Name: Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania SERCA z mięśni królika przy użyciu trehalozy. Technika ta zapewnia ponad 90% czystość białka i zachowanie aktywności katalitycznej, co umożliwia szczegółowe badania strukturalne i funkcjonalne tego kluczowego enzymu transportującego wapń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje za pomoc Edmundo Mata-Moralesa w edycji filmu, VM, Valentína de la Cruz-Torresa w oczyszczaniu SRV, Miguela A. Rivera-Morana w oczyszczaniu i analizie SERCA oraz Juana C. Gonzaleza-Castro, Franco E. Juareza, Alejandry Nevarez, Nicolasa Rocha-Vizueta i Jocelina I. Ramíreza-Alonso w produkcji wideo. Nie otrzymano żadnych funduszy, grantów ani innego wsparcia na przeprowadzenie tego badania.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi i lokalnymi (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się ze zwierzętami w laboratoriach eksperymentalnych51,67,68. Tkanka mięśniową pobrano od osobników dzikiego typu Oryctolagus cuniculus z lokalnej jednostki ds. obsługi zwierząt (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Wstępną sekcję i obróbkę mięśni przeprowadził lekarz weterynarii specjalizujący się w zarządzaniu zwierzętami laboratoryjnymi. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytych w tej badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Izolacja siateczki sarkoplazmatycznej z szybko kurczących się mięśni królika (Czas trwania: 7 - 9 h)
UWAGA: Szczegóły procedury opisano w pracy Champeil i wsp.69.
<ol>
	<li>Pobrać tkankę mięśni szybkokurczliwych (~70 g z obu tylnych kończyn na zwierzę) od dzikiego typu Oryctolagus cuniculus. 
	UWAGA: Wymagana jest wcześniejsza identyfikacja wizualna mięśni przeznaczonych do sekcji70,71.</li>
	<li>Rozmielić mięśnie szybkokurczliwe w blenderze, zawieszając je w trzech objętościach 100 mM KCl; cykl obejmuje 1 min pracy i 1 min odpoczynku w lodzie, powtórzyć trzy razy72.</li>
	<li>Usunąć resztki tkankowe poprzez wirowanie (1500 × g) w temperaturze 4 °C przez 5 min; w razie potrzeby należy przeprowadzić drugie wirowanie (4200 × g).</li>
	<li>Zebrać nadsącz i zhomogenizować go za pomocą homogenizatora tkankowego (10 pociągnięć przy niskiej prędkości, tj. 500-1,500 rpm)72,73. Odwirować homogenat (10,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 15 min. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas homogenizacji, ponieważ użycie stosunkowo wysokiej prędkości może doprowadzić do uszkodzenia urządzenia oraz operatora.</li>
	<li>Odwirować nadsącz (zawierający siateczkę sarkoplazmatyczną) (33,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 120 min.</li>
	<li>Zawiesić osad w 40 mL 0,5 M sacharozy i wirować (12,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 15 min. Rozcieńczyć nadsącz (0,6 M KCl i 0,15 M sacharozy) i wirować zawiesinę (34,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 165 min.</li>
	<li>Zawiesić osad zawierający płaty pęcherzyków siateczki sarkoplazmatycznej (SRVs) w 0,3 M sacharozy, 0,1 M KCl i 5 mM Tris-HCl, pH 7,0. Określić stężenie białka metodą Lowry'ego74, stosując albuminę surowicy ludzkiej jako standard białkowy.</li>
	<li>Rozdzielić SRVs (30-32 mg/mL) na alykwoaty o objętości 1 mL. Próbki SRVs przechowywać w temperaturze -72 °C do dalszego przetwarzania. 
