Ocena migracji nowotworowych komórek macierzystych przy użyciu kompartmentaryzujących urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Ogólnym celem tej procedury jest wizualna kontrola i scharakteryzowanie migracji komórek rakowych za pomocą kompartmentowego urządzenia mikroprzepływowego. Osiąga się to poprzez pierwszą dysocjację, wcześniej istniejące neurosfery komórek macierzystych guza mózgu hodowanych w pożywce wolnej od surowicy. Drugim krokiem jest wyprodukowanie dwuwarstwowego wzorca SU eight i użycie miękkiej formy litograficznej stempla A-P-D-M-S, który ma konstrukcję z podziałem na przedziały.

Następnie zmontuj urządzenie mikroprzepływowe i załaduj je komórkami macierzystymi guza mózgu. Wreszcie, długoterminowe obrazowanie poklatkowe migracji komórek macierzystych guza mózgu odbywa się za pomocą systemu mikroskopowego typu "wszystko w jednym". Ostatecznie wyniki pokazują, że komórki macierzyste guza mózgu wykazują rotacyjną sekwencję etapów morfologicznych podczas migracji przez bardzo ograniczoną przestrzeń.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi masami, takimi jak komora Boytona Transwella, jest to, że mikrourządzenie pozwala na wizualną kontrolę procesu migracji, kontrolowane rozmieszczenie komórek i precyzyjne dostarczanie czynników. Dlatego technologia micro foric ma cechy niezawodnego, wydajnego i opłacalnego wyboru i nawigacji pojedynczych komórek. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię przerzutów i nawrotów raka, ponieważ analiza pojedynczych komórek silnie migrujących może zidentyfikować potencjalne przyszłe cele chemioterapeutyczne.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w zachowanie migracyjne układu nowotworowego, może być również stosowana do innych systemów, takich jak rozwój embrionalny, odpowiedzi immunologiczne, gojenie się ran i regeneracja narządów. Począwszy od zawiesiny komórkowej nerwi pochodzących z BTSC. Połącz komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i odwiruj je z prędkością 900 obr./min przez pięć minut, ale nie szybciej.

Zassać super natin. Następnie pozwól neurosferom się rozluźnić, inkubując je w 0,5 mililitra wstępnie ogrzanego Accutane przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji należy mechanicznie rozbić komórki za pomocą 10 do 20 delikatnych pociągnięć pipety P 100.

Następnie dodaj 1,5 mililitra pożywki z komórkami macierzystymi, aby zneutralizować wirówkę Accutane, zawiesinę komórek przy 1300 obr./min przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki z komórkami macierzystymi. Sprawdź gęstość komórek za pomocą hemocytometru i dostosuj gęstość do 20 000 komórek na mikrolitr. Aby rozpocząć produkcję ósmego wzorca SU, przygotuj dwie maski fotograficzne za pomocą programu Adobe Illustrator i drukuj laserowo przezroczystą folię z wbudowanym programem Image Setter.

Pierwsza warstwa maski fotograficznej składa się z dwóch znaczników odniesienia i szeregu mikrokanałów, a druga warstwa maski fotograficznej ma komory siedzenia i odbiorcze. Oczyść obie warstwy maski izopropanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Teraz obróć wafel z uchwytem z trzema mikronami SU o grubości trzech mikronów i osiem fotorezystów, a następnie upiecz na miękko.

Następnie, z pierwszą warstwą maski fotograficznej w bliskim kontakcie z uv, naświetl zdjęcie, oprzyj się i pozwól mu się utwardzić. Następnie po upieczeniu i rozwinięciu utwardzonego wafla. Przykryj obszary znaczników odniesienia wafla uchwytu taśmą klejącą.

Następnie obróć wafel fotorezystem o grubości 250 mikronów. Następnie odklej taśmę, aby odsłonić znaczniki w celu wyrównania. Umieść drugą warstwę fotorezystu i wyrównaj znaczniki odniesienia.

Następnie naświetl UV i utwardź drugą warstwę maski fotograficznej, a następnie po upieczeniu i wywołaniu. Teraz zmodyfikuj SU eight master poprzez osadzanie z fazy gazowej, aby zmniejszyć lepkość powierzchni. Umieść wafle w wysuszonym pomieszczeniu z kilkoma kroplami roztworu Tri Chloro Cline pod próżnią przez co najmniej jedną godzinę.

Wzorzec będzie wtedy gotowy do użycia do formowania PDMS za pomocą wzorca. Zacznij od dokładnego wymieszania bazy polimerowej z utwardzeniem w stosunku 10 do jednego. Następnie umieść mieszaninę w osuszaczu w celu odgazowania próżniowego, aż nie będzie widać pęcherzyków powietrza.

