Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Nasze badania koncentrują się na wykorzystaniu unikalnych właściwości granulowanych hydrożeli do badania ruchu komórek i funkcji regeneracji tkanek. Odpowiedź komórki na mikrośrodowisko jest ważna dla modelowania w celu zrozumienia implikacji dla wpływu translacyjnego. Wraz ze wzrostem wykorzystania rusztowań portów 3D rośnie zapotrzebowanie na kompleksowe testy migracji 3D, które lepiej odwzorowują zachowanie komórek w środowisku gojenia się ran.

Opracowaliśmy dwa trójwymiarowe procesy badawcze, od opracowania rusztowania po obrazowanie i analizę, do badania ruchu i migracji komórek in vitro. Dzięki tym dwóm nowym testom uzyskaliśmy możliwość śledzenia reagujących komórek na dwóch różnych etapach gojenia się ran: początkowej infiltracji rusztowania z tkanki masowej i ruchu komórek po otoczeniu złożonym rusztowaniem. Na początek umieść 120 000 ludzkich komórek fibroblastów skóry na centymetr kwadratowy w co najmniej sześciu dołkach na 96-dołkowej płytce.

Po całonocnej inkubacji usunąć pożywkę z dołków komórkowych za pomocą aspiratora lub pipety. Dodaj barwnik w 20 mikrolitrach każdego stanu żelu do studzienek za pomocą pipety wyporowej. Używając nasadki wirówki z wirnikiem z wirnikiem ustawionym na 25 stopni Celsjusza, obracaj płytkę z prędkością 100 g przez 15 sekund z przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 8, aby spłaszczyć żel.

Obróć płytkę o 180 stopni i ponownie obróć, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu na dnie studzienki. Aby aseptycznie usieciować żel, należy zastosować skupione światło o długości 365 nanometrów przez 30 sekund, aby wyżarzyć rusztowanie. Po uformowaniu wszystkich rusztowań dodaj 200 mikrolitrów pożywki do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować komórki i uchwycić ich zachowanie migracyjne. W celu analizy obrazu otwórz oprogramowanie do konwersji obrazów Imaris w celu konwersji wsadowej. Przeciągnij i upuść obrazy mikroskopowe do oprogramowania do konwersji i wybierz folder w obszarze oprogramowania, aby zaimportować pliki.

Wybierz każdy plik z osobna, aby ustawić rozmiar woksela. Naciśnij Rozpocznij wszystko, aby rozpocząć konwersję. Następnie w oprogramowaniu Imaris Arena wybierz obraz z areny, aby rozpocząć przetwarzanie.

Kliknij zakładkę Image Pros na głównym pasku narzędzi. Teraz kliknij menu rozwijane dla Kanał 1 i wybierz Odejmowanie tła. Naciśnij przycisk OK, aby powrócić do widoku 3D.

Na małym pasku narzędzi kliknij ikonę z zaokrąglonymi niebieskimi kształtami oznaczonymi etykietą Dodaj nowe powierzchnie, aby utworzyć kartę edytowalnych obiektów o nazwie Powierzchnie 1. Ręcznie wygeneruj parametry dla wszystkich replik za pomocą przycisku z niebieską strzałką. Ustaw szczegółowość powierzchni na 0,7 mikrometra i wybierz opcję Odejmowanie tła, Kontrast lokalny.

Wprowadź średnią długość komórki do średnicy największej kuli, która mieści się w polu obiektu. W przypadku progowania określ histogram intensywności, aby podzielić tylko najjaśniejsze komórki. Włącz opcję Podziel stykające się obiekty, Wzrost regionu i ustaw średnicę punktów początkowych tak, aby odpowiadała poprzednio używanej średnicy.

Aby zapisać parametry tworzenia do analizy wsadowej, kliknij ikonę różdżki oznaczoną jako Tworzenie. Kliknij przycisk Zapisz parametry dla partii, nazwij plik i kliknij przycisk OK. Aby zebrać wszystkie wysokości komórek, kliknij kartę Szczegółowe. Wybierz określone wartości, a następnie pozycję Z z menu rozwijanych.

Kliknij ikonę Zapisz, aby wyeksportować wszystkie pozycje Z i klasyfikacje do pliku XLS. Na początek wlej PBS na szalkę Petriego pod pokrywą laminarną i odpipetuj 20-mikrolitrowe kropelki roztworu pożywki komórkowej na odwróconą pokrywę szalki Petriego. Umieść pokrywkę z powrotem na naczyniu i inkubuj płytkę, aby uzyskać wiszące sferoidy 3D z kulturą kropelkową.

