Name: Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Odkryj metody kwantyfikacji trójwymiarowej migracji komórek w granulowanych hydrożelach. Protokoły obejmują hodowlę komórek, mikroskopię konfokalną i analizę obrazu w oprogramowaniu Imaris.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy było częściowo wspierane przez US National Institutes of Health High Priority, Short-Term Project Award (1R56DK126020-01) oraz filantropijny dar od Kurtin Trust. J.T. został ufundowany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Schematy rysunkowe stworzone za pomocą BioRender.com.

<ol><li>Jerka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+endothelial+cell+migration%3A+Insights+into+fundamental+forces%2C+inflammation%2C+biomaterial+applications%2C+and+tissue+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Unraveling endothelial cell migration: Insights into fundamental forces, inflammation, biomaterial applications, and tissue regeneration strategies.</a> ACS Appl Bio Mater. 7 (4), 2054-2069 (2024).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Yamada, K. M., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of 3D cell migration.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (12), 738-752 (2019).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+biology+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices.</a> Trends Cell Biol. 13 (5), 264-269 (2003).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kloxin, C. J., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+cellularly+responsive+hydrogels+and+their+experimental+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination.</a> Adv Mater. 22 (31), 3484-3494 (2010).</li>
<li>Solbu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+migration+in+hydrogels%3A+An+overview+of+relevant+materials+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Assessing cell migration in hydrogels: An overview of relevant materials and methods.</a> Mater Today Bio. 18, 100537(2023).</li>
<li>Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+bulk+hydrogel+degradation+by+simultaneous+control+of+proteolytic+cleavage+kinetics+and+hydrogel+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Lett%22%5BJournal%5D)">Tuning bulk hydrogel degradation by simultaneous control of proteolytic cleavage kinetics and hydrogel network architecture.</a> ACS Macro Lett. 7 (11), 1302-1307 (2018).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Qazi, T. H., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granular+hydrogels+for+endogenous+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Granular hydrogels for endogenous tissue repair.</a> Biomater Biosyst. 1, 100008(2021).</li>
<li>Tanner, G. I., Schiltz, L., Narra, N., Figueiredo, M. L., Qazi, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granular+hydrogels+improve+myogenic+invasion+and+repair+after+volumetric+muscle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Granular hydrogels improve myogenic invasion and repair after volumetric muscle loss.</a> Adv Healthc Mater. 25, e2303576(2024).</li>
<li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li>
<li>Roosa, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+of+IL-33+to+microporous+annealed+particle+scaffolds+enhances+type+2-like+immune+responses+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Conjugation of IL-33 to microporous annealed particle scaffolds enhances type 2-like immune responses in vitro and in vivo.</a> Adv Healthc Mater. 13 (25), 2400249(2024).</li>
<li>Jaberi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microgel+packing+to+tailor+the+physical+and+biological+properties+of+gelatin+methacryloyl+granular+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Engineering microgel packing to tailor the physical and biological properties of gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds.</a> Adv Healthc Mater. 13 (25), 2402489(2024).</li>
<li>Nandi, S., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+cell+migration+within+three-dimensional+in+vitro+wound+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments.</a> J Vis Exp. 126, e56099(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Adv Mater. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nat Mater. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Adv Funct Mater. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> J Vis Exp. (184), e64119(2022).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomater Sci Eng. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granular+hydrogels%3A+Emergent+properties+of+jammed+hydrogel+microparticles+and+their+applications+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Granular hydrogels: Emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 1-8 (2019).</li>
<li>Jo, C. H., Roh, Y. H., Kim, J. E., Shin, S., Yoon, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+platelet-rich+plasma+gel+formation+by+varying+time+and+gravitational+forces+during+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Implantol%22%5BJournal%5D)">Optimizing platelet-rich plasma gel formation by varying time and gravitational forces during centrifugation.</a> J Oral Implantol. 39 (5), 525-532 (2013).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+tubular+tissue+constructs+by+centrifugal+casting+of+cells+suspended+in+an+in+situ.+crosslinkable+hyaluronan-gelatin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of tubular tissue constructs by centrifugal casting of cells suspended in an in situ. crosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogel.</a> Biomaterials. 26 (36), 7628-7635 (2005).</li>
<li>Vu, L. T., Jain, G., Veres, B. D., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+on+planar+and+three-dimensional+matrices%3A+A+hydrogel-based+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell migration on planar and three-dimensional matrices: A hydrogel-based perspective.</a> Tissue Eng Part B Rev. 21 (1), 67-74 (2015).</li>