	UWAGA: Wydajność białka wynosi 100-110 mg SRVs na zwierzę.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie SERCA (Czas trwania: 18 - 20 h)
UWAGA: Szczegóły dotyczące procedury znajdują się w pracy Rivera-Morán et al.46.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę SRVs do stężenia 2 mg białka/mL, używając schłodzonego w lodzie buforu zawierającego 75 mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.6 M KCl, 6 mM EDTA, 1 mM EGTA oraz 0.1% (w/v) deoksycholan sodu (DOC). Inkubować zawiesinę SRVs na lodzie przez 10 min przy łagodnym mieszaniu. Odwir upcoming zawiesinę SRVs (100,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 60 min. 
	UWAGA: DOC należy dodawać kroplami.</li>
	<li>Resuspender osad w &lt;3 mL buforu zawierającego 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M KCl, 45% glicerolu (v/v) oraz 2 mM EDTA. Zhomogenizować zawiesinę i dopełnić do objętości końcowej 10 mL. Oznaczyć stężenie białka, a następnie dostosować je do 6.5 mg/mL. Dodać azolectynę do stężenia 5 mg/mL oraz Zwittergent 3-14 w proporcji 0.85 (w/w). 
	UWAGA: Azolectynę i Zwittergent 3-14 należy dodawać kroplami.</li>
	<li>Zhomogenizować zawiesinę i odwirować (100,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 60 min. Zebrać nadsącz i rozcieńczyć w stosunku 1:2 za pomocą 2 mM EGTA (pH 7.2).</li>
	<li>Delikatnie nalać zawiesinę na nieciągły gradient stężeń trehalozy (45, 40, 35 i 30% w/v) w 10 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA, 0.1% deoksycholanu i 1 mg/mL azolectyny. Odwirować (100,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 14 h. Zebrać przezroczysty, lekko żółtawy osad utworzony na dnie probówek. 
	UWAGA: Zarówno tworzenie gradientu trehalozy, jak i nakładanie zawiesiny próbki muszą być wykonane przy użyciu odpowiednich technik. Zaleca się wirowanie przez noc.</li>
	<li>Delikatnie resuspender osad w małej objętości (&lt;1.5 mL) buforu zawierającego 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M KCl, 45% glicerolu oraz 2 mM EDTA. Oznaczyć stężenie białka. Dostosować stężenie białka poprzez rozcieńczenie do 2 mg/mL. Pobrać alikwoty (~50 µL) zawiesiny i przechowywać oczyszczoną SERCA w temperaturze −72 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę SDS-PAGE oczyszczonej SERCA72 oraz próbek białek pobranych na różnych etapach oczyszczania. Zabarwić żel błękitem Coomassie72. 
	UWAGA: Zastosowanie 0.6 M trehalozy zamiast glicerolu w buforze do resuspensji zwiększa stabilność enzymu podczas przechowywania oraz cykli zamrażania i rozmrażania28,29.</li>
</ol>
3. Analiza aktywności ATPase (Czas trwania, 1 - 2 h)
<ol>
	<li>Test sprzężony enzymatycznie: ATPase-kinaza pirogronianowa-dehydrogenaza mleczanowa
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną (1 mL): 50 mM MOPS (pH 7.0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolopirogronianu, 250 µM NADH. Uwzględnić zmienne stężenia ATP (od 0,001 do 0,25 mM).</li>
		<li>Starannie ujednorodnić mieszaninę reakcyjną za pomocą wstrząsania w vorteksie. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 ◦C przez 10 min. Dodać 0,9 U dehydrogenazy mleczanowej (LDH) oraz 1,5 U kinazy pirogronianowej (PK).</li>
		<li>Rozpocząć reakcję ATPase poprzez dodanie 10 µg SERCA.</li>
