Name: Ocena ruchliwości nerwowych komórek macierzystych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego na bazie żelu agarozowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-11T02:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Poznaj metodę oceny ruchliwości komórek macierzystych przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia na bazie żelu agarozowego. Technika ta pozwala badać wpływ EGF na neuronalne komórki macierzyste.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest wspierana przez New York State Office of Science, Technology and Academic Research (NYSTAR) (w formie grantu Center for Advanced Technology) oraz przez granty z Nanobiotechnology Center (NBTC), programu STC National Science Foundation na podstawie umowy nr ECS-9876771, a także American Brain Tumor Association i New York Academy of Medicine (JAB).

Procedura
Powlekanie szkiełek fibronektyną
Przed montażem urządzenia mikroprzepływowego należy zsterylizować i pokryć szkiełka przedmiotowe fibronektyną. Powlekanie szkiełek powinno odbywać się w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania sterylności. Wzdłuż krawędzi szkiełka należy ułożyć sterylny dystans z PDMS i zaznaczyć markerem permanentnym stronę skierowaną ku górze. Do wnętrza dystansu z PDMS, na całą powierzchnię szkiełka przedmiotowego, należy nanieść pipetą 1 ml roztworu fibronektyny (Sigma) o stężeniu 5 μg/ml. Pozostawić szkiełka w spokoju na godzinę, a następnie całkowicie osuszyć za pomocą pistoletu z N2. Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4oC do późniejszych eksperymentów.
Montaż urządzenia
Cały protokół montażu urządzenia jest przeprowadzany w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych, zgodnie z poniższymi procedurami:
<ol>
<li>Oczyścić matrycę krzemową z wytłoczonymi mikrokanałami, przecierając ją 70% etanolem i susząc pistoletem z N2. Za pomocą pęsety umieścić sterylny ogranicznik z PDMS o wysokości 1 mm wokół elementów wypukłych matrycy. </li>
<li>Przygotować żel agarozowy stosowany w urządzeniu, odważając 0,3 g proszku agarozy (Fisher Scientific) i 10 ml pożywki niezależnej od CO2 (Invitrogen) w zlewce o pojemności 50 ml. Wymieszać zawiesinę szpatułką i podgrzać w kuchence mikrofalowej przez 20 sekund na ustawieniu HIGH. Jeśli obecne są nierozpuszczone granulki, podgrzewać mieszaninę przez kolejne 10 sekund i zamieszać gorącą ciecz, aby pozbyć się ostatnich pozostałości granulek. Powtórzyć ten proces z czasem grzania 8 sekund, a następnie 5 sekund.</li>
<li>Szybko wlać roztwór agarozy na matrycę krzemową otoczoną ogranicznikiem z PDMS i natychmiast przykryć mieszaninę agarozy sterylnym szkiełkiem podstawowym. Wywierać stały, delikatny nacisk na szkiełko przez około 2 minuty, aby zapewnić żelowanie agarozy do tej samej stałej wysokości 1 mm, co wysokość ogranicznika z PDMS. </li>
<li>Po zgęlowaniu agarozy oddzielić uformowany żel agarozowy wraz z ogranicznikiem z PDMS od matrycy krzemowej i przenieść go na szkiełko podstawowe pokryte fibronektyną, tak aby mikrokanały w żelu agarozowym były skierowane w stronę szkiełka. Użyć końcówki strzykawki o rozmiarze 16 G do wykonania otworów w obszarach zbiorników mikrokanałów w celu uzyskania dostępu do wlotów i wylotów. Dodać 500 μl pożywki niezależnej od CO2 do uformowanego żelu agarozowego na szkiełku, aby zapobiec wysychaniu mikrokanałów.</li>
<li>Umyć akrylowy kolektor stosowany w urządzeniu 70% etanolem i wypłukać wodą DI. Dopasować otwory w kolektorze do otworów wykonanych w żelu agarozowym z mikrokanałami. Następnie dopasować kolektor, ogranicznik z PDMS i szkiełko z fibronektyną do metalowej ramy urządzenia. Włożyć śruby do urządzenia i dokręcić śrubokrętem do momentu wystąpienia oporu. Przeciwdziała to zbyt mocnemu dokręceniu urządzenia, co mogłoby doprowadzić do odkształcenia mikrokanałów w agarozie. Śruby dokręcać zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby żel wewnątrz urządzenia nie przesunął się. Przetestować urządzenie pod kątem nieszczelności i zatorów w mikrokanałach za pomocą strzykawki 1 ml. Strzykawka jest wyposażona w dren Tygon z końcówką pipety do ładowania żelu na końcu drenu, aby wstrzyknąć pożywkę niezależną od CO2 do mikrokanałów. Mikrokanał uznaje się za prawidłowo uformowany, gdy po wstrzyknięciu pożywki do odpowiedniego wlotu pożywka wypływa wyłącznie z wylotu mikrokanału. Urządzenie jest teraz gotowe do użycia. </li>
</ol>
