Name: Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj metodę analizy migracji komórek w trójwymiarowej macierzy fibrynowej do badań nad gojeniem ran. Technika ta pozwala obserwować wpływ czynników pro- i antymigracyjnych na dynamikę ruchu komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez American Heart Association (16SDG29870005) oraz North Carolina State University Research and Innovation Seed Funding.

1. Dzień 1: Przygotowanie komórek i odczynników
UWAGA: Wszystkie czynności związane z przygotowaniem komórek i odczynników powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.
<ol>
	<li>Ciepło przefiltrowane zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM), płodowa surowica bydlęca (FBS), L-glutamina i penicylina/streptomycyna w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę z ludzkich fibroblastów skórnych (HDFn) dla noworodków, uzupełniając podgrzany DMEM 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy.</li>
	<li>Rozmrozić fiolkę z zamrożonymi HDFns i odwirować przez 8 minut przy 200 x g w celu usunięcia pożywki do kriokonserwacji. Zawiesić komórki w przygotowanym pożywce HDFn o gęstości 1 x 106 komórek/ml i zasiać nasiona w kolbie hodowlanej T-75.</li>
	<li>Umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aby umożliwić namnażanie komórek.</li>
	<li>Przechowuj nośniki HDFn w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W razie potrzeby przygotuj odczynniki pro- i antymigracyjne.</li>
</ol>
2. Dzień 3: Przygotowanie sferoidów
<ol>
	<li>Wykonaj następujące czynności w okapie hodowlanym, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, odessaj pożywkę i dodaj 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Przechowywać kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby całkowicie oderwać komórki od powierzchni kolby.</li>
	<li>Dodaj 5 ml podgrzanej pożywki do kolby, aby zneutralizować trypsynę.</li>
	<li>W probówce do mikrowirówki wymieszać 10 μl błękitu trypanowego i 10 μl zawiesiny komórek.</li>
	<li>Odwirować oryginalną zawiesinę komórkową przez 8 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Podczas wirowania zawiesiny komórek dodać 10 μl zawiesiny komórek błękitu trypanowego do hemocytometru i przeprowadzić zliczanie komórek.</li>
	<li>Po odwirowaniu należy zassać pożywkę bez usuwania osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w stężeniu 1,25 x 105 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na dno 10 cm szalki Petriego, aby utrzymać nawodnione środowisko podczas wzrostu sferoidów.</li>
	<li>Odwróć pokrywkę szalki Petriego. Dodać kilka 20 μl kropli zawiesiny komórek na wewnętrzną powierzchnię pokrywki szalki Petriego.</li>
	<li>Szybko ponownie odwróć pokrywkę i umieść ją z powrotem na dnie naczynia, uważając, aby nie usunąć wiszących kropli. Rysunek 1 ilustruje pomyślnie uformowane wiszące krople.</li>
	<li>Ostrożnie umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C i pozwolić sferoidom rosnąć w wiszącej kulturze kroplowej przez okres 72 godzin.</li>
</ol>
3. Dzień 6: Osadzanie sferoid w matrycy 3D
<ol>
	<li>Wykonaj następujące czynności w okapie hodowlanym, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.</li>
	<li>Aby utworzyć pierwszą warstwę fibryny, należy utworzyć roztwór skrzepu o objętości wystarczającej do dodania 100 μl roztworu skrzepu na dowolną liczbę studzienek (1 sferoida na studzienkę). Skrzepy składają się z 10% 10-krotnego buforu HEPES objętościowo (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl2, pH 7,4), 2 mg/ml ludzkiego fibrynogenu i 0,1 U/ml ludzkiej alfa-trombiny. Pozostała objętość skrzepu składa się z ultraczystej wody.
	<ol>
		<li>Na końcu dodaj trombinę i szybko dodaj roztwór do żądanych dołków na 48-dołkowej płytce, aby zapobiec polimeryzacji skrzepów przed dodaniem do studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij/postukaj w płytkę, aby upewnić się, że mieszanina skrzepu fibryny pokrywa całą studzienkę, a następnie umieść płytkę studzienkową w inkubatorze na 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację dolnej warstwy skrzepu. Nie potrząsaj dobrze płytką wystarczająco mocno, aby wywołać tworzenie się pęcherzyków; Po prostu kołysz płytę w razie potrzeby, aż cała studnia zostanie pokryta. Jeśli używane są większe objętości skrzepów, ten krok może nie być konieczny.</li>
	<li>Przenieś sferoidy do warstwy fibryny.
