Ocena ruchliwości nerwowych komórek macierzystych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego na bazie żelu agarozowego

Cześć, jestem Kevin wygrał. Jestem studentem studiów magisterskich na kierunku inżynieria w Laboratorium Biofluidów na Uniwersytecie Cornella. A dzisiaj opowiem o użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie agros do badania wpływu naskórkowego czynnika wzrostu EGF na neuro komórki macierzyste Maureen.

Urządzenie składa się zasadniczo z trzech kanałów mikroprzepływowych, każdy o szerokości 150 mikronów. EGF jest pompowany do jednego z kanałów bocznych, a bufor jest pompowany do drugiego kanału bocznego. Zasadniczo ustawia statyczny liniowy gradient chemiczny w całym kanale środkowym.

Ponieważ dyfuzja EGF łatwo dyfunduje przez agrożel, komórki macierzyste neuronów są wysiewane w kanale środkowym, a postęp ich migracji jest monitorowany pod mikroskopem. Tak więc urządzenia zasadniczo składały się z górnej warstwy z pleksi, która ma wszystkie wloty i wyloty do podłączenia do rurki. A pod spodem znajduje się membrana agrożelowa, w której znajdują się cztery urządzenia wzorcowe.

Jest on otoczony przekładką PDMS, co gwarantuje, że mamy stałą grubość w całym urządzeniu. PDMS i żel montuje się na szklanym szkiełku, które jest pokryte ect. Pomaga to komórkom przylegać do szkiełka podstawowego.

Dodatkowo płyta ze stali nierdzewnej służy do montażu całego urządzenia, a my sami przekładamy urządzenie razem ze. Linia komórkowa typu dzikiego została transfekowana wektorem retrowirusowym w celu nadekspresji receptora EGF typu dzikiego, a linia komórkowa delta została transfekowana zmutowaną wersją receptora EGF, która umożliwia jej bycie składnikowo aktywną bez liganda EGF. Dobrze, więc zacznę od wyjaśnienia procesu montażu naszego urządzenia mikroprzepływowego.

Tak więc najpierw umieściłem przekładkę PDMS wokół cech reliefowych mikrokanałów krzemowych w naszych masterach. Więc teraz zamierzam zważyć 0,3 grama agros. Więc teraz zamierzam przytoczyć 10 mililitrów niezależnych mediów CO2 i dodać to do agros.

Zamierzam pipetować w górę i w dół, aby wymieszać proszek aros z pożywką niezależną od CO2. Teraz jesteśmy gotowi na kuchenkę mikrofalową. Jak teraz widać, agros jest teraz upłynniony, ale pozostało jeszcze kilka granulek.

Postaram się to zakręcić, aby rozpuścić granulkę i pozbyć się pęcherzyków powietrza. Wylewam więc stopiony agros na reliefowe elementy silikonowego wzorca, a teraz biorę sterylne szklane szkiełko i umieszczam je na przekładce PDMS. I ustawiłem go pod kątem, aby spróbować wypchnąć większość pęcherzyków powietrza z agrożelu.

I przyłożyłem nacisk i będę nadal wywierał nacisk, aż skorupa agros zastygnie. Tak więc po jednej do dwóch minut zastygł. Teraz usunę nadmiar agros ze zjeżdżalni.

Następnym krokiem jest delikatne zsunięcie szklanego szkiełka, a ten szklany szkiełko można zamontować można wyrzucić. Teraz postaram się delikatnie przenieść wzór aros na szkiełko, które wcześniej pokryłam fibronektyną. Zasadniczo używam tego plastikowego sterylnego arkusza, aby pomóc mi podnieść wzór agros za pomocą przekładki PDMM MS i przeniosę wzór agros kanałami w dół w kierunku suwaka.

Teraz, gdy jest to mocno na szklanym szkiełku, wybiję otwory w poszczególnych zbiornikach, aby plastikowy kolektor miał dostęp do kanałów. Zrobię to za pomocą małego metalowego dziurkacza. Teraz zakończyliśmy wykrawanie w urządzeniu.

Dodam 500 mikrolitrów pożywek niezależnych od CO2, aby zapobiec wysuszeniu mikrokanałów, a teraz pozostawię je na jedną do dwóch minut. Okej, po jednej do dwóch minut spróbuję spuścić nadmiar pożywki, a teraz wyrównam otwory, które wbiły się w wzór agros, z otworami wlotowymi i wylotowymi kolektora z pleksi. A kiedy otwory są już wyrównane, mocno dociskam, aby utworzyć ładne uszczelnienie.

