Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Nasze badania mają na celu zrozumienie roli podzbiorów neutrofili i tego, w jaki sposób przyczyniają się one do patogenezy chorób zapalnych, takich jak toczeń. W szerszym sensie nasza praca pokazuje również niejednorodność populacji neutrofili w biologii człowieka i to, jak może się ona zmieniać w zależności od różnych stanów fizjologicznych. Nowe badania pokazują, że populacje neutrofili u ludzi są niejednorodne.

Jednak neutrofile są nadal badane jako pojedyncza populacja ze względu na trudności w niezawodnym wyizolowaniu podtypów bez aktywacji i w wystarczającej ilości. Nasz protokół zapewnia metodę nietkniętej izolacji i podstawowej charakterystyki podtypów neutrofili, przezwyciężając te problemy. Ostatnie badania, choć ograniczone, wykazały, że podtypy neutrofili, takie jak neutrofile o niskiej gęstości, odgrywają rolę w zmienionych stanach fizjologicznych, takich jak ciąża i stan zapalny, a także w chorobach takich jak gruźlica, autoimmunizacja i rak.

Nasz protokół umożliwi powtarzalne, rzetelne badania nad wkładem tych komórek w zdrowie i choroby ludzkie. Teraz, gdy mamy przetestowany, solidny protokół oddzielania neutrofili o niskiej gęstości od neutrofili o normalnej gęstości, skupiamy się na odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące tego, jak te neutrofile o niskiej gęstości prezentują się w stanach zapalnych. Jesteśmy szczególnie zainteresowani tym, czym różnią się one od neutrofili o normalnej gęstości pod względem liczby komórek, fenotypu immunologicznego, metabolizmu immunologicznego i nie tylko.

Na początek oznacz cztery 50-mililitrowe stożkowe rurki do izotonicznych roztworów roboczych 100%81%70% i 55%Dodaj 27 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do pierwszej probówki oznaczonej 100%Dodaj 3 mililitry 10X PBS. Następnie odmierz wymagane objętości izotonicznych 100% roztworów roboczych i 1X PBS dla każdego stężenia roztworów roboczych. Dodaj go do odpowiednich stożkowych rurek.

Użyj pipety Pasteura, aby dokładnie wymieszać w celu uzyskania jednorodności. Teraz ostrożnie ułóż 3 mililitry izotonicznego 81% roztworu roboczego na dnie 15-mililitrowej stożkowej tuby. Następnie powoli i delikatnie nałóż 3 mililitry izotonicznego 70% roztworu roboczego na wierzch, upewniając się, że warstwy się nie mieszają.

Aby przygotować bufor do separacji komórek, połącz 2% płodową surowicę bydlęcą, 1 milimol EDTA i PBS do całkowitej objętości 500 mililitrów. Odpipetować do dokładnego wymieszania w celu uzyskania jednorodności. Dokładnie obracaj kulki magnetyczne przez 30 sekund, aby upewnić się, że są całkowicie zawieszone przed użyciem.

Dla każdego dawcy podaj 4 mililitry krwi pełnej do trzech oddzielnych 14-mililitrowych probówek z okrągłym dnem. Odpipetować 200 mikrolitrów koktajlu izolacyjnego neutrofili i 200 mikrolitrów kulek magnetycznych do każdej probówki. Delikatnie odpipetować roztwór, aby ponownie zawiesić mieszaninę przed inkubacją, aby umożliwić odczynnikom związanie się z niechcianymi komórkami.

Następnie dodaj bufor do separacji komórek do każdej probówki, aby uzupełnić objętość do 12 mililitrów i dobrze wymieszaj. Umieść probówki bez pokrywek na stojaku magnetycznym i inkubuj. Teraz użyj pipety serologicznej, aby ostrożnie przenieść przezroczystą zawiesinę komórek zawierającą neutrofile z każdej probówki do nowej, czystej probówki.

Następnie wyjmij oryginalną rurkę z magnesu. Ponownie wiruj kulki magnetyczne przez 30 sekund. Dodaj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych do nowo przeniesionej zawiesiny komórek przed ponownym zawieszeniem i inkubacją, jak pokazano wcześniej.

Umieść rurki z powrotem na magnesie bez pokrywek. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej przenieść klarowną zawiesinę komórek zawierającą wyizolowane neutrofile do nowej probówki. Wyciągnij izolowane zawiesiny neutrofili uzyskane z krwi pełnej do jednej 50-mililitrowej probówki.

Uzupełnij probówkę do całkowitej objętości 50 mililitrów za pomocą bufora do separacji komórek. Odwirować z włączoną przerwami, a następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 1 mililitrze buforu do separacji komórek. Po ponownym odwirowaniu zawiesiny wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 3 mililitrach pożywki o gradiencie gęstości 55%.

Powoli ułóż 3 mililitry pożywki o gradiencie gęstości 55% zawierającej zawiesinę komórek na wcześniej przygotowanych rurkach gradientu gęstości, unikając zakłóceń gradientu. Odwirować probówki o sile 720 G przez 30 minut bez użycia przerwy. Po odwirowaniu należy ostrożnie obchodzić się z probówkami, aby nie naruszyć warstw.

Za pomocą pipety transferowej ostrożnie odizoluj oddzielne warstwy zawierające neutrofile o niskiej i normalnej gęstości i przenieś je do oddzielnych oznakowanych 15-mililitrowych probówek. Aby zmyć resztki pożywki o gradiencie gęstości, dodaj PBS do każdej 15-mililitrowej probówki do oznaczenia 15 mililitrów. Następnie odwirować przy 400 G przez 5 minut w temperaturze pokojowej z włączoną przerwami.

Policz komórki w każdej frakcji na hemocytometrze przed dalszymi eksperymentami. Nawarstwienie całkowitej liczby neutrofili na ośrodku gradientu gęstości doprowadziło do pomyślnego uformowania się dwóch odrębnych pasm. Przy czym neutrofile o niskiej gęstości tworzą górne pasmo, a neutrofile o normalnej gęstości tworzą dolne pasmo.

Przeciążenie pożywki gradientu gęstości neutrofilami powyżej 5-6 milionów komórek na mililitr spowodowało, że prążki wydawały się rozproszone, zwiększając ryzyko mieszania się podtypów. Średnia czystość izolacji wynosiła 93,8% dla neutrofili o niskiej gęstości i 96,3% dla neutrofili o normalnej gęstości z minimalnym zanieczyszczeniem innymi typami komórek.