	<ol>
		<li>Wyjąć z inkubatora płytkę studzienkową i szalkę Petriego zawierające sferoidy w wiszącej kulturze kropelkowej i zbadać sferoidy pod mikroskopem. Następnie umieść naczynie w okapie hodowlanym.</li>
		<li>Ostrożnie odwróć pokrywę szalki Petriego, aby umożliwić dostęp do wiszących kultur kropelkowych.</li>
		<li>Za pomocą igły 21 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml ostrożnie przenieś jedną kroplę z odwróconej pokrywki na środek każdej studzienki, uważając, aby nie przebić spolimeryzowanej warstwy fibryny pokrywającej dno studzienki. Aby skutecznie przenieść kroplę, powoli wciągnij kroplę do igły. Przerwać odciąganie tłoka do tyłu, gdy tylko cała kropla znajdzie się wewnątrz igły; Zbyt daleko cofnięte opadanie może spowodować powstawanie pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócić efektywny transfer sferoidów lub późniejsze obrazowanie.</li>
		<li>Zbadaj płytkę studzienki pod mikroskopem, aby upewnić się, że sferoidy prawidłowo przeniosły się do wszystkich pożądanych studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu utworzenia drugiej warstwy fibryny należy utworzyć kolejny roztwór skrzepu, używając tego samego preparatu, co powyżej, w celu utworzenia pierwszej warstwy fibryny (krok 3.2). Ostrożnie odpipetować 100 μl na każdą kroplę zawierającą sferoidy i ponownie zbadać pod mikroskopem, aby upewnić się, że sferoidy są nadal nienaruszone i nie zostały zepchnięte na krawędzie studzienek.</li>
	<li>Umieść płytkę studzienkową z powrotem w inkubatorze i pozwól drugiej warstwie polimeryzować przez 1 godzinę.</li>
</ol>
4. Dzień 6: Dodanie czynników promigracyjnych lub hamujących
<ol>
	<li>Podgrzej nośnik HDFn do 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj następujące czynności w okapie, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>Przygotować pożywki dla każdej grupy, w tym odpowiednie stężenia czynników pro/antymigracyjnych, które mają być oceniane.</li>
	<li>Wyjąć płytkę studzienkową z inkubatora i umieścić w kapturze hodowlanym.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywek wzorcowych do każdej studzienki kontrolnej grupy sferoidalnej, 500 μl pożywki hamującej do każdej studzienki grupy sferoidalnej hamowanej migracją i 500 μl pożywki promigracyjnej do każdej studzienki grupy sferoidalnej wzmocnionej migracją.</li>
	<li>Włożyć płytkę studzienki z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Zmieniaj nośniki co 48 godzin.</li>
</ol>
5. Dni 6-9: Ocena migracji i proliferacji komórek
<ol>
	<li>Obrazowanie sferoid za pomocą mikroskopii jasnego pola natychmiast po dodaniu pożywki (0 h), a następnie co 24 godziny przez 72 godziny. Opcjonalnie: w każdym punkcie czasowym wykonaj obraz stosu z osią Z, aby określić, czy migracja zachodzi w płaszczyznach poza głównym obszarem ostrości. Z naszego doświadczenia wynika, że tak nie jest; Warto jednak upewnić się, że tak jest w każdym eksperymencie.</li>
	<li>Użyj ImageJ, aby określić wzrost komórek w każdej studzience, analizując procentowy wzrost obszaru dla każdej sferoidy, śledząc granicę komórki dla każdej sferoidy w każdym kolejnym punkcie czasowym i używając funkcji "Zmierz", aby uzyskać powierzchnię.</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
<li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619(2015).</li>
<li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+Lead+the+Way%3A+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-00534-3_12">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li>
<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2221-3759/2/4/198">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li>
<li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+collagen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li>
<li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li>
<li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+signaling+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+REs+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li>
<li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li>
<li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots%3A+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li>
<li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin-based+biomaterials%3A+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+%28MSCs%29+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).</li>
<li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten pozwala na badanie migracji komórek w ECM związanych z gojeniem się ran za pomocą modelu 3D in vitro . Kluczowym krokiem w prawidłowym wykonaniu zabiegu jest prawidłowy rozwój sferoid fibroblastów; Stężenie komórek podczas przygotowania zostało zoptymalizowane, aby uzyskać początkowe stężenie 2500 komórek/kroplę, co pozwoliło na niezawodne tworzenie sferoid w okresie inkubacji wynoszącym 72 godziny. Jeśli użyta zostanie niewystarczająca liczba komórek, sferoidy mogą nie agregować się skutecznie i mo...

