Name: Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej człowieka. Protokół wykorzystuje gradient gęstości i separację magnetyczną, zapewniając wysoką czystość próbek do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Health Research Board EIA-2024-002 oraz Royal City of Dublin Hospital Trust. Chcielibyśmy podziękować dr Lorraine Thong i dr Kevinowi Brownowi za ich pomoc w pobraniu próbek od zdrowych dawców do tego manuskryptu.

Próbki krwi zostały pobrane za świadomą zgodą zdrowych uczestników. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Badań zarówno Szpitala św. Jakuba, jak i Szpitala Uniwersyteckiego w Tallaght.
1. Przygotowanie podłoża o gradiencie gęstości, frakcji izotonicznych roztworów roboczych i buforu do separacji komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie izotonicznych roztworów roboczych z ośrodka o gradiencie gęstości
	<ol>
		<li>Przygotowanie 100% roztworu roboczego Isotonic (~1,123 g/mL)
		<ol>
			<li>Aby przygotować izotoniczny 100% roztwór roboczy, połącz 27 ml pożywki o gradiencie gęstości z 3 ml 10x PBS. W ten sposób powstaje roztwór izotoniczny nadający się do dalszych rozcieńczeń.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie izotonicznego roztworu roboczego 81% (~1,0996 g/mL)
		<ol>
			<li>Przygotować izotoniczny 81% roztwór roboczy, mieszając 8,1 ml izotonicznego 100% roztworu roboczego (przygotowanego w kroku 1.1.1) z 1,9 ml 1x PBS. Dokładnie wymieszaj, aby zapewnić jednorodność.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie izotonicznego 70% roztworu roboczego (~1,0861 g/ml)
		<ol>
			<li>Aby przygotować izotoniczny 70% roztwór roboczy, połącz 7 ml izotonicznego 100% roztworu roboczego z 3 ml 1x PBS. Upewnij się, że roztwór jest dobrze wymieszany.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie izotonicznego 55% roztworu roboczego (1,0676 g/ml)
		<ol>
			<li>Przygotuj izotoniczny 55% roztwór roboczy, mieszając 5,5 ml izotonicznego 100% roztworu roboczego z 4,5 ml 1x PBS. Dokładnie wymieszaj.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakładanie warstw frakcji gradientowych
	<ol>
		<li>Nakładanie warstw frakcji gradientowej
		<ol>
			<li>Używając stożkowej probówki o pojemności 15 ml, ostrożnie nałóż na dno 3 ml izotonicznego 81% roztworu roboczego. Następnie powoli i delikatnie nałóż 3 ml izotonicznego 70% roztworu roboczego na wierzch, unikając mieszania warstw. Ten gradient zostanie wykorzystany do separacji komórek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu do separacji komórek
	<ol>
		<li>Przygotowanie 500 ml buforu do separacji komórek
		<ol>
			<li>Aby przygotować bufor do separacji komórek, połącz 2% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) z 1x PBS do całkowitej objętości 500 ml. Użyj tego bufora do mycia i ponownego zawieszania komórek podczas procesu izolacji. 
			UWAGA: Upewnij się, że warstwy są dobrze oddzielone i nienaruszone. W tym protokole izotoniczne roztwory robocze są określane jako "100%", "81%", "70%" i "55%" w oparciu o metodę przygotowania, zgodną z wcześniejszymi badaniami5. Należy jednak wyjaśnić, że etykiety te nie reprezentują rzeczywistych końcowych stężeń roztworów roboczych. Na przykład pożywkę o gradiencie gęstości "100%" przygotowuje się przez zmieszanie 27 ml pożywki o gradientze o czystej gęstości z 3 ml 10x PBS, co daje końcowe stężenie 90% izotonicznego roztworu roboczego. Kolejne rozcieńczenia (np. "81%", "70%" i "55%") podobnie odzwierciedlają proporcje preparatu, a nie rzeczywiste stężenia procentowe. Nomenklatura ta została zachowana w celu zachowania spójności z terminologią używaną we wcześniejszej literaturze przedmiotu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja neutrofili z krwi pełnej za pomocą selekcji negatywnej
<ol>
	<li>Przygotowanie koralików magnetycznych
	<ol>
		<li>Dokładnie obracaj kulki magnetyczne przez 30 sekund, aby upewnić się, że są całkowicie zawieszone przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie krwi
	<ol>
		<li>Dla każdego dawcy podajcie 4 ml krwi pełnej do trzech oddzielnych probówek okrągłodennych o pojemności 14 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodanie koktajlu izolującego neutrofile i kulek magnetycznych
	<ol>
		<li>Do każdej probówki dodać 50 μl koktajlu izolującego neutrofile i 50 μl kulek magnetycznych na ml krwi. Na 4 ml krwi dodaj 200 μl każdego odczynnika.</li>
