Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Pierwszym raportem jest to, że bardzo ważne jest dokładne zlokalizowanie określonego obszaru częstotliwości błony podstawnej w większości modeli, w których zmienia się liczba synaps i można analizować ich funkcję. Lokalizacja ślimakowa określonych obszarów częstotliwości jest niezawodnie wykonywana przy użyciu map częstotliwości miejsc w połączeniu z danymi z ślimaka. Mikroskop zapewnia wgląd w kilka badań naukowych.

Potwierdza to pogląd, że neuropatia ślimakowa jest głównym początkowym zdarzeniem poprzedzającym utratę słuchu, szumy uszne i nadwrażliwość słuchową. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u znieczulonej ośmiotygodniowej dorosłej myszy męskiej C57 black 6J. Umieść mysz na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w pomieszczeniu ekranowanym elektrycznie i akustycznie.

Następnie umieść podskórną elektrodę rejestrującą igłę o średnicy 20 milimetrów i rozmiarze 28 pod skórą na wierzchołku czaszki na głębokości trzech milimetrów. Elektroda referencyjna w okolicy ipsilateralnej ślinianki przyusznej, poniżej małżowiny usznej mierzonego ucha i elektroda masowa w okolicy ślinianki przyusznej po przeciwnej stronie. Umieść obok myszy głośnik polowy z zamkniętą osłoną terenową wyposażoną w dwucentymetrową plastikową rurkę z końcówką w kształcie stożka i włóż końcówkę do zewnętrznego kanału słuchowego.

Aby uzyskać słuchową odpowiedź pnia mózgu lub nagranie ABR, generuj pipsy tonów przy zmniejszających się poziomach ciśnienia akustycznego od 90 do 10 decybeli, w krokach co pięć do 10 decybeli poziomu ciśnienia akustycznego. Na tym etapie odpowiedzi są wzmacniane, filtrowane i uśredniane. Przy każdej częstotliwości należy określić próg ABR, który jest minimalnym poziomem ciśnienia akustycznego, który zapewnia wiarygodny zapis ABR z jedną lub kilkoma rozróżnialnymi falami, które można wyraźnie zidentyfikować za pomocą oględzin.

Po nagraniu ABR odsłoń pęcherz od strony brzusznej i otwórz pęcherz ostrymi nożyczkami, aby uzyskać dostęp do ślimaka. Za pomocą cienkich kleszczy usuń kości skroniowe i przetnij tętnicę strzemiączka. Następnie usuń strzemiączko z okienka owalnego i rozerwij okrągłą błonę okienną.

Delikatnie obróć końcówkę igły o rozmiarze 13 mm i rozmiarze 27, aby zrobić mały otwór na wierzchołku ślimaka, a następnie użyj pipety z cienką końcówką, aby delikatnie przepłukać 4% paraformaldehydu przez okienko do przestrzeni perylimfatycznych. Następnie opłucz kości trzy razy przez pięć minut na mycie zimnym świeżym 0,1 molowym PBS na pranie. Następnie następuje odwapnienie kości za pomocą 10% EDTA przez cztery godziny w temperaturze pokojowej i 20 obrotów na minutę na poziomym wytrząsarce.

Pod koniec inkubacji przenieść odwapnioną kość skroniową do świeżego 0,1-molowego PBS pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj 3 i 5 kleszczyków Dumonta i igły o rozmiarze 27, aby kolejno wypreparować wierzchołkowe, środkowe i podstawowe obszary ślimaka. Użyj żyletki, aby wykonać małą serię nacięć wzdłuż więzadła spiralnego i usunąć membranę tektorialną i błonę Reissnera.

Następnie należy rozbić pozostały nabłonek słuchowy, w tym rąbek spiralny, na poszczególne zwoje ślimaka w celu przygotowania całego wierzchowca. Następnie użyj obiektywu olejowego 40X w mikroskopie świetlnym, aby zmierzyć długość błony podstawnej za pomocą skali 250 mikrometrów umieszczonej w okularze. Można go regulować wzdłuż stereorzęsek wewnętrznych komórek rzęsatych.

Po rozbiorze umieść każdy obrót ślimaka w osobnych probówkach wirówkowych o pojemności 2,5 mililitra. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania z 10% kozią surowicą w PBS w 0,1% Triton X-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Pod koniec inkubacji użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby usunąć roztwór pod mikroskopem preparacyjnym.