Przygotowanie i wysiewanie komórek do urządzenia
Gdy komórki osiągną 70% konfluencji (gęstość komórek około 100,000 cells/ml), są gotowe do wysiania do urządzenia.
Komórki przemyć dwukrotnie DPBS (Invitrogen). W celu ododerwania komórek dodać 200 μl trypsyny-EDTA (Invitrogen). Komórki przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki M2 z surowicą w celu inaktywacji trypsyny. Pożywkę wzrostową z komórkami wirować z prędkością 1000 RPM przez 5 minut. Odessać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 5 ml DPBS. Komórki w DPBS ponownie wirować w tych samych warunkach. Ponownie odessać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 500 μl pożywki niezależnej od CO2.
Przenieś otrzymaną zawiesinę komórek do środkowego mikrokanału urządzenia za pomocą przepływu grawitacyjnego. Do wlotu i wylotu środkowego mikrokanału dodaj odpowiednio 60 μl zawiesiny komórkowej oraz 20 μl pożywki niezależnej od CO2. Obserwuj środkowy mikrokanał pod mikroskopem w świetle przechodzącym, aby sprawdzić adhezję komórek. Komórki zazwyczaj przylegają po 10 minutach. Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej gęstości adhezji do dna kanału, odpipetuj pozostałą zawiesinę komórkową z wlotu oraz pożywkę z wylotu. Do wlotu i wylotu kanału środkowego wprowadź po 60 μl pożywki niezależnej od CO2. Na wlocie i wylocie kanału środkowego umieść przykrywki z PDMS, aby zminimalizować parowanie pożywki z kanału środkowego.
Obrazowanie komórek w urządzeniu
Przed montażem urządzenia przeciągnij sterylną dętkę pompy perystaltycznej przez stację pogodową mikroskopu (Olympus X81) i podłącz ją do pompy perystaltycznej (Watson-Marlow 205U/CA). Przepłucz dętkę roztworem PBS z prędkością 4 RPM. Po zmontowaniu urządzenia przygotuj odpowiednie stężenia roztworów epidermal growth factor (EGF) (Sigma) w pożywce niezależnej od CO2 w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml. Rozwiruj roztwory EGF w vorteksie przez 5 sekund i podłącz je do dętek. Podłącz dętki oznaczone odpowiednimi stężeniami EGF do urządzenia. Dyfuzja EGF przez grzbiet kanału i ustanowienie stabilnego gradientu chemicznego zajmuje około godziny.
Oprogramowanie do obrazowania Slidebook jest wykorzystywane do wykonywania serii zdjęć co 10 minut przez około 5 godzin w trakcie jednego przebiegu eksperymentalnego. Zautomatyzowany stolik x-y jest zaprogramowany tak, aby w danym punkcie czasowym obrazować dwa podobszary (każdy o powierzchni 400μm x400μm) tego samego kanału centralnego, przy czym obrazowanych jest łącznie trzy kanały centralne. Komórki w różnych kanałach centralnych (zazwyczaj 3 w jednym przebiegu) są poddawane działaniu różnych stężeń EGF, zgodnie z oznaczeniami na przewodach.
Materiały i sprzęt
Linie komórkowe: Komórki C17.2 to NSC pochodzące z zewnętrznej warstwy ziarnistej pozarodowego móżdżku myszy 6, 7. Wykorzystując tę linię komórkową, opracowaliśmy dwie inne mysie linie komórek macierzystych za pomocą metody transfekcji retrowirusowej. Te dwie stabilnie transfektowane linie komórkowe to (1) wtEGFR – nadwyrażająca ludzki EGFR typu dzikiego oraz (2) ΔEGFR – będąca konstytutywnie aktywnym mutantem EGFR. W celu ułatwienia detekcji retrowirusy przenoszą szkielet z genem zainteresowania, po którym następuje wewnętrzna sekwencja wiązania rybosomów (IRES) oraz zielone białko fluorescencyjne (GFP).
Hodowla komórkowa: Mysie komórki NSCs C17.2 oraz ich warianty hodowano w płytce 6-dołkowej w pożywce M2 (DMEM (Invitrogen) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Invitrogen), 5% surowicy końskiej (HS) (Invitrogen) oraz 1% penicyliny/streptomycyny (Invitrogen).) Komórki utrzymywano w temperaturze 37oC w atmosferze 80% powietrza i 5% CO2. 
Urządzenie mikrofluidyczne: plastikowy kolektor, przekładka z PDMS oraz stalowa ramka do stabilizacji urządzenia.
Obrazowanie
Stosuje się odwrócony mikroskop fluorescencyjny (Olympus IX-81) wraz z wzmocnioną kamerą CCD (Orca, Hamamatsu). Urządzenie mikroprzepływowe jest zamontowane na zautomatyzowanym stoliku x-y-z, a stolik znajduje się w komorze inkubacyjnej utrzymującej temperaturę 37oC. Zazwyczaj na jednym chipie znajduje się 3-4 urządzenia, które są filmowane w tym samym punkcie czasowym przy użyciu zautomatyzowanego stolika x-y-z.
Utrzymywanie przepływu
Do utrzymania przepływów we wszystkich kanałach odpływowych i dopływowych wykorzystuje się automatyczną pompę perystaltyczną z 8 równoległymi liniami (Watson-Marlow 205U/CA).
 
