Name: Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę oceny morfologii i funkcji synaps wstęgowych w ślimaku myszy C57BL/6J. Protokół obejmuje rejestrację odpowiedzi pnia mózgu, preparowanie histologiczne i mikroskopię konfokalną do analizy zmian synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81770997, 81771016, 81830030); wspólny projekt finansowania Pekińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych i Pekińskiego Komitetu Edukacji (KZ201810025040); Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (7174291); oraz Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (2016M601067).

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NRC/ILAR dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (8. edycja). Protokół badania został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Pekinie w Chinach.
1. Selekcja zwierząt
<ol>
	<li>Do wszystkich eksperymentów użyj dorosłych samców myszy C57BL/6J (w wieku 8 tygodni) jako modelu zwierzęcego. 
	nuta: Myszy C57BL/6J noszące wariant splicingu Cdh23 wykazują przyspieszone starzenie się układu słuchowego, co objawia się 40% utratą synaps wstęgowych w podstawowym zwoju ślimaka i 10% utratą środkowego obrotu w wieku 6 miesięcy, po czym następuje szybki wzrost tej utraty w całym ślimaku wraz z wiekiem18, 19. Dlatego zalecamy ostrożność podczas używania myszy C57BL/6J starszych niż 6 miesięcy do badań słuchowych. Inne szczepy myszy mogą być używane w zależności od określonych celów eksperymentalnych.</li>
	<li>Sprawdź myszy za pomocą profesjonalnego diagnostycznego otoskopu kieszonkowego, aby wykluczyć patologie ucha zewnętrznego lub środkowego przed oceną słuchu. Potencjalne objawy mogą obejmować płyn lub ropę w przewodzie słuchowym zewnętrznym, zaczerwienienie i obrzęk miejscowej tkanki oraz perforację błony bębenkowej. 
	nuta: Chociaż jest to rzadko spotykane, po zidentyfikowaniu myszy z chorobami ucha zewnętrznego lub środkowego należy wykluczyć</li>.
</ol>
2. Ocena słuchu
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny chlorowodorku ketaminy (100 mg/kg) i chlorowodorku ksylazyny (10 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia na podstawie bolesnych bodźców (np. odruch szczypania palców). 
	nuta: Gdy odruch szczypania palców u nóg jest całkowicie nieobecny, zwierzę osiągnęło odpowiednią głębokość znieczulenia do badania słuchowego. Jeśli obustronne zapisy ABR wymagają więcej czasu, należy podać mniejszą dawkę (jedną piątą pierwotnej dawki) środków znieczulających, aby przywrócić pierwotną płaszczyznę znieczulania. Należy uważać, aby uniknąć przedawkowania środka znieczulającego, ponieważ może to prowadzić do śmierci myszy.</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę ciała znieczulonego zwierzęcia na poziomie 37,5 °C za pomocą termoregulującej poduszki grzewczej. Umieść znieczulone zwierzę w pomieszczeniu osłoniętym elektrycznie i akustycznie, aby uniknąć zakłóceń podczas badania słuchu. 
	nuta: Utrzymuj temperaturę fizjologiczną podczas całego zabiegu, aż zwierzę całkowicie się obudzi, aby zapobiec śmierci spowodowanej hipotermią po znieczuleniu.</li>
	<li>Umieść podskórne elektrody igłowe (20 mm, 28 G) na wierzchołku czaszki (elektroda rejestrująca), w okolicy ślinianki przyusznej poniżej małżowiny usznej mierzonego ucha (elektroda referencyjna) oraz w okolicy ślinianki przyusznej po przeciwnej stronie (elektroda uziemiająca), na głębokości 3 mm pod skórą głowy myszy, odpowiednio20.</li>
	<li>Użyj głośnika o zamkniętym polu, aby przeprowadzić stymulację akustyczną za pomocą plastikowej rurki o średnicy 2 cm z końcówką w kształcie stożka. Dopasuj końcówkę do zewnętrznego kanału słuchowego21. 
	nuta: Upewnij się, że impedancja elektryczna elektrody rejestrującej i referencyjnej jest mniejsza niż 3 kOhm (zwykle 1 kOhm). Jeśli impedancja jest wysoka, zmień miejsce wprowadzenia elektrody, wyczyść elektrodę alkoholem lub wymień elektrodę, aby uniknąć zmian amplitudy fali ABR.</li>
	<li>W przypadku nagrywania ABR wygeneruj pipsy tonów (czas trwania 3 ms, czasy narastania/opadania 1 ms, z szybkością 21,1/s, częstotliwość: 4–48 kHz) i prezentuj je przy malejących SPL od 90 do 10 dB w krokach 5\u20121210 dB SPL20. Na tym etapie odpowiedzi są wzmacniane (10 000 razy), filtrowane (0,1–3 kHz) i uśredniane (1 024 próbki/poziom bodźca). 
	nuta: ABR są zbierane dla każdego poziomu bodźca w krokach co 10 dB, z dodatkowymi 5 dB krokami w pobliżu progu.</li>
	<li>Dla każdej częstotliwości określ próg ABR, który odnosi się do minimalnego SPL, co daje wiarygodny zapis ABR z jedną lub kilkoma rozróżnialnymi falami, które można wyraźnie zidentyfikować przez oględziny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	nuta: Zwykle konieczne jest powtórzenie procesu dla niskich SPL wokół progu, aby zapewnić spójność przebiegów. Próg odpowiedzi to najniższy poziom bodźca, przy którym można zaobserwować przebieg, gdy spadek o 5 dB doprowadziłby do zaniku przebiegu.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek ślimakowych
<ol>
	<li>Po nagraniu ABR należy poddać znieczulone myszy eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy, odciąć im głowę, odsłonić pęcherz od strony brzusznej i otworzyć ostrymi nożyczkami, aby uzyskać dostęp do ślimaka.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy usuń kości skroniowe, przetnij tętnicę strzemiączka, usuń strzemiączko z okienka owalnego i rozerwij okrągłą błonę okienną. Zrób mały otwór na wierzchołku ślimaka, delikatnie obracając końcówkę igły (13 mm, 27 G).</li>
