Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu określonych metod leczenia na migrację komórek w trójwymiarowym rusztowaniu fibrynowym związanym z raną. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran, dotyczące tego, w jaki sposób zmiany w strukturze sieci włókien wpływają na migrację komórek i skrzepy fibryny w miejscach ran, główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia prostą i powtarzalną metodę analizy migracji komórek w skrzepach fibryny w 3D. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ przenoszenie sferoid może być trudne.

Zacznij od podgrzania fiolki z zamrożonym ludzkim fibroblastem skóry noworodka w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki są właśnie rozmrożone, zbierz je przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w świeżej pożywce z fibroblastów skóry dla noworodków o stężeniu 1 x 10 do 6 komórek na mililitr. Następnie wysiewaj komórki w kolbie hodowlanej T75 na 72-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Gdy kultura osiągnie 80% konfluencji, odłącz komórki pięcioma mililitrami trypsyny EDTA. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zneutralizuj trypsynę pięcioma mililitrami podgrzanej pożywki i wymieszaj 40 mikrolitrów komórek z błękitem trypanowym w stosunku 1:1. Zarezerwuj 10 mikrolitrów podwielokrotności komórek do zliczenia.

Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w stężeniu 1,25 x 10 do 5 komórek na mililitr. Następnie pokryj dno 10-centymetrowej szalki Petriego pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Następnie odwróć pokrywkę szalki Petriego i dodaj wiele 20 mikrolitrowych kropli zawiesiny komórek na wewnętrzną powierzchnię pokrywki.

Po umieszczeniu wszystkich kropli ponownie odwróć pokrywkę na naczyniu, uważając, aby nie usunąć wiszących kropli i delikatnie umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 72 godziny. Pod koniec inkubacji dodać 100 mikrolitrów roztworu skrzepu na sferoidę na studzienkę do płytki 48-dołkowej i delikatnie wstrząsnąć i postukać w płytkę, aby upewnić się, że mieszanina skrzepów fibryny pokrywa całą studzienkę. Umieścić płytkę w inkubatorze na jedną godzinę.

Gdy warstwa skrzepu ulegnie polimeryzacji, potwierdź obecność sferoid w wiszącej kulturze kroplowej, pod mikroskopem świetlnym i przenieś 48-dołkową płytkę i wiszące naczynie do hodowli kroplowej do kaptura do hodowli komórkowej. Ostrożnie odwróć pokrywkę szalki Petriego, aby uzyskać dostęp do wiszących kultur kroplowych i użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21, aby przenieść jedną kroplę do każdej studzienki pokrytej fibryną. Zwracam szczególną ostrożność podczas zasysania i powlekania sferoid, ponieważ najtrudniejszym i najbardziej krytycznym krokiem w tym procesie jest przenoszenie sferoid bez ich niszczenia.

Zbadaj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że sferoidy zostały prawidłowo wysiane w odpowiednich studzienkach. Delikatnie nałóż 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu skrzepu na każdą kroplę zawierającą sferoidę i ponownie zbadaj sferoidy pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są one nadal nienaruszone i znajdują się w środku każdej studzienki. Następnie umieść 48-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić polimeryzację drugiej warstwy fibryny.

Po jednej godzinie potraktuj każdą studzienkę 500 mikrolitrami odpowiedniej pożywki dla odpowiedniej eksperymentalnej grupy sferoidalnej i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Uzyskuj obrazy sferoid za pomocą mikroskopii jasnego pola co 24 do 72 godzin, używając stosu z do wyświetlania kolejnych przekrojów poprzecznych hodowli komórkowej 3D. Następnie, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu, prześledź granicę komórki każdej sferoidy w każdym kolejnym punkcie czasowym i użyj funkcji pomiaru, aby uzyskać dostęp do procentowego wzrostu powierzchni dla każdej sferoidy.

Po ich hodowli, w czynniku pro lub antymigracyjnym będącym przedmiotem zainteresowania, początkowe obszary sferoidów można określić za pomocą obrazowania mikroskopowego w jasnym polu i wykorzystać jako odniesienie do określenia stopnia późniejszego wzrostu komórek z ciał sferoidalnych w każdym kolejnym punkcie czasowym. W tym reprezentatywnym eksperymencie sferoidy, które były wystawione na działanie czynnika promigracyjnego, wykazywały znacznie zwiększony stopień migracji od pierwotnego ciała sferoidalnego w porównaniu ze sferoidami wystawionymi na działanie czynnika hamującego migrację lub kontrolującego. I odwrotnie, sferoidy wystawione na działanie czynnika antymigracyjnego wykazywały znacznie zmniejszony stopień migracji od pierwotnego ciała sferoidalnego w porównaniu ze sferoidami poddanymi działaniu grupy kontrolnej.

Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu dwóch i pół godziny, z wyłączeniem czasu hodowli komórkowej, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i osadzać sferoidy komórkowe do trójwymiarowych testów migracji komórek in vitro. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak histologia i immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób struktura sieci fibryny w skrzepie lub wyrównanie aktyny w komórkach sferoidalnych odpowiada zwiększonej lub zmniejszonej migracji komórek.

Nie zapominaj, że praca z kulturami komórkowymi i igłami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego i praca w sterylnym kapturze do hodowli.