<li>Cialdai, F., Risaliti, C., Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+fibroblasts+in+wound+healing+and+tissue+remodeling+on+Earth+and+in+space%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Role of fibroblasts in wound healing and tissue remodeling on Earth and in space.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 958381(2022).</li>
<li>Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+characterize+granular+hydrogel+rheological+properties%2C+porosity%2C+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1427-1442 (2022).</li>
<li>Shaik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+matrix-derived+granular+hydrogel+enhances+cell+function+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Cardiac matrix-derived granular hydrogel enhances cell function in 3D culture.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 16 (43), 58346-58356 (2024).</li>
<li>Puiggalí-Jou, A., Asadikorayem, M., Maniura-Weber, K., Zenobi-Wong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-loaded+sulfated+microislands+in+granular+hydrogels+promote+hMSCs+migration+and+chondrogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Growth factor-loaded sulfated microislands in granular hydrogels promote hMSCs migration and chondrogenic differentiation.</a> Acta Biomater. 166, 69-84 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten opisuje dwa modele in vitro do charakteryzowania migracji komórek w 3D w celu gojenia ran i integracji tkankowej. Pierwszy model, test migracji oparty na monowarstwie, opiera się na prawidłowo przyłączonych i zlewających się komórkach. Protokół ten został opracowany z wykorzystaniem typu komórek fibroblastów i zoptymalizowany przy gęstości wysiewu 1,20 000 komórek/cm2. Ta gęstość pozwala komórkom rosnąć z dnia na dzień do co najmniej 80% zbiegu równomiernie na dnie płytki studzienki. Ten krok zapewnia migrację w kierunku z w ciągu co najmniej 24 godzin; Jeśli konfluencja jest zbyt niska po dodaniu warstwy żelu, komórki mogą nadal rozprzestrzeniać się po plastiku hodowli tkankowej, a także do żelu, co powoduje niejednorodny, spowolniony wzorzec migracji, który zaobserwowano podczas optymalizacji. Nierównomierne wysokości migracji można jeszcze zaobserwować na obszarach o mniejszej gęstości komórek, nawet przy 80% zbieganiu. Dobrze replikowane redukują szum związany z tymi zachowaniami komórek. Nadmiernie zlewające się komórki mogą powodować podnoszenie komórek w okresie wirowania i potencjalnie śmierć komórek. Zmienność ta jest rozwiązywana przez rozsiewanie w stałej liczbie komórek i przechwytywanie spójnego obszaru obrazu, aby umożliwić odpowiednie porównania danych. Zgodnie z wiedzą autora, wirowanie płytek nie zostało opublikowane w celu spłaszczania żelu, ale wirowanie jest powszechnie stosowane do pasażowania komórek i przenoszenia biomaterii21,22. Dostosowanie prędkości do prędkości pasażowania pozwoli utrzymać żywotność komórek w celu dalszego optymalnego przetwarzania komórek.
Podstawowym wyzwaniem w tej metodzie jest maksymalizacja rozdzielczości i głębokości obrazowania przy jednoczesnej minimalizacji czasu obrazowania, aby zapewnić najlepszą analizę. Barwnik śledzący zielone krwinki jest wystarczająco jasny, aby zobrazować 96-dołkowy z krokiem 5 μm lub mniejszym i czasem naświetlania do 1000 ms. Skrócenie czasu ekspozycji skraca czas, w którym komórki nie znajdują się w warunkach inkubacji, ale także zmniejsza rozdzielczość. Parametry te muszą być optymalizowane indywidualnie dla każdego mikroskopu, ale zmienność jest zmniejszana poprzez zapewnienie, że wszystkie obrazy są rejestrowane przy tych samych ustawieniach w ramach jednego badania.
Ważną uwagą dotyczącą analizy MA jest to, że wymaga ona wyeliminowania komórek na lub poniżej wysokości monowarstwy, aby zapewnić, że tylko komórki migrujące są brane pod uwagę w testach statystycznych. W związku z tym mediany dołków replikowanych są zgłaszane ze względu na niegaussowski charakter dystrybucji pozycji komórek po filtrowaniu. Porównanie między grupami można zwizualizować za pomocą histogramu, a mediany można analizować statystycznie za pomocą testu nieparametrycznego.
Pomimo tych wyzwań, metoda migracji w górę oparta na monowarstwie jest, w najprostszym wydaniu, powtarzalnym testem do infiltracji komórek 3D porowatych rusztowań. Aby zbadać mechanistyczne skutki migracji komórek, upewnij się, że parametry pasują do badanego typu komórki. Może to obejmować dodanie składników chemotaktycznych lub haptotaktycznych w żelu lub w pożywce. Kompletne pożywki ludzkiego fibroblastu skórnego obejmują chemokiny wędrowne, ale inne typy komórek, które wykorzystują bardziej specyficzne wskazówki, wymagają odpowiedniej adaptacji testu. Ten test nadaje się do testowania wielu typów zmiennych; Ich zakres nie jest jednak objęty niniejszym Protokołem. MAMA zapewnia fizjologicznie istotne środowisko analogiczne do przemieszczania się komórek z tkanki masowej do wstrzykniętego porowatego hydrożelu in vivo.
W przypadku metody PLOSMA umieszczenie sferoid w środku rusztowania ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania i znaczącej migracji komórek w trzech wymiarach. Dokładne wysiew sferoidy w środku żelu zależy od użytkownika. W tym celu ustabilizowanie pipety na cylindrze niedominującą ręką użytkownika pomaga w centrowaniu, a skuteczność pozycji wysiewu można potwierdzić za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej. Sferoida poza środkiem może być naprawiona przez drugą próbę z nową sferoidą, na tym samym rusztowaniu lub na nowym rusztowaniu. Z tego powodu autorzy zalecają stworzenie większej liczby sferoid niż to konieczne i przygotowanie większej ilości żelu MAP niż to konieczne.