	<li>Utrwalić wyizolowane kości za pomocą 4% (wag./obj.) paraformaldehydu w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) przez noc w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety z cienką końcówką delikatnie przepłukać utrwalacz przez przestrzenie perylimfatyczne poprzez nałożenie na owalne lub okrągłe okienka (jako wlot) i otwór na wierzchołku (jako wylot). 
	nuta: Niektóre białka wymagają krótkiego czasu utrwalenia, aby uniknąć zniszczenia ich epitopów do znakowania immunologicznego. W takich przypadkach inkubować kości w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny, w zależności od instrukcji producenta dotyczących immunohistochemii. Utrwalenie można również przeprowadzić poprzez perfuzję serca w celu usunięcia krwi ślimakowej, unikając szumu tła spowodowanego niespecyficznym barwieniem na późniejszych etapach, szczególnie w mysich modelach synaptopatii ślimakowej.</li>
	<li>Opłucz kości trzy razy przez 5 minut 0,1 M zimnym PBS, aby usunąć resztki paraformaldehydu. Odwapnić kości 10% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w temperaturze pokojowej przez 4 godziny lub w temperaturze 4 °C przez 24 godziny poprzez delikatne wytrząsanie w wytrząsarce poziomej przy 20 obr./min. EDTA można odświeżyć w połowie. 
	nuta: Czas odwapnienia zależy od stężenia EDTA i preferencji użytkowników. Odwapniona tkanka powinna zachowywać pewien stopień wytrzymałości, co ułatwia manipulowanie izolacją całych wierzchołków ślimaka na późniejszych etapach. Kości skroniowe mogą być odwapnione w 10% EDTA z rotacją, co pozwala naukowcom opuścić laboratorium po testach ABR i eksperymentach z utrwalaniem. Czas odwapnienia jest elastyczny w zakresie od 20 do 30 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś jedną odwapnioną kość skroniową z EDTA do 0,1 M PBS. Użyj kleszczyków Dumonta #3, #5 i igły 27 G, aby kolejno wypreparować wierzchołkowe, środkowe i podstawowe obszary ślimaka, a następnie wypreparuj ślimak z kości pod mikroskopem stereoskopowym (jak opisano wcześniej22). Wykonaj serię małych nacięć wzdłuż więzadła spiralnego za pomocą żyletki i usuń membranę tektorialną oraz błonę Reissnera (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	nuta: Tak długo, jak wypreparowany ślimak jest nienaruszony, proces ten może być modyfikowany zgodnie ze zwykłym protokołem danego operatora.</li>
	<li>Następnie należy rozciąć pozostały nabłonek słuchowy, w tym rąbek spiralny, na poszczególne zwoje ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa z obszarem haczyka) w celu przygotowania całego mocowania.</li>
	<li>Pod 40-krotnym obiektywem olejowym mikroskopu świetlnego zmierz długość błony podstawnej za pomocą skali 250 μm umieszczonej w okularze, którą można regulować wzdłuż stereorzęsek IHC.</li>
	<li>Oblicz długość każdego skrętu ślimaka, dodając wszystkie długości segmentów (250 μm na segment) i jednocześnie uzyskaj całkowitą długość błony podstawnej, sumując długości każdego zwoju.</li>
	<li>Przelicz całkowitą długość błony podstawnej, w tym obszar haczyka, na wartość procentową opartą na odległości od wierzchołka ślimaka (0% odnosi się do wierzchołka ślimaka, 100% do podstawy ślimaka).</li>
	<li>Przelicz tę odległość na częstotliwość charakterystyczną ślimaka za pomocą funkcji logarytmicznej (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 × log(f), z nachyleniem 1,25 mm/oktawę częstotliwości, gdzie d jest znormalizowaną odległością od wierzchołka ślimaka w procentach, f jest częstotliwością w kHz), jak opisano wcześniej5,6. W ten sposób można uzyskać zakres częstotliwości w odpowiednim obszarze błony podstawnej przy każdym zwrocie ślimaka.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Po rozbiorze umieść każdy obrót ślimaka w osobnej probówce wirówkowej o pojemności 2,5 ml i inkubuj zwoje ślimaka w 10% koziej surowicy/PBS/0,1% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze.</li>
	<li>Usunąć powyższy roztwór blokujący/przepuszczalny z każdej probówki za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem preparacyjnym i inkubować próbki z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej/PBS/0,1% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze. 
	nuta: Do znakowania immunologicznego wstążek synaptycznych ślimaka należy użyć presynaptycznego markera mysiego białka wiążącego anty-karboksylowe 2 IgG1 (CtBP2, znakujące domenę B białka rusztowania RIBEYE, 1:400) i postsynaptycznego markera mysiego receptora antyglutaminianu 2 IgG2a (GluR2, znakującego podjednostkę receptora AMPA, 1:200)23.</li>
	<li>Przepłukać trzy razy przez 5 minut 0,1 M zimnym PBS w celu usunięcia pozostałości przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej/PBS/0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 2\u20123 h w ciemności na rotatorze. 
	UWAGA: Przygotuj odpowiednie mieszaniny przeciwciał drugorzędowych przy użyciu koziego przeciwciała anty-mysiego Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) i koziego anty-mysiego Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), które są komplementarne do przeciwciał pierwszorzędowych użytych w kroku 4.2. Aby poprawić skuteczność znakowania wstęg synaptycznych, zalecamy wybór określonych przeciwciał drugorzędowych. Niektóre laboratoria przedłużają inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi, aby zwiększyć immunoznakowanie GluR224.</li>
	<li>Przepłukać trzy razy przez 5 minut 0,1 M PBS w celu usunięcia pozostałości przeciwciał drugorzędowych i przenieść próbki z probówek wirówkowych o pojemności 2,5 ml na płytki 35 mm zawierające 0,1 M PBS.</li>