		<li>Oznaczyć tworzenie NADH. Monitorować zmianę intensywności absorbancji co sekundę przez 600 s przy długości fali (λ) 340 nm w czasie, używając spektrofotometru z termostatowaną podstawką na kuwetę. 
		UWAGA: Interwał czasowy pomiaru absorbancji może być różny, jednak należy starać się zarejestrować jak najwięcej punktów danych, aby wyznaczyć początkową linię prostą reakcji ATPase.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczyć szybkość hydrolizy ATP 
	UWAGA: Szczegóły procedury znajdują się w publikacji Rivera-Morán i wsp.46.
	<ol>
		<li>Obliczyć wartość nachylenia (Δabs/min) części liniowej każdej z otrzymanych krzywych. Użyć molowego współczynnika ekstynkcji (ε) NADH (λ = 6,220 M−1·cm−1), aby określić aktywność ATPase (µmoli ATP zhydrolizowanych/min.mg białka).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczyć parametry kinetyczne Km i Vmax
	<ol>
		<li>Przedstawić zależność szybkości od stężenia ATP na wykresie przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia grafiki.</li>
		<li>Dopasować dane metodą regresji nieliniowej do równania Michaelisa-Menten (Równanie 1)46: 
		<img alt="Równanie Michaelisa-Menten: v=Vmax·S/(Km+S), formuła kinetyki enzymatycznej, analiza biochemiczna." src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie v to szybkość, Vmax to szybkość maksymalna, [S] to stężenie ATP, a Km to stała Michaelisa-Menten.</li>
		<li>Wyznaczyć Km i Vmax metodą iteracyjną. 
		UWAGA: Dodatek DOC może zwiększyć szybkość reakcji ATPase; zaleca się przetestowanie różnych stężeń DOC w celu znalezienia wartości optymalnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza znakowania SERCA izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Czas trwania: 30 - 45 min, wyłącznie dla znakowania FITC)
UWAGA: Szczegóły procedury znajdują się w publikacjach54,75,76.
<ol>
	<li>Zawiesić SERCA (20 µg) w 50 µL (objętość końcowa) buforu do znakowania (100 mM KCl, 5 mM MgCl2 oraz 30 mM Tris-HCl, pH 8.9) zawierającego 1 mM FITC. Wymieszać za pomocą wortexa.</li>
	<li>Inkubować próbki przez różne odstępy czasu (15 min, 10 min, 7 min, 5 min i 2 min) w ciemności i w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję znakowania poprzez dodanie 1 objętości lodowatego buforu zatrzymującego (480 mM sacharozy i 48 mM MOPS, pH 7.0), zawierającego ATP (5 mM). Inkubować na lodzie przez 5 min w ciemności.</li>
	<li>Poddać oznakowane FITC białko SERCA elektroforezie SDS-PAGE72. Naświetlić przezroczyste żele światłem UV (λ = 302 nm). Wykonać dokumentację fotograficzną wyniku.</li>
	<li>Zabarwić żel błękitem Coomassie. Wykonać dokumentację fotograficzną wyniku. 
	UWAGA: Przeprowadzenie znakowania FITC w ciemni może poprawić jakość sygnału fluorescencyjnego.</li>
</ol>
5. Widma dichroizmu kołowego (CD) (Czas trwania: 30 min)
UWAGA: Szczegóły procedury znajdują się w publikacjach11,77.
<ol>
	<li>Zawiesić SERCA (3 µM) w 400 µL 10 mM buforu fosforanowego (pH 7.0) w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Nanieść próbkę do kuwety o drodze optycznej 0.1 cm. Ustawić zakres długości fal λ dla widm dalekiego UV pomiędzy 190-260 nm. Ustawić rozdzielczość wewnętrzną oraz szerokość pasma na 1 nm.</li>
	<li>Zarejestrować sygnał CD z prędkością 50 nm/min w temperaturze 25 °C.</li>
</ol>