Etap wirowania drugiej warstwy zapewnia, że sferoida jest (1) równomiernie pokryta żelem i (2) zdolna do równomiernego rozprowadzania się w górę i w dół w żelu, co ma kluczowe znaczenie dla badania dostarczonych komórek. Wirowanie może również powodować przemieszczanie się sferoidy od środka w kierunku krawędzi studni i chociaż protokół ten ogranicza to zjawisko poprzez optymalizację etapów wirowania i objętości żelu użytego dla każdej warstwy (15 μl) w celu równomiernego rozprowadzenia, nie eliminuje całkowicie jego ruchu. Dokładna prędkość i czas wirowania wymagane do ograniczenia ruchu sferoidalnego mogą wymagać dostosowania zgodnie z modelem wirówki; Jednak specyfikacja opisana w tym protokole może być wykorzystana jako punkt odniesienia dla indywidualnej optymalizacji. Innym podejściem jest pozostawienie sferoidom 2 godzin czasu inkubacji na przyczepienie się do rusztowania przed dodaniem drugiej warstwy żelu. Ruch sferoidalny jest szczególnie dobrze łagodzony, gdy wdrażane są obie strategie. Wreszcie, ze względu na wieloetapowy proces wirowania, metoda ta może nie być odpowiednia dla mniej odpornych linii komórkowych.
Poza logistyką galwanizacji sferoid metodą PLOSMA, istnieją ograniczenia podczas akwizycji obrazu. Sferoidę można obrazować przy użyciu 4-krotnego lub 10-krotnego powiększenia, ale aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj co najmniej 10-krotnego powiększenia i zmniejsz rozmiar kroku z-stacków do 2-5 μm. Powiększenie powinno być spójne przez cały czas trwania badania. Czas obrazowania wydłuża się wraz ze wzrostem rozdzielczości, dlatego należy ograniczyć liczbę próbek w każdej płytce dołka (4-8 dołków na płytkę), aby zminimalizować czas spędzony poza inkubatorem. Konfiguracja obrazowania na żywo może również poprawić śledzenie i zapewnić lepszy wgląd.
Ponieważ granulowane hydrożele mają unikalną topologię i parametry projektowe, które obejmują objętość własną, porowatość, wytrzymałość mechaniczną, a w niektórych przypadkach bioaktywność, konieczne jest badanie zachowania komórek w odniesieniu do tych aspektów z jak największą dokładnością. Metoda PLOSMA ma na celu modelowanie ruchu komórek po porodzie lub po całkowitym wprowadzeniu komórek do granulowanego żelu. Ponieważ komórki są zmuszone do migracji przez pory nieodłącznie związane z geometrią granulowanego hydrożelu, metoda PLOSMA skutecznie izoluje porowatość jako czynnik wpływający na zachowanie komórek. Potencjalne zastosowania tego testu to dostarczanie komórek in situ i integracja tkanek w ziarnistym rusztowaniu, szczególnie w przestrzeni gojenia się ran23.
Oba protokoły zostały opracowane z pierwotnymi ludzkimi fibroblastami skóry ze względu na rolę migracji fibroblastów w naprawie i przebudowie tkanek 4,24, jednak zachowanie migracyjne wszelkich przylegających komórek można mierzyć w odpowiedzi na zmianę porowatego rusztowania - w tym dodanie czynników wzrostu i powierzchniowy/masowy skład żelu. Zmiany te mogą wymagać dostosowania tych testów w celu uzyskania znaczących wyników. Parametry wymagające dalszej optymalizacji obejmują gęstość wysiewu komórek, czas trwania eksperymentu i/lub potok analizy. IMARIS to potężne narzędzie do analizy obrazowej, które jest wykorzystywane do analizy migracji komórek i ma możliwości wykraczające poza to, co zostało tutaj opisane, które obejmują klasyfikację wszystkich obiektów na wybranej "powierzchni" w zestawy na podstawie różnych właściwości, takich jak pole powierzchni, objętość, intensywność i odległość od innych utworzonych powierzchni. Istnieje wiele zasobów internetowych, które pozwalają określić dalsze metody analizy.
Dwie opisane tutaj metody dotyczą nie tylko początkowego stanu wprowadzenia tkanki do materiału ziarnistego w sposób fizjologiczny, ale także późniejszej odpowiedzi komórki po całkowitym osadzeniu w materiale. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów migracji, obecne komórki są zdolne do proliferacji równolegle z ruchem, jednak konstrukcja opisanych testów nie zakłóca proliferacji, a tym samym nie zapewnia nadmiernego wpływu na analizę. Obie metody są kompatybilne z barwieniem końcowym oprócz obrazowania podłużnego, które wykorzystuje utrwalanie PFA do wykrywania takich wskaźników, jak cytoszkielet, odkładanie kolagenu, proliferacja i inne. Zastosowanie przedstawionych metod zmierza w kierunku dokładniejszego czasoprzestrzennego odwzorowania migracji komórek 3D, które wykorzystuje infiltrację komórek jako mierzalny parametr, w przeciwieństwie do poprzednich metod 1,6,14,15,25,26,27.