	<li>Umieścić kroplę podłoża montażowego zawierającego 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) na szkiełku podstawowym i przenieść próbki z PBS do podłoża mocującego. Umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i zwolnij, aby szkiełko nakrywkowe delikatnie opadło. 
	nuta: Aby upewnić się, że komórki rzęsate są skierowane do góry i że podczas zabiegu nie dochodzi do fałdowania lub skręcania próbek ślimaka, należy zamontować próbki ślimaka pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Umieścić szkiełka w pudełku ze szkiełkami w temperaturze 4 °C na noc, aby szkiełka wyschły, a następnie zobrazować pod laserowym mikroskopem konfokalnym</li>.
</ol>
5. Ocena morfologiczna synaps wstęgowych ślimaka
<ol>
	<li>Preparaty obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego z trzema laserami - diodą UV 405 nm, laserem argonowym 488 nm i laserem półprzewodnikowym pompowanym diodą 561 nm (DPSS) w celu wzbudzenia DAPI (widmo wzbudzenia 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (widmo wzbudzenia 496–549 nm) i Alexa Fluor 568 (widmo wzbudzenia 573–631 nm), odpowiednio.</li>
	<li>Uzyskuj konfokalne stosy osi Z w odległości 8 μm od każdego obrotu ślimaka za pomocą 63-krotnej soczewki olejowej o wysokiej rozdzielczości. 
	nuta: Po zdefiniowaniu wszystkie parametry do digitalizacji mikrofotografii powinny zostać zapisane i zastosowane jednolicie do wszystkich slajdów.</li>
	<li>W przypadku zliczania punktów synaptycznych należy ustawić stosy z (rozmiar kroku 0,3 μm) tak, aby obejmowały całą długość IHC, zapewniając w ten sposób, że można zobrazować wszystkie punkty synaptyczne.</li>
	<li>Scal obrazy zawierające puncta w stosie z, aby uzyskać projekcję osi z, a następnie zaimportuj je do oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
	<li>Podziel całkowitą liczbę synaps w każdym stosie z w określonych obszarach częstotliwości przez liczbę IHC (równą ręcznym zliczeniom jądrowym DAPI), aby obliczyć liczbę punktów synaptycznych dla każdego IHC. W każdym określonym obszarze częstości uśrednij wszystkie punkty synaptyczne na trzech obrazach różnych pól mikroskopowych zawierających 9-11 IHC.
	<ol>
		<li>Nakreśl obszar zainteresowania (ROI), w tym obszary podstawno-boczne każdego IHC, za pomocą przycisku wyboru odręcznego. Użyj funkcji miary do automatycznego określania ilościowego punktu, a funkcji działu wodnego do rozróżnienia blisko sąsiadujących miejsc.</li>
		<li>Po każdym automatycznym liczeniu należy przeprowadzić oględziny z ręcznymi poprawkami, aby zapewnić niezawodne liczenie punktowe. 
		nuta: Eksperymentatorzy powinni pozostać ślepi co do tego, czy szkiełko pochodzi z wierzchołka, środkowego czy podstawnego zwoju ślimaka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualnie oceń strukturę i rozmieszczenie synaptyczne, aby ręcznie odizolować poszczególne IHC od ich sąsiadów za pomocą narzędzia Pencil Tool (M), aby lepiej zobrazować architekturę cytoszkieletu i lokalizację synaptyczną.</li>
	<li>Aby sprawdzić zestawienie wstęg presynaptycznych (CtBP2) i plam receptorów postsynaptycznych (GluR2), wyodrębnij przestrzeń woksela wokół wstęgi za pomocą narzędzia Zaznaczanie prostokątne i wyizoluj pojedynczą wstęgę za pomocą Przytnij. Klikając Obraz > Rozmiar obrazu, uzyskaj tablicę miniatur tych miniaturowych projekcji, które można następnie wykorzystać do identyfikacji sparowanych synaps (pojawiających się jako ściśle zestawione pary CtBP2-dodatnich i GluR2-dodatnich punkta) w porównaniu z sierocymi wstążkami (bez postsynaptycznych łat receptora glutaminianu) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
	>nuta: Normalne synapsy ślimakowe pojawiają się jako połączone znakowanie immunologiczne wstążki presynaptycznej w komórce rzęsatej (anty-CtBP2) i postsynaptycznego receptora glutaminianu na zakończeniu nerwu słuchowego (anty-GluR2)25. Niektóre laboratoria używają projekcji konfokalnych w połączeniu z modelowaniem 3D w celu ilościowego określenia rozmiaru lub objętości plamy synaptycznej26,27. Przed znaczną utratą synaps wstęgowych, wstążki wykazujące zmiany rozmiaru lub bez sparowanych plastrów receptora glutaminianu prawdopodobnie wskazują na dysfunkcję synapsów27,28.</li>
</ol>
6. Ocena funkcjonalna synaps wstęgowych ślimaka
<ol>
	<li>Zbierz wszystkie fale ABR dla każdego bodźca częstotliwościowego prezentowanego przy SPL 90 dB w celu analizy ponadprogowych amplitud fali ABR I. 
	nuta: Badania neurofizjologiczne i morfologiczne wykazały, że włókna o niskim wskaźniku spontaniczności i wysokim progu są szczególnie podatne na starzenie się i narażenie na hałas29,30. Chociaż prosta utrata synaps wstęgowych nie może wpływać na progi ABR, zwykle powoduje znaczne zmniejszenie amplitud fali I fali ABR, ponieważ te aferenty, w tym włókna o niskiej spontaniczności, wysokim progu i włókna o wysokiej spontaniczności, o niskim progu, w znacznym stopniu przyczyniają się do sumowania aktywności włókien nerwowych ślimaka28,29,31. W tym miejscu wybiera się natężenie ponadprogowe 90 dB SPL.</li>
	<li>Określ amplitudę fali I od szczytu do szczytu za pomocą programu do analizy offline (Rysunek 4). Każda fala I w badaniu ABR składa się z początkowego odchylenia dodatniego (p) i następującego po nim odchylenia ujemnego (n). Amplituda fali I ABR jest definiowana jako różnica napięcia między Ip (dodatni szczyt fali I) i In (ujemny szczyt fali I)29. 
	nuta: W stanach patologicznych synaptopatię ślimakową można określić na podstawie amplitud ponadprogowych załamka ABR I, które odzwierciedlają zsumowane odpowiedzi początkowe SGN wywołanych dźwiękiem. Jednak wrażliwość ślimaka, która nie jest zagrożona z powodu dysfunkcji OHC, jest warunkiem wstępnym tej metody.</li>
</ol>

