Name: Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T21:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4+ myszy C57BL/6. Protokół obejmuje izolację komórek z węzłów chłonnych i śledziony oraz ich hodowlę w warunkach indukujących Th17.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest częściowo wspierana przez nagrody NIH/NCATS Clinical and Translational Science Awards dla University of Florida TL1 TR000066 i UL1 TR000064, suplement różnorodności z Parent Grant R01AI056152 z National Institute of Health, grant BD Biosciences na odczynniki oraz University of Florida.

Wszystkie zwierzęta były wykorzystywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Przygotowanie miksów i mediów
<ol>
	<li>Sterylne pH PBS: 7,3 (1 l) 
	0,23 g NaH2PO4 
	1,15 g na2HPO4 
	9,0 g NaCl 
	Uzupełnij objętość wodą DI. Sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Pożywka do hodowli komórkowych (100 ml) 
	89 ml RPMI 
	10 ml 10% FBS 
	1 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego (ABAM) 100 μg 50 mM 2-merkaptoetanolu (3,5 μg podstawowego 2-merkaptoetanolu na 96,5 μg PBS)</li>
	<li>Bufor FACS (fluorescencyjne sortowanie komórek aktywujących) (do stosowania podczas cytometrii przepływowej) 2% FBS w sterylnym PBS</li>
	<li>iTh17 Mix (na podstawie liczby próbek określić objętość potrzebną dla wszystkich mieszanek i pożywek) 
	1,5 μg/ml anty-CD28 
	20 ng/ml IL-6 
	5 ng/ml TGF-β
</li>
</ol>
2. Komórki zostaną posiane w trzech egzemplarzach w następujących warunkach
<ol>
	<li>Anty-CD3, anty-CD28 (jest to mieszanka kontrolna aktywacji).</li>
	<li>iTH17: anty-CD3, anty-CD28, IL-6, TGF-β.</li>
</ol>
3. Anty-CD3 na płytce (10 μg/ml)
Zaleca się, aby przygotowanie płytek anty-CD3 z płytkami było wykonane co najmniej 4 godziny przed dodaniem komórek do płytek.
<ol>
	<li>Dodać 30 μl anty-CD3 do studzienek (anty-CD3 rozcieńcza się w sterylnym PBS) nowej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej mikrotestu U z dnem i postukać w boki płytki, aby zapewnić równomierne pokrycie studzienek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, a następnie przechowywać w lodówce do czasu dodania mieszanek i komórek do płytki.</li>
</ol>
4. Sekcja myszy
<ol>
	<li>Protokół ten opiera się na użyciu myszy C57BL/6 w wieku 3-8 miesięcy i zakupionych w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).</li>
	<li>Ofiaruj mysz za pomocą uduszenia CO2 i potwierdź śmierć z późniejszym zwichnięciem szyjki macicy.</li>
	<li>Wysterylizuj narzędzia do preparacji myszy i obszar nacięcia 70% etanolem i rozpocznij sekcję.</li>
	<li>Od strony brzusznej chwyć skórę znajdującą się przed otworem cewki moczowej i zacznij ciąć nożyczkami w górę brzusznej linii środkowej, aż dotrze do obszaru podbródka. Podejmij środki ostrożności, aby nie rozerwać ani nie wciąć się w wyściółkę ściany otrzewnej.</li>
	<li>Pociągnij do tyłu skórę i przypnij w dół, aby umożliwić wygodny dostęp do węzłów chłonnych podczas usuwania.</li>
	<li>Pobrane węzły chłonne i śledziony zostaną usunięte za pomocą kleszczy i umieszczone na sterylnej szalce Petriego zawierającej 5 ml buforu do biegania autoMACS zakupionego w Miltenyi Biotec (patrz rysunki 2 i 3 dla schematów usuwania węzłów chłonnych i śledziony).
	<ol>
		<li>Usuń pachowe węzły chłonne, które znajdują się w pobliżu pachy (pachy) za mięśniami piersiowymi każdej myszy.</li>
		<li>Usuń węzły chłonne ramienne, które znajdują się w tkankach łącznych znajdujących się w pobliżu każdej pachy.</li>
		<li>Usuń powierzchowne węzły chłonne szyjki macicy znajdujące się na szyi każdej myszy.</li>
		<li>Usuń pachwinowe węzły chłonne, które znajdują się w okolicy bioder w miejscu połączenia 3 naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Aby uzyskać dostęp do krezkowych węzłów chłonnych, przetnij otrzewną wyściełającą brzuszną linię środkową. Węzły chłonne krezkowe znajdują się w tkance łącznej, która utrzymuje jelita razem. Zwykle znajdują się w ciągu 4-8 węzłów i mogą wyglądać jak "sznur pereł". Upewnij się, że wyciągnąłeś cały sznurek.</li>