Autor oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Większość cząsteczek i jonów nie może swobodnie przenikać przez błony komórkowe, np. proton (H+) wymaga transportera błonowego w błonie plazmatycznej różnych organizmów i organelli, takich jak mitochondria83,84. Błony komórkowe są selektywne, a cząsteczki i jony, które przechodzą przez błony komórkowe, są różnorodne, więc w komórce można znaleźć kilka rodzajów białek błonowych, takich jak (a) transportery ABC, (b) kanały jonowe, (c) ATPazy związane z b...

Białka/enzymy błonowe są niezbędnymi składnikami biologicznymi komórek, ponieważ odgrywają kluczową rolę w różnych procesach1,2,3. Niektóre z funkcji mogą obejmować transport jonów i cząsteczek do i z kompartmentów wewnętrznych komórki / wewnętrznych (zarówno aktywnych/pasywnych), rozpoznawanie komórka-komórka, wiązanie międzykomórkowe, zakotwiczenie/przyłączanie i wykrywanie środowiska zewnętrznego poprzez integrację z maszynerią transdukcji sygnału w normalnych i trudnych warunkach fizycznych i chemicznych (wysoka zawartość soli, niska woda, wysoka temperatura, oporność na leki, itp.)3 Dlatego określenie trójwymiarowej (3D) struktury białek błonowych i/lub enzymów stało się bardzo ważne zarówno dla badań podstawowych, jak i stosowanych4,7,6. Co ważne, białka/enzymy błonowe są szeroko wykorzystywane jako cele do odkrywania leków (zarówno naturalnych, jak i zaprojektowanych)7,8,9. Oznacza to, że białka błonowe mają nieodłączne znaczenie dla zdrowia9,10,11.
Hydrofobowy charakter białek/enzymów błonowych jest najtrudniejszą technicznie właściwością fizykochemiczną dla laboratorium eksperymentalnego12,13,14, tym bardziej podczas pracy z oligomerycznymi i/lub bardzo labilnymi integralnymi białkami błonowymi15,16. Izolacja odpowiednich ilości białka/enzymu błonowego o najwyższej możliwej jakości do funkcjonalnych testów eksperymentalnych i badań strukturalnych jest wysoce pożądana17. Białka błonowe, które są z natury hydrofobowe, są bardzo trudne do oczyszczenia, a wybór detergentu jest zwykle jedną z najważniejszych kwestii, które należy wziąć pod uwagę17,18,19,20. W związku z tym metody laboratoryjne stosowane do izolowania białek błonowych zazwyczaj powodują pewien stopień uszkodzenia układu strukturalnego 3D białka21. Niektóre z tych metod obejmują użycie (a) sonikacji (fale ultradźwiękowe o wysokiej częstotliwości/energii), (b) detergentów rozpuszczających białka (ostrych, średnich lub delikatnych)22, (c) stosunkowo wysokich ciśnień w chromatografii kolumnowej i ultrawirowaniu z dużą prędkością23, (d) cząsteczek wytrącających, (e) enzymów trawiennych i innych21. Wszystkie te procesy mogą przyczyniać się do lub być główną przyczyną destabilizacji białek podczas oczyszczania21. Pod tym względem niektóre protokoły wydają się działać stosunkowo dobrze dla danego białka błonowego. Jednak optymalizacja jest zawsze mile widziana w przypadku korzystania z nowych nowoczesnych testów lub metod, które wymagają wyższej jakości przygotowania białka błonowego w celu uzyskania zadowalających wyników24. Kroki optymalizacyjne mogą obejmować, między innymi, ulepszenie konstrukcji konstrukcji, znalezienie optymalnych warunków dla ekspresji białek błonowych, ustanowienie lepszych warunków obsługi (tj. pH, temperatury itp.), znalezienie najlepszego kompatybilnego detergentu, dostosowanie etapów oczyszczania, takich jak czas sonikacji, prędkość wirowania, przeformułowanie roztworów buforowych poprzez dodanie środków stabilizujących itp.25,26,27. Dlatego każda zmiana w metodologii oczyszczania, która prowadzi do wzrostu jakości (czystości) i aktywności oczyszczonego białka/enzymu błonowego, jest ważna.
W rodzinie ATPazy typu P, błona plazmatyczna drożdży H+-ATPaza wydaje się być jednym z najbardziej labilnych członków28,29. H+-ATPaza traci swoją aktywność hydrolizującą ATP po odwodnieniu (liofilizacji), szoku cieplnym itp.28,29. Zastosowanie trehalozy jako stabilizatora białka przetestowano w izolacji błony komórkowej H+-ATPazy z drożdży K. lactis30,31; otrzymany preparat H+-ATPazy charakteryzował się wysoką czystością i wykazywał aktywność katalityczną. Co ważne, pozwoliło to na wyjaśnienie oligomerycznego stanu enzymu metodami biochemicznymi, ujawniając, że jest to heksamer, a następnie potwierdzone przez mikroskopię krioelektronową31,32,33,34,35. W związku z tym wydaje się prawdopodobne, że delikatne trójwymiarowe (3D) ułożenie białek błonowych może zostać utracone w stosunkowo trudnych warunkach podczas oczyszczania36. Kinetykę inaktywacji dwufazowej obserwuje się dla H+-ATPazy podczas inaktywacji za pośrednictwem ciepła29. W komórkach drożdży, podobnie jak w wielu innych organizmach, disacharydowa trehaloza gromadzi się w wysokich stężeniach w warunkach stresu środowiskowego37,38,39. Trehaloza utrzymuje integralność