Biomateriały do zastosowań terapeutycznych coraz częściej ewoluują w kierunku bardziej złożonych i odpowiednich modeli środowisk komórkowych do badania integracji tkanek. Rusztowania z biomateriału zapewniają trójwymiarową (3D) strukturę wzrostu komórek i mają na celu naśladowanie pożądanej tkanki1,2. Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych obejmują naturalne matryce i syntetyczne rusztowania, które zapewniają komórkom dalszą złożoność za pomocą wskazówek haptotaktycznych lub chemotaktycznych3,4. Tradycyjne rusztowania hydrożelowe są sieciowane masowo, co daje nanoporowatą siatkę, która umożliwia dyfuzję małych cząsteczek5,6, ale wymaga degradacji w celu migracji w skali komórkowej do obszaru tkanki wymagającego naprawy7. Granulowane hydrożele są podzbiorem biomateriałów, które mają wysoki potencjał do translacji klinicznej ze względu na ich biokompatybilność, zdolność do dostosowywania się do nieregularnych kształtów oraz, w wielu przypadkach, ich wstrzykiwalność8,9. Ich blokowy charakter zapewnia przewagę porowatości w skali komórkowej w celu zwiększenia infiltracji tkanek i angiogenezy, a także modułowości, która pozwala na dodanie heterogenicznych wskazówek dotyczących zachowania komórek10,11,12. Zrozumienie reakcji i ruchu komórek w rusztowaniu 3D ma kluczowe znaczenie fizjologiczne we wszystkich zastosowaniach wykorzystujących biomateriały do integracji tkanek.
Badanie wrastania tkanek w trzech wymiarach okazało się jednak trudne do osiągnięcia z dokładnością ilościową. Zwiększona złożoność środowiska 3D wymaga modeli migracji komórek in vitro, które mogą nie tylko zapewnić wgląd w zachowanie komórek, ale także zoptymalizować warunki materialne. Wcześniej opublikowane raporty na temat migracji komórek granulowanego rusztowania 3D wykorzystywały miejscowe wysiewanie do zbadania zachowania komórek, zgłaszając infiltrację do porowatej struktury i morfologii komórki13 i inne kiełkowanie sferoidów14,15, mierząc długość wzrostu i liczbę pędów. Na długości migracji wysiewu miejscowego mogą mieć nierównomierny wpływ siły grawitacji, a ze względu na ograniczenia mikroskopowe wyniki nie mogą być podłużne. Metoda kiełkowania sferoidów została ograniczona do kwantyfikacji 2D poprzez projekcję maksymalną, która nie jest w stanie uchwycić mechanizmu kontrolowanej inwazji. Obie metody są mierzone w płaszczyźnie xy, która nie ma niuansów niezbędnych do pełnego podsumowania ruchu komórkowego 3D i infiltracji rusztowania.
Ten protokół opisuje dwa podejścia do ilościowego określania migracji komórek, takie jak infiltracja in vitro do porowatych rusztowań hydrożelowych 3D granulowanych, w szczególności przy użyciu rusztowań z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP)16,17,18,19. Celem poniższych metod jest badanie zachowania komórek w ziarnistych żelach poprzez kontrolowanie kierunkowości ich migracji w celu analizy trójwymiarowej. Pierwsze, oparte na monowarstwie podejście do badania migracji rosnącej (MAMA) jest uproszczonym modelem endogennej integracji komórek, który ilustruje jednolite interakcje komórka-materiał i służy jako platforma do reprezentowania początkowego środowiska, w którym komórki łączą się z ziarnistymi hydrożelami, a także do izolowania indywidualnych zachowań przed infiltracją rusztowania. Druga, zwana metodą równoległej warstwowej zewnętrznej migracji sferoidów (PLOSMA), to test migracji sferoidalnej komórek 3D, który bada ruch komórek, gdy jest w pełni otoczony złożonym środowiskiem rusztowania i modeluje ruch komórki po dostarczeniu, a także ruch po tym, jak komórki w pełni weszły do ziarnistego żelu.
