Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Coraz częściej docenia się wpływ mikrośrodowiska mechanicznego na sygnalizację i migrację komórek. Wymaga to zastosowania unikalnych, eksperymentalnych podejść w celu dostarczenia mechanicznej stymulacji do pojedynczej komórki. Technika ta pozwala na dynamiczną manipulację mikrośrodowiskiem mechanicznym pod komórką w czasie rzeczywistym.

Umożliwia obserwację mechanicznie regulowanych zmian w zachowaniu migracji komórek i subkomórkowych zdarzeniach sygnalizacyjnych. Procedurę zademonstrują ze mną Nyla Naim, post-doc i Johnathan Patterson, technik z naszego laboratorium. Zacznij od użycia Chorono-1 do aktywacji szklanej powierzchni każdego dolnego szkiełka nakrywkowego na 20 sekund, a następnie natychmiast nałożyć 50 mikrolitrów wiążącego roztworu roboczego silanu na każde szkiełko nakrywkowe.

Pozostawić roztwór do wyschnięcia na 10 minut przed spłukaniem szkiełek nakrywkowych dwa razy 95% etanolem i dwa razy izopropanolem. Następnie pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu przez około 20 minut. W przypadku osadzania fluorescencyjnych mikrokulek należy najpierw poddać działaniu sonikacji roztworu roboczego mikrokulek przez jedną godzinę.

Na 15 minut przed zakończeniem sonikacji należy umieścić aktywowane szkiełka nakrywkowe pionowo w ceramicznym uchwycie szkiełek nakrywkowych i przenieść uchwyt do stołowego urządzenia do czyszczenia plazmowego w celu obróbki plazmowej powietrzem w pomieszczeniu na trzy minuty. Następnie umieść kawałki folii parafinowej w 60-mililitrowych pokrywkach szalek Petriego i umieść szkiełka nakrywkowe na foliach, lekko stukając w każde szkiełko nakrywkowe, aby zapewnić dobry kontakt między folią a szkiełkiem nakrywkowym. Następnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu roboczego kulki do górnej części każdego szkiełka nakrywkowego i natychmiast zassaj roztwór etanolu od strony szkiełek nakrywkowych, pozostawiając kulki na szkiełku nakrywkowym.

Aby odlać hydrożele natychmiast po ich przygotowaniu, dodaj 25 mikrolitrów kropli roztworu hydrożelu do aktywowanej strony każdego dolnego szkiełka nakrywkowego i natychmiast odwróć perełkowane górne szkiełka nakrywkowe, perełką do dołu, na kroplę. Pozostaw żele do polimeryzacji przez 30 minut przed użyciem kleszczy, aby delikatnie usunąć szkiełka nakrywkowe. Następnie spłucz żele trzema, pięciominutowymi praniami w świeżych 50 miliMoler Hepes na pranie.

Aby aktywować powierzchnie hydrożeli, inkubuj żele w świeżych 50 miliMoler Hepes, uzupełnionych 0,4 milimolowym Sulfo Sanpah i natychmiast wystawiaj żele na działanie ultrafioletowej lampy łukowej w zamkniętym obszarze przez 90 sekund. Pod koniec aktywacji umyj żele trzema, pięciominutowymi płukaniami w świeżych Hepes i potraktuj aktywowane hydrożele 20 mikrogramami na mililitr fibronektyny przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odessać nadmiar roztworu fibronektyny i przemyć żele trzy razy w PBS przez pięć minut na pranie.

Po ostatnim praniu umieść hydrożele w małej objętości PBS i sterylizuj żele przez 15 minut w świetle ultrafioletowym w kapturze do hodowli tkankowej. Następnie umyj żele jeden raz w świeżym PBS. W przypadku posiewu komórkowego zasiaj 2,1 razy 10 cztery interesujące komórki w trzech mililitrach podłoża na hydrożel i pozwól komórkom przylegać w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do 18 godzin.

Podczas wyrównywania komórek użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć mikropipetę ze szkła borokrzemianowego o średnicy jednego milimetra i długości 100 milimetrów, aby uzyskać stożek o średnicy ponad dwóch milimetrów, który zmniejsza się do około 50 mikrometrów średnicy w pierwszym milimetrze i rozciąga się do długiej, równoległej rurki o średnicy 10 mikrometrów w ostatnim milimetrze. Następnie załaduj pipetę do mikrokuźni i uformuj ją tak, aby miała końcówkę o długości 15 mikrometrów, która jest zamknięta na samym końcu odcinka o długości 250 mikrometrów, wygięta pod kątem około 35 stopni od reszty pipety. Przybliżona średnica na zakręcie powinna wynosić około 30 mikrometrów, aby nadać wytrzymałość końcówce.