<ol><li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12%2C055+railway+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+and+Hearing%22%5BJournal%5D)">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li>
<li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+transduction%2C+tuning%2C+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cochlear+frequency+map+for+the+cat%3A+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li>
<li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li>
<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA%2FJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li>
<li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+guide+to+plotting+a+cochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056(2016).</li>
<li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+after+noise+exposure%3A+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+%22recovered%22+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li>
<li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li>
<li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li>
<li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity%2C+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-Laryngologica%22%5BJournal%5D)">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li>
<li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss%3A+Manifestations+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li>
<li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li>
<li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341(2013).</li>
<li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054(2017).</li>
<li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li>
<li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL%2F6J+mice+with+age+%28Delta%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li>
<li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+auditory+brainstem+response+testing%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-Protocol%22%5BJournal%5D)">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li>
<li>Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li>
<li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIBEYE%2C+a+component+of+synaptic+ribbons%3A+a+protein%27s+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li>
<li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907(2016).</li>
<li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li>
<li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%22temporary%22+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+%28Macaca+mulatta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL%2F6J+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ponieważ synaptopatia ślimakowa została po raz pierwszy scharakteryzowana u dorosłych myszy z tymczasowym przesunięciem progu (TTS) wywołanym szumem pasma oktawowego 8\u201216 kHz przy 100 dB SPL przez 2 godziny31, naukowcy coraz częściej badają wpływ synaptopatii u różnych ssaków, w tym małp i ludzi32,33. Oprócz narażenia na hałas, kilka innych schorzeń jest związanych z synaptopatią ślimaka (np. starzenie się, stosowanie leków ototoksycz...