Aby skonfigurować PLOSMA, użyj pipety wyporowej, aby aseptycznie dodać 15 mikrolitrów żelu do dołków przezroczystej 96-dołkowej płytki. Używając nasadki wirówki z wirnikiem do obracania płytek, obracaj płytkę z prędkością 1 000 g przez 10 sekund, aby spłaszczyć żel. Obróć płytkę o 180 stopni i ponownie obróć, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu.

Następnie zastosuj skupione światło o długości 365 nanometrów przez 30 sekund, aby wyżarzyć rusztowanie i usieciować żel na zdjęciu od góry. W asepcie przesunąć szalkę Petriego z wiszącymi kropelkami do okapu do hodowli tkankowych i odwrócić pokrywkę. Za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów powoli zasysaj kroplę, aż sferoida wejdzie do końcówki pipety i wyrzuć kroplę na rusztowanie pośrodku studzienki.

Inkubować płytkę studzienki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby sferoidy mogły przyczepić się do rusztowania. Po inkubacji odpipetować dodatkowe 15 mikrolitrów żelu na wierzch każdej sferoidy. Wirować płytkę o masie 300 g przez 15 sekund w każdym kierunku, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu.

Wyżarzaj górną warstwę żelu przy użyciu światła ultrafioletowego, jak pokazano wcześniej. Umieść płytkę pod mikroskopem konfokalnym i zobrazuj sferoidy po wybraniu najniższej i najwyższej płaszczyzny Z. Po zaimportowaniu obrazów do oprogramowania Imaris Arena kliknij menu rozwijane dla kanału 1 i wybierz opcję Odejmowanie tła.

Naciśnij przycisk OK u dołu panelu. W widoku 3D naciśnij przycisk Auto Adjust All Channels (Automatyczna regulacja wszystkich kanałów) w wyskakującym oknie Display Adjustment (Regulacja wyświetlania) i wprowadź odpowiednie poprawki. Na mniejszym pasku narzędzi kliknij ikonę Dodaj nowy układ odniesienia, aby utworzyć kartę o nazwie Układ odniesienia 1.

Przesuń początek układu współrzędnych do środka sferoidy we wszystkich trzech płaszczyznach. Na tym samym pasku narzędzi kliknij ikonę z pomarańczowymi kulami, aby dodać nowe punkty, tworząc kartę o nazwie Miejsca 1, a następnie naciśnij przycisk niebieskiej strzałki, aby kontynuować. W przypadku progowania dostosuj histogram intensywności, aby podzielić na segmenty tylko najjaśniejsze części.

Użyj fragmentatora, aby nawigować po stosie obrazów w celu uzyskania dokładności. Naciśnij trzykrotnie niebieską strzałkę Dalej. Usuń zaznaczenie opcji Renderuj we fragmentatorze lub kliknij ikonę żółtego kwadratu w panelu konfiguracji.

Kliknij zakładkę Statystyki. Z menu rozwijanych wybierz określone wartości i odległość od układu odniesienia początku. Kliknij ikonę Zapisz.

Aby zapisać wszystkie zmiany i analizy, należy kliknąć ikonę Zapisz na głównym pasku narzędzi. Metoda ta została wykorzystana do oceny infiltracji komórkowej na granicy faz tkanek. Mediana pozycji na osi Z migrujących komórek znacznie wzrosła od zera do 24 godzin, co wskazuje na zauważalny ruch komórek w pionie.

Zmiana krotności migracji komórek wzdłuż osi Z podwoiła się po 24 godzinach. Komórki wysiane metodą PLOSMA wykazały znaczne rozprzestrzenianie się i migrację z rdzenia sferoidalnego po 24 godzinach. Trójwymiarowe renderingi pokazały rozległe rozproszenie komórek w rusztowaniu PLOSMA po 24 godzinach, z widocznymi projekcjami rozciągającymi się na zewnątrz.

Przetworzone obrazy 3D za pomocą funkcji Spots ujawniły rozproszone pozycje komórek w rusztowaniu, co wskazuje na powszechną migrację. Komórki przebyły średnią odległość ponad 200 mikrometrów ze spójnymi wynikami we wszystkich próbkach. Zmiana fałdu na wysokości Z komórek w rusztowaniu PLOSMA wynosiła około 4, co wskazuje na znaczny ruch w górę.