		<li>Śledziona znajduje się w okolicy brzucha, za żołądkiem i jelitami. Usuń go, ciągnąc i odłączając go od trzustki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mielenie organów pod sterylnym kapturem za pomocą 2 matowych szkiełek mikroskopowych. Umieść węzły chłonne lub śledzionę po oszronionej stronie jednego szkiełka mikroskopowego i pocieraj matową stroną drugiego szkiełka, aż się rozpadnie. Powtarzaj, aż wszystkie węzły chłonne i śledziona zostaną zmielone.</li>
</ol>
Uwaga: Zaleca się zacząć od węzłów chłonnych, a skończyć na śledzionie, ponieważ krew utrudni dostrzeżenie pozostałych węzłów chłonnych w buforze autoMAC.
<ol start="9">
	<li>Aby przefiltrować zmielone narządy do zawiesiny jednokomórkowej, należy zacząć od kilkukrotnego złożenia kawałka nylonu o grubości 40 μm i umieszczenia go w górnej części probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Materiał nylonowy powinien mieć wymiary około 3 x 3 cale.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i igły 21 G należy odessać 5 ml buforu do biegania i zmielonych organów autoMAC. Dozuj powoli do złożonego materiału nylonowego. Uważaj, aby nie przebić materiału igłą.</li>
</ol>
Uwaga: Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki, roztwór powinien wyglądać jak blady, spójny roztwór bez widocznych kawałków tkanki stałej. Jeśli pozostaną ciała stałe, należy je ponownie zassać i dozować przez nowy złożony kawałek nylonu umieszczony w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
<ol start="11">
	<li>Zawsze trzymaj ogniwa na lodzie, gdy nie są używane.</li>
</ol>
5. Separacja komórek
<ol>
	<li>Aby uzyskać optymalne wyniki, uzyskaj co najmniej 80% czystą populację komórek CD4 + CD25- za pomocą separatora komórek autoMACS Pro przy użyciu zestawu do izolacji regulatorowych komórek T MACS CD4 + CD25 +, myszy. Protokół ujemnej retencji populacji komórek CD4 + CD25- uzyskuje się za pośrednictwem Miltenyi Biotec.</li>
</ol>
6. Zróżnicowanie Th17
<ol>
	<li>Zbierz populację komórek CD4 + CD25- po oddzieleniu za pomocą separatora komórek autoMACS Pro.</li>
	<li>Policz komórki rozcieńczone w stosunku 1:1000 błękitem trypanowym za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Po ustaleniu stężenia na podstawie liczby komórek, zawiesinę komórek rozcieńczyć do 1 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Po 4 godzinach wyjąć 96-dołkowe płytki z anty-CD3 związanym płytkami.</li>
	<li>Studzienki pokryte powłoką anty-CD3 przemyć 200 μl PBS. Powtórz 2 razy.
	<ol>
		<li>Aby przepłukać, dodaj 200 μl sterylnego PBS do studzienek pokrytych anty-CD3 i wyjmij PBS do pojemnika na odpady.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100 μl mieszaniny iTh17 lub mieszaniny kontrolnej aktywacji (patrz punkt #2) do studzienek w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Dodać 100 μl komórek do każdej studzienki, w której umieszczono mieszaninę Th17 lub mieszankę kontrolną aktywacji.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez co najmniej 72 godziny lub do 5 dni (różnicowanie Th17 można uzyskać po 72 godzinach lub po 5 dniach).</li>
	<li>Różnicowanie Th17 można ocenić za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i analizy cytometrii przepływowej, ELISA lub qPCR</li>
</ol>
7. Aktywacja komórek (konieczna tylko do barwienia wewnątrzkomórkowego)
<ol>
	<li>Wyjąć 96-dołkowe płytki z inkubatorów po upływie 72 godzin lub 5 dni
	<ol>
		<li>Przypomnijmy, że różnicowanie Th17 można osiągnąć po 72 godzinach lub 5 dniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla każdego warunku (np. kontrola aktywacji lub iTh17) przenieś komórki, które są w trzech egzemplarzach, do jednego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli komórek. Komórki dla jednego warunku zostały teraz zebrane w jednym dołku na 24-dołkowej płytce hodowlanej, w przeciwieństwie do trzech razy w 96-dołkowej dolnej płytce hodowlanej.</li>
