Name: Obrazowanie żywych komórek migrujących komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie w trójwymiarowej matrycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę obrazowania białek znakowanych fluorescencyjnie w żywych, migrujących komórkach w trójwymiarowej matrycy kolagenowej. Technika ta pozwala wizualizować dynamikę białek w fizjologicznie relewantnym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Grantowi Sumidzie za krytyczną lekturę rękopisu. Praca ta była wspierana przez Beckman Young Investigator Award (SY), Hellman Family New Faculty Award (SY), NIH EUREKA oraz University of California Cancer Research Coordinating Committee.

1. Generowanie stabilnej linii komórkowej (np. komórek MDCK)
<ol>
	<li>Wysiać komórki w naczyniu p35 do osiągnięcia 80-90% konfluencji. Nie dopuszczać do powstania 100% konfluentnej monowarstwy, co obniżyłoby wydajność transfekcji.</li>
	<li>Przeprowadzić transfekcję komórek wybranym plazmidem przy użyciu Lipofectamine 2000. Warunki transfekcji zoptymalizować zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Następnego dnia przenieść komórki do dwóch szalek Petri p150. Zaleca się użycie dużych szalek, aby zapewnić odpowiedni odstęp między koloniami stabilnymi.</li>
	<li>Następnego dnia wymienić medium i dodać 500 μg/ml G418 do każdej szalki. Stężenie G418 należy zoptymalizować dla poszczególnych linii komórkowych.</li>
	<li>Wymieniać medium co drugi dzień przez około 2 tygodnie. Po 2 tygodniach powinny zacząć tworzyć się kolonie oporne na G418, widoczne gołym okiem.</li>
	<li>Za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego zidentyfikować kolonie dodatnie pod kątem GFP. Zaznaczyć te kolonie na szalce za pomocą pisaka permanentnego.</li>
	<li>Aby selektywnie trypsynizować kolonie z naczynia do hodowli tkankowej, odessać medium i dwukrotnie przemyć komórki PBS lub roztworem trypsyny. Podczas drugiego przemywania nie odsysać całego roztworu. Pozostawić cienką warstwę cieczy na dnie szalki, aby zapobiec wysychaniu komórek.</li>
	<li>Dla każdej zaznaczonej kolonii: użyć wysterylizowanego patyczka z watą, aby przetrzeć obszar jak najbliżej krawędzi kolonii. Stworzy to „wyspę” wilgotnego obszaru zawierającą kolonię komórek. Nanieść pipetą 10 μl trypsyny na kolonię. Powtórzyć czynność dla każdej kolonii i postępować szybko, aby uniknąć wysychania. Doświadczony badacz jest zazwyczaj w stanie wyizolować ok. 12 kolonii z szalki p150.</li>
	<li>Inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, aż komórki oddzielą się od szalki i przybiorą okrągły kształt.</li>
	<li>Dla każdej kolonii: nanieść pipetą 10 μl trypsyny na kolonię, a następnie kilka razy pipetować roztwór w górę i w dół, aby oderwać komórki od szalki. Następnie przenieść wszystkie komórki z kolonii do pojedynczego dołka w płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Po wyrośnięciu kolonii stabilnych analizuje się ekspresję białka w każdej z nich za pomocą standardowego western blotu oraz immunofluorescencji. Roznamnażać te linie komórkowe do dalszych analiz.</li>
</ol>
2. Modyfikacja powierzchni szalki z szklanym dnem dla optymalnego wiązania kolagenu (Opcjonalnie)
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić silanizację szkła, nanieś pipetą 300 μl 2% roztworu 3-aminopropylotrimetoksysilanu na szklaną część każdej szalki p35 z otworem 10 mm. Schemat silanizacji i sieciowania przedstawiono na Rysunku 1. 3-Aminopropylotrimetoksysilan jest rozpuszczony w wodzie filtrowanej.</li>