Wlej mieszaninę na maskę i ponownie odgazuj. Jeśli zostaną wprowadzone nowe pęcherzyki powietrza, utwardź formę na równej płycie grzejnej przez dwie godziny w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Po ostygnięciu do temperatury pokojowej delikatnie zwolnij stempel PDMS.

W ten sposób kanały hodowlane są grawerowane w PDMS i gotowe do montażu urządzenia mikroprzepływowego. Mistrz nadaje się do wielokrotnego użytku do formowania, dopóki nie zostanie pęknięty lub zużyty. Gdy wzorzec stanie się lepki, powłokę zapobiegającą przywiewaniu można ponownie nałożyć.

Zacznij od wykonania wlotów i wylotów w urządzeniu mikroprzepływowym za pomocą stempla PDMS. Za pomocą nakłucia otworu biopsyjnego wyczyść stempel PDMS, mocząc go w 70% etanolu przez 30 minut, a następnie spłukując go wodą dejonizowaną przez 10 minut. Wysterylizuj i zakończ reakcje sieciowania stempla PDMS poprzez autoklawowanie.

Teraz połóż stempel PDMS na szklanym szkiełku nakrywkowym pokrytym poli L lizyną. Urządzenie jest następnie powlekane laminatem poprzez napełnianie komór roztworem laminatu przez wloty zbiorników i inkubowane przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessaj laminat z urządzenia.

Następnie umyj urządzenie, zalewając je dwukrotnie podłożem z komórek macierzystych. Teraz załaduj 11 mikrolitrów zdysocjowanych komórek do jednego ze zbiorników wysiewających W razie potrzeby użyj aspiracji próżniowej, aby wepchnąć komórki do komory. Następnie załaduj dodatkowe siedem mikrolitrów komórek do sąsiedniego zbiornika siedzenia.

Po pięciu minutach zbiorniki osadzenia i odbiorcze zostaną zalane mediami. Teraz umieść na urządzeniu sterylny arkusz PDMS o grubości od 0,5 do jednego milimetra. Naturalna przyczepność powierzchniowa PDMS do siebie uszczelni urządzenie po uszczelnieniu, jest gotowe do transportu, inkubacji i obrazowania mikroskopowego.

Wstępnie zrównoważ biot, IM, uruchamiając go przez 45 minut. Aby ustabilizować jego temperaturę, wilgotność i dopływ powietrza, dodaj kilka naczyń z wodą do komory próbki, aby uzyskać odpowiednią wilgotność. Załaduj przygotowane urządzenie do komory na próbkę mikroskopu.

Wyśrodkuj urządzenie za pomocą mikropęsety. Teraz ustaw punkty pozycji ostrości i punkty czasowe za pomocą oprogramowania Biot i w razie potrzeby rozpocznij nagrania poklatkowe. Po pięciu dniach w hodowli wymień pożywkę hodowlaną.

BTC zasiane w urządzeniu były w sposób ciągły rejestrowane przez obraz fazowy. Przez pięć dni w komorze osadzania komórki w kształcie wrzeciona pozostawały w fazie przed migracją. Gdy zbliżyli się do wejścia do mikrokanału, kilka komórek rozszerzyło się i wytworzyło wypukłości kleju.

Tylko jedna komórka była w stanie zająć wejście i zbadać kierunek migracji. Gdy komórka określiła kierunek migracji, zaczęła przepływać przez cały mikrokanał ze stałą, dużą prędkością. Pod koniec Microchannel komórka przystąpiła do eksploracji otwartej przestrzeni komory odbiorczej, zanim w końcu do niej weszła.

Obserwując komórki w dwusekundowych odstępach obrazowania, okazało się, że migracja mocy jest generowana głównie przez aktywność blabbingu podobną do tej, jaką mają komórki OID. Podejmując próbę wykonania zabiegu, należy pamiętać, że konstrukcja urządzenia jest na tyle elastyczna, że można manipulować wymiarami mikrokanalików w celu uzyskania pożądanego stopnia migracji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć unikalne urządzenie mikroprzepływowe z przedziałami, odpowiednie do hodowli interesujących Cię komórek, a następnie wykonywania długoterminowego obrazowania poklatkowego w celu jakościowego i ilościowego zdefiniowania cech migracyjnych tych komórek Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji lub mikromacierz DNA, mogą być zastosowane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jak genetycznie różnią się wysoce migrujące komórki nowotworowe.