Inkubować próbki z podstawowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej i PBS w 0,1% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na rotatorze. Następnego ranka przepłucz próbki tkanek trzy razy przez pięć minut zimnym 0,1 molowym PBS na przemycie, aby usunąć wszelkie pozostałości przeciwciał pierwszorzędowych. Następnie oznaczyć próbki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej w PBS w 0,1% Triton X-100 przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej na rotatorze, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji przemyć próbki trzykrotnie 0,1-molowym PBS, jak pokazano, i przenieść próbki na indywidualne 35-milimetrowe płytki zawierające 0,1-molowy PBS. Umieść kroplę podłoża montażowego uzupełnionego DAPI na szkiełku podstawowym i przenieś próbki z PBS na podłoże montażowe. Umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na każdym szkiełku i zwolnij, aby szkiełka nakrywkowe delikatnie opadły.

Następnie wysusz szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby zobrazować próbki, użyj mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi laserami i soczewką olejową o wysokiej rozdzielczości 63X, aby uzyskać osiem mikrometrowych stosów konfokalnych Z z każdego obrotu ślimaka. W przypadku zliczania punktów synaptycznych ustaw stosy Z z krokiem o wielkości 0,3 mikrometra tak, aby obejmowały całą długość wewnętrznych komórek rzęsatych, zapewniając, że wszystkie punkty synaptyczne mogą być obrazowane i połącz obrazy zawierające puncta w stos Z, aby uzyskać projekcję dostępu Z.

Zaimportuj scalone obrazy do odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów. Podziel całkowitą liczbę synaps w każdym stosie Z w określonych regionach częstotliwości przez liczbę dodatnich wewnętrznych komórek rzęsatych DAPI, aby obliczyć liczbę punktów synaptycznych dla każdej komórki. W każdym określonym obszarze częstości uśrednij wszystkie punkty synaptyczne na trzech obrazach różnych mikroskopijnych pól, zawierających od dziewięciu do 11 wewnętrznych komórek rzęsatych.

Aby lepiej zobrazować architekturę cytoszkieletu i lokalizację synaptyczną, użyj narzędzia pędzelka, aby wizualnie ocenić strukturę synaptyczną i rozmieszczenie poszczególnych wewnętrznych komórek rzęsatych. Aby sprawdzić zestawienie wstążek presynaptycznych i plam receptorów postsynaptycznych, użyj narzędzia do zaznaczania prostokątnego, wyodrębnij przestrzeń woksela wokół wstążek i użyj cięcia obrazu, aby wyizolować poszczególne wstęgi. Następnie kliknij obraz i rozmiar obrazu, aby uzyskać tablicę miniatur tych miniaturowych projekcji, których można użyć do identyfikacji sparowanych synaps i sierocych wstążek.

Wszystkie dziesięć myszy w tym reprezentatywnym eksperymencie wykazywało progi ABR w odpowiedzi na wybuchy tonów w zakresie od 25 do 70 decybeli na poziom ciśnienia akustycznego, w zależności od częstotliwości bodźca. Próg słyszenia w tym eksperymencie był najniższy i wynosił 16 kiloherców, co odpowiada około 43% odległości od wierzchołka ślimaka, co sugeruje, że wrażliwość akustyczna jest znacznie zmniejszona w innych obszarach ślimaka. Całe mocowania nabłonka słuchowego są preparowane na trzy części, a długości są mierzone i przeliczane na ich procentową odległość od wierzchołka ślimaka.

Położenie częstotliwości na błonie podstawnej każdego skrętu ślimaka oblicza się za pomocą funkcji logarytmicznej. W normalnych uszach dorosłych myszy barwienie immunologiczne ujawnia zestawione ze sobą pary wstążek synaptycznych i plastrów receptora glutaminianu. Badanie powierzchni błony podstawno-bocznej wewnętrznych komórek rzęsatych, z ośmioma do 20 parami na komórkę.

Chociaż zdecydowana większość puncta pojawia się jako zestawione pary w normalnych uszach, sieroce wstążki są rzadko obserwowane przy dużych powiększeniach. Liczba wewnętrznych synaps wstęgowych komórek rzęsatych jest najwyższa w obszarze 16 kiloherców i znacznie zmniejsza się wraz ze wzrostem odległości od tego miejsca. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas tej procedury, jest to, że należy zagwarantować integralność błony podstawnej ślimaka.

Musimy kłaść nacisk na dokładność, dopóki nie osiągniemy biegłości technicznej. Po tej procedurze można przeprowadzić terapię genową, aby odpowiedzieć na pytanie, czy neuropatia ślimakowa może zostać naprawiona za pomocą tego środka. Miara ta jest szerszą techniką badania neuropatii ślimakowej, która, jeśli pierwotne zdarzenia początkowe wiążą się z utratą słuchu, szumem w uszach i nadwrażliwością słuchową.