	<li>Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odsącz roztwór 3-aminopropylotrimetoksysilanu i przemyj wodą filtrowaną trzykrotnie, po 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Odsącz wodę i umieść szalki na płycie grzejnej ustawionej na 50 °C na 1,5 godziny. Połóż pokrywki szalek lekko uchylone, aby wilgoć mogła odparować z wnętrza szalki.</li>
	<li>Zdejmij szalki z płyty grzejnej i pozostaw do ostygnięcia.</li>
	<li>Nanieś pipetą 300 μl 2% roztworu glutaraldehydu na szklaną część każdej szalki. Glutaraldehyd jest rozpuszczony w PBS.</li>
	<li>Inkubuj przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odsącz roztwór glutaraldehydu i przemyj szalki PBS trzykrotnie, po 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Sterylizuj szalki poprzez naświetlanie promieniami UV przez 1 godzinę. Zsilanizowane szalki można przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie trójwymiarowego żelu kolagenowego z cząstkami znacznikowymi
<ol>
	<li>Przemyć fluorescencyjne cząsteczki znacznikowe, wirując 100 μl roztworu zapasowego cząsteczek znacznikowych (1010 particles/ml) w wirówce przy 15,000 rpm przez 5 minut, odessać ciecz i dodać 500 μl pożywki. Powtórzyć 5 razy. Po ostatnim przemyciu resuspendować cząsteczki w 30 μl pożywki.</li>
	<li>Poddać komórki wykazujące ekspresję GFP trypsynizacji w sposób rutynowy.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy do stężenia około 2 x 106 cells/ml.</li>
	<li>Pipetować 240 μl pożywki wzrostowej do probówki typu Eppendorf.</li>
	<li>Dodać 12,6 μl 1M Hepes, 20 μl filtrowanej wody, 50 μl zawiesiny komórkowej, a następnie 10 μl fluorescencyjnych cząsteczek.</li>
	<li>Na koniec dodać 167 μl roztworu kolagenu typu I z skóry bydlęcej (aby uzyskać stężenie robocze 1 mg/ml).</li>
	<li>Dokładnie wymieszać roztwór, a następnie pipetować 80 μl roztworu na szklaną część silanizowanego naczynia z szklanym dnem.</li>
	<li>Umieścić naczynie w inkubatorze i pozwolić żelowi spolimeryzować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Typowy żel kolagenowy w naczyniu p35 z szklanym dnem przedstawiono na rysunku 1A.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 2 ml pożywki wzrostowej do każdego naczynia.</li>
</ol>
4. Procedura akwizycji obrazów w odstępach czasu
<ol>
	<li>Włącz kontrolę temperatury obudowy mikroskopu i pozwól komorze mikroskopu ustabilizować się do stałej temperatury 37 °C. Przykład systemu do obrazowania żywych komórek przedstawiono na Rysunku 2.</li>
	<li>Wymień medium na nowe, uzupełnione o 25 mM Hepes w celu utrzymania neutralnego pH. W przypadku obrazowania DIC wymień górną część naczynia na taką, która posiada szklane dno. Za pomocą cienkiego paska parafilmu zakryj bok naczynia, aby zapobiec odparowywaniu medium.</li>
	<li>W przypadku zastosowania obiektywu imersyjnego naolejowego nanieś jedną kroplę płynu imersyjnego na obiektyw.</li>
	<li>Umieść naczynie zawierające żel kolagenowy na stole mikroskopu i upewnij się, że naczynie styka się z płynem imersyjnym.</li>
	<li>Ustaw ostrość próbki i wyszukaj interesujące komórki do obrazowania. Aby zminimalizować dryft stołu, pozwól naczyniu ustabilizować się przez około 45 minut przed rozpoczęciem długiej sesji akwizycji.</li>
	<li>Określ parametry akwizycji obrazu. Zminimalizuj ekspozycję laserową, która mogłaby uszkodzić komórki, modulując moc lasera, czas ekspozycji, częstotliwość oraz czas trwania akwizycji. Rzeczywiste parametry będą różnić się w zależności od systemu mikroskopowego i typu komórek.</li>
	<li>Podczas akwizycji time-lapse można dodać inhibitor. W przypadku eksperymentu z dodaniem inhibitora nie zaklejaj naczynia parafilmem.
