Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika

Nasze badania koncentrują się na oczyszczaniu SERCA, o wysokiej jakości strukturalnej i aktywności katalitycznej, jednocześnie badając, czy trehaloza stabilizuje SERCE podczas oczyszczania, zwiększając jego stabilność i funkcjonalność. Określenie trójwymiarowej struktury ATPaz typu P w ich stanach oligomerycznych. Wykorzystanie sztucznej inteligencji do modelowania strukturalnego ATPaz, symulacji dynamiki strukturalnej i dokowania molekularnego ligandów w celu zbadania terapii chorób i poprawy analizy funkcji białek oraz nowszych technologii. Obecne wyzwania obejmują zrozumienie mechanizmów konwersji energii w P-ATPazach, wyjaśnienie, w jaki sposób struktura czwartorzędowa reguluje funkcję i aktywność oraz identyfikację skutecznych inhibitorów do zastosowania terapeutycznego w chorobach człowieka. Potwierdzamy stan heksameryczny protono-ATPazy błony plazmatycznej GS i wykazujemy jej dynamikę strukturalną, zależność lub lepkość medium zgodnie z teorią Kramersa.

[Narrator] Na początek zdobądź szybkokurczliwe mięśnie od dzikiego typu Oryctolagus cuniculus. Zawiesić go w trzech objętościach 100-milimolowego chlorku potasu do maceracji. Miksuj przez minutę, a następnie przez minutę lodowatego odpoczynku. Odwirować próbkę o masie 1 500 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut, aby usunąć resztki tkanki. Zebrać supernatant do probówki, a następnie homogenizować go za pomocą młynka do tkanek. Następnie odwirować homogenat, a następnie supernatant. Zawiesić granulki w około 40 mililitrach 0,5 molowej sacharozy. Teraz odwiruj zawiesinę w temperaturze 12 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut. Rozcieńczyć otrzymany supernatant w 0,6 molowym chlorku potasu i 0,15 molowej sacharozie przed odwirowaniem. Zawiesić osad zawierający arkusze pęcherzyków retikulum sarkoplazmatycznego w buforze zawierającym 0,3 molową sacharozę, 0,1 molowego chlorku potasu i 5 milimolowy trischlorowodorek o pH 7,0. Podwielokrotność pęcherzyków retikulum sarkoplazmatycznego w objętościach 1 mililitra. Zawiesinę pęcherzyków retikulum sarkoplazmatycznego inkubować na lodzie przez 10 minut, delikatnie mieszając, a następnie odwirować. Zawiesić osad w mniej niż 3 mililitrach 25-milimolowego buforu tris-chlorowodorku. Po homogenizacji zawiesiny dostosować ją do końcowej objętości 10 mililitrów z buforem tris-chlorowodorku. Określ stężenie białka za pomocą testu Lowry'ego. Dodaj azolektynę w ilości 5 miligramów na mililitr, a następnie dodaj 0,85 Zwittergent 3-14. Ponownie homogenizować zawiesinę i odwirowywać przy 100 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 60 minut. Zebrać supernatant do nowej probówki. Rozcieńczyć go w stosunku 1 do 2 2 milimolowym EGTA o pH 7,2. Delikatnie wlać zawiesinę na nieciągły gradient stężenia trehalozy w buforze Tris. Następnie odwirować jak poprzednio i zebrać przezroczysty, lekko żółty granulek. Delikatnie zawiesić osad w małej objętości bufora Tris. Zmierz stężenie białka, a następnie rozcieńcz je, aby dostosować stężenie białka do 2 miligramów na mililitr. Dla aktywności ATPazy należy przygotować 1 mililitr mieszaniny reakcyjnej. Wirować test reakcyjny w celu homogenizacji, a następnie inkubować go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Dodaj 0,9 jednostki dehydrogenazy L-mleczanowej i 1,5 jednostki kinazy pirogronianowej. Dodać 10 mikrogramów SERCA, aby zainicjować reakcję ATPazy. Monitoruj zmianę absorbancji co sekundę przez 600 sekund przy 340 nanometrach za pomocą spektrofotometru wyposażonego w termostatyczną oprawę ogniwa w celu określenia tworzenia się NAD. W celu oznaczania SERCA izotiocyjanianem fluoresceiny lub FITC, najpierw zawiesić 20 mikrogramów SERCA w 50 mikrolitrach buforu znakującego. Wiruj, aby dobrze wymieszać. Następnie inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15, 10, 7, 5 i 2 minuty. Aby zatrzymać reakcję etykietowania, dodaj równą objętość lodowatego buforu zatrzymującego. Inkubować na lodzie w ciemności przez 5 minut. Poddaj SERCA oznaczone FITC SDS-PAGE. Wystaw przezroczyste żele na działanie światła ultrafioletowego o długości fali 302 nanometrów i udokumentuj wynik na zdjęciach. Na koniec zabarwij żel kolorem Coomassie blue. Udokumentuj wynik na zdjęciu. W celu analizy widm dichroizmu kołowego należy najpierw zawiesić SERCA w 400 mikrolitrach 10-milimolowego buforu fosforanowego o pH 7,0 w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Załaduj próbkę do komórki o długości ścieżki 0,1 centymetra. Teraz ustaw zakres widm dalekiego ultrafioletu od 190 do 260 nanometrów, a wewnętrzną rozdzielczość i szerokość pasma na 1 nanometr. Nagraj sygnał dichroizmu kołowego z prędkością 50 nanometrów na minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Barwiony na niebiesko żel SDS-PAGE Coomassie wykazał wzbogacanie pasma białkowego SERCA w miarę postępu oczyszczania. Końcowy etap oczyszczania SERCA z wykorzystaniem ultrawirowania na gradiencie stężenia trehalozy pozwolił uzyskać czystość przekraczającą 90%. Pęcherzyki retikulum sarkoplazmatycznego zawierały dużą ilość SERCA, przy czym około 73% całkowitego białka w pęcherzykach odpowiadało tej P-ATPazie. Zaobserwowano wzorzec kinetyczny Michaelisa-Mentena dla oczyszczonego SERCA w krzywej szybkości hydrolizy ATP w funkcji stężenia ATP, potwierdzając jego funkcjonalność enzymatyczną. Wykres Lineweavera-Burka ujawnił stałą Michaelisa wynoszącą około 10 mikromoli dla ATP, zgodną z wcześniej podawanymi wartościami. Znakowanie SERCA metodą FITC wykazało nienaruszone miejsce wiązania nukleotydów. Niebiesko zabarwiona opaska SERCA Coomassie odpowiadała dokładnie opasce oznaczonej FITC. Spektroskopia dichroizmu kołowego potwierdziła wysoką jakość strukturalną oczyszczonego SERCA, którego widmo wskazuje na dobrze zdefiniowane elementy struktury drugorzędowej.