Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Celem tej demonstracji jest obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie w żywych komórkach w macierzy 3D. Najpierw należy stworzyć stabilne linie komórkowe ekspresujące białka znakowane fluorescencyjnie. Następnie wysiać te komórki w kolagenową macierz 3D, a potem wykonać obrazy time-lapse migrujących komórek przy użyciu mikroskopu konfokalnego.

Ostatecznie wyniki te wyjaśniają lokalizację i dynamikę białek w migrujących komórkach dzięki obrazowaniu time-lapse i analizie białek fluorescencyjnych (FP), umożliwiając obserwację dynamiki i lokalizacji białek w 3D oraz w czasie rzeczywistym. Stanowi to jedną z metod odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące migracji komórek. Na przykład: w jaki sposób kontakty adhezyjne są regulowane przez białka cytoplazmatyczne?

A także w jaki sposób kontakty te są zaburzane przez specyficzne inhibitory. W naczyniu P 35 hoduj komórki przy konfluencji 80 do 90%, a następnie przeprowadź transfekcję komórek odpowiednim plazmidem, stosując lipo 2000 zgodnie z instrukcją producenta. Następnie umieść komórki w inkubatorze.

Następnego dnia przenieś komórki do dwóch szalek Petri P one 50 i inkubuj przez noc. Uzupełnij medium, dodając 50 µg/mL G four 18. Kontynuuj hodowlę w warunkach selekcji antybiotykowej przez dwa tygodnie.

Zbadaj kulturę w poszukiwaniu kolonii opornych na G four 18. Następnie, korzystając z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, zidentyfikuj i zaznacz kolonie wykazujące ekspresję GFP.

Przemyj komórki dwukrotnie roztworem PBS. Po drugim płukaniu pozostaw cienką warstwę cieczy dla każdej zaznaczonej kolonii, aby zapobiec ich wysychaniu. Przetrzyj obszar jak najbliżej krawędzi za pomocą sterylnego patyczka i nanieś pipetą 10 µL trypsyny na kolonię.

Powtórz szybko tę czynność dla każdej kolonii. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w celu odłączenia komórek. Zweryfikuj pod mikroskopem, czy komórki mają okrągły kształt.

Dodaj 10 µL trypsyny do każdej kolonii, pipetując w celu całkowitego odlepienia komórek od płytki. Następnie przenieś każdą kolonię komórek do oddzielnej studni 24-dołkowej płytki hodowlanej, aby namnożyć stabilne kolonie. Następnie oceń ekspresję białka w koloniach, wykorzystując standardowy western blot oraz immunofluorescencję.

Namnożone wybrane linie komórkowe poddaje się modyfikacji powierzchniowej szkła. Dno naczynia zapewnia optymalne wiązanie kolagenu. Należy nanieść pipetą 300 µL roztworu do sylonyzacji na szklaną część każdej szalki P 35 z otworem o średnicy 10 mm.

Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór i trzykrotnie przemyć wodą filtrowaną, płucząc przez 10 minut za każdym razem. Usunąć wodę i umieścić płytki na płycie grzewczej o temperaturze 50 °C na 1,5 godziny.

Ustawić pokrywki naczyń lekko przesunięte względem nich, aby umożliwić wyschnięcie. Po ostygnięciu wysuszonych naczyń nanieść pipetą 300 µL 2% roztworu glutaraldehydu na szklaną część każdego naczynia. Inkubować przez jedną godzinę, a następnie przemyć PBS 3 razy po 10 minut.

Następnie należy wysterylizować naczynia, naświetlając je światłem UV przez jedną godzinę. W pierwszej kolejności należy odwirować 100 µL fluorescencyjnych cząsteczek znacznika. Po odrzuceniu cieczy cząsteczki należy resuspendować w 500 µL pożywki.

Wykonaj pięć płukań, a następnie resuspenduj cząsteczki w 30 µL pożywki. Następnie zbierz komórki ekspresujące GFP przy użyciu trypsyny i przygotuj zawiesinę o stężeniu 2 milionów komórek na ml w probówce typu Eppendorf. Pipetuj 240 µL pożywki wzrostowej. Dodaj 12,6 µL 1 M HEPES, 20 µL filtrowanej wody, 50 µL roztworu komórek oraz 10 µL fluorescencyjnych cząsteczek.

Na koniec dodać 167 µL kolagenu z skóry bydlęcej, a następnie dokładnie wymieszać roztwór. Następnie przenieść 80 µL na szklaną część przygotowanej silikonizowanej foremki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut, aż żel spolimeryzuje.