	<ol>
		<li>Przygotuj medium uzupełnione o Hepes z lekiem w żądanym stężeniu roboczym.</li>
		<li>Przed dodaniem leku do medium wstrzymaj akwizycję obrazu i ostrożnie zdejmij górną część naczynia, nie poruszając nim.</li>
		<li>Odsuń medium z naczynia za pomocą aspiratora i pipetą dodaj do naczynia medium zawierające lek. Następnie ostrożnie załóż górną część naczynia.</li>
		<li>Próbka może stracić ostrość w wyniku dodania nowego medium; ponownie ustaw ostrość.</li>
		<li>Wznowij akwizycję, a następnie monitoruj proces przez kolejne 30 minut i w razie potrzeby ponownie koryguj ostrość. Przykład eksperymentu z dodaniem leku przedstawiono na Rysunku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Procedura i analiza FRAP
<ol>
	<li>Konfiguracja FRAP różni się w zależności od systemu; należy postępować zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Ustaw parametry obrazowania żywych komórek.</li>
	<li>Ustaw parametry fotowybielania. Użyj mocy lasera wystarczającej do fotowybielenia sygnału fluorescencyjnego bez uszkodzenia komórki. Przetestuj te parametry na komórkach próbnych.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję obrazów i zarejestruj co najmniej 5 klatek przed fotowybieleniem obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Kontynuuj akwizycję; czas regeneracji powinien być wystarczający do uchwycenia pełnego powrotu fluorescencji. Przykład eksperymentu FRAP przedstawiono na Ryc. 5.</li>
	<li>Przeanalizuj regenerację fluorescencji, mierząc średnią intensywność fluorescencji obszaru fotowybielonego (przed i po fotowybielaniu) w czasie. Używając oprogramowania do analizy statystycznej (np. Excel), dopasuj krzywą regeneracji do równania wykładniczego: I=If(1-e-kt), gdzie I to intensywność, If to intensywność końcowa, t to czas, a τ½ to czas potrzebny do osiągnięcia połowy wartości końcowej: τ½=ln(2)/k. Czas połowowy jest miarą szybkości mobilności białka.</li>
	<li>Wyznacz parametry czasu połowicznego i intensywności końcowej z krzywej dopasowania wykładniczego. Oblicz frakcję mobilną, wyznaczając stosunek końcowej do początkowej intensywności fluorescencji.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykład obrazowania żywych, zdrowych komórek nabłonkowych w macierzy przedstawiono na rysunku 3. Zdrowe komórki charakteryzują się gładką, ciągłą błoną oraz wyraźnym jądrem, podczas gdy komórki niezdrowe często mają uszkodzoną błonę i nadmierną liczbę wakuol. W macierzy 3D pojedyncze komórki nabłonkowe migrują1, a w ciągu kilku dni tworzą w niej trójwymiarowe, sferyczne, wielokomórkowe cysty2. Komórki są również bardzo dynamiczne i migrują w obrębie cysty (rysunek 3). Deformację macierzy wynikającą z sił trakcyjnych wywieranych przez migrujące komórki analizuje się poprzez przemieszczenie cząsteczek znacznika osadzonych w otaczającej macierzy (rysunek 4). Ruchy cząsteczek znacznika są przedstawione jako obraz maksymalnej projekcji z różnych punktów czasowych, a każdy punkt czasowy jest pseudo-kolorowany w celu wskazania czasu (rysunek 4B). Alternatywnie, obrazy pojedynczej cząsteczki znacznika są prezentowane w formie montażu, aby pokazać ruch cząsteczki znacznika w czasie (rysunek 4C). Cała analiza obrazu została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania ImageJ. Te jakościowe oceny deformacji macierzy, a tym samym sił wywieranych przez migrujące komórki, stanowią przydatne pierwsze przybliżenie rozkładu sił trakcyjnych. Ilościowa ocena sił trakcyjnych wywieranych przez migrujące komórki w 3D wykracza poza zakres niniejszego protokołu i jest opisana w innych publikacjach3,4.
Typowy eksperyment odzyskiwania fluorescencji po fotobleachingu przedstawiono na rysunku 5. Obszar zainteresowania musi zostać poddany fotobleachingowi przy użyciu zoptymalizowanych ustawień lasera w taki sposób, aby intensywność fluorescencji była widocznie zmniejszona w porównaniu do poziomów tła (w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu), przy jednoczesnym zachowaniu zdrowych i nieuszkodzonych komórek. Optymalne ustawienia muszą zostać określone empirycznie, ponieważ każda konfiguracja FRAP jest inna (np. FRAP z wykorzystaniem konfokalnego systemu skaningowego).
