Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu wybranych zabiegów na migrację komórek w trójwymiarowym rusztowaniu fibrynowym związanym z raną. Metoda ta może pomóc w udzieleniu kluczowych odpowiedzi w dziedzinie gojenia ran na temat tego, jak zmiany w strukturze sieci włókien wpływają na migrację komórek do skrzepów fibrynowych w miejscach zranienia; główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona prostą i powtarzalną metodę analizy migracji komórek wewnątrz skrzepów fibrynowych w 3D. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ przenoszenie sferoidów może być problematyczne.

Zacznij od ogrzania fiolki z zamrożonymi ludzkimi fibroblastami skóry noworodka w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Gdy komórki zostaną rozmrożone, zbierz je poprzez wirowanie i resuspenduj osad w świeżej pożywce do ludzkich fibroblastów skóry noworodka w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml. Następnie zasiaj komórki w kolbie hodowlanej T75 i inkubuj przez 72 h w temperaturze 37 °C oraz w atmosferze 5% CO2.

Gdy kultura osiągnie 80% konfluencji, odklej komórki za pomocą pięciu mililitrów trypsyny EDTA. Po pięciu minutach w temperaturze 37 °C zneutralizuj trypsynę pięcioma mililitrami ogrzanego medium, a następnie zmieszaj 40 µL komórek z błękitem trypanu w stosunku 1:1. Odstaw alikwot 10 µL komórek do zliczenia.

Zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie zawiesić osad w stężeniu 1,25 x 10⁵ komórek na mililitr. Następnie na dno 10-centymetrowej szalki Petriego nalać pięć mililitrów sterylnego PBS. Po czym odwrócić pokrywkę szalki Petriego i nanieść na jej wewnętrzną powierzchnię kilka 20-mikrolitrowych kropli zawiesiny komórkowej.

Po naniesieniu wszystkich kropel, ponownie przykryj szalkę pokrywką, uważając, aby nie naruszyć wiszących kropel, a następnie ostrożnie umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 72 godziny. Po zakończeniu inkubacji, do płytki 48-dołkowej dodaj 100 µL roztworu skrzepującego na każdy sferoid w każdym dołku, a następnie delikatnie potrząśnij i postukaj płytką, aby upewnić się, że mieszanina skrzepu fibrynowego pokrywa cały dołek. Umieść płytkę w inkubatorze na jedną godzinę.

Po spolimeryzowaniu warstwy skrzepu, potwierdź obecność sferoidów w hodowli w wiszących kroplach pod mikroskopem świetlnym, a następnie przenieś płytkę 48-dołkową oraz szalkę z hodowlą w wiszących kroplach do komory z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie odwróć pokrywkę szalki Petriego, aby uzyskać dostęp do hodowli w wiszących kroplach, i użyj strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 21 G, aby przenieść jedną kroplę do każdego dołka pokrytego fibryną. Zachowaj szczególną ostrożność podczas aspiracji i wysiewania sferoidów, ponieważ najtrudniejszym i najbardziej krytycznym etapem procesu jest przeniesienie sferoidów bez ich zniszczenia.

Obejrzyj płytkę pod mikroskopem, aby potwierdzić, że sferoidy zostały prawidłowo naniesione do odpowiednich dołków. Ostrożnie nanieś 100 µL świeżo przygotowanego roztworu skrzepu na każdą kroplę zawierającą sferoid i ponownie obejrzyj sferoidy pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są one nadal nienaruszone i znajdują się w centrum każdego dołka. Następnie umieść płytkę 48-dołkową z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić polimeryzację drugiej warstwy fibryny.

Po godzinie do każdej studni należy dodać 500 µL odpowiedniego pożywki dla danej grupy eksperymentalnej sferoidów i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Obrazy sferoidów należy rejestrować za pomocą mikroskopii w polu jasnym co 24 do 72 godzin, stosując stos Z (z stack), aby zobrazować kolejne przekroje hodowli komórkowej 3D. Następnie, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu, należy obrysować krawędź każdej sferoidy w każdym kolejnym punkcie czasowym i użyć funkcji pomiaru, aby określić procentowy przyrost powierzchni każdej sferoidy.

Po ich hodowli w obecności badanego czynnika pro- lub antymigracyjnego, początkowe obszary sferoidów można określić za pomocą obrazowania mikroskopowego w świetle przechodzącym i wykorzystać je jako punkt odniesienia do określenia stopnia późniejszego wyrastania komórek z ciał sferoidów w każdym kolejnym punkcie czasowym. W tym reprezentatywnym eksperymencie sferoidy poddane działaniu czynnika promigracyjnego wykazały znacząco zwiększony stopień migracji z pierwotnego ciała sferoidu w porównaniu do sferoidów poddanych działaniu czynnika hamującego migrację lub czynnika kontrolnego. I odwrotnie, sferoidy poddane działaniu czynnika antymigracyjnego wykazały znacząco zmniejszony stopień migracji z pierwotnego ciała sferoidu w porównaniu do sferoidów traktowanych kontrolnie.

Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w dwie i pół godziny, nie licząc czasu hodowli komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować i osadzać sferoidy komórkowe do trójwymiarowych testów migracji komórek in vitro. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak badania histologiczne i immunohistochemiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób struktura sieci fibryny w skrzepie lub orientacja aktyny w komórkach sferoidu odpowiadają za zwiększoną lub zmniejszoną migrację komórek.

Należy pamiętać, że praca z hodowlami komórkowymi i igłami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego i praca w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.