Następnie ostrożnie dodaj 2 ml pożywki wzrostowej. Doprowadź komorę mikroskopu do stanu równowagi w stałej temperaturze 37 °C i uzupełnij pożywkę komórkową. Aby utrzymać neutralne pH podczas obrazowania DIC, wymień pokrywkę naczynia na szklaną z cienkim paskiem parafiny.

Przykryj bok naczynia, aby zapobiec odparowaniu przy użyciu obiektywu imersyjnego. Nanieś jedną kroplę medium imersyjnego w miejscu obiektywu. Umieść naczynie z żelem kolagenowym na stoliku mikroskopu w taki sposób, aby naczynie miało kontakt z cieczą imersyjną.

Ustaw ostrość próbki i wyszukaj komórki przeznaczone do obrazowania, aby zminimalizować dryf stolika. Pozostaw naczynie do ustabilizowania na około 45 minut. Przed rozpoczęciem długotrwałej akwizycji określ parametry pozyskiwania obrazów dla eksperymentów z dodatkiem inhibitora.

Przygotować pożywkę uzupełnioną lekiem o żądanym stężeniu roboczym. Uzupełnić pożywkę komórkową w celu utrzymania neutralnego pH, ale nie uszczelniać jej profilem. Przenieść próbkę pod mikroskop i przystąpić do obrazowania w czasie podawania leku.

Wstrzymaj obraz, uchwyć i ostrożnie zdejmij pokrywkę naczynia, nie poruszając nim. Odsuń medium i pipetą przenieś medium zawierające lek do naczynia. Następnie ostrożnie załóż pokrywkę.

Konfiguracja FRAP zależy od konkretnego systemu, dlatego należy zapoznać się z instrukcją producenta. W pierwszej kolejności należy ustawić parametry dla obrazowania żywych komórek.

Do fotowybielania. Przetestuj te parametry na komórkach treningowych, aby uzyskać moc lasera wystarczającą do fotowybielenia sygnału fluorescencyjnego bez uszkodzenia komórki. Następnie rozpocznij akwizycję obrazu próbki, rejestrując co najmniej pięć klatek.

Następnie przeprowadź fotowybielanie w obszarze zainteresowania. Kontynuuj rejestrację obrazów w czasie powrotu fluorescencji. Za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej zmierz średnią intensywność fluorescencji w obszarze poddanym fotowybielaniu przed i po tym procesie w funkcji czasu.

Dopasuj krzywą powrotu do równania wykładniczego. Wyznacz parametry czasu połowicznego oraz intensywności końcowej z krzywej dopasowania wykładniczego. Następnie oblicz frakcję mobilną, wyznaczając stosunek końcowej do początkowej intensywności fluorescencji.

Te obrazy żywych komórek w 3D przedstawiają zdrowe komórki nabłonkowe z ekspresją GFP aktyny. Po czterech dniach hodowli komórki te utworzyły cystę w trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Niektóre komórki migrowały wzdłuż powierzchni cysty, podczas gdy inne migrowały w jej wnętrzu.

Deformację macierzy wynikającą z sił trakcyjnych wywieranych przez migrujące komórki analizuje się poprzez przemieszczanie cząsteczek znacznika osadzonych w otaczającej macierzy. Przedstawiono tutaj wpływ inhibicji kinazy RO na siłę trakcyjną. Ruchy cząsteczek znacznika są wyświetlane jako obraz maksymalnej projekcji z różnych punktów czasowych, a każdy punkt czasowy jest oznaczony pseudo-kolorem.

Alternatywnie obrazy pojedynczej cząsteczki znacznika są wyświetlane w formie montażu, aby ukazać ruch tej cząsteczki. W czasie cząsteczka ta poruszała się w kierunku tylnej krawędzi migrującej komórki, a następnie oddalała się od niej, odpowiednio przed i po dodaniu Y 2 7 6 3 2. Analiza FRAP śledzi komórki wyrażające GFP actin podczas ich migracji w macierzy trójwymiarowej, wskazując typowy powrót fluorescencji. Po eksperymencie fotowybielania przy zoptymalizowanych ustawieniach lasera intensywność fluorescencji w badanym obszarze (region of interest) jest wyraźnie zmniejszona w porównaniu z poziomem tła, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i nienaruszonej struktury komórek.

Ten wykres przedstawia dopasowanie krzywej regeneracji do funkcji wykładniczej. Po opanowaniu techniki wysiewanie komórek w macierzy może zająć godzinę. Należy pamiętać, że praca z aminopropylotrimetylosilanem może być niezwykle niebezpieczna.

Należy zatem zachować środki ostrożności, takie jak praca pod dygestorium chemicznym. Należy również pamiętać o zachowaniu warunków sterylnych podczas pracy z komórkami w macierzy 3D.