Obie metody są kwantyfikowalne za pomocą analizy obrazu 3D i mogą być stosowane do badania i optymalizacji interakcji materiał-komórka za pomocą podłużnych punktów czasowych dla zastosowań medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej, gdzie promowanie lub ograniczanie ruchu komórek mieści się w kryteriach projektowania. Ponadto metody te wykorzystują wirowanie płytek w celu równomiernego przygotowania testów wielodołkowych.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>VWR International</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Zielony barwnik CMFDS, 1 mg</td><td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td>20 x 50 ug jednostek, 492/517 nm</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>75016085</td><td>Seria ST Plus</td></tr><tr><td>Przezroczysta 96-dołkowa płytka</td><td>MilliPore Sigma</td><td>CLS3997-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Fibroblasty Podłoże podstawowe</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-030</td><td>480 ml, zestaw</td></tr><tr><td>do wzrostu fibroblastów bez czerwieni fenolowej - Niska surowica</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-041</td><td>7,5 mM L-glut, 5 ng / ml rh FGF zasadowy, 5 ug / ml rh Insulina, 1 ug / ml Hydrokortyzon, 50 ug / ml Kwas askorbinowy, 2% FBS</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td> <td>NIH</td><td></td><td>Publiczny dostęp do pobrania</td></tr><tr><td>Ludzkie fibroblasty skórne</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>Dorosłe ludzkie fibroblasty skórne</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro Confocal</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem z 4-krotnym, 10-krotnym powiększeniem</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3/4D Imaged Visualizaiton and Analysis, autorski</td></tr><tr><td>inkubator</td><td>ThermoFisher</td><td>Pipety Finnpipette F2 o zmiennej objętości</td><td>Inkubator CO2 HeraCell Vios 160i, 165L</td></tr><tr><td>M-20 Wirnik kubełkowy wahadłowy</td><td>ThermoFisher</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Fisher Scientific</td><td>9004-67-5</td><td>Klasa laboratoryjna, w postaci proszku</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (4%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ19943K2</td><td>Do mocowania&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>08-757-100A</td><td>Bakteriologiczne szalki Petriego z pokrywką 35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Pipety</td><td>ThermoFisher</td><td>4642080</td><td>Finnpipette F2 Pipety o zmiennej objętości</td></tr><tr><td>Sterylne PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Fisher Scientific</td><td>327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granulowane rusztowania hydrożelowe mają znaczący potencjał w medycynie regeneracyjnej, funkcjonując albo jako nośniki do dostarczania komórek, albo jako interfejsy do integracji tkanek. W tym artykule przedstawiono dwa nowatorskie podejścia do ilościowego określania migracji komórek w obrębie i do granulowanych hydrożeli, podkreślając różne zastosowania tych rusztowań. Po pierwsze, przedstawiono test interfejsu jednowarstwowego komórki, który symuluje wzrost tkanki do granulowanych hydrożeli w celu integracji. Po drugie, opisano test oparty na sferoidach, zaprojektowany do śledzenia ruchu komórek w matrycy hydrożelowej, specjalnie przystosowany do zastosowań związanych z dostarczaniem komórek. Obie metody umożliwiają precyzyjne i kontrolowane pomiary migracji komórek, zapewniając kompleksowy zestaw narzędzi dla badaczy wykorzystujących granulowane rusztowania hydrożelowe. Motywacją do opracowania tych metod jest potrzeba dostosowanej kontroli migracji komórek w obrębie rusztowania w celu dostosowania jej do konkretnych zastosowań. Optymalizując i standaryzując te techniki kwantyfikacji, naukowcy mogą iteracyjnie udoskonalać właściwości hydrożelu ziarnistego, zapewniając jego skuteczność w różnych kontekstach medycyny regeneracyjnej. Ten solidny zestaw narzędzi ilościowych oferuje nowe możliwości ulepszania granulowanych rusztowań hydrożelowych, zwiększając ich zastosowanie zarówno w zastosowaniach związanych z dostarczaniem komórek, jak i integracją tkanek.

Niniejszy protokół ma na celu szczegółowe opisanie niezbędnych etapów dwóch nowych testów migracji w rusztowaniach ziarnistych. Metoda MAMA może być wykorzystana do oceny infiltracji komórkowej na styku tkanek. Żele hydrogrowe ziarniste stanowią bardziej złożony system niż hydrożele lite, a zatem są z natury trudniejsze w procesowaniu pod kątem migracji9,20. Ważne jest zrozumienie procesu etapowego przedstawionego na Rysunku 1. Każdy krok wynika z poprzedniego i został zoptymalizowany w tym protokole. Wysiew HDF z gęstością 120 000 komórek/cm2 doprowadzi do uzyskania co najmniej 80% konfluencji w ciągu nocy (Rysunek 1A), a te niefluorescencyjne komórki najlepiej znakować barwnikiem do śledzenia komórek w dniu eksperymentu, aby zmaksymalizować potencjał obrazowania (Rysunek 1B). Protokół ten stosuje niską siłę odśrodkową, analogiczną do tej używanej podczas pasażowania HDF, aby zachować żywotność komórek. Ze względu na kąt powstający podczas pojedynczego etapu wirowania, konieczne jest obrócenie płytki o 180°, aby zapewnić przesunięcie żelu tak, by całkowicie pokrył dno studni (Rysunek 1C). Pozostawienie komórek do regeneracji w inkubatorze przez 30 min po wyżarzaniu (Rysunek 1D) pozwoli zachować żywotność komórek i doprowadzi do optymalnej migracji (Rysunek 1E). Duży obszar płytki 96-dołkowej można obrazować za pomocą obiektywu 4x i dopasowywać w punktach czasowych od 0 do 24 h (Rysunek 2A,B), aby szeroko ocenić zachowanie komórek. Przetwarzanie otrzymanych obrazów typu z-stack w oprogramowaniu analitycznym umożliwia zaawansowane analizy wielu dużych zbiorów danych w łatwym w obsłudze interfejsie. Niniejszy protokół podsumowuje kroki prowadzące do stworzenia zbiorów danych dla wysokości komórek, lub pozycji Z, w każdym punkcie czasowym, wizualizowane na reprezentatywnych obrazach na Rysunku 2B,C. Analiza przetworzonych danych przedstawiona jest na Rysunku 3A, zwizualizowana za pomocą średniej z median wysokości oraz ich odchylenia standardowego dla każdego punktu czasowego; krotność zmiany wysokości w stosunku do komórek niemigrujących w czasie t = 0 h pokazano na Rysunku 3B. Dane bazowe tej metody zazwyczaj nie mają rozkładu normalnego, dlatego mediany są bardziej odpornymi miarami do porównań i w związku z tym zostały użyte do podsumowania danych.