Gojenie ran to złożony proces, który prowadzi do przywrócenia integralności tkanek po urazie. Proces ten jest podzielony na cztery nakładające się na siebie etapy, obejmujące hemostazę, zapalenie, proliferację i przebudowę, z których każdy jest regulowany przez złożoną kombinację rozpuszczalnych wskazówek, interakcji komórka-matryca i komunikacji komórka-komórka. 1,2 Orkiestracja tych sygnałów kontroluje wiele reakcji komórkowych w procesie gojenia się ran, w tym, co ważne, migrację komórek. 3,4 Migracja komórek jest bardzo dynamicznym procesem, zależnym zarówno od fenotypów komórkowych, jak i biochemicznych i biofizycznych właściwości środowiska macierzy zewnątrzkomórkowej. 5 Komórki nieustannie badają środowisko swojej macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez szlaki pośredniczone przez integryny; Proces ten pozwala komórkom wyczuwać szeroki zakres właściwości matrycy, w tym topografię, sztywność i uwięzienie. Dwuwymiarowa (2D) analiza migracji komórek pokazuje, że migracja jest napędzana przez tworzenie lamellipodiów na krawędzi natarcia poprzez generowanie wiązek włókien aktynowych. Późniejsze tworzenie się zrostów ogniskowych na krawędzi natarcia, w połączeniu ze skurczem i wycofaniem napędzanym aktomiozyną na krawędzi spływu, popycha komórkę do przodu. 6 Trójwymiarowa (3D) migracja komórkowa nie jest obecnie dobrze poznana, jednak ostatnie badania pokazują, że migracja 3D jest znacznie inna niż wyżej opisany mechanizm w 2D i prawdopodobnie jest napędzana przez mechanizmy alternatywne. Na przykład ostatnie badania Petrie i wsp. wykazano, że w zależności od właściwości ECM, komórki w matrycach 3D mogą przełączać się między mechanizmami migracji sterowanymi lamellipodium i lobopodium. 7 Ponieważ migracja komórek jest kluczowym elementem reakcji na gojenie się ran, modele 3D migracji komórek są kluczowe dla zrozumienia fizjologicznych reakcji na różne bodźce podczas gojenia się ran. Chociaż wykazano, że zachowanie migracyjne komórek na powierzchniach 2D różni się znacznie od migracji w matrycach 3D, większość obecnych modeli migracji komórek in vitro podczas procesu gojenia się ran, w tym dobrze znany test zadrapań, wykorzystuje hodowle jednowarstwowe 2D. 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 Niedawno opracowane testy wykorzystywały matrycę 3D, ale nadal hodowano komórki w monowarstwie na wierzchu matrycy, ograniczając w ten sposób zdolność do prawdziwego odtworzenia trójwymiarowości środowiska komórkowego in vivo.15
Celem opisanej tutaj metody jest badanie migracji komórek w fizjologicznie istotnym modelu 3D, a nie na powierzchni 2D, w celu uzyskania dokładniejszego zrozumienia reakcji migracyjnych związanych z zastosowanymi bodźcami. Metoda ta pozwala na ocenę migracji komórek w obrębie macierzy skrzepu fibryny 3D w obecności czynników, które aktywują lub hamują szlaki związane z migracją komórek. Do tej metody wybrano matrycę fibrynową ze względu na kluczową rolę, jaką fibryna odgrywa we wczesnych stadiach gojenia się ran; Po urazie w środowisku rany tworzy się skrzep fibryny, który zapobiega utracie krwi i służy jako rusztowanie do początkowej infiltracji komórek podczas naprawy i przebudowy tkanek. 2,16,17,18,19,20 Dodatkowo, fibryna jest stosowana klinicznie jako uszczelniacz chirurgiczny, a skład uszczelniaczy został powiązany z migracją komórek i ostatecznymi wynikami gojenia. Poprzednie badanie przeprowadzone przez Coxa i wsp. Badano migrację fibroblastów ze skrzepami fibryny składającymi się z różnych stężeń fibryny i trombiny w celu optymalizacji uszczelniacza fibrynowego. W tych badaniach określono ilościowo migrację komórek z skrzepów fibryny na plastikowe naczynia. 