Czas ekspozycji i odstępy czasowe podczas akwizycji obrazów po FRAP muszą być starannie kontrolowane, aby uniknąć fotoblaknięcia tła. Zastosowanie mniejszej mocy lasera, krótkiego czasu ekspozycji, czułej kamery oraz wysokowydajnej optyki jest niezbędne dla uzyskania wysokiej jakości obrazowania FRAP. Jeśli fotoblaknięcie fluorescencji podczas akwizycji obrazu jest znaczące, to zanikanie tła musi zostać określone ilościowo i znormalizowane względem obserwowanej intensywności powrotu fluorescencji. Ze względu na trójwymiarowy charakter środowiska, komponent z osi z podczas powrotu intensywności fluorescencji może stać się istotny. Dlatego ważne jest zdefiniowanie objętości poddanej fotoblaknięciu poprzez wykonanie obrazów stosu 3D obszaru fotoblaknięcia przed i po procedurze. Dalsza analiza i modelowanie powrotu fluorescencji omówiono w innych opracowaniach5,6.
Wyjątkowe połączenie technik obrazowania żywych komórek: GFP do śledzenia dynamiki białek cytoszkieletu, czerwonych fluorescencyjnych cząsteczek znacznikowych do monitorowania deformacji macierzy oraz dodania inhibitorów, może być stosowane jednocześnie do analizy dynamiki białek, sił trakcyjnych i szlaków molekularnych.
<img alt="Schemat procesu powlekania kolagenem; modyfikacje chemiczne szkiełka przedmiotowego dla eksperymentów z hodowlami komórkowymi." src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przygotowanie żelu kolagenowego. A) Zpolimeryzowana matryca kolagenowa w naczyniu z szklanym dnem. Różowy kolor żelu wynika z obecności zatopionych cząsteczek fluorescencyjnych. B) Procedura obróbki naczyń z szklanym dnem w celu sieciowania żelu kolagenowego z powierzchnią szkła. Najpierw naczynie z szklanym dnem poddaje się działaniu roztworu 3-aminopropyltrimetoksysilanu, a następnie roztworu glutaraldehydu, który sieciuje matrycę kolagenową ze szkłem.
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej z układem FRAP, wiązką lasera i optyką do analizy próbek." src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat konfiguracji mikroskopu konfokalnego/FRAP. Mikroskop konfokalny bazuje na systemie Zeiss AxioObserver z kamerą CCD CoolSnap HQ II i jest całkowicie zautomatyzowany przez oprogramowanie Slidebook (Intelligent Imaging Innovations). Jednostka konfokalna została zaprojektowana na zamówienie w oparciu o jednostkę z wirującym dyskiem Yokogawa CSU10 oraz dwa lasery półprzewodnikowe (488 nm o mocy 50 mW oraz 561 nm o mocy 40 mW) z akustooptycznym filtrem przestrajalnym (AOTF), umożliwiającym przełączanie między laserami w czasie milisekund. Filtry emisyjne to 525/50 nm oraz 620/60 nm (#118661 i #118085, Chroma Technology), a lustro dichroiczne to 488-568 BrightLine Dual band (Semrock). Zastosowane obiektywy to obiektyw C-Apochromat 40x o dużej odległości roboczej z NA 1.1 i odległością roboczą 0.62 mm oraz obiektyw Plan-Apochromat 63x z NA 1.4 i odległością roboczą 0.19 mm. Mikroskop zawiera również system fotoablacji FRAP, który składa się z barwnikowego lasera pompowanego światłowodowo, komputerowo sterowanej pozycji i intensywności wiązki oraz ograniczonej dyfrakcyjnie wielkości plamki. Ponadto mikroskop jest wyposażony w zmotoryzowany stół x-y z enkoderami liniowymi o rozdzielczości 0.1 mikrona na każdej osi. Podczas obrazowania time-lapse temperatura otoczenia jest utrzymywana za pomocą specjalnie zaprojektowanej komory mikroskopowej i grzałki z układem sprzężenia zwrotnego kontroli temperatury. Aby wyeliminować szum i wibracje, cały system mikroskopowy został umieszczony na stole antywibracyjnym.