	<li>Całkowita objętość każdej studzienki na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej wynosi teraz 600 μl. Zwiększ objętość każdej studzienki do 1 ml za pomocą pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodać PMA (octan mirystynianu forbolu) (50 ng/ml), jonomycynę (1 μM) i BFA (Brefeldin-A) (10 μg/ml) do każdego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w podanych stężeniach.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
</ol>
8. Barwienie wewnątrzkomórkowe
<ol>
	<li>Wybarwić komórki pożądanymi markerami zewnątrzkomórkowymi i wewnątrzkomórkowymi do analizy cytometrii przepływowej. Aby wykryć obecność IL-17, barwienie wewnątrzkomórkowe wykonuje się za pomocą przeciwciał anty-IL-17A. Zalecane markery powierzchni zewnątrzkomórkowej to CD4, CD8 i CD25.
	<ol>
		<li>Użyj zestawu startowego do barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych - myszy firmy BD Bioscience do barwienia wewnątrzkomórkowego IL-17.</li>
		<li>Dla każdej próbki komórki osadkowe usuwają supernatant i ponownie zawisają osad komórek w 200 μl buforze FACS (2% FBS w PBS).</li>
		<li>Przenieś zawieszone komórki na płytkę cytometrii przepływowej 96 komórek.</li>
		<li>Obracaj komórki w dół przez 5 minut z prędkością 1,200 obr./min i odrzuć supernatant.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu PBS FACS, odwirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS i zastosować 100 μl mieszaniny przeciwciał zewnątrzkomórkowych (Ab) (zewnątrzkomórkowa mieszanina Ab jest wytwarzana w buforze FACS). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, przykryć folią.</li>
		<li>Powtórz krok 8.1.4.</li>
		<li>Powtórz krok 8.1.5 2x.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 100 μl buforu BD Cytofix/Cytoperm. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, przykryć folią.</li>
		<li>Dodać 100 μl 1x buforu BD Perm/Wash, odwirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min i odrzucić supernatant. Powtórzyć.</li>
		<li>Dodać 50 μl wewnątrzkomórkowej mieszaniny Ab. (Wewnątrzkomórkowa mieszanina Ab jest wytwarzana w 1x BD Perm / Wash) Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, przykryć folią.</li>
		<li>Powtórz krok 8.1.10.</li>
		<li>Zawieś komórki w 200 μl buforu barwiącego BD.</li>
		<li>Zawieszone komórki umieścić w probówkach do cytometrii przepływowej zawierających 200 μl buforu barwiącego BD (końcowa objętość to 400 μl).</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy próbki będą gotowe do odczytu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Analiza cytometryczna przepływowa
<ol>
	<li>Populacja żywych komórek bramki.</li>
	<li>Z populacji żywych komórek, brama na populacji CD4 + CD8-.</li>
	<li>Z populacji CD4+CD8- brama na populacji IL-17A+.
	<ol>
		<li>Opierając się na naszych poprzednich wynikach eksperymentalnych, 100% populacji IL-17A+ będzie miało CD25+.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
*Całkowita bezwzględna liczba komórek została uzyskana po trzykrotnym połączeniu próbki 
**Bezwzględną liczbę komórek CD4 + CD25 + IL-17A + określono przez pomnożenie całkowitej liczby komórek przez procent żywej bramki i procent całkowitej liczby komórek zawierających markery specyficzne dla linii, CD4, CD25 i IL-17A, określone za pomocą cytometrii przepływowej.
10. qPCR i ELISA
<ol>
	<li>Umieść komórki nieużywane do analizy cytometrycznej przepływowej w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i odwiruj z prędkością 13 000 obr./min przez 5-10 minut. Komórki znajdujące się w osadzie komórkowej po odwirowaniu zostaną wykorzystane do analizy qPCR. Analizę qPCR przeprowadzono przy użyciu termocyklera Peltiera PTC-200 (Biorad).</li>
	<li>Pobrać supernatant z probówek odwirowanych do testu ELISA. Test ELISA IL-17A przeprowadzono przy użyciu pary przeciwciał TC11-18H10 (wychwyt, numer katalogowy 555068) i biotyny TC11-8H4 (wykrycie, numer katalogowy 555067) zakupionej w BD Biosciences. Wzorce ELISA IL-17A uzyskano z eBioscience (numer katalogowy 14-8171-80).</li>
	<li>Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić pozostałe komórki do wykorzystania do qPCR w 175 μl buforze do lizy RNA (użyć natychmiast do ekstrakcji RNA, syntezy cDNA i qPCR lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania).
