Obrazowanie żywych komórek migrujących komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie w trójwymiarowej matrycy

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach z tworzywa sztucznego. W niniejszym raporcie opisano technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek i analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej, trójwymiarowej matrycy.

Demonstracja ta ma na celu zobrazowanie fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach w matrycy 3D. Po pierwsze, wygeneruj stabilne linie komórkowe wyrażające fluorescencyjnie znakowane białka. Zasiej te komórki w matrycy kolagenowej 3D, a następnie uzyskaj obrazy poklatkowe migrujących komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Ostatecznie wyniki rzucają światło na lokalizację i dynamikę białek w migrujących komórkach poprzez obrazowanie poklatkowe i analizę FP, obserwację dynamiki i lokalizacji białek w 3D i w czasie rzeczywistym. Oferuje jedną ze sposobów odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące migracji komórek. Na przykład, w jaki sposób kontakty adhezyjne są regulowane przez białka cytoplazmatyczne?

A także w jaki sposób te kontakty są zaburzone przez określone inhibitory. W misce P 35 komórki hodowlane o płynności od 80 do 90% co transfekują komórki interesującym plazmidem za pomocą lipo 2000 zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie umieść komórki w inkubatorze.

Następnego dnia podziel komórki na dwie szalki P one 50 Petriego i inkubuj przez noc. Uzupełnij pożywkę, dodając 50 mikrogramów na mililitr G four 18. Kontynuuj hodowlę pod selekcją antybiotyków przez dwa tygodnie.

Zbadaj kulturę pod kątem kolonii odpornych na G cztery 18. Następnie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Zidentyfikuj i oznacz kolonie z dodatnim wynikiem GFP.

Umyj komórki dwukrotnie PBS. Po drugim praniu pozostaw cienką warstwę płynu, aby zapobiec wysychaniu komórek dla każdej zaznaczonej kolonii. Wytrzyj jak najbliżej krawędzi wysterylizowanym bawełnianym wacikiem i odpipetuj 10 mikrolitrów trypsyny na kolonię.

Powtórz szybko dla każdej kolonii. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu oderwania komórek. Sprawdź okrągły wygląd pod mikroskopem.

Dodaj 10 mikrolitrów trypsyny do każdej kolonii, pipetą, aby całkowicie oderwać komórki od płytki. Następnie przenieś każdą kolonię komórek do pojedynczego dołka z 24-dołkową kulturą talerzową, aby amplifikować stabilne kolonie. Następnie oceń ekspresję białek w koloniach za pomocą standardowego western blot i immunofluorescencji.

Rozwiń wybrane linie komórkowe modyfikację powierzchni szkła. Dolne naczynie zapewnia optymalne wiązanie kolagenu. Odpipetować 300 mikrolitrów roztworu siloizacyjnego na szklaną część każdej naczynia P 35 z 10-milimetrowym otworem.

Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór i przemyć przefiltrowaną wodą trzy razy przez 10 minut każdy. Usuń wodę i umieść naczynia na płycie grzejnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza na 1,5 godziny.

Umieść wierzch naczyń lekko poza naczyniem, aby umożliwić wyschnięcie. Po ostygnięciu suchych naczyń odpipetować 300 mikrolitrów 2% roztworu aldehydu glutarowego na szklaną porcję każdego naczynia. Inkubować przez godzinę, a następnie przemywać PB S3 razy przez 10 minut każdy.

Przystąp do sterylizacji naczyń przez wystawienie na działanie światła UV przez godzinę. Pierwsze granulki 100 mikrolitrów fluorescencyjnych cząstek znacznikowych przez odwirowanie. Wyrzuć ciecz i ponownie zawieś cząstki w 500 mikrolitrach pożywki.

Wykonaj pięć prań, a następnie ponownie zawieś cząstki w 30 mikrolitrach pożywki. Następnie zbierz komórki wykazujące ekspresję GFP za pomocą trypsyny i przygotuj zawiesinę 2 milionów komórek na mililitr do probówki einor Odpipetuj 240 mikrolitrów pożywki wzrostowej. Dodaj 12,6 mikrolitra jednej sterty molowej, 20 mikrolitrów przefiltrowanej wody, 50 mikrolitrów roztworu komórkowego i 10 mikrolitrów cząstek fluorescencyjnych.

Na koniec dodaj 167 mikrolitrów bydlęcego kolagenu skóry właściwej, dokładnie wymieszaj jeden roztwór. Teraz przenieś 80 mikrolitrów na szklaną część przygotowanego silosowego naczynia. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 50 minut, aby żel uległ polimeryzacji.