Następnie umieść hydrożel na stoliku odwróconego mikroskopu. Przykryj podłoże olejem mineralnym i wybierz obiektyw 10x. Przygotowaną mikropipetę wysterylizuj 70% alkoholem.

Następnie włóż do uchwytu mikropipety z haczykiem skierowanym w stronę naczynia i użyj manipulatora kursu, aby opuścić pipetę, aż haczyk dotknie powierzchni płynu. Skoncentruj mikroskop na komórkach przylegających do górnej części żelu i uważając, aby obiektyw nie był narażony na uderzenie w próbkę lub stolik, przenieś ostrość nad żel, aby znaleźć końcówkę mikropipety. Obracaj pipetę, aż końcówka będzie prostopadła do płaszczyzny ogniskowej, tak aby końcówka mikropipety była skierowana w dół, a następnie w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość na końcówce pipety.

Skoncentruj się z powrotem na warstwie komórek, aby ocenić, jak daleko pipeta znajduje się od powierzchni żelu, a następnie ustaw ostrość z powrotem na płaszczyźnie, która znajduje się w połowie odległości między żelem a końcówką pipety. Następnie powoli opuść pipetę, aby osiągnąć pośrednią płaszczyznę ogniskowej i zwiększ powiększenie do tego, które zostanie użyte w eksperymencie, zanim opuść pipetę, aż uniesie się tuż nad powierzchnią hydrożelu. W przypadku kalibracji mikromanipulatora należy zobrazować obszar pozbawiony komórek, obszar z kulkami, ale bez manipulacji, z pipetą stykającą się z żelem i z zaangażowaną pipetą ciągnącą żel.

Następnie użyj obrazu J, aby porównać pola bez ściegu z polami ściegu bez zaangażowania, pola koralików z zaangażowanym żelem i ciągniętym żelem, aby obliczyć względne przemieszczenia ściegu i siłę przyłożoną do żeli. Aby przeprowadzić test durotaksji, monitoruj grupę komórek przez 30 minut, aby zidentyfikować komórki, które poruszają się w ukierunkowany sposób. Wybierz komórkę, która porusza się równomiernie w jednym kierunku, i monitoruj komórki o żądanej liczbie klatek na sekundę przez dodatkowe 30 minut.

Następnie należy ustawić pipetę około 50 mikrometrów przed bliższą stroną krawędzi natarcia wybranej komórki i przesunąć mikromanipulator tak, aby żel był odkształcony prostopadle do kierunku ruchu komórki. Następnie obserwuj komórkę w czasie, gdy reaguje na ostry, lokalny gradient sztywności hydrożelu. Korzystając z tej techniki, jak pokazano, fibroblasty embrionalne szczurów przesuwają się w kierunku zwiększonej sztywności gradientów naniesionych przez szklaną mikropipetę.

Szczurze embrionalne komórki fibroblastów, przejściowo wyrażające czujnik napięcia winkuliny na 125 kilopaskalowych żelach poliakrylamidowych, wykazują również tworzenie się zrostów ogniskowych w kierunkach rozciągania w okresie 40 minut. Analiza transferu energii rezonansu Forstera ujawnia, że winkulina zlokalizowana w zrostach ogniskowych doświadcza natychmiastowej zmiany napięcia, gdy ma do czynienia z ostrą stymulacją durotaktyczną. Rozszerzenie użyteczności tego testu na obserwację subkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych w odpowiedzi na stymulację durotaktyczną.

Jeśli podejmiesz wiele prób rozciągnięcia komórki lub jeśli mikroigła ześlizgnie się podczas testu, zacznij od nowa z nową komórką, aby uniknąć przekazywania wielu, zmiennych, mechanicznych bodźców. Oprócz przydatności do oznaczania durotaksji, technika ta może być łączona z podejściami genetycznymi, takimi jak bioczujniki, RNAI lub edycja genów, aby pomóc w określeniu mechanizmów molekularnych zaangażowanych w mechanotransdukcję.