	<ol>
		<li>Patrz Tabela II, aby zapoznać się z sekwencjami starterów dla IL-17A i aktyny (gen utrzymania domu)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chen, Z., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+and+ROR%CE%B3T%3A+transcriptional+regulation+of+Treg+and+Th17%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17.</a> International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).</li>
<li>Cua, D. J., Sherlock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-23+rather+than+interleukin-12+is+the+critical+cytokine+for+autoimmune+inflammation+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain.</a> Nature. 421, 742-748 (2003).</li>
<li>El-Behi, M., Rostami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+views+on+the+roles+of+Th17+and+Th17+cells+in+experimental+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).</li>
<li>Inaba, K., Kroide, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+memory+T+lymphocytes+isolated+from+the+mixed+leukocyte+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction.</a> Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).</li>
<li>L, I. vanovF. rutosR., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).</li>
<li>Jager, L. D., Dabelic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kinase+Inhibitory+Region+of+SOCS-1+is+Sufficient+to+Inhibit+T+helper-17+Function+in+Experimental+Allergic+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis.</a> J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).</li>
<li>Kimura, A., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6%3A+regulator+of+Treg%2FTh17+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-6: regulator of Treg/Th17 balance.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+transmitted+segmented+filamentous+bacteria+segregate+with+diabetes+protection+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice.</a> PNAS. 108, 11548-11553 (2011).</li>
<li>Langrish, C. L., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).</li>
<li>Lau, K., Benitez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+1+diabetes+by+a+Lactobacillus+johnsonii+mediated+Th17+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias.</a> J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).</li>
<li>Lee, Y., Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells.</a> Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).</li>
<li>Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+and+regulatory+T+cells+in+mediating+and+restraining+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation.</a> Cell. 140, 845-858 (2010).</li>
<li>O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protective+function+for+interleukin+17A+in+T+cell-mediated+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation.</a> Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).</li>
<li>Picca, C. C., Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TCR+specificity+in+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cell+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection.</a> Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).</li>
<li>Shah, K., Lee, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disregulated+balance+of+Th17+and+Th1+cells+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research & Therapy. 12, R53(2010).</li>
<li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of Multiple Sclerosis.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).</li>
<li>Stockringer, B., Veldhoen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+function+of+Th17+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and function of Th17 T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24, 179-189 (2006).</li>
<li>Zou, Y., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+production+of+interleukin-17%2Finterferon-%CE%B3+and+matrix+remodeling-associated+genes+in+experimental+Candida+albicans+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis.</a> Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).</li>
</ol>