Następnie ostrożnie dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej. Zrównoważ komorę mikroskopu do temperatury w stanie ustalonym 37 stopni Celsjusza, uzupełnij pożywkę komórkową. Aby utrzymać neutralne pH dla obrazowania DIC, należy wymienić górną część naczynia na szklaną pokrywę z cienkim paskiem paraformu.

Przykryj bok naczynia, aby zapobiec parowaniu, aby uzyskać obiektyw zanurzeniowy w olejku. Umieść jedną kroplę płynu immersyjnego w pozycji obiektywu. Żel kolagenowy zawierający naczynie na stoliku mikroskopowym, dzięki czemu naczynie styka się z płynem zanurzeniowym.

Skoncentruj się na próbce i wyszukaj interesujące komórki do zobrazowania, aby zminimalizować dryf stołu montażowego. Pozostaw danie na około 45 minut. Przed rozpoczęciem długiego przechwytywania należy określić parametry akwizycji obrazu dla eksperymentów z dodawaniem inhibitorów.

Przygotuj uzupełnioną pożywkę z lekiem o pożądanym stężeniu roboczym. Uzupełnij pożywkę komórkową, aby utrzymać neutralne pH, ale nie uszczelniaj perfilem. Przenieś próbkę do mikroskopu i kontynuuj obrazowanie w czasie leczenia farmakologicznego.

Zatrzymaj obraz, uchwyć i ostrożnie zdejmij górną część naczynia, nie naruszając naczynia. Odessać pożywkę i odpipetować pożywkę zawierającą lek do naczynia. Następnie ostrożnie wymień naczynie.

Konfiguracja Top frap różni się w zależności od systemu. Zapoznaj się więc z instrukcją producenta. Najpierw ustaw parametry dla obrazowania żywych komórek.

Do fotowybielania. Przetestuj te parametry na komórkach treningowych, aby uzyskać wystarczającą moc lasera do fotowybielania sygnału fluorescencyjnego bez uszkadzania ogniwa. Następnie rozpocznij przechwytywanie obrazu na próbce, uzyskując co najmniej pięć klatek.

Następnie fotowybielaj obszar zainteresowania. Kontynuuj przechwytywanie w czasie odzyskiwania. Zmierz średnią intensywność fluorescencji wybielonego obszaru przed i po fotowybielaniu w czasie, korzystając z oprogramowania do analizy statystycznej.

Dopasuj krzywą odzysku do równania wykładniczego. Uzyskaj parametry połowy i końcowej intensywności z wykładniczej krzywej dopasowania. Następnie oblicz frakcję ruchomą, biorąc stosunek końcowej do początkowej intensywności fluorescencji.

Te obrazy 3D żywych komórek pokazują zdrowe komórki nabłonkowe wyrażające aktynę GFP. Po czterech dniach hodowli komórki te utworzyły torbiel w matrycy kolagenowej 3D. Niektóre komórki migrowały wzdłuż powierzchni torbieli, podczas gdy inne migrowały we wnętrzu torbieli.

Deformacja matrycy w wyniku sił trakcyjnych wywieranych przez migrujące komórki jest analizowana poprzez przemieszczenie cząstek znacznikowych osadzonych w otaczającej matrycy. Wpływ hamowania kinazy RO na siłę pociągową przedstawiono tutaj. Ruchy cząstek śledzących są wyświetlane jako maksymalny obraz projekcyjny różnych punktów czasowych, a każdy punkt czasowy jest pseudokolorowy.

Alternatywnie, obrazy pojedynczej cząstki znacznikowej są wyświetlane jako montaż, aby pokazać ruch cząstki znacznikowej. Z biegiem czasu ta cząstka znacznikowa przemieszczała się w kierunku i od krawędzi spływu migrującej komórki przed i po dodaniu odpowiednio Y 2 7 6 3 2. Analiza frap śledzi komórki wyrażające aktynę GFP podczas migracji w trójwymiarowej matrycy wskazującej na typowe odzyskiwanie fluorescencji Po eksperymencie z wybielaniem fotograficznym w zoptymalizowanych ustawieniach laserowych, intensywność fluorescencji obszaru zainteresowania jest widocznie zmniejszona w porównaniu z poziomem tła przy zachowaniu zdrowych i nieuszkodzonych komórek.

Ten wykres pokazuje dopasowanie krzywej odzysku do funkcji wykładniczej. Po opanowaniu wysiewanie komórek w macierzy może zająć godzinę. Nie zapominaj, że praca z trzema aminopropylotramitylowymi może być niezwykle niebezpieczna.

Podejmij więc środki ostrożności, takie jak praca w kapturze chemicznym. Należy również pamiętać o zachowaniu sterylnych warunków podczas pracy z komórkami w matrycy 3D.