Częstotliwości w zakresie około 20\u201220,000 Hz mogą być odbierane przez ludzi jako bodźce słuchowe. Ludzki słuch jest zwykle najbardziej wrażliwy w pobliżu 1 000 Hz, gdzie średni poziom ciśnienia akustycznego wynosi 20 μPa u młodych dorosłych (tj. 0 decybeli poziomu ciśnienia akustycznego [dB SPL]). W niektórych stanach patologicznych ubytek słuchu jest ograniczony do określonych częstotliwości. Na przykład we wczesnych stadiach ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL) na audiogramie można zaobserwować "wcięcie" (tj. podniesienie progu słyszenia) przy 4 kHz1. Wzdłuż przegrody ślimaka ssaków, jego gradacje sztywności i masy tworzą wykładniczą mapę częstotliwości, z detekcją dźwięku o wysokiej częstotliwości u podstawy ślimaka i detekcją niskiej częstotliwości u podstawy ślimaka i detekcją niskiej częstotliwości w apex2. Rzeczywiście, wzdłuż błony podstawnej znajduje się mapa lokalizacji ślimaka, co prowadzi do tego, co jest znane jako organizacja tonotopowa2,3. Każde dane miejsce na błonie podstawnej ma najwyższą czułość tylko na jedną konkretną częstotliwość dźwięku, która jest zwykle określana jako częstotliwość charakterystyczna3,4, chociaż można również zaobserwować reakcje na inne częstotliwości.
Do tej pory różne modele myszy były wykorzystywane do badania normalnego funkcjonowania, procesów patologicznych i skuteczności terapeutycznej w systemie słuchowym. Dokładna znajomość parametrów fizjologicznych ślimaka myszy jest warunkiem koniecznym do przeprowadzenia takich badań nad ubytkiem słuchu. Ślimak myszy jest anatomicznie podzielony na zwoje wierzchołkowe, środkowe i podstawne, które odpowiadają różnym obszarom częstotliwości. Oznaczając aferenty nerwu słuchowego w jądrze ślimaka w celu przeanalizowania odpowiadających im obwodowych miejsc unerwienia w ślimaku, Müller i wsp. udało się ustalić mapę częstości występowania miejsc w ślimaku u normalnej myszy in vivo5. W przedziale 7,2–61,8 kHz, który odpowiada położeniom między 90% a 10% pełnej długości błony podstawnej, mapa miejsca i częstotliwości ślimaka myszy może być opisana za pomocą prostej funkcji regresji liniowej, sugerującej związek między znormalizowaną odległością od podstawy ślimaka a logarytmem częstotliwości charakterystycznej5. U myszy laboratoryjnych mapa miejsca-częstotliwości może być wykorzystana do zbadania związku między progami słyszenia w określonych zakresach częstotliwości a ślimakami pokazującymi liczbę brakujących komórek rzęsatych w względnych obszarach wzdłuż błony podstawnej6. Co ważne, mapa częstotliwości miejsc zapewnia system pozycjonowania do badania minimalnych uszkodzeń strukturalnych, takich jak uszkodzenia synaps wstęgowych komórek rzęsatych w określonych lokalizacjach częstotliwości ślimaka u myszy z obwodowym urazem słuchowym7,8.
W ślimaku ssaków, synapsy wstęgowe składają się z wstęgi presynaptycznej, gęstej od elektronów projekcji, która wiąże aureolę gotowych do uwolnienia pęcherzyków synaptycznych zawierających glutaminian w IHC, oraz postsynaptycznego zagęszczenia na końcu nerwowym SGN z receptorami glutaminianu9. Podczas transdukcji dźwięku ślimakowego ugięcie pęczka komórek rzęsatych powoduje depolaryzację IHC, która prowadzi do uwalniania glutaminianu z IHC do postsynaptycznych zakończeń aferentnych, aktywując w ten sposób szlak słuchowy. Aktywacja tej ścieżki prowadzi do przekształcenia sygnałów mechanicznych indukowanych dźwiękiem w kod szybkości w klasie SGN<sup="xref">10. Rzeczywiście, synapsa wstęgowa IHC jest wysoce wyspecjalizowana w niestrudzonej transmisji dźwięku z szybkością setek Hz z dużą precyzją czasową i ma kluczowe znaczenie dla presynaptycznych mechanizmów kodowania dźwięku. Wcześniejsze badania wykazały, że synapsy wstęgowe różnią się znacznie pod względem wielkości i liczby w różnych regionach częstotliwości u dorosłej myszy cochlea11,12, co prawdopodobnie odzwierciedla strukturalną adaptację do konkretnego kodowania dźwięku dla potrzeb przetrwania. Niedawne eksperymentalne badania na zwierzętach wykazały, że synaptopatia ślimakowa przyczynia się do wielu form upośledzenia słuchu, w tym ubytku słuchu spowodowanego hałasem, ubytku słuchu związanego z wiekiem i dziedzicznego ubytku słuchu13,14. W związku z tym metody identyfikacji skorelowanych zmian w liczbie, strukturze i funkcji synaps w określonych regionach częstotliwości są coraz częściej stosowane w badaniach nad rozwojem słuchu i chorobami ucha wewnętrznego, przy użyciu modeli wygenerowanych za pomocą eksperymentalnej manipulacji zmiennymi genetycznymi lub środowiskowymi15,16,17.
W bieżącym raporcie prezentujemy protokół analizy liczby, struktury i funkcji synaptycznej w określonym obszarze częstotliwości błony podstawnej u dorosłych myszy. Lokalizacja częstości ślimaka jest wykonywana przy użyciu danej mapy miejsca-częstotliwości w połączeniu z ślimakiem. Normalne cechy morfologiczne synaps wstęgowych ślimaka są oceniane za pomocą presynaptycznego i postsynaptycznego barwienia immunologicznego. Stan funkcjonalny synaps wstęgowych ślimaka określa się na podstawie amplitud nadprogowych I fali ABR. Z niewielkimi zmianami protokół ten może być stosowany do badania stanów fizjologicznych lub patologicznych w innych modelach zwierzęcych, w tym szczurach, świnkach morskich i myszoskoczkach.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, Chiny</td><td>H35020148</td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>chlorowodorek ksylazyny</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>X-1251</td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>Aparatura fizjologiczna TDT</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td><td>System Fizjologii Słuchu III</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie SigGen/BioSig</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, Stany Zjednoczone</td><td>System Fizjologii Słuchu III</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka elektryczna</td><td>Pet Fun</td><td>11072931136</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont 3#</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada</td><td>0203-3-PO</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumonta 5#</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada</td><td>0209-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon Corp., Tokio, Japonia</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>ZSGB-BIO, Pekin, Chiny</td><td>ZLI-9021</td><td></td></tr><tr><td>Receptor antyglutaminianu 2, zewnątrzkomórkowy, klon 6C4</td><td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td><td>Mysz MAB397</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz Anti-CtBP2</td><td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td><td>612044</td><td>mysz&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>A21124</td><td>koza</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG2a</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Koza A21131</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe zawierające DAPI</td><td>ZSGB-BIO, Pekin, Chiny</td><td>ZLI-9557</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td> Oprogramowanie <td>TCS SP8 II</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Media Cybernetyka, Bethesda, MD, USA</td><td>wersja 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Profesjonalny diagnostyczny otoskop kieszonkowy</td><td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>HS-OT10</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda igłowa</td><td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, Chiny</td><td>1029</td><td>20 mm, 28 G</td></tr><tr><td>Zamknięte pole prelegent</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floryda, USA</td><td>CF1</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Wewnętrzne komórki rzęsate ślimaka (IHC) przesyłają sygnały akustyczne do neuronów spiralnych (SGN) poprzez synapsy wstęgowe. Kilka badań eksperymentalnych wykazało, że synapsy komórek rzęsatych mogą być początkowymi celami w odbiorczym ubytku słuchu (SNHL). W takich badaniach zaproponowano koncepcję "synaptopatii" ślimaka, która odnosi się do zmian w liczbie, strukturze lub funkcji synaps wstęgowych, które skutkują nieprawidłową transmisją synaptyczną między IHC i SGN. Chociaż synaptopatia ślimakowa jest nieodwracalna, nie wpływa na próg słyszenia. W modelach eksperymentalnych wywołanych hałasem, ograniczone uszkodzenie synaps IHC w wybranych obszarach częstotliwości jest wykorzystywane do identyfikacji czynników środowiskowych, które specyficznie powodują synaptopatię, a także fizjologicznych konsekwencji zakłócenia tego obwodu ucha wewnętrznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy morfologii i funkcji synaps ślimaka w określonym regionie częstości u dorosłych myszy. W tym protokole lokalizacja ślimaka w określonych regionach częstości jest przeprowadzana przy użyciu map miejsca i częstotliwości w połączeniu z danymi ze ślimaka, po czym ocenia się cechy morfologiczne synaps wstęgowych za pomocą synaptycznego barwienia immunologicznego. Stan funkcjonalny synaps wstęgowych jest następnie określany na podstawie amplitudy fali I słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR). Niniejszy raport pokazuje, że podejście to może być wykorzystane do pogłębienia naszej wiedzy na temat patogenezy i mechanizmów dysfunkcji synaps w ślimaku, co może pomóc w opracowaniu nowych interwencji terapeutycznych.