<img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="Analiza ruchu komórek, wykres rozrzutu stężenia względem typu komórek, śledzenie mikroskopowe, badanie biologiczne." width="573" height="414" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rys. 1 Mobilność trzech szczepów NSC (rodzicielskiego, wtEGFR oraz DEGFR) w różnych stężeniach EGF Wszystkie trajektorie zostały uzyskane poprzez śledzenie filmu z 5 godzin (z wyjątkiem wtEGF 100ng/ml, 4 godziny), a początki wszystkich ścieżek zostały przesunięte do punktu (0,0) w celu porównania. 
 
 <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, trajektorie komórek; sygnalizacja EGFR; wykres śledzenia komórek; badanie naukowe." width="576" height="546" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2">
 Rys. 2 Korelacja poziomu ekspresji EGFR i motywności (a) dwa obrazy NSC wtEGF na powierzchni kanału mikrofluidycznego z 100ng/ml EGF. Obraz po lewej to obraz fluorescencyjny, a po prawej obraz w prześwietlonym polu jasnym. Pasek skali wynosi 100µm, a szerokość kanału to 400 µm. Komórki zostały podzielone na dwie populacje na podstawie jasności ekspresji GFP. Komórki w niebieskich okręgach są ciemniejsze, co oznacza niższy poziom ekspresji EGFR; natomiast komórki w czerwonych okręgach są jaśniejsze, co wskazuje na wyższy poziom ekspresji EGFR. (b) Trajektorie komórek o niskim i wysokim poziomie ekspresji EGFR. Trajektorie te zostały pobrane z czterogodzinnego filmu.

<ol><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+in+search+of+a+killer+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li>
<li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-a-chip%22%5BJournal%5D)">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li>
<li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li>
<li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype%3A+Cell+enhancer+or+cell+transformer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li>
<li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li>
</ol>

Rys. 1 przedstawia trajektorie trzech szczepów NSC: komórek macierzystych, wtEGFR oraz ΔEGFR (kontrola). Każdy zestaw trajektorii uzyskano z filmu trwającego 5 godzin. W przypadku komórek macierzystych ruchliwość komórek osiągnęła szczyt przy stężeniu EGF wynoszącym ~ 10ng/ml; dla komórek wtEGFR szczyt ruchliwości przesunął się na wartość 100ng/ml lub wyższą; w przypadku komórek ΔEGFR ruchliwość komórek była niezależna od stężenia EGF, zgodnie z oczekiwaniami.

Komórki wtEGF przy stężeniu 10...