Teraz umieszczam kolektor z pleksi na mocowaniach ze stali nierdzewnej i teraz delikatnie skleję urządzenie ze sobą za pomocą. Jestem bardzo ostrożny, aby nie dokręcić zbyt mocno, ponieważ spowoduje to zgniecenie kanałów i umieszczam w sposób zgodny z ruchem wskazówek zegara, aby zapobiec szczelinowaniu się wewnątrz żelu Agros. Zamierzam narysować jeden mil nośnika i użyję tej strzykawki do przetestowania urządzenia.

I jak widać, wstrzykuję płyn do każdego mikrokanału i szukam płynu, który wypłynie z każdego wylotu. Tak więc w tej chwili umieściłem zmontowane urządzenie w komorze środowiskowej mikroskopu. Jest on utrzymywany w temperaturze 37 stopni Celsjusza, więc rozgrzeje to urządzenie i przygotuje je do momentu, gdy będziemy musieli zasiać komórki.

I jak widać, już przekręciłem te dwa, rurkę pompy parasola przez konfigurację. A obecnie przepłukuję rurkę PBS w ramach przygotowań do naszych eksperymentów. Więc teraz zajmiemy się ustawieniem rurek.

Zamierzam przewlec rurkę pompy parasola przez nasadki z już wybitymi w nich otworami. A każda rurka ma określoną liczbę nacięć, dzięki czemu mogę zidentyfikować zarówno wlot, jak i wylot rurki. Tak więc rurka z czterema nacięciami otrzyma 10 nanogramów na promil.

Rozwiązanie EGF podłączy teraz rurkę do urządzenia. Więc dołączę go do każdego urządzenia w zależności od tego, ile ma nacięć. Odpowiada więc rozwiązaniu, które przyjmuje.

A teraz podłączam rurkę wylotową. Używamy przezroczystej rurki tigon, aby upewnić się, że media rzeczywiście przepływają przez rurkę wylotową i nie ma zatorów w kanale. A teraz uruchomię pompki do parasoli.

Więc teraz rozpocznę procedurę wysiewania komórek do środkowego kanału. Zacznę od usunięcia nadmiaru mediów w kanale czujnika. Więc teraz zobaczę komórki.

Ogniwa są już zawieszone w pożywkach niezależnych od CO2. I zostałem sprzedany, siedziałem 60 na wlocie kanału środkowego i siedziałem 20 mikrolitrów na wylocie. I miejmy nadzieję, że komórki zostaną osadzone przez przepływ napędzany grawitacją.

Powtórzę tę procedurę dla pozostałych dwóch czułych kanałów i teraz będziemy obserwować to pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy umiejscowienie komórek się powiodło. Tak więc teraz komórki przylgnęły do szklanego szkiełka i za kilka minut zaczną się rozprzestrzeniać i osiągnąć swoją unikalną morfologię. Tak więc dzisiaj omówiliśmy montaż właściwego urządzenia, przygotowanie odczynników i techniki mikroskopowe, których używam do obrazowania migracji komórek w urządzeniu.

Podsumowując, mamy nadzieję, że to urządzenie będzie miało znacznie szersze zastosowanie, szczególnie w warunkach klinicznych. Więc wyfiguruj jeden poziomo. Pokazuje trajektorie komórek C 17.2 i rosnące stężenia EGF w pionie.

Pokazuje trajektorie różnych szczepów komórek C 17.2, których użyliśmy w naszych eksperymentach z tym samym stężeniem EGF. Dane z komórek rodzicielskich pokazują, że szczyt ruchliwości występuje przy gradiencie stężenia EGF wynoszącym 10 nanogramów na promil, co wskazuje, że receptory zostały nasycone ligandem przy wyższym stężeniu EGF. Dane dotyczące typu dzikiego pokazują, że następuje wzrost ruchliwości przy stężeniu stu nanogramów na promil lub EGF.

Oznacza to, że receptory nie ulegają wysyceniu przy wyższych stężeniach EGF. Ma to sens, ponieważ zostały one zaprojektowane do nadekspresji receptora EGF. Wreszcie, dane dotyczące linii komórkowej delta wskazują, że ruchliwość komórek jest w przybliżeniu niezależna od stężenia EGF.

Jest to również oczekiwane, ponieważ zmutowane receptory EGF zostały zaprojektowane tak, aby były aktywowane niezależnie od obecności EGF.