Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro
August 16th, 2017
Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.
Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu określonych metod leczenia na migrację komórek w trójwymiarowym rusztowaniu fibrynowym związanym z raną. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran, dotyczące tego, w jaki sposób zmiany w strukturze sieci włókien wpływają na migrację komórek i skrzepy fibryny w miejscach ran, główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia prostą i powtarzalną metodę analizy migracji komórek w skrzepach fibryny w 3D. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ przenoszenie sferoid może być trudne.
Zacznij od podgrzania fiolki z zamrożonym ludzkim fibroblastem skóry noworodka w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki są właśnie rozmrożone, zbierz je przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w świeżej pożywce z fibroblastów skóry dla noworodków o stężeniu 1 x 10 do 6 komórek na mililitr. Następnie wysiewaj komórki w kolbie hodowlanej T75 na 72-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Gdy kultura osiągnie 80% konfluencji, odłącz komórki pięcioma mililitrami trypsyny EDTA. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zneutralizuj trypsynę pięcioma mililitrami podgrzanej pożywki i wymieszaj 40 mikrolitrów komórek z błękitem trypanowym w stosunku 1:1. Zarezerwuj 10 mikrolitrów podwielokrotności komórek do zliczenia.
Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w stężeniu 1,25 x 10 do 5 komórek na mililitr. Następnie pokryj dno 10-centymetrowej szalki Petriego pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Następnie odwróć pokrywkę szalki Petriego i dodaj wiele 20 mikrolitrowych kropli zawiesiny komórek na wewnętrzną powierzchnię pokrywki.
Po umieszczeniu wszystkich kropli ponownie odwróć pokrywkę na naczyniu, uważając, aby nie usunąć wiszących kropli i delikatnie umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 72 godziny. Pod koniec inkubacji dodać 100 mikrolitrów roztworu skrzepu na sferoidę na studzienkę do płytki 48-dołkowej i delikatnie wstrząsnąć i postukać w płytkę, aby upewnić się, że mieszanina skrzepów fibryny pokrywa całą studzienkę. Umieścić płytkę w inkubatorze na jedną godzinę.
Gdy warstwa skrzepu ulegnie polimeryzacji, potwierdź obecność sferoid w wiszącej kulturze kroplowej, pod mikroskopem świetlnym i przenieś 48-dołkową płytkę i wiszące naczynie do hodowli kroplowej do kaptura do hodowli komórkowej. Ostrożnie odwróć pokrywkę szalki Petriego, aby uzyskać dostęp do wiszących kultur kroplowych i użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21, aby przenieść jedną kroplę do każdej studzienki pokrytej fibryną. Zwracam szczególną ostrożność podczas zasysania i powlekania sferoid, ponieważ najtrudniejszym i najbardziej krytycznym krokiem w tym procesie jest przenoszenie sferoid bez ich niszczenia.
Zbadaj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że sferoidy zostały prawidłowo wysiane w odpowiednich studzienkach. Delikatnie nałóż 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu skrzepu na każdą kroplę zawierającą sferoidę i ponownie zbadaj sferoidy pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są one nadal nienaruszone i znajdują się w środku każdej studzienki. Następnie umieść 48-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić polimeryzację drugiej warstwy fibryny.
Po jednej godzinie potraktuj każdą studzienkę 500 mikrolitrami odpowiedniej pożywki dla odpowiedniej eksperymentalnej grupy sferoidalnej i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Uzyskuj obrazy sferoid za pomocą mikroskopii jasnego pola co 24 do 72 godzin, używając stosu z do wyświetlania kolejnych przekrojów poprzecznych hodowli komórkowej 3D. Następnie, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu, prześledź granicę komórki każdej sferoidy w każdym kolejnym punkcie czasowym i użyj funkcji pomiaru, aby uzyskać dostęp do procentowego wzrostu powierzchni dla każdej sferoidy.
Po ich hodowli, w czynniku pro lub antymigracyjnym będącym przedmiotem zainteresowania, początkowe obszary sferoidów można określić za pomocą obrazowania mikroskopowego w jasnym polu i wykorzystać jako odniesienie do określenia stopnia późniejszego wzrostu komórek z ciał sferoidalnych w każdym kolejnym punkcie czasowym. W tym reprezentatywnym eksperymencie sferoidy, które były wystawione na działanie czynnika promigracyjnego, wykazywały znacznie zwiększony stopień migracji od pierwotnego ciała sferoidalnego w porównaniu ze sferoidami wystawionymi na działanie czynnika hamującego migrację lub kontrolującego. I odwrotnie, sferoidy wystawione na działanie czynnika antymigracyjnego wykazywały znacznie zmniejszony stopień migracji od pierwotnego ciała sferoidalnego w porównaniu ze sferoidami poddanymi działaniu grupy kontrolnej.
Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu dwóch i pół godziny, z wyłączeniem czasu hodowli komórkowej, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i osadzać sferoidy komórkowe do trójwymiarowych testów migracji komórek in vitro. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak histologia i immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób struktura sieci fibryny w skrzepie lub wyrównanie aktyny w komórkach sferoidalnych odpowiada zwiększonej lub zmniejszonej migracji komórek.
Nie zapominaj, że praca z kulturami komórkowymi i igłami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego i praca w sterylnym kapturze do hodowli.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy protokół ma na celu ocenę wpływu czynników pro- i anty-migracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowym krzepnięciu fibrynowym. Dostarcza wglądu w to, jak zmiany w strukturze sieci włókien wpływają na migrację komórek w gojeniu ran.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Migracja komórek
- Gojenie ran
- Analiza macierzy fibrynowej
Tło
- Migracja komórek jest kluczowa dla gojenia ran.
- Krzepnięcia fibrynowe odgrywają znaczącą rolę w procesie gojenia ran.
- Zrozumienie wpływu różnych leczeń na migrację komórek może poprawić strategie terapeutyczne.
- Ta metoda pozwala na reproduktywalną analizę zachowania komórek w środowisku 3D.
Cel badania
- Obserwacja wpływu określonych leczeń na migrację komórek.
- Badanie, w jaki sposób zmiany strukturalne w fibrynie wpływają na ruch komórek.
- Dostarczenie wiarygodnej metody badania dynamiki komórek w 3D rusztowaniu z fibryny.
Stosowane metody
- Odtapianie świeżo urodzonych ludzkich fibroblastów skóry.
- Centrifugowanie i ponowne zawieszenie komórek w pożywce hodowlanej.
- Zasiew komórek w kolbie hodowlany T75 w celu inkubacji.
- Obserwacja migracji komórek w macierzy fibrynowym.
Główne wyniki
- Wykazano wykonalność analizy migracji komórek w 3D krzepnięciach fibryny.
- Zidentyfikowano kluczowe czynniki wpływające na ruch komórek w gojeniu ran.
- Dostarczono reproduktywalną metodę dla przyszłych badań.
- Podkreślono wyzwania, z jakimi mogą się zmierzyć nowi użytkownicy podczas przenoszenia sferydów.
Wnioski
- Protokół oferuje cenne narzędzie do badania migracji komórek.
- Zrozumienie dynamiki ruchu komórek może wpłynąć na podejście terapeutyczne.
- Dalsze badania mogą opierać się na tej metodzie, aby zbadać dodatkowe czynniki wpływające na migrację.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This 3D fibrin-based migration assay addresses the translational gap between oversimplified 2D scratch assays and physiologically relevant wound healing models. By enabling quantitative analysis of spheroid outgrowth in a fibrin matrix, it supports mechanistic de-risking of pro- and anti-migratory compounds in preclinical discovery. The method enhances predictive confidence when prioritizing targets for wound healing and fibrosis indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on cell migration pathways within a disease-relevant extracellular matrix.
- Operational Value: Provides reproducible quantification of spheroid area changes to validate migratory phenotypes.
- Predictive Value: Enables functional target de-risking by correlating compound treatment with directional cell outgrowth in 3D.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fibrin-coated wells compatible with high-content brightfield imaging and z-stack analysis.
- Quantitative Output: Delivers time-resolved percent increase in spheroid area as a measurable migration endpoint.
- Scalability: Supports multi-well plate formats for dose-response screening of migratory modulators.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models fibroblast migration in fibrin-rich wound environments, aligning with dermal repair and fibrosis pathways.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo studies by replicating key structural and biochemical cues of wound clots.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria based on migration inhibition or stimulation thresholds in a physiologic context.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for compounds modulating cell motility in tissue repair.
- Discovery Biology: Tests mechanistic effects of genetic or pharmacological perturbations on migration in a 3D matrix.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of compound effects on spheroid outgrowth over 24–72 hour intervals.
- Analytics: Provides image-based morphometric readouts (area expansion) to compare migratory responses across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro migration data to preclinical models by preserving fibrin matrix composition and cellular interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a plug-and-play platform for evaluating migratory phenotypes across cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases physiological relevance of migration assays, reducing false positives from 2D artifacts.
- Operational Value: Standardizes spheroid embedding and fibrin polymerization for inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves early prediction of compound efficacy in wound healing, lowering attrition in later stages.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of migratory targets based on quantifiable 3D responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hanging drop spheroid formation and fibrin handling.
- Depends on sterile technique and precise spheroid transfer using syringe and needle to avoid shear damage.
- Necessitates standardized brightfield microscopy and image analysis software for consistent morphometric tracing.
- Adaptation to other cell types may require optimization of spheroid size and fibrin concentration.
- Limited by the technical challenge of spheroid transfer, which affects throughput and reproducibility for novice users.