<img alt="Mikroskopia time-lapse, etapy podziału komórki, fluorescencja, analiza dynamiczna, obserwacja naukowa." src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Obrazowanie żywych komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję GFP-aktyny. Komórki te utworzyły cystę po 4 dniach hodowli w trójwymiarowej matrycy kolagenowej. Niektóre komórki poruszają się wzdłuż powierzchni cysty (żółta grot strzałki), podczas gdy inne migrują wewnątrz cysty (czerwona grot strzałki). Pasek skali 10 μm, czas podany w godzinach.
<img alt="Proces podziału komórki na obrazach mikroskopowych; znakowanie fluorescencyjne; konfiguracja eksperymentu z Y27632." src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wpływ inhibicji kinazy Rho na siłę trakcyjną. A) Obraz DIC migrującej komórki MDCK wykazującej ekspresję jądrowego markera z tagiem GFP. Obraz wykonano bezpośrednio przed podaniem inhibitora kinazy Rho Y-27632. Pasek skali 10 μm. B) Przesunięcie cząsteczek wynikające z dodania Y-27632. Pozycje cząsteczek w różnych punktach czasowych (0 - 52 min) zostały pseudo-pokolorowane zgodnie ze skalą intensywności, a następnie rzutowane na jeden obraz. Biały obszar to jądro dodatnie pod kątem GFP w migrujących komórkach. Pasek skali 10 μm. Czas w minutach. C) Ruch cząsteczek przy krawędzi tylnej komórki (patrz strzałka w B). Gwiazdka oznacza ostatnią klatkę zarejestrowaną przed dodaniem Y-27632. Cząsteczka znacznika poruszała się w kierunku krawędzi tylnej migrującej komórki przed dodaniem Y-27632 oraz oddalała się od niej po jego dodaniu. Pasek skali 1 μm.
<img alt="Sekwencyjne obrazy mózgu i wykres intensywności pokazujące fotoblaknięcie w czasie w badaniu fluorescencyjnym." src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Analiza FRAP komórki migrującej w macierzy trójwymiarowej, wykazującej ekspresję GFP-aktyny. A) Obrazy z lapse-time komórki wykazującej ekspresję GFP-aktyny przed i po fotoblaknięciu. Mały obszar GFP-aktyny nagromadzonej w tylnej części komórki został poddany fotoblaknięciu (czerwona strzałka) w punkcie czasowym 0. Czas w sekundach, pasek skali 5 μm. B) Średnia intensywność fluorescencji obszaru poddanego fotoblaknięciu (linia ciągła) oraz dopasowanie wykładnicze powrotu fluorescencji (kółka) przedstawione w funkcji czasu. Intensywność fluorescencji znormalizowano do wartości początkowej przed fotoblaknięciem.

<ol><li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li>
<li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li>
<li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li>
<li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
<li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania obrazowania żywych komórek do badania mechanizmów migracji komórek w macierzy trójwymiarowej. Skuteczność tej techniki zależy od uzyskania „dobrych” klonów stabilnie eksponujących białka znakowane GFP. Niski poziom białek GFP wymaga nadmiernej ekspozycji na wzbudzenie, co pogarsza stan zdrowia komórek, natomiast zbyt wysoki poziom GFP wywołuje niepożądane skutki uboczne w komórce. W związku z tym istotny jest wybór wektora do transfekcji genów do komórek (np. promot...