<table><tbody><tr><td>Podłoże DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium) (1X)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże niezależne od CO2</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>18045-088</td><td>Własnościowe podłoże bez HEPES, odpowiednie do wspierania wzrostu wielu linii komórek nabłonkowych, fibroblastów i limfocytów w warunkach atmosferycznych, nie zawiera L-glutaminy</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>Fosforanowy bufor solny, bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Zawiera 10 000 jednostek penicyliny (zasada) i 10 000 g streptomycyny (zasada)/ml z wykorzystaniem penicyliny G (sól sodowa) i siarczanu streptomycyny w 0,85% soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana</td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>16050-130</td><td>Surowica konia, surowica przebadana w kierunku EIA (wynik negatywny)</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Fibronektyna z ludzkiej osocza, nazywana również globuliną nierozpuszczalną na zimno</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td>Epidermalny czynnik wzrostu z gruczołu podżuchwowego myszy, liofilizowany</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-500</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Podczas gdy technologia mikroprzepływowa osiąga nowy poziom dojrzałości w odniesieniu do analiz makromolekularnych, testy oparte na komórkach znajdują się wciąż w początkowej fazie rozwoju1. Wynika to w dużej mierze z trudności w tworzeniu stabilnego mikrośrodowiska kompatybilnego z komórkami przy użyciu konwencjonalnych technik mikrofabrykacji i materiałów. Rozwiązujemy ten problem poprzez wprowadzenie nowego materiału do mikrofabrykacji – żelu agarozowego – jako materiału bazowego dla urządzenia mikroprzepływowego. Żel agarozowy jest wysoce plastyczny oraz przepuszczalny dla gazów i składników odżywczych niezbędnych do przeżycia komórek, co czyni go idealnym materiałem do analiz opartych na komórkach. Wykazaliśmy wcześniej, że urządzenia oparte na żelu agarozowym z powodzeniem stosowano w badaniach migracji bakterii i neutrofili2. W niniejszym raporcie w membranie z żelu agarozowego o grubości około 1mm uformowano trzy równoległe kanały mikroprzepływowe. Za pomocą pompy perystaltycznej w dwóch kanałach bocznych utrzymywany jest stały przepływ pożywki/buforu. Komórki są utrzymywane w kanale środkowym w celu obserwacji. Ponieważ składniki odżywcze i związki chemiczne z kanałów bocznych nieustannie dyfundują do kanału środkowego, środowisko chemiczne kanału środkowego jest łatwo kontrolowane poprzez przepływ w kanałach bocznych. Używając tego urządzenia, wykazujemy, że ruch komórek macierzystych neuronów można z łatwością monitorować optycznie w różnych warunkach chemicznych, a wyniki eksperymentalne pokazują, że nadekspresja receptorów epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR) zwiększa mobilność komórek macierzystych neuronów. Mobilność komórek macierzystych neuronów jest ważnym biomarkerem oceniającym agresywność komórek, a tym samym czynnik tumorigenny3. Zrozumienie mechanizmu leżącego u podstaw mobilności NSC dostarczy wiedzy zarówno na temat zaburzeń rozwoju układu nerwowego, jak i inwazji macierzystych komórek raka mózgu.

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Podczas gdy technologia mikroprzepływowa osiąga nowy poziom dojrzałości w przypadku analiz makrocząsteczkowych, analizy oparte na komórkach znajdują się wciąż w początkowej fazie1. Jest to ...