Brak informacji do zadeklarowania.

Tutaj opisaliśmy protokół umożliwiający osiągnięcie różnicowania Th17 in vitro . Badanie różnicowania Th17 jest ważne, ponieważ różnicowanie limfocytów T w podzbiór Th17 ma kluczowe znaczenie dla skutecznej eliminacji ludzkich patogenów13. I odwrotnie, produkcja IL17 jest związana z progresją choroby autoimmunologicznej13. Metoda różnicowania Th17 ma zastosowanie w wielu środowiskach badawczych, ponieważ może być stosowana do wielu różnych mysich modeli regulacji immunologicznej i autoimmun...

Limfocyty T CD4+ (limfocyty T) odgrywają kluczową rolę w obronie układu odpornościowego przed zakaźnymi mikroorganizmami. I odwrotnie, limfocyty T są również ściśle związane z początkiem i progresją chorób autoimmunologicznych, takich jak cukrzyca typu 1, toczeń rumieniowaty układowy i reumatoidalne zapalenie stawów. Limfocyty T CD4 + ulegają aktywacji poprzez połączenie interakcji receptora limfocytów T (TCR) z cząsteczkami pokrewnego antygenu / głównego kompleksu zgodności tkankowej II (MHCII) oraz interakcji receptora CD28 z ligandami B7.1 / B7.215. Oprócz zapewnienia stymulacji TCR i kostymulacji CD28, komórki prezentujące antygen zapewniają również środowisko cytokinowe, które określa stan różnicowania limfocytów T, kierując w ten sposób odpowiedzią limfocytów T na dany antygen. Odrębne interakcje komórkowe między patogenem a antygenem tworzą odrębne środowiska cytokinowe, które przechylają limfocyty T w dół odrębnych szlaków skoncentrowanych na eliminacji patogenu inicjującego. Niestety, szlaki efektorowe limfocytów T, pierwotnie zaprojektowane do eliminowania inwazyjnych patogenów, mogą być błędnie skierowane przeciwko własnym tkankom15. Dlatego lepsze zrozumienie stanu różnicowania każdego odrębnego podzbioru limfocytów T CD4 + ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia, jak modulować równowagę między eliminacją patogenów a tolerancją na siebie.
Oprócz szlaków różnicowania limfocytów Th1, Th2 i indukowalnych regulatorowych limfocytów T, naiwne limfocyty T mogą być również napędzane przez cytokiny w dół szlaku Th17. Podczas gdy komórki Th1 zwalczają patogeny wewnątrzkomórkowe, komórki Th2 eliminują patogeny zewnątrzkomórkowe, a limfocyty T regulatorowe (Treg) minimalizują reakcje zapalne1, 16; Komórki Th17 odgrywają ważną rolę w eliminacji zewnątrzkomórkowych bakterii i grzybów. Komórki Th17 są na ogół oznaczone ekspresją specyficznego dla linii czynnika transkrypcyjnego RORγT i wytwarzaniem IL-17A, który sprzyja aktywacji makrofagów i neutrofili1, 7.
Komórki Th17 były zamieszane w kilka chorób autoimmunologicznych i związane z nimi modele gryzoni. Na przykład wykazano, że IL-23 (która jest wymagana do utrzymania fenotypu Th17), ale nie IL-12, była głównym winowajcą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu (EAE), modelu choroby gryzoni dla SM. Następnie wykazano, że zmniejszenie produkcji IL-17 jest skorelowane z zapobieganiem EAE2, 6, 17. Ponadto komórki Th17 są związane z innymi zaburzeniami autoimmunologicznymi, w tym zapaleniem stawów i toczniem rumieniowatym układowym (SLE)10, 16. Wykazano, że myszy p19-/- z niedoborem IL-23 mają bardzo niską liczbę komórek Th17 i są odporne na rozwój nie tylko EAE, ale także zapalenia stawów wywołanego kolagenem, modelu reumatoidalnego zapalenia stawów10, 18. Ponadto stwierdzono również, że myszy leczone neutralizującymi przeciwciałami IL-17A po wystąpieniu zapalenia stawów wywołanego kolagenem mają również ustąpienie uszkodzenia stawów18. Należy zauważyć, że rola komórek Th17 w progresji choroby autoimmunologicznej pozostaje do scharakteryzowania, ponieważ ostatnie badania wykazały również ochronną rolę komórek Th17 w cukrzycy typu 1 9, 11 i zapaleniu jelit14. Badania te potwierdzają znaczenie różnicowania Th17 w autoimmunizacji.
Różnicowanie in vitro Th17 jest niezbędną metodą w badaniach nad limfocytami T, ponieważ istnieją co najmniej dwa kłopotliwe pytania, które wymagają dalszych badań: 1) Jak dokładnie IL-6 reguluje równowagę między różnicowaniem Treg i Th17, oraz 2) jakie są dokładne mechanizmy zaburzeń zapalnych wywołanych przez IL-17? Nasza metoda wykorzystuje limfocyty T CD4+CD25- ze śledziony i węzłów chłonnych myszy C57BL/6. Ważne jest, aby pamiętać, że chociaż możliwe jest wywołanie różnicowania Th17 przy użyciu zanieczyszczonej populacji, uzyskanie co najmniej 80% czystej populacji limfocytów T CD4 + CD25 neguje wszelkie obawy o zanieczyszczenie i zapewnia bardziej pomyślne wyniki różnicowania Th17. W celu uzyskania prawidłowego różnicowania Th17, limfocyty T CD4 + CD25 inkubuje się w obecności anty-CD3 i anty-CD28, które dostarczają sygnały aktywacyjne, odpowiednio 1 i 2 oraz IL-6 i TGF-β. Chociaż doniesiono, że sama IL-23 może być wykorzystana do osiągnięcia różnicowania Th17, później wykazano, że IL-23 jest niezbędna dla stabilności populacji komórek Th17, ale IL-6 i TGF-β są niezbędne do różnicowania Th173, 18, 19. Badania na myszach wykazały, że receptor IL-23 ulega ekspresji na limfocytach T CD4 + dopiero po ich stymulacji IL-6 i TGF-β13, 18. Ponadto komórki Th17 będą z powodzeniem rozwijać się w obecności przeciwciał blokujących IL-23, o ile obecne są IL-6 i TGF-β18, 19. W związku z tym ten protokół różnicowania Th17 zapewnia odpowiednie warunki do skutecznego indukowania różnicowania Th17. Lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw różnicowania Th17 i produkcji IL-17 stwarza szansę na opracowanie lepszych metod leczenia chorób autoimmunologicznych13.