Podobnie metoda PLOSMA może być wykorzystana do oceny motywności dostarczonych komórek w obrębie ziarnistego rusztowania hydrożelowego 3D. Rycina 4A przedstawia kroki metody PLOSMA; szczególnie istotne jest umieszczenie sferoidu w centrum dołka. Zaleca się centrowanie sferoidu w polu widzenia, choć zależy to od możliwości mikroskopu. Rycina 4B prezentuje reprezentatywne obrazy rozprzestrzeniania się sferoidu dla t = 0 h oraz t = 24 h, wykonane przy powiększeniu 10x w kanale FITC (488 nm). W oprogramowaniu można utworzyć układ odniesienia z punktem początkowym i dopasować go do każdego stosu z-stack (Rycina 5A,B). Oprogramowanie może śledzić odległość promieniową od tego układu odniesienia i eksportować ją jako wymagany zestaw danych (Rycina 5C). Rycina 6A przedstawia reprezentatywny obraz renderowania 3D sferoidu dla t = 24 h, natomiast Rycina 6B pokazuje funkcję Spots w oprogramowaniu. Przykład przetworzonych danych przedstawiono na Rycynie 7. Rycina 7A reprezentuje średnią odległość przebytą od centrum, znormalizowaną do odległości z dnia 0. Rycina 7B izoluje odległości przebyte wyłącznie w płaszczyźnie z, ponieważ jest to kierunek, który metoda PLOSMA ma za zadanie badać.
<img alt="Schemat testu migracji wznoszącej opartego na monowarstwie; wzrost komórek, aplikacja barwnika, wirowanie hydrożelu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Hodowla komórkowa i obrazowanie w teście migracji wznoszącej opartego na monowarstwie. Schemat głównych etapów przetwarzania komórek i żelu w metodzie MAMA. (A) Komórki są hodowane do osiągnięcia konfluencji przez noc, a (B) barwnik do śledzenia komórek jest dodawany tuż przed dodaniem żelu ziarnistego. Rusztowanie jest formowane poprzez (C) wirowanie płytki i stabilizowane za pomocą (D) sieciowania fotochemicznego. Obrazowanie w wielu punktach czasowych umożliwia (E) wizualizację migracji komórek w górę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej, widoki z góry i z boku wzrostu komórek w czasie 0h i 24h, analiza fluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przetwarzanie obrazów MAMA. Reprezentatywne obrazy z procesu przetwarzania obrazów. Porównanie widoku z góry i z boku surowych obrazów konfokalnych w czasie (A) t = 0 i (B) t = 24 h w kanale FITC przy powiększeniu 4x. (B) Porównanie widoku z góry i z boku przetworzonych wysokości Z pozycji komórek w czasie (C) t = 0 i (D) t = 24 h. Przetwarzanie dla 24 h obejmuje odjęcie mediany wysokości z niemigrujących komórek. Paski skali = 500 µm. Skróty: MAMA = Monolayer-based Ascending Migration Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe analizy migracji komórek; pozycja medianowa, krotność zmiany w czasie; dane statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza wyników migracji komórek MAMA. (A) Pozycja medianowa Z i odchylenie standardowe wysokości komórek w każdym powtórzeniu (n = 6) w punktach czasowych t = 0 (27.0 µm ± 1.4 µm) i t = 24 h (46.6 µm ± 10.8 µm). (B) Migracja komórek po 24 h znormalizowana do 0 h i przedstawiona jako krotność zmiany (1.8 ± 0.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat metody PLOSMA, hodowla komórkowa, warstwa MAP, sferoid komórkowy; obrazy mikroskopowe t0 i t24." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Test migracji sferoidów na zewnątrz w warstwach równoległych (PLOSMA) – hodowla komórek i obrazowanie. (ASchemat opisujący etapy warstwowania rusztowania.BMaksymalne projekcje intensywności sferoidów wykonane w 0. i 24. godzinie. Obrazy zostały wykonane poprzez konfokalna mikroskopia fluorescencyjna w kanale FITC (488 nm) przy powiększeniu 10x. Paski skali = 200 µmSkróty: PLOSMA = Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay (test migrowania sferoid na zewnątrz w warstwach równoległych). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wizualizacji objętościowej 3D przy użyciu systemu spektroskopowego; tabela danych emisyjnych; interfejs symulacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Tworzenie nowego układu odniesienia początku współrzędnych. (A) Przycisk nowej ramy odniesienia początku współrzędnych zaznaczony czerwoną ramką. (B) Nowy początek współrzędnych został ustawiony w centrum sferoidu we wszystkich trzech wymiarach. (C) Wyświetlone metryki wyjściowe to odległości powierzchni komórek od układu odniesienia początku współrzędnych, co opisuje, jak daleko komórki zmigrowały z centrum. Pasek skali = 120 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna 3D pokazująca lokalizację białek w komórkach, schemat badania obrazowania komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Renderingi 3D osadzonego sferoidu po 24 h. (A) Przetworzony sferoid w przestrzeni 3D. (B) Środek tego samego sferoidu został wyznaczony za pomocą funkcji układu odniesienia początku współrzędnych w programie IMARIS, a rozprzestrzenienie komórek zostało zakodowane kolorystycznie w zależności od odległości od punktu początkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe przebytej odległości i krotności zmiany wysokości Z; wyniki analizy statystycznej danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Przykładowe wyniki dla PLOSMA. (A) Przykładowe wyniki PLOSMA przedstawiające przebytą odległość w µm. Średnia przebyta odległość wyniosła 240.8 µm ± 36.87 µm. (B) Krotność zmiany wysokości Z (tf/t0) podczas kiełkowania sferoidów. Średnia krotność zmiany wyniosła 3.82 ± 1.495. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig07large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...

