5%TWEEN 80. Następnie za pomocą mikropipety przenieś 20 mikrolitrów kultury pierwotnej do jednej z probówek.
Inkubuj kultury w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 300 obrotów na minutę i w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną OD600 od 0,6 do 0,8. Na początek w okapie laminarnym dozuj sześć mililitrów pożywki Saautona, uzupełnionej 2% glukozą, do dołków sześciodołkowej płytki. Zaszczep studzienki 120 mikrolitrami wtórnych kultur Mycobacterium smegmatis.
Trzymaj jeden niezaszczepiony dobrze jako kontrolę pożywki. Następnie pipetuj kulturę w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby uzyskać równomierne wymieszanie. Przykryj pokrywkę i ostrożnie uszczelnij płytkę folią parafinową.
Inkubować płytkę w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Aby uzyskać wizualną ocenę wzrostu biofilmu, umieść płytki w systemie dokumentacji żelowej pod oświetleniem światłem białym epi. Aby zmierzyć suchą masę, zważ arkusz bibuły.
Wyodrębnij biofilm z płytki sześciodołkowej i przenieś go na papier za pomocą szpatułki. Ostrożnie zbierz większość biofilmu z kultury. Umieść biofilm na bibułce.
Umieść bibułę w inkubatorze, aż biofilm całkowicie wyschnie. Następnie zmierz łączną wagę papieru i biofilmu. Błonki biofilmu były widoczne od trzeciego dnia.
Siateczkowa hodowla poprawiła się po dodaniu 2% glukozy do pożywki Saautona. Rozwój biofilmu był widoczny między trzecim a szóstym dniem. W trzecim dniu zaobserwowano film z lekką siateczkowatą siateczką.
Ten film dojrzał w piątym dniu i rozpadł się w szóstym dniu.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia skalowalny protokół opracowywania biofilmów pelikulowych, ze szczególnym uwzględnieniem gatunków prątków. Podejście to zwiększa istotność fizjologiczną eksperymentów laboratoryjnych poprzez skuteczniejsze naśladowanie naturalnego wzrostu bakterii niż w przypadku konwencjonalnych metod planktonicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Metabolizm bakteryjny
- Tworzenie biofilmu
- Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe
Wprowadzenie
- Zrozumienie metabolizmu energetycznego bakterii ma kluczowe znaczenie dla ich wzrostu i przetrwania.
- Istniejące metody hodowli biofilmów prątkowych mogą być złożone i nie są powszechnie stosowane.
- Uproszczenie procesu wytwarzania biofilmów może ułatwić ich szersze zastosowanie w badaniach.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie biofilmu błonowego z wykorzystaniem Mycobacterium smegmatis.
- Protokoły szczepienia kultur i pomiaru wzrostu biofilmu.
- Ocena rozwoju biofilmu za pomocą technik wizualnych i pomiaru masy.
Główne wyniki
- Tworzenie biofilmu stało się widoczne od trzeciego dnia i osiągnęło dojrzałość do piątego dnia.
- Dodatek glukozy zwiększył siatkowanie kultur.
- Protokół zapewnia niezawodną metodę testowania skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko biofilmom.
Wnioski
- Niniejsza praca przedstawia uproszczoną i skuteczną metodę hodowli biofilmu prątek.
- Zastosowanie opisanego protokołu obejmuje zrozumienie cyklu życia bakterii oraz badania przesiewowe środków przeciwdrobnoustrojowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele prątkowe oparte na biofilmach wypełniają istotną lukę w badaniach nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez odtwarzanie fizjologicznie istotnych stanów wzrostu bakterii. System ten umożliwia bardziej predykcyjną ocenę skuteczności leków przeciwdrobnoustrojowych i wspiera wczesne etapy ograniczania ryzyka w weryfikacji hipotez terapeutycznych. Jego skalowalność i adaptacyjność czynią go podstawowym narzędziem do przesiewowego badania całych portfolio oraz walidacji celów w badaniach i rozwoju (R&D) nad chorobami zakaźnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w kontekście biofilmu istotnym dla przebiegu choroby.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów w fizjologicznie odpowiednich warunkach wzrostu.
- Ułatwia analizę ryzyk mechanistycznych poprzez modelowanie naturalnej wielokomórkowości bakterii.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia powtarzalną platformę do ilościowej i jakościowej oceny tworzenia biofilmu.
- Umożliwia standaryzowaną ocenę skuteczności związków przeciwko bakteriom wbudowanym w biofilm.
- Wspiera skalowalność i adaptację testu dla różnych gatunków prątków przy minimalnych zmianach w protokole.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica modele in vitro ze stanami bakteryjnymi przypominającymi warunki in vivo w celu zwiększenia istotności translacyjnej.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania leków po przedkliniczne badania przesiewowe środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie fenotypów oporności obserwowanych w warunkach klinicznych.
Integracja rurociąga i przepływu pracy
Ta metoda hodowli biofilmu integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając zarówno walidację celu, jak i identyfikację wiodących związków w programach przeciwdrobnoustrojowych.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów oporności w wielokomórkowych układach bakteryjnych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki służące do priorytetyzacji związków.
- Analityka: Umożliwia pomiar masy biofilmu oraz ocenę wizualną na potrzeby badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro z fenotypami bakteryjnymi istotnymi w kontekście chorobowym.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczny, skalowalny protokół, który można dostosować do różnych celów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognoz w modelowaniu skuteczności przeciwdrobnoustrojowej i oporności.
- Wartość operacyjna: Upraszcza wdrażanie protokołu i standaryzuje testy biofilmu w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań dzięki dostarczeniu fizjologicznie istotnych danych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe ukierunkowanych na oporność związaną z biofilmem w oparciu o analizę ryzyka.
Kwestie implementacyjne
- Wymaga doświadczenia w hodowli bakterii i stosowania technik sterylnych.
- Wymaga dostępu do standardowej aparatury mikrobiologicznej oraz narzędzi analitycznych do ilościowego oznaczania biofilmu.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu uzyskania powtarzalnych wyników w badaniach wieloośrodkowych.
- Można dostosować do różnych gatunków prątków poprzez niewielkie modyfikacje protokołu.
- Ogranicza się do modelowania in vitro; nie obejmuje oddziaływań między gospodarzem a patogenem.
