Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie komórek TH 17 z naiwnych limfocytów T CD 4 dodatnich. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie węzłów chłonnych i śledziony od dorosłej myszy C 57 black six. W drugim etapie tkanki są mielone w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Cztery dodatnie limfocyty T CD 25 ujemne są następnie izolowane i hodowane w warunkach indukcji lub kontroli aktywacji TH 17. Ostatecznie Q-P-C-R-E-I-S-A i cytometria przepływowa mogą być wykorzystane do oceny ekspresji IL 17 A. Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w różnicowanie limfocytów T CD czterech w komórki T osiem 17 u C 57 czarnych sześciu myszy.

Można go również zastosować do innych modeli myszy. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ węzły chłonne są bardzo małe, co utrudnia etapy sekcji. Bez bezpośredniej wizualizacji tej metody, co najmniej cztery godziny przed dodaniem komórek pokryj studzienki nowej 96-dołkowej płytki do mikrobadań tkankowych UBO 30 mikrolitrami anty CD trzy rozcieńczonej w sterylnym PBS, postukaj w boki płytki, aby zapewnić równomierne pokrycie studzienek, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po czterech godzinach, Wstaw płytkę do lodówki, aż nadejdzie czas na dodanie komórek.

Po stwierdzeniu zgonu przez zwichnięcie szyjki macicy wysterylizuj obszar nacięcia u dorosłej myszy C 57 black six za pomocą 70% etanolu. Następnie chwyć skórę przed otworem cewki moczowej i przetnij od brzusznej linii środkowej do okolicy podbródka, uważając, aby nie naruszyć otrzewnej. Następnie przypnij skórę, aby umożliwić dostęp do węzłów chłonnych i śledziony w celu usunięcia.

Teraz usuń pachowe węzły chłonne znajdujące się w pobliżu pachy myszy za mięśniami piersiowymi i umieść tkankę na szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów buforu biegowego AutoMax. Następnie usuń węzły chłonne ramienne znajdujące się w tkance łącznej w pobliżu każdej pachy. Następnie usuń powierzchowne węzły chłonne szyjne znajdujące się na szyi zwierzęcia, po bokach tchawicy, a następnie usuń pachwinowe węzły chłonne znajdujące się w okolicy bioder na połączeniu trzech naczyń krwionośnych.

Aby uzyskać dostęp do krezkowych węzłów chłonnych, najpierw przetnij brzuszną linię środkową przez wyściółkę otrzewnej. Węzły chłonne krezki znajdują się głęboko w krezce myszy, zwykle w ciągu od czterech do ośmiu węzłów, które mogą wyglądać jak sznur pereł. Usuń śledzionę, ciągnąc ją i odłączając od trzustki.

Następnie umieść go na szalce Petriego z węzłami chłonnymi, aby zmielić narządy. Umieść węzły chłonne na oszronionej stronie jednego szkiełka mikroskopowego, a następnie przetrzyj tkanki matową stroną drugiego szkiełka. Aby przefiltrować zmielone narządy do zawiesiny jednokomórkowej, najpierw kilkakrotnie złóż kawałek nylonu o wymiarach około 3 cale na 3 cale i umieść go w górnej części 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21, aby zassać komórki i bufor, a następnie powoli dozuj roztwór komórek do złożonego nylonu. Uważając, aby nie przebić materiału igłą. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki roztwór powinien wydawać się spójny bez widocznych kawałków tkanki stałej.

Umieść ten roztwór na lodzie. Po posortowaniu komórek przez separację AutoMax do co najmniej 80% CD cztery dodatnie CD 25 ujemna czystość komórek. Policz komórki przez wykluczenie błękitu trianowego, a następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek do 10 do sześciu komórek na mililitr w pożywce do hodowli komórkowych.

Teraz przepłucz wszystkie dołki płyty anty CD z trzema powłokami 200 mikrolitrów PBS. Każdy wyrzuca pranie do pojemnika na odpady. Następnie dodać 100 mikrolitrów koktajlu indukującego TH 17 lub mieszanek kontrolnych aktywacji do odpowiednich studzienek w trzech powtórzeniach.

Na koniec dodaj 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki i inkubuj komórki przez co najmniej 72 godziny lub do pięciu dni, aby osiągnąć różnicowanie komórek TH 17 dla Eli SA i QPCR. Po okresie inkubacji należy zebrać trzy egzemplarze każdej próbki do pojedynczych probówek einor. Po odwirowaniu komórek przenieś supernatant do oddzielnych probówek einor i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby później zmierzyć produkcję IL 17 A przez ELI.

A.To przygotować się do QPCR po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić, pozostałe granulki w 175 mikrolitrach, bufor do lizy RNA do natychmiastowej ekstrakcji RNA lub przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu przygotowania do rozpoczęcia procedury po okresie inkubacji. W ramach przygotowań do aktywacji komórek przed IL 17, wewnątrzkomórkowa pula barwienia każda z komórek kontrolnych indukujących lub aktywujących TH 17 trzykrotnie trafia do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki.