Testy słuchu ABR przeprowadzono u 10 myszy C57BL/6J (w wieku 8 tygodni) w znieczuleniu. Odpowiedzi ABR wywoływano za pomocą bodźców w postaci paczek tonowych o częstotliwościach 4, 8, 16, 32 i 48 kHz. Próg słuchowy każdego zwierzęcia wykrywano wizualnie, identyfikując co najmniej jedną wyraźną falę w zapisie ABR. Wszystkie myszy wykazały progi ABR w odpowiedzi na paczki tonowe w zakresie od 25 do 70 dB SPL, w zależności od częstotliwości bodźca. Nasze wyniki wykazały, że próg słuchowy był najniższy przy 16 kHz (<strong c...

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Pierwszym raportem jest to, że bardzo ważne jest dokładne zlokalizowanie określonego obszaru częstotliwości błony podstawnej w większości modeli, w których zmienia się liczba synaps i można analizować ich funkcję. Lokalizacja ślimakowa określonych obszarów częstotliwości jest niezawodnie wykonywana przy użyciu map częstotliwości miejsc w połączeniu z danymi z ślimaka. Mikroskop zapewnia wgląd w kilka badań naukowych.Potwierdza to pogląd, że neuropatia ślimakowa jest głównym początkowym zdarzeniem poprzedzającym utratę słuchu, szumy uszne i nadwrażliwość słuchową. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u znieczulonej ośmiotygodniowej dorosłej myszy męskiej C57 black 6J. Umieść mysz na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w pomieszczeniu ekranowanym elektrycznie i akustycznie.Następnie umieść podskórną elektrodę rejestrującą igłę o średnicy 20 milimetrów i rozmiarze 28 pod skórą na wierzchołku czaszki na głębokości trzech milimetrów. Elektroda referencyjna w okolicy ipsilateralnej ślinianki przyusznej, poniżej małżowiny usznej mierzonego ucha i elektroda masowa w okolicy ślinianki przyusznej po przeciwnej stronie. Umieść obok myszy głośnik polowy z zamkniętą osłoną terenową wyposażoną w dwucentymetrową plastikową rurkę z końcówką w kształcie stożka i włóż końcówkę do zewnętrznego kanału słuchowego.Aby uzyskać słuchową odpowiedź pnia mózgu lub nagranie ABR, generuj pipsy tonów przy zmniejszających się poziomach ciśnienia akustycznego od 90 do 10 decybeli, w krokach co pięć do 10 decybeli poziomu ciśnienia akustycznego. Na tym etapie odpowiedzi są wzmacniane, filtrowane i uśredniane. Przy każdej częstotliwości należy określić próg ABR, który jest minimalnym poziomem ciśnienia akustycznego, który zapewnia wiarygodny zapis ABR z jedną lub kilkoma rozróżnialnymi falami, które można wyraźnie zidentyfikować za pomocą oględzin.Po nagraniu ABR odsłoń pęcherz od strony brzusznej i otwórz pęcherz ostrymi nożyczkami, aby uzyskać dostęp do ślimaka. Za pomocą cienkich kleszczy usuń kości skroniowe i przetnij tętnicę strzemiączka. Następnie usuń strzemiączko z okienka owalnego i rozerwij okrągłą błonę okienną.Delikatnie obróć końcówkę igły o rozmiarze 13 mm i rozmiarze 27, aby zrobić mały otwór na wierzchołku ślimaka, a następnie użyj pipety z cienką końcówką, aby delikatnie przepłukać 4% paraformaldehydu przez okienko do przestrzeni perylimfatycznych. Następnie opłucz kości trzy razy przez pięć minut na mycie zimnym świeżym 0,1 molowym PBS na pranie. Następnie następuje odwapnienie kości za pomocą 10% EDTA przez cztery godziny w temperaturze pokojowej i 20 obrotów na minutę na poziomym wytrząsarce.Pod koniec inkubacji przenieść odwapnioną kość skroniową do świeżego 0,1-molowego PBS pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj 3 i 5 kleszczyków Dumonta i igły o rozmiarze 27, aby kolejno wypreparować wierzchołkowe, środkowe i podstawowe obszary ślimaka. Użyj żyletki, aby wykonać małą serię nacięć wzdłuż więzadła spiralnego i usunąć membranę tektorialną i błonę Reissnera.Następnie należy rozbić pozostały nabłonek słuchowy, w tym rąbek spiralny, na poszczególne zwoje ślimaka w celu przygotowania całego wierzchowca. Następnie użyj obiektywu olejowego 40X w mikroskopie świetlnym, aby zmierzyć długość błony podstawnej za pomocą skali 250 mikrometrów umieszczonej w okularze. Można go regulować wzdłuż stereorzęsek wewnętrznych komórek rzęsatych.Po rozbiorze umieść każdy obrót ślimaka w osobnych probówkach wirówkowych o pojemności 2,5 mililitra. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania z 10% kozią surowicą w PBS w 0,1% Triton X-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Pod koniec inkubacji użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby usunąć roztwór pod mikroskopem preparacyjnym.Inkubować próbki z podstawowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej i PBS w 0,1% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na rotatorze. Następnego ranka przepłucz próbki tkanek trzy razy przez pięć minut zimnym 0,1 molowym PBS na przemycie, aby usunąć wszelkie pozostałości przeciwciał pierwszorzędowych. Następnie oznaczyć próbki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej w PBS w 0,1% Triton X-100 przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej na rotatorze, chroniąc przed światłem.Pod koniec inkubacji przemyć próbki trzykrotnie 0,1-molowym PBS, jak pokazano, i przenieść próbki na indywidualne 35-milimetrowe płytki zawierające 0,1-molowy PBS. Umieść kroplę podłoża montażowego uzupełnionego DAPI na szkiełku podstawowym i przenieś próbki z PBS na podłoże montażowe. Umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na każdym szkiełku i zwolnij, aby szkiełka nakrywkowe delikatnie opadły.Następnie wysusz szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby zobrazować próbki, użyj mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi laserami i soczewką olejową o wysokiej rozdzielczości 63X, aby uzyskać osiem mikrometrowych stosów konfokalnych Z z każdego obrotu ślimaka. W przypadku zliczania punktów synaptycznych ustaw stosy Z z krokiem o wielkości 0,3 mikrometra tak, aby obejmowały całą długość wewnętrznych komórek rzęsatych, zapewniając, że wszystkie punkty synaptyczne mogą być obrazowane i połącz obrazy zawierające puncta w stos Z, aby uzyskać projekcję dostępu Z.Zaimportuj scalone obrazy do odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów. Podziel całkowitą liczbę synaps w każdym stosie Z w określonych regionach częstotliwości przez liczbę dodatnich wewnętrznych komórek rzęsatych DAPI, aby obliczyć liczbę punktów synaptycznych dla każdej komórki. W każdym określonym obszarze częstości uśrednij wszystkie punkty synaptyczne na trzech obrazach różnych mikroskopijnych pól, zawierających od dziewięciu do 11 wewnętrznych komórek rzęsatych.Aby lepiej zobrazować architekturę cytoszkieletu i lokalizację synaptyczną, użyj narzędzia pędzelka, aby wizualnie ocenić strukturę synaptyczną i rozmieszczenie poszczególnych wewnętrznych komórek rzęsatych. Aby sprawdzić zestawienie wstążek presynaptycznych i plam receptorów postsynaptycznych, użyj narzędzia do zaznaczania prostokątnego, wyodrębnij przestrzeń woksela wokół wstążek i użyj cięcia obrazu, aby wyizolować poszczególne wstęgi. Następnie kliknij obraz i rozmiar obrazu, aby uzyskać tablicę miniatur tych miniaturowych projekcji, których można użyć do identyfikacji sparowanych synaps i sierocych wstążek.Wszystkie dziesięć myszy w tym reprezentatywnym eksperymencie wykazywało progi ABR w odpowiedzi na wybuchy tonów w zakresie od 25 do 70 decybeli na poziom ciśnienia akustycznego, w zależności od częstotliwości bodźca. Próg słyszenia w tym eksperymencie był najniższy i wynosił 16 kiloherców, co odpowiada około 43% odległości od wierzchołka ślimaka, co sugeruje, że wrażliwość akustyczna jest znacznie zmniejszona w innych obszarach ślimaka. Całe mocowania nabłonka słuchowego są preparowane na trzy części, a długości są mierzone i przeliczane na ich procentową odległość od wierzchołka ślimaka.Położenie częstotliwości na błonie podstawnej każdego skrętu ślimaka oblicza się za pomocą funkcji logarytmicznej. W normalnych uszach dorosłych myszy barwienie immunologiczne ujawnia zestawione ze sobą pary wstążek synaptycznych i plastrów receptora glutaminianu. Badanie powierzchni błony podstawno-bocznej wewnętrznych komórek rzęsatych, z ośmioma do 20 parami na komórkę.Chociaż zdecydowana większość puncta pojawia się jako zestawione pary w normalnych uszach, sieroce wstążki są rzadko obserwowane przy dużych powiększeniach. Liczba wewnętrznych synaps wstęgowych komórek rzęsatych jest najwyższa w obszarze 16 kiloherców i znacznie zmniejsza się wraz ze wzrostem odległości od tego miejsca. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas tej procedury, jest to, że należy zagwarantować integralność błony podstawnej ślimaka.Musimy kłaść nacisk na dokładność, dopóki nie osiągniemy biegłości technicznej. Po tej procedurze można przeprowadzić terapię genową, aby odpowiedzieć na pytanie, czy neuropatia ślimakowa może zostać naprawiona za pomocą tego środka. Miara ta jest szerszą techniką badania neuropatii ślimakowej, która, jeśli pierwotne zdarzenia początkowe wiążą się z utratą słuchu, szumem w uszach i nadwrażliwością słuchową.