błony i funkcję transportową poprzez stabilizację białek (zarówno osadzonych w błonie, jak i cytozolowych) oraz błon komórkowych40,41. Mechanizm stabilizujący trehalozę został szeroko zbadany przez kilka grup oraz przez nasze laboratorium42,43,44,45. Eksperymenty z H+-ATPazą i innymi enzymami wykazały, że trehaloza jest najskuteczniejszym stabilizatorem białek wśród mono- i disacharydów28,29. Doprowadziło to do włączenia go do protokołu oczyszczania H+-ATPazy30. Ostatnio trehaloza została również wykorzystana do oczyszczania siateczki sarkoplazmatycznej Ca2+-ATPazy (SERCA) z szybkokurczliwych mięśni królika z dobrymi wynikami w czystości i aktywności białka46. Dlatego trehaloza wydaje się być dobrym i odpowiednim dodatkiem do oczyszczania ATPaz typu P i prawdopodobnie innych białek błonowych i cytozolowych.
Dla P-ATPaz istnienie strukturalnych domen cytoplazmatycznych jest eksperymentalną zaletą, szczególnie w badaniach interakcji substrat/ligand47; Wiązanie ATP zostało zbadane w wysoce czystych rekombinowanych domenach N47,48,49, eliminując w ten sposób techniczne rozważania dotyczące oczyszczania całych enzymów błonowych47,48,50, między innymi51. Niestety, niektóre badania funkcjonalne (katalityczna/konwersja energii) i strukturalne (układ podjednostek i interakcja z innymi białkami) nadal wymagają całej klasy P-ATPase<sup="xref">52,53. W związku z tym oczyszczenie SERCA zostało osiągnięte przez kilka grup badawczych54,55,56,57,58. Jednak ulepszenia nadal mogą być wdrażane46, na przykład zwiększając nienaruszoność oczyszczonej ATPase59, unikając denaturacji/zakłóceń kompleksów białkowych25, zwiększyć rozpuszczalność bez denaturacji białka błonowego (tj. unikając tworzenia agregatów makromolekularnych)60, prowadzić do lepszej kompatybilności z testami i innymi metodami analitycznymi61 Ponadto, w miarę pojawiania się nowych strategii eksperymentalnych, dodatków, inhibitorów enzymów itp. w literaturze naukowej61,62,63,64,65,66, czasami muszą być testowane z całą P-ATPazą. W pracy opisano protokół oczyszczania SERCA i zastosowania trehalozy jako dodatku stabilizującego strukturę białka i aktywność ATPazy; Oznacza to, że oprócz poprawy jakości enzymu (strukturalnej), trehaloza pomaga zapobiegać utracie struktury i aktywności enzymu podczas izolacji i przechowywania enzymu, co pomaga oszczędzać materiał biologiczny, a tym samym zmniejszać liczbę oczyszczań enzymów.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Azolectin z soi</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td></tr><tr><td>Stacjonarny transoświetlacz UV&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>Podwójna intensywność Wysokie ustawienie jest idealne do dokumentacji analitycznej. Niskie ustawienie zmniejsza fotonickowanie lub fotowybielanie próbek żelu podczas wykonywania prac przygotowawczych.</td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix B500 camera&nbsp;</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brylantowy niebieski G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610406</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl maltoside</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(eter 2-aminoetylowy)-N,N,N&prime;,N&prime; -tetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Sól tetrasodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodwodziana&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td>N-tetradecylo-N,N-dimetylo-3-amon-1-propanosulfonian</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolopirogronian (PEP)</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>Dehydrogenaza mleczanowa z mięśni królika</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza</td> <td>pirogronianowa z mięśni królikaSigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr> Spektropolarymetr <tr><td>dodecylosiarczanu sodu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Jasco Corp.</td><td>Jasco J1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloza</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>T0167</td><td>Dihydrat</td></tr><tr><td>chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu</td><td>Ultrawirówka Sigma-Aldrich Corp</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td></td> Spektrofotometr UV/VS <td>Beckman</td><td>Optima XPN</td><td></td></tr><tr><td>&NBSP;</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td>Spektrofotometr UV-Vis Agilent 8453 wykorzystuje matrycę fotodiod do jednoczesnego pomiaru pełnego widma światła ultrafioletowego do widzialnego</td></tr><tr><td>WiseStir HS-30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>Dh. WOS01010</td><td>Idealny do wszystkich zastosowań dyspergujących i homogenizujących, przeznaczony do rozdrabniaczy tkanek.</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej ca2+-atpazy z mięśni królika

