Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

Nasza grupa używa EPG do zbadania, w jaki sposób arbowirusy i inne czynniki wpływają na zachowania związane z sondowaniem i spożyciem, które występują podczas karmienia krwią, ponieważ wiele patogenów manipuluje zachowaniem wektora, aby zwiększyć transmisję. Zasadniczo badamy, co dzieje się podczas ukąszenia komara i jak te zachowania wpływają na przenoszenie patogenów i patologię choroby. Historycznie rzecz biorąc, EPG był używany głównie do badania owadów odżywiających rośliny.

Niedawny rozwój procedur AC-DC EPG dla stawonogów żywiących się krwią pozwala nam badać zachowania związane z sondowaniem i spożyciem, które występują podczas karmienia krwią w niespotykanych dotąd szczegółach, bez konieczności stosowania procedur inwazyjnych, co może pozwolić na opracowanie nowych strategii zarządzania. Największym wyzwaniem związanym ze stosowaniem EPG u stawonogów żywiących się krwią jest korelacja kształtów fal z aktywnościami biologicznymi, takimi jak ślinotok i przenoszenie patogenów. Mamy mocne hipotezy oparte na elektrycznym pochodzeniu fal i literaturze, ale nadal potrzebujemy dowodów empirycznych.

Na początek przełóż końcówkę szklanej pipety pastwiskowej przez płomień, lekko obracając pipetę. Sprawdź średnicę i powtórz proces, aby doprowadzić pipetę do żądanego rozmiaru. Aby wykonać aspirator do owadów, przykryj duży koniec zmodyfikowanej pipety pastwiskowej moskitierą i włóż do silikonowej rurki połączonej z aspiratorem laboratoryjnym, zabezpieczając połączenie taśmą izolacyjną.

W przypadku elektrod rejestrujących owiń blok pianki świeżą folią do trzymania przygotowanych kikutów owadów i komarów drutowych. Zeskrob górny jeden centymetr drutu miedzianego żyletką, aż będzie błyszczący ze wszystkich stron. Następnie pokrój złoty drut o średnicy 0,025 milimetra na kawałki o długości od czterech do pięciu centymetrów.

Trzymaj drut w samozamykających się kleszczach zamaskowanych taśmą, aby uniknąć wgniecenia drutu, delikatnie owiń złoty drut trzy razy wokół drutu miedzianego kikuta owada, zaczynając wzdłuż czystej końcówki drutu miedzianego. Użyj sondy preparucyjnej, aby nałożyć srebrny klej, aby utrzymać złoty drut na miejscu. Po upewnieniu się, że nie ma luźnego końca, umieść kikut owada w piance, aż klej wyschnie.

Następnie delikatnie pogłaszcz złoty drut przymocowany do kikuta owada, aby uformować go w długi, delikatny łuk i przyciąć drut do około 2,5 do 3 centymetrów długości. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, przytrzymaj kikut owada za mosiężny gwóźdź ręką niedominującą, podczas gdy złoty drut dotyka stolika mikroskopu preparacyjnego i chwyć sam koniec złotego drutu kleszczami drobnopunktowymi za pomocą dominującej ręki, użyj kleszczyków drobnopunktowych, aby skrzyżować końcówkę złotego drutu nad drutem miedzianym kikuta owada w pobliżu klejonego obszaru. Następnie delikatnie pociągnij za kikut owada, aż złoty drut utworzy małą złotą pętlę wokół kleszczyków z cienkim punktem.

Zwolnij złoty drut i ostrożnie wyjmij kleszcze. Trzymając kikut owada w niedominującej ręce, chwyć złotą pętlę cienkimi kleszczami punktowymi. Pociągnij za kikut owada, jednocześnie lekko obracając kleszcze od króćca, aż pętla zgnie się pod kątem 90 stopni do szyjki drutu.

Upewnij się, że złota pętla jest całkowicie zamknięta przed powrotem kikuta owada do bloku piankowego. Na początek przygotuj aspirator do owadów i elektrody rejestrujące do okablowania komarów. Ułóż znieczulone komary na plecach na podkładce anestezjologicznej tak, aby ich brzuchy były skierowane w stronę badacza.

Po umieszczeniu taśmy laboratoryjnej nałóż na taśmę 0,5 centymetra kroplę świeżo wymieszanego srebrnego kleju. Następnie zassaj brzuch znieczulonego komara do aspiratora. Używając ssania tylko na tyle długo, aby osadzić brzuch na miejscu i przytrzymaj komara pod lunetą sekcyjną nad srebrnym klejem za pomocą aspiratora.

Po zanurzeniu szpilki minuchin w srebrnym kleju nałóż cienką warstwę na przedplecze komara. Szybko zanurz złotą pętlę na końcówce elektrody nagrywającej w srebrnym kleju. Umieść go na srebrnym miejscu kleju na przedpleczu komara i kołysz pętlą w przód iw tył, aby upewnić się, że przylega równo.

Następnie umieść kikut owada w piance pod kątem, który pozwoli komarsowi wygodnie stać, gdy się obudzi. Po okablowaniu żądanej liczby komarów umieść blok pianki w pudełku do przechowywania i utrzymuj go. Aby rozpocząć, przymocuj elektrody rejestrujące do komarów w dniu elektropenetografii lub eksperymentu EPG.

Gdy host znajdzie się na miejscu, obróć głowicę amplifier na bok. Po usunięciu przewodowego komara włóż mosiężny kołek króćca owadów do portu w głowicy amplifier. Rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do zarządzania sprzętem.

Umieść głowicę amplifier nad ręką, aby komar mógł wygodnie stać i sondować. Włącz głowicę amplifier, gdy jest uziemiony. Dostosuj pozycję ręki gospodarza zgodnie z potrzebami, aby pomóc w pomyślnym pomiarze.

Użyj oprogramowania do zarządzania sprzętem, aby dokonywać obserwacji ze znacznikami czasu dotyczących reakcji hosta, zachowań komarów, zmian wzmocnienia i innych istotnych zdarzeń podczas nagrywania. Dostosuj położenie sygnałów na ekranie i wzmocnienie oprogramowania za pomocą oprogramowania do zarządzania sprzętem, aby oba sygnały były wyraźnie widoczne. Aby wyregulować wzmocnienie sprzętowe, przerzuć kanał o jeden zakres i przełączniki mnożnika.

Jeśli ta regulacja nie jest wystarczająca, przekręć pokrętło wzmocnienia kanału pierwszego w prawo lub w lewo, aby odpowiednio zwiększyć lub obniżyć wzmocnienie, aby uniknąć szczytów lub niewyraźnych szczytów. Aby dostroić przesunięcie, przestaw przełącznik przesunięcia kanału o jeden kanał na skrzynce sterowniczej na neg. Następnie obracaj pokrętłem przesunięcia kanału o jeden, aż szczyty w sygnałach przed i po wystąpią w tym samym kierunku na ekranie komputera.

Jeśli komar znajduje się w środku sondy, pozwól mu skończyć. Jeśli sonda nie zostanie wykonana w ciągu 10 minut, wyłącz głowicę amplifier. Poproś gospodarza, aby ostrożnie usunął rękę, a następnie usuń komara za pomocą dołączonego kikuta owada.

Na koniec wymień komar w pudełku do przechowywania. Nagrania AC-DC EPG komarów Culex tarsalis żerujących na ludzkich dłoniach wygenerowały interpretowalne przebiegi nadające się do klasyfikacji na rodziny, typy i podtypy.