morphological-functional-evaluation-ribbon-synapses-at-specific

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Ten film demonstruje metodę oceny synaps wstęgowych w określonych regionach ślimaka myszy. Wykorzystuje techniki barwienia immunologicznego i obrazowania konfokalnego w celu identyfikacji funkcjonalnych synaps w różnych regionach częstotliwości w każdym skręcie ślimaka.

Ocena synaps wstęgowych w określonych obszarach częstotliwości ślimaka myszy

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Przedstawiono protokół przetwarzania ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków poprzez immunoznakowanie aferentnych struktur synaptycznych i komórek rzęsatych, wygaszanie autofluorescencji w starzejącej się tkance, preparowanie i szacowanie długości ślimaka oraz ilościowe określanie synaps w stosach obrazów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego.

Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków

Tutaj prezentujemy protokół dla mysiego modelu ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL). Aby wywołać NIHL, opracowaliśmy nowe i proste urządzenie wykorzystujące tekturę falistą, klatkę pułapkę na szczury i głośnik. Odpowiedź słuchowa pnia mózgu i obrazowanie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do oceny odpowiednio funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych.

Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych

Mikroskop z arkuszami świetlnymi został opracowany do obrazowania i digitalizacji całego ślimaka.

Obrazowanie starzejącego się ślimaka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszach świetlnych

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.

Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej

Poznaj metodę oceny morfologii i funkcji synaps wstęgowych w ślimaku myszy C57BL/6J. Protokół obejmuje rejestrację odpowiedzi pnia mózgu, preparowanie histologiczne i mikroskopię konfokalną do analizy zmian synaptycznych.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Przeglądaj więcej filmów