20 Tutaj prezentujemy metodę, która pozwala na ilościowe określenie migracji komórek w środowisku fibryny 3D. Chociaż metoda opisana w tym protokole wykorzystuje fibrynę, model ten można łatwo zmodyfikować w celu wykorzystania alternatywnych materiałów matrycowych zgodnie z potrzebami, takich jak kolagen lub inne matryce 3D. Dodatkowo przedstawiamy zastosowanie sferoid fibroblastów w tym teście, ponieważ migracja fibroblastów do łożyska rany ma ogromne znaczenie dla syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej i naprawy/przebudowy tkanek. Jednak podczas procesu naprawy neutrofile są pierwszym typem komórek, który migruje do łożyska rany, a następnie makrofagi. Fibroblasty następnie zaczynają infiltrować środowisko rany po około 48 godzinach od początkowego urazu, na początku fazy proliferacyjnej procesu gojenia się rany. 19 Ten test może być łatwo zmodyfikowany tak, aby obejmował neutrofile, makrofagi lub inne typy komórek, aby ocenić, jak zmiany w strukturze skrzepów fibryny wpływają na migrację tych typów komórek. 21
Aby wdrożyć ten test, najpierw formuje się sferoidę fibroblastów przy użyciu modyfikacji wcześniej opisanych technik hodowli komórek macierzystych. 22 Sferoida fibroblastów jest następnie przenoszona do matrycy fibryny 3D, a wzrost może być łatwo monitorowany i określany ilościowo przez kilka dni. Protokół ten uwzględnia 3D systemów fizjologicznych poprzez osadzanie sferoid komórek 3D w matrycy fibryny, unikając w ten sposób ograniczeń w znaczeniu spowodowanych użyciem powierzchni wzrostu 2D z monowarstwą komórki do modelowania zachowań migracyjnych, jednocześnie umożliwiając ocenę zachowania komórek w wysoce kontrolowanym środowisku in vitro.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td>Zmodyfikowane podłoże Eagle's firmy Dulbecco<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 4,5 g/l glukozy, z pirogronianem sodu, bez L-glutaminy</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM już zawierające L-glutaminę może być również używane</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100 mm, niepoddane obróbce, sterylizowane, niepirogenne</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Naczynia o dowolnej wielkości mogą być używane do zawieszania kultur kroplowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca z krajów zatwierdzonych przez USDA, inaktywowana termicznie, sterylnie filtrowana, testowana na hodowlach komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Nie jest potrzebna w przypadku stosowania DMEM, który zawiera już L-glutaminę&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny stabilizowany, sterylnie filtrowany, z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny / ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie fibroblasty skórne, noworodkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Można zastąpić innym typem komórek zainteresowania</td></tr><tr><td>Igła 21 G x 1 1/2</td>' <td>BD&nbsp;</td><td>305167</td><td>Będą działać również igły 22 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Można używać strzykawek o dowolnej objętości</td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych, polistyren, Greiner Bio-One (pakowany indywidualnie) (48 dołków)</td><td>VWR</td><td>82051-004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki fibrynogen - plazminogen, czynnik von Willebranda i fibronektyna</td><td>Laboratoria Badawcze Enzymów</td> Zubożonych <td>FIB 3</td><td>Można zastąpić interesującym białkiem macierzy</td></tr><tr><td>Ludzkie Laboratoria Badawcze Enzymów</td><td>Alfa Trombiny</td><td>HT 1002a</td><td>Może nie być konieczne w zależności od interesującego białka matrycy</td></tr> <tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Kaptur <td></td><td></td><td></td><td>do hodowli komórkowych BSL2</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td>do hodowli komórkowych</tr><tr><td>Mikroskop odwrócony z obiektywem</td><td></td><td></td><td></td>10X</tr><tr><td>Kompatybilna z wirówką z probówkami</td><td></td><td></td><td></td> 15 ml</tr></tbody></table>

charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Obecnie, większość modeli gojenia ran in vitro, takich jak dobrze znane testy zadrapań, obejmuje badanie migracji komórek i zamykania ran na dwuwymiarowych powierzchniach. Jednak środowisko fizjologiczne, w którym zachodzi gojenie się ran in vivo, jest raczej trójwymiarowe niż dwuwymiarowe. Staje się coraz bardziej jasne, że zachowanie komórek różni się znacznie w środowiskach dwuwymiarowych i trójwymiarowych; W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na bardziej fizjologicznie istotne modele in vitro do badania zachowań migracyjnych komórek podczas zamykania ran. Opisana w niniejszym dokumencie metoda pozwala na badanie migracji komórek w trójwymiarowym modelu, który lepiej odzwierciedla warunki fizjologiczne niż dotychczas ustalone dwuwymiarowe testy zarysowania. Celem tego modelu jest ocena wzrostu komórek poprzez badanie migracji komórek z dala od ciała sferoidalnego osadzonego w macierzy fibrynowej w obecności czynników pro- lub antymigracyjnych. Za pomocą tej metody można zaobserwować wzrost komórek z ciała sferoidalnego w trójwymiarowej matrycy, który można łatwo określić ilościowo w czasie za pomocą mikroskopii jasnego pola i analizy obszaru ciała sferoidalnego. W tym systemie można również ocenić wpływ czynników promigracyjnych i/lub hamujących na migrację komórek. Metoda ta zapewnia naukowcom prostą metodę analizy migracji komórek w trójwymiarowych matrycach związanych z ranami in vitro, zwiększając w ten sposób znaczenie badań komórkowych in vitro przed zastosowaniem modeli zwierzęcych in vivo.

Kultury sferoidów mogą być wykorzystywane do skutecznej oceny wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację fibroblastów in vitro 
Trójwymiarowe sferoidy fibroblastów można formować za pomocą metody kropli wiszącej w okresie 72 h (Rycina 1). Po okresie hodowli sferoidy są osadzane w matrycy skrzepu i obrazowane za pomocą mikroskopii w jasnym polu (Rycina 2). Początkowe powierzchnie sferoidów (przedstawi...

Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.

Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu wybranych zabiegów na migrację komórek w trójwymiarowym rusztowaniu fibrynowym związanym z raną. Metoda ta może pomóc w udzieleniu kluczowych odpowiedzi w dziedzinie gojenia ran na temat tego, jak zmiany w strukturze sieci włókien wpływają na migrację komórek do skrzepów fibrynowych w miejscach zranienia; główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona prostą i powtarzalną metodę analizy migracji komórek wewnątrz skrzepów fibrynowych w 3D. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ przenoszenie sferoidów może być problematyczne.Zacznij od ogrzania fiolki z zamrożonymi ludzkimi fibroblastami skóry noworodka w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Gdy komórki zostaną rozmrożone, zbierz je poprzez wirowanie i resuspenduj osad w świeżej pożywce do ludzkich fibroblastów skóry noworodka w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml. Następnie zasiaj komórki w kolbie hodowlanej T75 i inkubuj przez 72 h w temperaturze 37 °C oraz w atmosferze 5% CO2.Gdy kultura osiągnie 80% konfluencji, odklej komórki za pomocą pięciu mililitrów trypsyny EDTA. Po pięciu minutach w temperaturze 37 °C zneutralizuj trypsynę pięcioma mililitrami ogrzanego medium, a następnie zmieszaj 40 µL komórek z błękitem trypanu w stosunku 1:1. Odstaw alikwot 10 µL komórek do zliczenia.Zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie zawiesić osad w stężeniu 1,25 x 10⁵ komórek na mililitr. Następnie na dno 10-centymetrowej szalki Petriego nalać pięć mililitrów sterylnego PBS. Po czym odwrócić pokrywkę szalki Petriego i nanieść na jej wewnętrzną powierzchnię kilka 20-mikrolitrowych kropli zawiesiny komórkowej.Po naniesieniu wszystkich kropel, ponownie przykryj szalkę pokrywką, uważając, aby nie naruszyć wiszących kropel, a następnie ostrożnie umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 72 godziny. Po zakończeniu inkubacji, do płytki 48-dołkowej dodaj 100 µL roztworu skrzepującego na każdy sferoid w każdym dołku, a następnie delikatnie potrząśnij i postukaj płytką, aby upewnić się, że mieszanina skrzepu fibrynowego pokrywa cały dołek. Umieść płytkę w inkubatorze na jedną godzinę.Po spolimeryzowaniu warstwy skrzepu, potwierdź obecność sferoidów w hodowli w wiszących kroplach