<table><tbody><tr><td colspan="4">odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>sterylna poliestrenowa szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>autoMACS Bufor do biegania</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Premium Szkiełka mikroskopowe, matowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td>3" x 1"1 mm</td></tr><tr><td>5 ml 21G1 Strzykawka i igła bez lateksu</td><td>BD Biosciences</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 ml Probówki wirówkowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Nylon 40 mikronów</td><td>Miami Aquaculture</td><td>Nylon 40/26</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotest Płytka do hodowli tkankowej 96 dołków U dno </td><td>BD Biosciences</td><td>35-3077</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CL3524</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony NA/LE Chomik Anty-Mysz CD3e</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony NA/LE Chomik Anty-Mysz CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-6 Rekombinowane białko</td><td>eBioscience</td><td>14-8061-62</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta</td><td>R& D Systems</td><td>240-B-002</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór niebieskiego trypana 0,4 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>66H2364</td><td></td></tr><tr><td>Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>558107</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>553035</td><td></td></tr><tr><td>PE Sprzężony anty-mysz CD25</td><td>eBioscience</td><td>E01155-516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17</td><td>BD Biosciences</td><td>560820</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw startowy do barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych-Mysz</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2041AK (559311)</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD4 + CD25 + zestaw do izolacji regulatorowych komórek T, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>ABAM </td><td>Cellgro</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning, Cellgro</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>B 2-Mercapt&#8211; tanol</td><td>MP Biomedical</td><td>194834</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól wapniowa jonomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909-1ML</td><td>Niebezpieczna</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>159027</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Wychwyt mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555068</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Wykrywanie mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555067</td><td></td></tr><tr><td>Test ELISA IL-17A Standard</td><td>eBioscience</td><td>14-8171-80</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA IL-2 Zestaw</td><td></td> odczynników do substratów <td>BD Biosciences</td> 555148 <td></td></tr><tr><td>TMB </td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator komórek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend RT+</td><td>Inkubator CO2 ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Napco series 8000 WJ</td><td>Termocykler</td> Peltiera ThermoScientific <td></td><td></td></tr><tr><td>PTC-200</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i różnicowanie th17 naiwnych limfocytów t cd4