Nasze badania koncentrują się na wykorzystaniu unikalnych właściwości granulowanych hydrożeli do badania ruchu komórek i funkcji regeneracji tkanek. Odpowiedź komórki na mikrośrodowisko jest ważna dla modelowania w celu zrozumienia implikacji dla wpływu translacyjnego. Wraz ze wzrostem wykorzystania rusztowań portów 3D rośnie zapotrzebowanie na kompleksowe testy migracji 3D, które lepiej odwzorowują zachowanie komórek w środowisku gojenia się ran.Opracowaliśmy dwa trójwymiarowe procesy badawcze, od opracowania rusztowania po obrazowanie i analizę, do badania ruchu i migracji komórek in vitro. Dzięki tym dwóm nowym testom uzyskaliśmy możliwość śledzenia reagujących komórek na dwóch różnych etapach gojenia się ran: początkowej infiltracji rusztowania z tkanki masowej i ruchu komórek po otoczeniu złożonym rusztowaniem. Na początek umieść 120 000 ludzkich komórek fibroblastów skóry na centymetr kwadratowy w co najmniej sześciu dołkach na 96-dołkowej płytce.Po całonocnej inkubacji usunąć pożywkę z dołków komórkowych za pomocą aspiratora lub pipety. Dodaj barwnik w 20 mikrolitrach każdego stanu żelu do studzienek za pomocą pipety wyporowej. Używając nasadki wirówki z wirnikiem z wirnikiem ustawionym na 25 stopni Celsjusza, obracaj płytkę z prędkością 100 g przez 15 sekund z przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 8, aby spłaszczyć żel.Obróć płytkę o 180 stopni i ponownie obróć, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu na dnie studzienki. Aby aseptycznie usieciować żel, należy zastosować skupione światło o długości 365 nanometrów przez 30 sekund, aby wyżarzyć rusztowanie. Po uformowaniu wszystkich rusztowań dodaj 200 mikrolitrów pożywki do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować komórki i uchwycić ich zachowanie migracyjne. W celu analizy obrazu otwórz oprogramowanie do konwersji obrazów Imaris w celu konwersji wsadowej. Przeciągnij i upuść obrazy mikroskopowe do oprogramowania do konwersji i wybierz folder w obszarze oprogramowania, aby zaimportować pliki.Wybierz każdy plik z osobna, aby ustawić rozmiar woksela. Naciśnij Rozpocznij wszystko, aby rozpocząć konwersję. Następnie w oprogramowaniu Imaris Arena wybierz obraz z areny, aby rozpocząć przetwarzanie.Kliknij zakładkę Image Pros na głównym pasku narzędzi. Teraz kliknij menu rozwijane dla Kanał 1 i wybierz Odejmowanie tła. Naciśnij przycisk OK, aby powrócić do widoku 3D.Na małym pasku narzędzi kliknij ikonę z zaokrąglonymi niebieskimi kształtami oznaczonymi etykietą Dodaj nowe powierzchnie, aby utworzyć kartę edytowalnych obiektów o nazwie Powierzchnie 1. Ręcznie wygeneruj parametry dla wszystkich replik za pomocą przycisku z niebieską strzałką. Ustaw szczegółowość powierzchni na 0,7 mikrometra i wybierz opcję Odejmowanie tła, Kontrast lokalny.Wprowadź średnią długość komórki do średnicy największej kuli, która mieści się w polu obiektu. W przypadku progowania określ histogram intensywności, aby podzielić tylko najjaśniejsze komórki. Włącz opcję Podziel stykające się obiekty, Wzrost regionu i ustaw średnicę punktów początkowych tak, aby odpowiadała poprzednio używanej średnicy.Aby zapisać parametry tworzenia do analizy wsadowej, kliknij ikonę różdżki oznaczoną jako Tworzenie. Kliknij przycisk Zapisz parametry dla partii, nazwij plik i kliknij przycisk OK. Aby zebrać wszystkie wysokości komórek, kliknij kartę Szczegółowe. Wybierz określone wartości, a następnie pozycję Z z menu rozwijanych.Kliknij ikonę Zapisz, aby wyeksportować wszystkie pozycje Z i klasyfikacje do pliku XLS. Na początek wlej PBS na szalkę Petriego pod pokrywą laminarną i odpipetuj 20-mikrolitrowe kropelki roztworu pożywki komórkowej na odwróconą pokrywę szalki Petriego. Umieść pokrywkę z powrotem na naczyniu i inkubuj płytkę, aby uzyskać wiszące sferoidy 3D z kulturą kropelkową.Aby skonfigurować PLOSMA, użyj pipety wyporowej, aby aseptycznie dodać 15 mikrolitrów żelu do dołków przezroczystej 96-dołkowej płytki. Używając nasadki wirówki z wirnikiem do obracania płytek, obracaj płytkę z prędkością 1 000 g przez 10 sekund, aby spłaszczyć żel. Obróć płytkę o 180 stopni i ponownie obróć, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu.Następnie