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

Niektóre ATPazy typu P, takie jak Ca2+-ATPaza (SERCA) sarko/retikulum endoplazmatyczne, są z natury labilnymi białkami błonowymi, które wymagają specyficznych warunków fizykochemicznych podczas oczyszczania, aby uzyskać je o wysokiej czystości i jakości strukturalnej oraz w formie aktywnej katalitycznie. Trehaloza dwucucharydowa jest kompatybilną substancją rozpuszczoną, która jest syntetyzowana i gromadzona w wysokich stężeniach w cytoplazmie drożdży w celu stabilizacji błon i białek. Zastosowanie trehalozy jako dodatku w protokole oczyszczania błony plazmatycznej H+-ATPazy skutkuje uzyskaniem wysokiej jakości preparatu, którego strukturę heksameryczną wykazują biochemiczne metody analityczne. Trehaloza może być zatem stosowana jako dodatek stabilizujący do oczyszczania białek błonowych (P-ATPazy). Protokół ten opisuje modyfikację klasycznego protokołu oczyszczania SERCA poprzez poddanie SERCA wirowaniu na gradiencie stężeń trehalozy. Włączenie tego węglowodanu doprowadziło do oczyszczenia SERCA w formie aktywnej katalitycznie o wysokiej czystości i co ważne w formie stabilnej. Częściowa charakterystyka biochemiczna oczyszczonego SERCA (SDS-PAGE, kinetyka enzymów, znakowanie FITC, spektroskopia dichroizmu kołowego) wykazała, że enzym nadaje się do badań funkcjonalnych i strukturalnych. Sugeruje się zastosowanie trehalozy w protokole oczyszczania ATPaz typu P i innych labilnych białek błonowych (i cytozolowych).

SDS-PAGE białka SERCA na różnych etapach oczyszczania (Rysunek 1). Żel barwiony błękitem Coomassie wykazuje wzbogacenie prążka białka SERCA (pozorna masa cząsteczkowa &gt;100 kDa) w miarę postępu protokołu oczyszczania. Prążek białkowy odpowiadający SERCA wykazuje czystość &gt;90% po wirowaniu w gradiencie stężeń trehalozy. Wykres szybkości hydrolizy ATP w funkcji stężenia ATP (Rysunek 2A). Dla oczyszczonego SERCA zaobserwowano kinetykę ATPase według mo...

Ten protokół opisuje ulepszoną metodę oczyszczania SERCA, która obejmuje trehalozę disacharydową w końcowym etapie wirowania. Węglowodan ten stabilizuje białka w trudnych warunkach. Oczyszczone SERCA było aktywne katalitycznie i wykazywało wysoką czystość, dzięki czemu nadawało się do badań strukturalnych i funkcjonalnych.

Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

Nasze badania koncentrują się na oczyszczaniu SERCA, o wysokiej jakości strukturalnej i aktywności katalitycznej, jednocześnie badając, czy trehaloza stabilizuje SERCE podczas oczyszczania, zwiększając jego stabilność i funkcjonalność. Określenie trójwymiarowej struktury ATPaz typu P w ich stanach oligomerycznych. Wykorzystanie sztucznej inteligencji do modelowania strukturalnego ATPaz, symulacji dynamiki strukturalnej i dokowania molekularnego ligandów w celu zbadania terapii chorób i poprawy analizy funkcji białek oraz nowszych technologii. Obecne wyzwania obejmują zrozumienie mechanizmów konwersji energii w P-ATPazach, wyjaśnienie, w jaki sposób struktura czwartorzędowa reguluje funkcję i aktywność oraz identyfikację skutecznych inhibitorów do zastosowania terapeutycznego w chorobach człowieka. Potwierdzamy stan heksameryczny protono-ATPazy błony plazmatycznej GS i wykazujemy jej dynamikę strukturalną, zależność lub lepkość medium zgodnie z teorią Kramersa.[Narrator] Na początek zdobądź szybkokurczliwe mięśnie od dzikiego typu Oryctolagus cuniculus. Zawiesić go w trzech objętościach 100-milimolowego chlorku potasu do maceracji. Miksuj przez minutę, a następnie przez minutę lodowatego odpoczynku. Odwirować próbkę o masie 1 500 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut, aby usunąć resztki tkanki. Zebrać supernatant do probówki, a następnie homogenizować go za pomocą młynka do tkanek. Następnie odwirować homogenat, a następnie supernatant. Zawiesić granulki w około 40 mililitrach 0,5 molowej sacharozy. Teraz odwiruj zawiesinę w temperaturze 12 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut. Rozcieńczyć otrzymany supernatant w 0,6 molowym chlorku potasu i 0,15 molowej sacharozie przed odwirowaniem. Zawiesić osad zawierający arkusze pęcherzyków retikulum sarkoplazmatycznego w buforze zawierającym 0,3 molową sacharozę, 0,1 molowego chlorku potasu i 5 milimolowy trischlorowodorek o pH 7,0. Podwielokrotność pęcherzyków retikulum sarkoplazmatycznego w objętościach 1 mililitra. Zawiesinę pęcherzyków retikulum sarkoplazmatycznego inkubować na lodzie przez 10 minut, delikatnie mieszając, a następnie odwirować. Zawiesić osad w mniej niż 3 mililitrach 25-milimolowego buforu tris-chlorowodorku. Po homogenizacji zawiesiny dostosować ją do końcowej objętości 10 mililitrów z buforem tris-chlorowodorku. Określ stężenie białka za pomocą testu Lowry'ego. Dodaj azolektynę w ilości 5 miligramów na mililitr, a następnie dodaj 0,85 Zwittergent 3-14. Ponownie homogenizować zawiesinę i odwirowywać przy 100 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 60 minut. Zebrać supernatant do nowej probówki. Rozcieńczyć go w stosunku 1 do 2 2 milimolowym EGTA o pH 7,2. Delikatnie wlać zawiesinę na nieciągły gradient stężenia trehalozy w buforze Tris. Następnie odwirować jak poprzednio i zebrać przezroczysty, lekko żółty granulek. Delikatnie zawiesić osad w małej objętości bufora Tris. Zmierz stężenie białka, a następnie rozcieńcz je, aby dostosować stężenie białka do 2 miligramów na mililitr. Dla aktywności ATPazy należy przygotować 1 mililitr mieszaniny reakcyjnej. Wirować test reakcyjny w celu homogenizacji, a następnie inkubować go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Dodaj 0,9 jednostki dehydrogenazy L-mleczanowej i 1,5 jednostki kinazy pirogronianowej. Dodać 10 mikrogramów SERCA, aby zainicjować reakcję ATPazy. Monitoruj zmianę absorbancji co sekundę przez 600 sekund przy 340 nanometrach za pomocą spektrofotometru wyposażonego w termostatyczną oprawę ogniwa w celu określenia tworzenia się NAD. W celu oznaczania SERCA izotiocyjanianem fluoresceiny lub FITC, najpierw zawiesić 20 mikrogramów SERCA w 50 mikrolitrach buforu znakującego. Wiruj, aby dobrze wymieszać. Następnie inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15, 10, 7, 5 i 2 minuty. Aby zatrzymać reakcję etykietowania, dodaj równą objętość lodowatego buforu zatrzymującego. Inkubować na lodzie w ciemności przez 5 minut. Poddaj SERCA oznaczone FITC SDS-PAGE. Wystaw przezroczyste żele na działanie światła ultrafioletowego o długości fali 302 nanometrów i udokumentuj wynik na zdjęciach. Na koniec zabarwij żel kolorem Coomassie blue. Udokumentuj wynik na zdjęciu. W celu analizy widm dichroizmu kołowego należy najpierw zawiesić SERCA w 400 mikrolitrach 10-milimolowego buforu fosforanowego o pH 7,0 w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Załaduj próbkę do komórki o długości ścieżki 0,1 centymetra. Teraz ustaw zakres widm dalekiego ultrafioletu od 190 do 260 nanometrów, a wewnętrzną rozdzielczość i szerokość pasma na 1 nanometr. Nagraj sygnał dichroizmu kołowego z prędkością 50 nanometrów na minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Barwiony na niebiesko żel SDS-PAGE Coomassie wykazał wzbogacanie pasma białkowego SERCA w miarę postępu oczyszczania. Końcowy etap oczyszczania SERCA z wykorzystaniem ultrawirowania na gradiencie stężenia trehalozy pozwolił uzyskać czystość przekraczającą 90%. Pęcherzyki retikulum sarkoplazmatycznego zawierały dużą ilość SERCA, przy czym około 73% całkowitego białka w pęcherzykach odpowiadało tej P-ATPazie. Zaobserwowano wzorzec kinetyczny Michaelisa-Mentena dla oczyszczonego SERCA w krzywej szybkości hydrolizy ATP w funkcji stężenia ATP, potwierdzając jego funkcjonalność enzymatyczną. Wykres Lineweavera-Burka ujawnił stałą Michaelisa wynoszącą około 10 mikromoli dla ATP, zgodną z wcześniej podawanymi wartościami. Znakowanie SERCA metodą FITC wykazało nienaruszone miejsce wiązania nukleotydów. Niebiesko zabarwiona opaska SERCA Coomassie odpowiadała dokładnie opasce oznaczonej FITC. Spektroskopia dichroizmu kołowego potwierdziła wysoką jakość strukturalną oczyszczonego SERCA, którego widmo wskazuje na dobrze zdefiniowane elementy struktury drugorzędowej.