<table><tbody><tr><td>Kolagen wołowy, typ I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td>Roztwór stokowy ok. 3 mg/ml</td></tr><tr><td>3-aminopropylotrimetoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Rozcieńczyć w wodzie</td></tr><tr><td>glutaraldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td>Rozcieńczyć w PBS</td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery polistyrenowe Fluospheres 1 &amp;mu;m, fluorescencja czerwona (580/605)</td><td>Invitrogen</td><td>F13083</td><td></td></tr><tr><td>Geneticyna (G418)</td><td>Invitrogen</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S115500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15160-054</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Tradycyjnie migrację komórek badano na sztywnych, dwuwymiarowych powierzchniach plastikowych. Jednak podczas istotnych procesów biologicznych, takich jak gojenie ran, regeneracja tkanek czy przerzuty nowotworowe, komórki muszą przemieszczać się przez złożoną, trójwymiarową macierz zewnątrzkomórkową. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy stojące za tymi procesami biologicznymi, ważne jest zbadanie roli białek odpowiedzialnych za napędzanie migracji komórek. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół badania mechanizmów migracji komórek z wykorzystaniem linii komórek nabłonkowych (MDCK) oraz trójwymiarowej, włóknistej, samopolimeryzującej się macierzy jako układu modelowego. Ta optycznie przejrzysta macierz zewnątrzkomórkowa łatwo nadaje się do badań obrazowania żywych komórek i lepiej naśladuje fizjologiczne środowisko tkanek miękkich. Niniejsze opracowanie prezentuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji i dynamiki białek oraz odkształceń otaczającej trójwymiarowej macierzy.
Badanie lokalizacji i dynamiki białek podczas procesów komórkowych dostarcza kluczowych informacji na temat funkcji białek. Genetycznie kodowane znaczniki fluorescencyjne stanowią unikalną metodę obserwacji lokalizacji i dynamiki białek. Dzięki tej technice możemy w czasie rzeczywistym analizować subkomórkową akumulację kluczowych, generujących siłę komponentów cytoszkieletu podczas przemieszczania się komórki przez macierz. Dodatkowo, wykorzystując wiele znaczników fluorescencyjnych o różnych długościach fal, możemy jednocześnie badać lokalizację wielu białek, co pozwala nam sprawdzić na przykład, czy różne białka pełnią podobne czy odmienne role. Ponadto dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie można ilościowo określić za pomocą analizy fluorescencyjnego odzyskiwania po fotoblaknięciu (FRAP). Pomiar ten pozwala ocenić mobilność białek oraz stabilność ich wiązania z siecią cytoszkieletu.
Łącząc obrazowanie żywych komórek z zastosowaniem inhibitorów funkcji białek, możemy w czasie rzeczywistym badać zmiany w rozmieszczeniu białek oraz morfologii migrujących komórek. Ponadto łączymy obrazowanie żywych komórek z użyciem fluorescencyjnych cząsteczek znacznikowych osadzonych w macierzy, aby wizualizować odkształcenia macierzy podczas migracji komórek. Dzięki temu możemy zaobserwować, w jaki sposób migrująca komórka rozmieszcza białka generujące siłę i w których miejscach siły trakcyjne są przykładane do otaczającej macierzy. Stosując te techniki, możemy uzyskać cenne informacje na temat roli konkretnych białek i ich udziału w mechanizmach migracji komórek.

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Tradycyjnie migrację komórek badano na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Jednak w trakcie istotnych procesów biologicznych, takich jak gojenie ran...