Cześć, jestem Kevin Won. Jestem studentem studiów magisterskich inżynierii w Biofluids Lab na Uniwersytecie Cornella. Dzisiaj opowiem o wykorzystaniu mikroprzepływowego urządzenia opartego na agarozie do badania wpływu EGF (czynnika wzrostu naskórka) na murine neurostem cells (neuronalne komórki macierzyste myszy).Urządzenie składa się zasadniczo z trzech kanałów mikroprzepływowych, z których każdy ma szerokość 150 µm. EGF jest wpompowywany do jednego z kanałów bocznych, a bufor do drugiego kanału bocznego. Pozwala to na utworzenie statycznego liniowego gradientu chemicznego w poprzek kanału centralnego.Ponieważ EGF łatwo dyfunduje przez żel agarowy, komórki macierzyste neuronów wysiewa się w kanale środkowym, a postępy ich migracji monitoruje za pomocą mikroskopu. Urządzenia składają się zatem w zasadzie z górnej warstwy z pleksiglasu, w której znajdują się wszystkie wloty i wyloty do podłączenia rurek. Pod nią znajduje się membrana z żelu agarowego, zawierająca cztery wzorowane urządzenia.Całość jest otoczona dystansem z PDMS, co gwarantuje stałą grubość w całym urządzeniu. PDMS oraz żel są montowane na szkiełku przedmiotowym pokrytym ect. Pomaga to komórkom przylegać do szkiełka.Dodatkowo, płyta ze stali nierdzewnej służy do montażu całego urządzenia, które następnie skręcamy za pomocą śrub. Linia komórkowa typu dzikiego została przetransfekowana wektorem retrowirusowym w celu nadekspresji receptora EGF typu dzikiego, natomiast linia komórkowa delta została przetransfekowana zmutowaną wersją receptora EGF, która umożliwia jego konstytutywną aktywność bez liganda EGF. Dobrze, zacznę zatem od wyjaśnienia procesu montażu naszego urządzenia mikroprzepływowego.Najpierw umieściłam przekładkę z PDMS wokół elementów wypukłych krzemowych mikrokanałów w naszych matrycach. Teraz odważę 0,3 g agarozy. Następnie odmierzę 10 ml pożywki niezależnej od CO2 i dodam ją do agarozy.Następnie będę pipetować próbkę w górę i w dół, aby wymieszać proszek agros z pożywką niezależną od CO2. Teraz możemy przenieść naczynie do mikrofalówki. Jak widać, agros został upłynniony, choć wciąż pozostało kilka grudek.Spróbuję zakręcić próbką, aby rozpuścić granulki i pozbyć się pęcherzyków powietrza. Teraz wlewam stopiony agaros na elementy reliefowe silikonowej matrycy, a następnie biorę sterylną szkiełko przedmiotowe i kładę je na dystansie z PDMS. Kładę je pod kątem, aby spróbować wypchnąć większość pęcherzyków powietrza z żelu agarozowego.Następnie wywarłem nacisk i będę go kontynuować, aż powłoka agarozy stężeje. Po jednej lub dwóch minutach stężała. Teraz usunę nadmiar agarozy z szkiełka.Kolejnym krokiem jest delikatne zsunięcie szkiełka przedmiotowego, które może zostać teraz zutylizowane. Teraz spróbuję delikatnie przenieść wzór agros na szkiełko przedmiotowe, które wcześniej pokryłem fibronektyną. Używam tej sterylnej plastikowej folii, aby pomóc mi zdjąć wzór agros wraz z przekładką PDMS, a następnie przeniosę wzór agros z kanałami skierowanymi w dół w stronę szkiełka.Teraz, gdy urządzenie jest mocno przymocowane do szkiełka przedmiotowego, wykonam otwory w poszczególnych zbiorniczkach, aby plastikowy rozdzielacz miał dostęp do kanałów. Użyję do tego niewielkiego metalowego dziurkacza. Proces wykonywania otworów w urządzeniu został zakończony.Dodam 500 µL pożywki niezależnej od CO2, aby zapobiec wysychaniu mikrokanałów, a następnie odczekam od jednej do dwóch minut. Po upływie jednej lub dwóch minut spróbuję odprowadzić nadmiar pożywki, a następnie wyrównam otwory wykonane w matrycy z otworami wlotowymi i wylotowymi w rozdzielaczu z pleksiglasu. Po wyrównaniu otworów mocno docisnę całość, aby stworzyć szczelną uszczelkę.Teraz kładę pleksiglasowy rozdzielacz na uchwytach ze stali nierdzewnej i delikatnie złączę urządzenie za pomocą śrub. Bardzo uważam, aby nie dokręcić śrub zbyt mocno, ponieważ mogłoby to zmiażdżyć kanały; wkręcam śruby zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zapobiec przesunięciu się żelu Agarose wewnątrz. Pobiorę 1 mL medium i użyję tej strzykawki do przetestowania urządzenia.Jak widać, wstrzykuję ciecz do każdego mikrokanału i sprawdzam, czy wypływa ona z każdego otworu wylotowego. W tej chwili umieściłem zmontowane urządzenie w komorze inkubacyjnej mikroskopu. Jest ona utrzymywana w temperaturze 37 °C, co pozwoli rozgrzać urządzenie i przygotować je do etapu wysiewania komórek.Jak widać, przeprowadziłem