Aby zwiększyć całkowitą objętość do jednego mililitra, dodaj jon PMA, mycynę i felden A do każdej studzienki i inkubuj komórki przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wykryć obecność IL 17 A za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej. Najpierw przenieś komórki z każdej studzienki 24-dołkowej płytki do oddzielnej probówki einor. Następnie odkręć rurki.

Usunąć supernatanty i ponownie zawiesić granulki komórek w 200 mikrolitrach buforu faksowego. Przenieś zawieszone komórki na 96-dołkową płytkę cytometrii przepływowej i ponownie odwiruj komórki po umyciu granulek w 200 mikrolitrach buforu faksowego, ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach buforu faksowego i dodaj 100 mikrolitrów zewnątrzkomórkowej mieszaniny barwiącej przeciwciała. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej z dala od światła.

Po dwukrotnym umyciu komórek inkubować granulki w 100 mikrolitrach cyto BD. Utrwal bufor cyto perm pokryty folią przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Teraz umyj komórki dwukrotnie w 100 mikrolitrach jednego buforu do trwałej ondulacji X BD, a następnie inkubuj komórki w 50 mikrolitrach wewnątrzkomórkowej mieszaniny przeciwciał pokrytej folią przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po ponownym umyciu komórek należy zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego BD, a następnie przenieść komórki do probówek cytometrii przepływowej zawierających 200 mikrolitrów buforu barwiącego. Probówki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, gdy będą gotowe do odczytu do analizy metodą cytometrii przepływowej pierwszej bramki próbek w populacji żywych komórek. Następnie użyj żywej populacji komórek, aby zabramkować populację CD cztery dodatnie CD osiem ujemnych.

Wreszcie z CD cztery dodatnie CD osiem ujemny chód populacji na IL 17 Populacja dodatnia w celu różnicowania komórek TH 17, niefrakcjonowane połączone komórki węzła chłonnego i śledziony muszą zostać wzbogacone o populację limfocytów T CD 4 dodatnich CD 25. Na tym rysunku pokazano niefrakcjonowane pule komórek węzłów chłonnych, cyty SP i frakcje komórek TT oddzielone AutoMax wybarwione anty CD four i anty CD 25. Ten pierwszy wykres punktowy przedstawia reprezentatywny profil odsetka limfocytów CD 4 dodatnich, CD 25 dodatnich i CD 4 dodatnich CD 25 ujemnych obecnych w niefrakcjonowanych połączonych węzłach chłonnych i komórkach śledziony.

Procedura izolacji zapewnia również wzbogaconą populację limfocytów Treg z czterema dodatnimi CD 25, które można wykorzystać w dodatkowych eksperymentach. Na tym ostatnim wykresie punktowym pokazano pożądane wzbogacenie komórek populacją, która składa się z 84% CD cztery dodatnie CD 25 ujemne limfocyty T. Ta wzbogacona populacja limfocytów T CD 4 dodatnich CD 25 pomaga zapewnić bardziej skuteczne różnicowanie TH 17, jak pokazano na tym rysunku.

Podczas gdy inkubacja limfocytów T CD cztery dodatnie CD 25 ujemne z anty CD 3 i anty CD 28 przez pięć dni daje CD 25 dodatnie limfocyty T, inkubacja w warunkach indukujących TH 17 daje podzbiór IL 17 wytwarzający CD cztery dodatnie limfocyty CD 25. Status różnicowania TH 17 można dalej ocenić za pomocą ilościowego PCR i Elis A, tutaj dane ze wzbogaconych limfocytów T CD cztery dodatnie CD 25 ujemne inkubowane pod kontrolą lub warunki indukujące TH 17 pokazują, że CD cztery są dodatnie. Limfocyty T CD 25 ujemne inkubowane w warunkach TH 17 zwiększają IL 17 A, co można ustalić za pomocą QPCR i ELI SA. Specyficzny dla TH 17 czynnik transkrypcyjny ROAR gamma T jest również regulowany w górę przez CD cztery dodatnie limfocyty T CD 25 ujemne inkubowane w warunkach indukujących TH 17, co można zmierzyć za pomocą QPCR.

Podczas tej procedury ważne jest, aby pamiętać o osiągnięciu co najmniej 80% czystości komórek CD 4 dodatnich CD 25 przed inkubacją komórek w warunkach indukujących TH 17. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sekcję węzłów chłonnych i śledziony od czarnych sześciu myszy C 57, jak inkubować komórki w warunkach T 8 17 lub kontroli aktywacji oraz jak ocenić różnicowanie naiwnych limfocytów T 4 CD do komórek T 8 17 na południe.