pod mikroskopem świetlnym, a następnie przenieś płytkę 48-dołkową oraz szalkę z hodowlą w wiszących kroplach do komory z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie odwróć pokrywkę szalki Petriego, aby uzyskać dostęp do hodowli w wiszących kroplach, i użyj strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 21 G, aby przenieść jedną kroplę do każdego dołka pokrytego fibryną. Zachowaj szczególną ostrożność podczas aspiracji i wysiewania sferoidów, ponieważ najtrudniejszym i najbardziej krytycznym etapem procesu jest przeniesienie sferoidów bez ich zniszczenia.Obejrzyj płytkę pod mikroskopem, aby potwierdzić, że sferoidy zostały prawidłowo naniesione do odpowiednich dołków. Ostrożnie nanieś 100 µL świeżo przygotowanego roztworu skrzepu na każdą kroplę zawierającą sferoid i ponownie obejrzyj sferoidy pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są one nadal nienaruszone i znajdują się w centrum każdego dołka. Następnie umieść płytkę 48-dołkową z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić polimeryzację drugiej warstwy fibryny.Po godzinie do każdej studni należy dodać 500 µL odpowiedniego pożywki dla danej grupy eksperymentalnej sferoidów i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Obrazy sferoidów należy rejestrować za pomocą mikroskopii w polu jasnym co 24 do 72 godzin, stosując stos Z (z stack), aby zobrazować kolejne przekroje hodowli komórkowej 3D. Następnie, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu, należy obrysować krawędź każdej sferoidy w każdym kolejnym punkcie czasowym i użyć funkcji pomiaru, aby określić procentowy przyrost powierzchni każdej sferoidy.Po ich hodowli w obecności badanego czynnika pro- lub antymigracyjnego, początkowe obszary sferoidów można określić za pomocą obrazowania mikroskopowego w świetle przechodzącym i wykorzystać je jako punkt odniesienia do określenia stopnia późniejszego wyrastania komórek z ciał sferoidów w każdym kolejnym punkcie czasowym. W tym reprezentatywnym eksperymencie sferoidy poddane działaniu czynnika promigracyjnego wykazały znacząco zwiększony stopień migracji z pierwotnego ciała sferoidu w porównaniu do sferoidów poddanych działaniu czynnika hamującego migrację lub czynnika kontrolnego. I odwrotnie, sferoidy poddane działaniu czynnika antymigracyjnego wykazały znacząco zmniejszony stopień migracji z pierwotnego ciała sferoidu w porównaniu do sferoidów traktowanych kontrolnie.Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w dwie i pół godziny, nie licząc czasu hodowli komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować i osadzać sferoidy komórkowe do trójwymiarowych testów migracji komórek in vitro. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak badania histologiczne i immunohistochemiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób struktura sieci fibryny w skrzepie lub orientacja aktyny w komórkach sferoidu odpowiadają za zwiększoną lub zmniejszoną migrację komórek.Należy pamiętać, że praca z hodowlami komórkowymi i igłami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego i praca w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu peptydów na migrację komórek nabłonka oskrzeli. Metoda ta pozwala na szybkie i wysoce powtarzalne uzyskanie danych ilościowych na temat szybkości migracji komórek i zamykania ran.

Nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek

Ten artykuł opisuje metodę tworzenia ran w nabłonku żywej Clytia hemisphaerica medusa i obrazowania gojenia ran w wysokiej rozdzielczości in vivo. Dodatkowo przedstawiono technikę wprowadzania barwników i leków w celu zakłócenia procesów sygnalizacyjnych w komórkach nabłonka i macierzy zewnątrzkomórkowej podczas gojenia się ran.

Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Poznaj metodę analizy migracji komórek w trójwymiarowej macierzy fibrynowej do badań nad gojeniem ran. Technika ta pozwala obserwować wpływ czynników pro- i antymigracyjnych na dynamikę ruchu komórek.

Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Przeglądaj więcej filmów