purification-sarco-endoplasmic-reticulum-ca2-atpase-from-rabbit

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy Ca2 + retikulum sarkoplazmatycznego i rozkurczowej funkcji usuwania wapnia w kardiomiocytach za pomocą systemu obrazowania wapnia.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Ten protokół opisuje oczyszczanie F 1-ATPazy z hodowli owadów Trypanosoma brucei. W wyniku zabiegu powstaje wysoce czysty, jednorodny i aktywny kompleks odpowiedni do badań strukturalnych i enzymatycznych.

Izolacja 1-ATPazy F z pasożytniczego protisty Trypanosoma brucei

Mitochondria są kluczowymi organellami metabolicznymi, które wykazują wysoki poziom plastyczności fenotypowej w mięśniach szkieletowych. Import białek z cytozolu jest krytycznym szlakiem biogenezy organelli, niezbędnym do ekspansji retikulum i utrzymania funkcji mitochondriów.  Dlatego import białka służy jako barometr zdrowia komórek.

Pomiar zdolności importowej białek z mitochondriów mięśni szkieletowych

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Poznaj metodę oczyszczania SERCA z mięśni królika przy użyciu trehalozy. Technika ta zapewnia ponad 90% czystość białka i zachowanie aktywności katalitycznej, co umożliwia szczegółowe badania strukturalne i funkcjonalne tego kluczowego enzymu transportującego wapń.

Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca²⁺-ATPazy z mięśni królika

Przeglądaj więcej filmów