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Komórki Th17 są odrębnym podzbiorem limfocytów T, które wytwarzają interleukinę 17 (IL-17) i różnią się funkcją od innych podzbiorów limfocytów T, w tym Th1, Th2 i limfocytów T regulatorowych. Komórki Th17 okazały się głównym winowajcą nadgorliwych zapalnych odpowiedzi immunologicznych związanych z wieloma zaburzeniami autoimmunologicznymi. W tej metodzie oczyszczamy limfocyty T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy C57BL / 6 i stymulujemy oczyszczone limfocyty T CD4 + w kontrolnych i indukujących Th17 środowiskach. Środowisko indukujące Th17 obejmuje stymulację w obecności przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28, IL-6 i TGF-β. Po inkubacji przez co najmniej 72 godziny i przez okres do pięciu dni w temperaturze 37 °C, komórki są następnie analizowane pod kątem zdolności do wytwarzania IL-17 za pomocą cytometrii przepływowej, qPCR i ELISA. Zróżnicowane limfocyty T CD4 + CD25 Th17 można wykorzystać do dalszego wyjaśnienia roli, jaką komórki Th17 odgrywają w początku i progresji autoimmunizacji i obronie gospodarza. Co więcej, różnicowanie limfocytów CD4 + CD25 za pomocą Th17 z odrębnych mysich modeli nokautu/choroby może przyczynić się do naszego zrozumienia plastyczności losu komórki.

Niniejszy protokół różnicowania komórek Th17 rozpoczyna się od usunięcia śledziony oraz węzłów chłonnych pachy, ramienia, krezki, szyi i pachwiny. Przedstawienie lokalizacji każdego z nich znajduje się na rycinach 2 i 3. Ryciny 1 oraz 5 zawierają wizualną reprezentację metod opisanych w tym protokole.
Niniejszy protokół Th17 koncentruje się na różnicowaniu z populacji limfocytów T CD4+CD25-. Należy zwrócić uwagę, jak skutecznie separacja ko...

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest różnicowanie komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4+. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie węzłów chłonnych i śledziony od dorosłej myszy C57BL/6. W drugim kroku tkanki są rozdrabniane w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.Następnie izoluje się limfocyty T CD4+ CD25- i hoduje je w warunkach indukujących różnicowanie do Th17 lub w warunkach kontrolnych aktywacji. Ostatecznie do oceny ekspresji IL-17A można wykorzystać qPCR, ELISA oraz cytometrię przepływową. W ten sposób metoda ta pozwala na analizę różnicowania limfocytów T CD4 w komórki Th17 u myszy C57BL/6.Metodę tę można zastosować również w innych modelach mysich. Zademonstrowanie tej techniki jest kluczowe, ponieważ węzły chłonne są bardzo małe, co utrudnia etapy dyssekcji. Bez bezpośredniej wizualizacji tej metody, co najmniej cztery godziny przed dodaniem komórek, należy pokryć dołki nowej 96-dołkowej płytki mikrotestowej do hodowli tkanek UBO 30 µL przeciwciał przeciwko CD3 rozcieńczonych w sterylnym PBS; należy opukać boki płytki, aby zapewnić równomierne pokrycie dołków, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C. Po czterech godzinach płytkę należy schłodzić w

isolation-and-th17-differentiation-of-nave-cd4-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów CD4 T

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Ten protokół opisuje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 in vitro. W szczególności, w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, można uzyskać 90% czystość patogennych komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu tej metody różnicowania.

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Migdałki podniebienne są bogatym źródłem limfocytów B i T. Tutaj zapewniamy łatwy, skuteczny i szybki protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych. Opisana metoda została specjalnie dostosowana do badań nad wirusową etiologią zapalenia migdałków znanego jako zapalenie migdałków.

Skuteczny protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych

Poznaj metodę różnicowania komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4+ myszy C57BL/6. Protokół obejmuje izolację komórek z węzłów chłonnych i śledziony oraz ich hodowlę w warunkach indukujących Th17.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Przeglądaj więcej filmów