Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Celem tego badania jest zrozumienie niektórych ograniczeń w odpowiedzi immunologicznej na infekcję bakteryjną we wczesnym okresie życia. Aby to osiągnąć, musimy opracować i wykorzystać modele badawcze, które są specyficzne dla noworodków. Izolacja szpiku kostnego od szczeniaka w wieku 7 dni jest trudna i nie ma ugruntowanej pozycji.

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego noworodków są wrażliwe i podatne na stres w porównaniu z innymi BMDM. Technika zastosowana w tym protokole jest prosta i powtarzalna. Ta metoda prowadzi użytkowników w izolowaniu szpiku kostnego od siedmio- do dziewięciodniowych nowonarodzonych myszy bez użycia jakichkolwiek enzymów.

Badanie to zapewnia ustandaryzowaną strategię generowania makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od nowonarodzonych myszy, które można wykorzystać do odpowiedzi na pytania dotyczące immunologii noworodków. Ta powtarzalna metoda zapewnia specyficzny dla wieku model postępu badań nad odpornością noworodków w wielu dziedzinach wiedzy. Po dekapitacji wysterylizuj ciało znieczulonej noworodka myszy 70% etanolem.

Za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych z cienką końcówką wykonaj nacięcie między brzuchem a tylnymi nogami. Następnie usuń skórę, ciągnąc ją w kierunku stopy tylnych kończyn. Zeskrob tkankę łączną i mięśnie przyczepione do kości za pomocą kleszczy o ostrych krawędziach.

Przetnij kość piszczelową i kość udową nożyczkami. Użyj kleszczy, aby umieścić kość piszczelową i kość udową w probówce z pożywką hodowlaną MEM na lodzie. Przenieś kości do sitka o średnicy 40 mikronów z probówką do pobierania opłat.

Zmiażdżyć kości trzymililitrowym tłokiem strzykawki o sitko, aby uwolnić szpik. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 350 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 0,2% chlorku sodu, aby uzyskać hipotoniczny roztwór do lizy erytrocytów.

Natychmiast dodać równą objętość 1,6% chlorku sodu, aby roztwór był izotoniczny. Odwirować supernatant i usunąć roztwór do lizy. Ponownie zawieś komórki w kompletnym DMEM i policz komórki na automatycznym liczniku komórek.

Na początek zasiej 20 milionów nowonarodzonych komórek szpiku kostnego myszy w kolbie T75 w 10 mililitrach kompletnego DMEM zawierającego 2,5 mililitra 10% supernatantu L929. Inkubować kolbę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć dni. W 3 dniu różnicowania dodać dwa mililitry pożywki kondycjonowanej L929 do kolby.

Pod odwróconym mikroskopem z 20-krotnym powiększeniem codziennie obserwuj komórki. Aby zebrać makrofagi w dniu 5, należy odessać pożywkę różnicującą z kolby. Umyj komórki pięcioma mililitrami PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki i białka surowicy.

Dodaj pięć mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po pięciu minutach dodaj pięć mililitrów DMEM i odpipetuj w celu odłączenia komórek. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 350 g przez pięć minut.

Zdysocjuj podniebienie komórkowe w jednym mililitrze kompletnego DMEM. Policz komórki w automatycznym liczniku komórek. W obecności supernatantu z komórek L929 komórki szpiku kostnego różnicowały się w makrofagi w ciągu pięciu dni.

Tworzenie się komórek w kształcie wrzeciona obserwowano od drugiego dnia, przy czym prawie połowa wykazywała tę morfologię do 3 dnia, a większość do 5 dnia. Na początek ponownie zamieść makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego noworodków w kompletnym DMEM bez czerwieni fenolowej i antybiotyków. Wysiewaj 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej o gęstości 200 000 na kwadrant w 35-milimetrowej poczwórnej szalce.

Usuń wstępnie obliczony zapas Escherichia coli z 80 stopni Celsjusza. Podać żądaną objętość zawiesiny komórkowej do mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra, aby przygotować inokulum bakteryjne przy wielokrotności infekcji 25. Następnie dodaj PBS do całkowitej objętości jednego mililitra.

Odwirować zawiesinę bakteryjną o wadze 2000 g przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach PBS. Dodaj zielony barwnik fluorescencyjny wrażliwy na pH do końcowego stężenia 500 mikromolowców i inkubuj przez 20 minut w ciemności w celu koniugacji barwnika. Umyj bakterie cztery razy jednym mililitrem PBS przez odwirowanie w 1000 g przez pięć minut.

Zawiesić osad w 500 mikrolitrach kompletnego DMEM bez czerwieni fenolowej i dodać kultury makrofagów pochodzące ze szpiku kostnego. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny. Dodaj 200 nanogramów przepuszczalnego dla komórek czerwonego barwnika fluorescencyjnego, aby zabarwić lizosomy.

Po zakażeniu bakteryjnym wykryto obfitą fagocytozę zielonych bakterii fluorescencyjnych wewnątrz makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Zielona fluorescencja dodatkowo lokalizuje się z czerwoną fluorescencją wskazującą na zakwaszone lizosomy. Fagocytozę i pojawienie się zielonych, wrażliwych na pH, barwniko-dodatnich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego noworodków obserwowano również przez cały czterogodzinny okres infekcji.