już dwie rurki pompy perystaltycznej przez układ. Obecnie płuczę rurki roztworem PBS w celu przygotowania do naszych eksperymentów. Teraz przejdziemy do ustawienia rurek.Przewleczkę rurki pompy parasolowej przez nakrętki, w których wykonano już otwory. Każda rurka ma określoną liczbę nacięć, co pozwala mi zidentyfikować zarówno wlot, jak i wylot rurki. Rurka z czterema nacięciami zostanie wykorzystana do podania 10 nanogram per mil.Teraz przytwierdzę rurki z roztworem EGF do urządzenia. Przymocuję je do każdego urządzenia zgodnie z liczbą posiadanych wycięcia, co odpowiada ilości pobieranego roztworu.Teraz podłączam rurkę wylotową. Używamy przezroczystego wężyka typu tigon, aby upewnić się, że medium rzeczywiście przepływa przez rurkę wylotową i nie ma żadnych zatorów w kanale. Teraz uruchomię pompy perystaltyczne.Przystępuję teraz do procedury wysiewania komórek do kanału środkowego. Zacznę od usunięcia nadmiaru pożywki z kanału czujnika. Teraz będę mogła zobaczyć komórki.Komórki znajdują się już w zawiesinie w pożywce niezależnej od CO2. Wprowadziłem 60 µL do wlotu kanału środkowego oraz 20 µL do wylotu. Mamy nadzieję, że komórki zostaną osadzone dzięki przepływowi grawitacyjnemu.Powtórzę tę procedurę dla dwóch pozostałych kanałów czułych, a teraz przejdziemy do obserwacji pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy osadzanie komórek przebiegło pomyślnie. Komórki przyległy teraz do szkiełka przedmiotowego i w ciągu kilku minut zaczną się rozprzestrzeniać oraz przyjąć swoją charakterystyczną morfologię. Omówiliśmy dzisiaj montaż samego urządzenia, przygotowanie odczynników oraz techniki mikroskopowe, których używam do obrazowania migracji komórek wewnątrz urządzenia.Podsumowując, mamy nadzieję, że urządzenie to znajdzie znacznie szersze zastosowanie, w szczególności w warunkach klinicznych. Rysunek 1 przedstawia w osi poziomej trajektorie komórek C 17.2, a w osi pionowej zwiększające się stężenia EGF.Przedstawiono trajektorie różnych szczepów komórek C 17.2 wykorzystanych w naszych eksperymentach przy tym samym stężeniu EGF. Dane dla komórek rodzicielskich wykazują szczyt ruchliwości przy gradiencie stężeń EGF wynoszącym 10 ng/ml, co wskazuje na nasycenie receptorów ligandem przy wyższym stężeniu EGF. Natomiast dane dla typu dzikiego wykazują wzrost ruchliwości przy stężeniu EGF wynoszącym 100 ng/ml.Wskazuje to na to, że receptory nie ulegają nasyceniu przy wyższych stężeniach EGF. Jest to logiczne, ponieważ linie te zostały zaprojektowane tak, aby wykazywać nadekspresję receptora EGF. Wreszcie dane dla linii komórkowej delta wskazują, że ruchliwość komórek jest w przybliżeniu niezależna od stężenia EGF.Jest to również spodziewane, ponieważ zmutowane receptory EGF zostały zaprojektowane tak, aby aktywowały się niezależnie od obecności EGF.

assessing-neural-stem-cell-motility-using-an-agarose-gel-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena ruchliwości komórek macierzystych nerwowo-mózgowych za pomocą urządzenia mikrofluidycznego opartego na żelu agarozowym

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

W tym protokole pokazujemy, jak konstruować niestandardowe komory, które pozwalają na zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe translokacji komórek prekursorowych pochodzenia nerwowego w dorosłym mózgu podczas galwanotaksji.

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Ten film demonstruje test migracji neurosfery komórek prekursorowych neuronów - test in vitro do badania odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery - za pomocą analizy mikroskopowej.

Test neurosfery NPC: Test in vitro do oceny odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Prezentujemy trzy proste testy in vitro - test migracji na duże odległości, test migracji kokulturowej i test przyciągania chemo-chemicznego - które wspólnie oceniają funkcje komórek śródbłonka okołokomorowego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i ich interakcję z interneuronami GABA-ergicznymi.

Testy migracji, chemoprzyciągania i kohodowli komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Poznaj metodę oceny ruchliwości komórek macierzystych przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia na bazie żelu agarozowego. Technika ta pozwala badać wpływ EGF na neuronalne komórki macierzyste.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Przeglądaj więcej filmów