Celem niniejszej demonstracji jest obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie w żywych komórkach w macierzy 3D. W pierwszej kolejności należy wytworzyć stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie. Następnie komórki te należy wysiać w kolagenową macierz 3D, a następnie zarejestrować obrazy time-lapse migrujących komórek przy użyciu mikroskopu konfokalnego.Ostatecznie wyniki rzucają światło na lokalizację i dynamikę białek w migrujących komórkach za pomocą obrazowania time-lapse i analizy FP, umożliwiając obserwację dynamiki i lokalizacji białek w 3D oraz w czasie rzeczywistym. Stanowi to jedną z dróg do udzielenia odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące migracji komórek. Na przykład: w jaki sposób kontakty adhezyjne są regulowane przez białka cytoplazmatyczne?Oraz w jaki sposób kontakty te są zaburzane przez specyficzne inhibitory. W szalce P 35 hoduj komórki przy konfluencji od 80 do 90%, a następnie przeprowadź transfekcję komórek wybranym plazmidem z użyciem lipo 2000 zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie umieść komórki w inkubatorze.Następnego dnia przenieś komórki do dwóch szalek Petri P one 50 i inkubuj przez noc. Uzupełnij medium, dodając 50 µg/mL G four 18. Kontynuuj hodowlę w warunkach selekcji antybiotykowej przez dwa tygodnie.Zbadaj kulturę pod kątem obecności kolonii opornych na G four 18. Następnie, korzystając z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, zidentyfikuj i zaznacz kolonie wykazujące ekspresję GFP.Przemyć komórki dwukrotnie PBS. Po drugim przemyciu pozostawić cienką warstwę płynu w obrębie każdej zaznaczonej kolonii, aby zapobiec ich wyschnięciu. Przetrzeć obszar jak najbliżej krawędzi za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego, a następnie nanieść pipetą 10 µL trypsyny na kolonię.Powtórz szybko tę czynność dla każdej kolonii. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w celu odspojenia komórek. Zweryfikuj pod mikroskopem, czy komórki mają okrągły kształt.Nanieś 10 µL trypsyny na każdą kolonię, a następnie pipetuj, aby całkowicie odseparować komórki od płytki. Następnie przenieś każdą kolonię komórek do pojedynczej studni 24-dołkowej płytki hodowlanej w celu namnożenia stabilnych kolonii. W kolejnym kroku oceń ekspresję białka w koloniach, stosując standardowy western blot oraz immunofluorescencję.Namnożyć wybrane linie komórkowe, modyfikując powierzchnię szkła. Dno naczynia zapewnia optymalne wiązanie kolagenu. Nanieść pipetą 300 µL roztworu do sylilizacji na szklaną część każdego naczynia P 35 z otworem 10 mm.Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór i przemyć wodą filtrowaną trzykrotnie przez 10 minut w każdym cyklu. Usunąć wodę i umieścić szalki na płycie grzejnej o temperaturze 50 °C na 1,5 godziny.Ustaw pokrywki naczyń lekko przesunięte względem nich, aby umożliwić wysychanie. Po ostygnięciu wysuszonych naczyń pipetuj 300 µL 2% roztworu glutaraldehydu na szklaną część każdego naczynia. Inkubuj przez jedną godzinę, a następnie przemyj PBS 3 razy po 10 minut.Następnie wysterylizuj szalki, naświetlając je światłem UV przez jedną godzinę. W pierwszej kolejności odwiruj 100 µL fluorescencyjnych cząsteczek znacznika w celu uzyskania osadu. Odlej ciecz i resuspenduj cząsteczki w 500 µL pożywki.Przeprowadź pięć przemyć, a następnie resuspenduj cząsteczki w 30 µL pożywki. Następnie zbierz komórki wykazujące ekspresję GFP za pomocą trypsyny i przygotuj zawiesinę o stężeniu 2 milionów komórek na ml w probówce typu Eppendorf. Odmierz pipetą 240 µL pożywki wzrostowej. Dodaj 12,6 µL HEPES o stężeniu 1 M, 20 µL filtrowanej wody, 50 µL roztworu komórek oraz 10 µL cząsteczek fluorescencyjnych.Na koniec należy dodać 167 µL kolagenu z skóry bydlęcej i dokładnie wymieszać roztwór. Następnie przenieść 80 µL na szklaną część przygotowanej szalki sylikonizowanej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut, aby żel uległ polimeryzacji.Następnie ostrożnie dodaj 2 mL pożywki wzrostowej. Doprowadź komorę mikroskopu do stanu równowagi w stałej temperaturze 37 °C, uzupełniając pożywkę komórkową. Aby utrzymać neutralne pH podczas obrazowania DIC, wymień pokrywkę szalki na szklaną z cienkim paskiem parafiny.Przykryj bok szalki, aby zapobiec odparowywaniu w przypadku użycia obiektywu imersyjnego. Nanieś jedną kroplę cieczy imersyjnej w miejscu styku z obiektywem. Umieść szalkę z żelem kolagenowym na stoliku mikroskopu w taki sposób, aby szalka miała kontakt z cieczą imersyjną.Ustaw ostrość próbki i wyszukaj komórki przeznaczone do obrazowania, aby zminimalizować dryft stolika. Pozostaw naczynie na około 45 minut