zastosuj skupione światło o długości 365 nanometrów przez 30 sekund, aby wyżarzyć rusztowanie i usieciować żel na zdjęciu od góry. W asepcie przesunąć szalkę Petriego z wiszącymi kropelkami do okapu do hodowli tkankowych i odwrócić pokrywkę. Za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów powoli zasysaj kroplę, aż sferoida wejdzie do końcówki pipety i wyrzuć kroplę na rusztowanie pośrodku studzienki.Inkubować płytkę studzienki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby sferoidy mogły przyczepić się do rusztowania. Po inkubacji odpipetować dodatkowe 15 mikrolitrów żelu na wierzch każdej sferoidy. Wirować płytkę o masie 300 g przez 15 sekund w każdym kierunku, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu.Wyżarzaj górną warstwę żelu przy użyciu światła ultrafioletowego, jak pokazano wcześniej. Umieść płytkę pod mikroskopem konfokalnym i zobrazuj sferoidy po wybraniu najniższej i najwyższej płaszczyzny Z. Po zaimportowaniu obrazów do oprogramowania Imaris Arena kliknij menu rozwijane dla kanału 1 i wybierz opcję Odejmowanie tła.Naciśnij przycisk OK u dołu panelu. W widoku 3D naciśnij przycisk Auto Adjust All Channels (Automatyczna regulacja wszystkich kanałów) w wyskakującym oknie Display Adjustment (Regulacja wyświetlania) i wprowadź odpowiednie poprawki. Na mniejszym pasku narzędzi kliknij ikonę Dodaj nowy układ odniesienia, aby utworzyć kartę o nazwie Układ odniesienia 1.Przesuń początek układu współrzędnych do środka sferoidy we wszystkich trzech płaszczyznach. Na tym samym pasku narzędzi kliknij ikonę z pomarańczowymi kulami, aby dodać nowe punkty, tworząc kartę o nazwie Miejsca 1, a następnie naciśnij przycisk niebieskiej strzałki, aby kontynuować. W przypadku progowania dostosuj histogram intensywności, aby podzielić na segmenty tylko najjaśniejsze części.Użyj fragmentatora, aby nawigować po stosie obrazów w celu uzyskania dokładności. Naciśnij trzykrotnie niebieską strzałkę Dalej. Usuń zaznaczenie opcji Renderuj we fragmentatorze lub kliknij ikonę żółtego kwadratu w panelu konfiguracji.Kliknij zakładkę Statystyki. Z menu rozwijanych wybierz określone wartości i odległość od układu odniesienia początku. Kliknij ikonę Zapisz.Aby zapisać wszystkie zmiany i analizy, należy kliknąć ikonę Zapisz na głównym pasku narzędzi. Metoda ta została wykorzystana do oceny infiltracji komórkowej na granicy faz tkanek. Mediana pozycji na osi Z migrujących komórek znacznie wzrosła od zera do 24 godzin, co wskazuje na zauważalny ruch komórek w pionie.Zmiana krotności migracji komórek wzdłuż osi Z podwoiła się po 24 godzinach. Komórki wysiane metodą PLOSMA wykazały znaczne rozprzestrzenianie się i migrację z rdzenia sferoidalnego po 24 godzinach. Trójwymiarowe renderingi pokazały rozległe rozproszenie komórek w rusztowaniu PLOSMA po 24 godzinach, z widocznymi projekcjami rozciągającymi się na zewnątrz.Przetworzone obrazy 3D za pomocą funkcji Spots ujawniły rozproszone pozycje komórek w rusztowaniu, co wskazuje na powszechną migrację. Komórki przebyły średnią odległość ponad 200 mikrometrów ze spójnymi wynikami we wszystkich próbkach. Zmiana fałdu na wysokości Z komórek w rusztowaniu PLOSMA wynosiła około 4, co wskazuje na znaczny ruch w górę.

quantifying-three-dimensional-cell-migration-within-into-granular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.

Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Tutaj prezentujemy system mieszanych hodowli jednowarstwowych ex-vivo do badania migracji ludzkich komórek glejaka (hGC) w czasie rzeczywistym. Model ten zapewnia możliwość obserwowania interakcji między hGC a aksonami mielinizowanymi i niemielinizowanymi w obrębie komory z przedziałami.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek ludzkiego glejaka w kokulturach aksonów i oligodendrocytów w zwoju korzenia grzbietowego

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Odkryj metody kwantyfikacji trójwymiarowej migracji komórek w granulowanych hydrożelach. Protokoły obejmują hodowlę komórek, mikroskopię konfokalną i analizę obrazu w oprogramowaniu Imaris.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Przeglądaj więcej filmów