w celu stabilizacji. Przed rozpoczęciem długiego procesu rejestracji określ parametry akwizycji obrazu dla eksperymentów z dodatkiem inhibitora.Przygotować pożywkę uzupełnioną lekiem o pożądanym stężeniu roboczym. Odnowić pożywkę komórkową w celu utrzymania neutralnego pH, ale nie zamykać jej za pomocą Perfilu. Przenieść próbkę pod mikroskop i przystąpić do obrazowania w momencie podania leku.Zatrzymaj obraz, uchwyć i ostrożnie zdejmij pokrywkę naczynia, aby nie poruszyć jego zawartości. Odessij pożywkę i pipetuj pożywkę zawierającą lek do naczynia. Następnie ostrożnie załóż pokrywkę z powrotem.Konfiguracja FRAP w górnej części urządzenia różni się w zależności od systemu. Należy zatem zapoznać się z instrukcją producenta. W pierwszej kolejności należy ustawić parametry obrazowania żywych komórek.Do fotowybielania. Należy przetestować te parametry na komórkach próbnych, aby dobrać odpowiednią moc lasera, która pozwoli na fotowybielenie sygnału fluorescencyjnego bez uszkodzenia komórki. Następnie należy rozpocząć przechwytywanie obrazu próbki, rejestrując co najmniej pięć klatek.Następnie przeprowadź fotowybielanie obszaru zainteresowania. Kontynuuj rejestrację obrazów w czasie powrotu fluorescencji. Za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej zmierz średnią intensywność fluorescencji w obszarze poddanym fotowybielaniu przed i po zabiegu w funkcji czasu.Dopasuj krzywą regeneracji do równania wykładniczego. Wyznacz parametry czasu połowicznego oraz intensywności końcowej z dopasowanej krzywej wykładniczej. Następnie oblicz frakcję mobilną, wyznaczając stosunek końcowej do początkowej intensywności fluorescencji.Te obrazy żywych komórek w 3D przedstawiają zdrowe komórki nabłonkowe wykazujące ekspresję GFP aktyny. Po czterech dniach hodowli komórki te utworzyły torbiel w trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Niektóre komórki migrowały wzdłuż powierzchni torbieli, podczas gdy inne migrowały wewnątrz niej.Deformację macierzy wynikającą z sił trakcyjnych wywieranych przez migrujące komórki analizuje się poprzez przemieszczenie cząstek znacznika osadzonych w otaczającej macierzy. Przedstawiono tutaj wpływ inhibicji kinazy RO na siłę trakcyjną. Ruchy cząstek znacznika wyświetlane są jako obraz maksymalnej projekcji z różnych punktów czasowych, przy czym każdy punkt czasowy jest oznaczony pseudokolorem.Alternatywnie obrazy pojedynczej cząsteczki znacznika są prezentowane w formie montażu, aby ukazać ruch tej cząsteczki. W czasie ta cząsteczka znacznika przemieszczała się w stronę i oddalała od krawędzi tylnej migrującej komórki odpowiednio przed i po dodaniu Y 2 7 6 3 2. Analiza FRAP śledzi komórki wykazujące ekspresję GFP actin podczas ich migracji w macierzy trójwymiarowej, co wskazuje na typowy powrót fluorescencji. Po eksperymencie fotowybielania przy zoptymalizowanych ustawieniach lasera intensywność fluorescencji w obszarze zainteresowania jest widocznie zmniejszona w porównaniu z poziomem tła, przy jednoczesnym zachowaniu zdrowia i nienaruszonej struktury komórek.Wykres ten przedstawia dopasowanie krzywej regeneracji do funkcji wykładniczej. Po opanowaniu techniki, wysiew komórek w macierzy może zająć godzinę. Należy pamiętać, że praca z aminopropylotrimetylosilanem może być niezwykle niebezpieczna.Należy zatem podjąć środki ostrożności, takie jak praca w dygestorium chemicznym. Pamiętaj również o zachowaniu warunków sterylnych podczas pracy z komórkami w matrycy 3D.

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obrazowanie komórek in vivo migrujących komórek ekspresujących białka znaczone fluorescencyjnie w trójwymiarowym macierzy

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Poznaj metodę obrazowania białek znakowanych fluorescencyjnie w żywych, migrujących komórkach w trójwymiarowej matrycy kolagenowej. Technika ta pozwala wizualizować dynamikę białek w fizjologicznie relewantnym środowisku.

Obrazowanie żywych komórek migrujących komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie w trójwymiarowej matrycy (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Przeglądaj więcej filmów