		<li>Mieszaninę należy dobrze zawiesić, delikatnie pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut, aby odczynniki mogły związać się z niepożądanymi komórkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i separacja magnetyczna - pierwsza runda
	<ol>
		<li>Uzupełnij każdą probówkę do 12 ml za pomocą buforu do separacji komórek i dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Umieść probówki bez pokrywek na magnesie i pozwól im inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić przyciągnięcie kulek magnetycznych związanych z niechcianymi komórkami do ścianki probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór niepowiązanych komórek
	<ol>
		<li>Ostrożnie przenieść przezroczystą zawiesinę komórek zawierających neutrofile z każdej probówki do nowej, czystej probówki za pomocą pipety do przenoszenia. Wyjmij oryginalną rurkę z magnesu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowna aplikacja i inkubacja kulek magnetycznych - druga runda
	<ol>
		<li>Ponownie wiruj kulki magnetyczne przez 30 sekund. Dodaj taką samą objętość kulek magnetycznych do nowo przeniesionej zawiesiny komórek, jak w kroku 2.3. Dokładnie zawiesić i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Końcowa separacja magnetyczna i zbieranie
	<ol>
		<li>Umieść probówki z powrotem na magnesie bez pokrywek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść zawiesinę przezroczystych komórek do nowej probówki. Ta końcowa zawiesina reprezentuje izolowaną całkowitą populację neutrofili.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oddzielenie neutrofili o niskiej gęstości (LDN) i neutrofili o normalnej gęstości (NDN) od całkowitej populacji neutrofili
<ol>
	<li>Gromadzenie i przygotowanie zawiesin komórek
	<ol>
		<li>Dla każdego dawcy należy połączyć izolowane zawiesiny neutrofili w probówkach o pojemności 50 ml. Uzupełnij każdą probówkę do całkowitej objętości 50 ml za pomocą buforu do separacji komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirowania
	<ol>
		<li>Odwirować probówki o stężeniu 400 x g przez 5 minut przy temperaturze pokojowej przy włączonym hamulcu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowne zawieszenie i zliczanie komórek
	<ol>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 1 ml buforu do separacji komórek. Wykonaj zliczanie komórek, aby określić całkowitą liczbę neutrofili.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie podłoża o gradiencie gęstości
	<ol>
		<li>Ponownie odwirować probówki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej z włączonym hamulcem. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 3 ml pożywki o gradiencie gęstości 55%. Aby uzyskać optymalną rozdzielczość, użyj 3 ml pożywki o gradiencie gęstości 55% na 5-6 × 106 całkowitych neutrofili.</li>
		<li>W razie potrzeby podziel zawieszone komórki na wiele wstępnie przygotowanych probówek gradientu gęstości, upewniając się, że 3 ml zawiesiny komórek jest ułożone warstwami w każdej probówce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakładanie warstw na rurki gradientu gęstości
	<ol>
		<li>Zawiesinę komórkową o objętości 3 ml zawierającą pożywkę o gradiencie gęstości 55% należy powoli nakładać na gotowe probówki z gradientem gęstości (przygotowane zgodnie z opisem w sekcji 1). Zapewnij staranne nakładanie warstw, aby nie zakłócać gradientu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirowanie w gradiacji gęstości
	<ol>
		<li>Wirować probówki o masie 720 x g przez 30 minut bez użycia hamulca. Po odwirowaniu należy ostrożnie obchodzić się z probówkami, aby nie naruszyć warstw.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja frakcji neutrofili
	<ol>
		<li>Po odwirowaniu obserwuj, jak neutrofile rozdzielają się na dwie odrębne warstwy: 
		Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) będą zlokalizowane na granicy faz 55%/70%, tworząc górne pasmo na poziomie około 3 ml, a neutrofile o normalnej gęstości (NDN) będą znajdować się na granicy faz 70%/81%, pojawiając się jako dolne pasmo wokół znaku 6 ml.</li>
		<li>Za pomocą pipety transferowej ostrożnie odizoluj każdą warstwę i przenieś je do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie wydzielonych frakcji
	<ol>
		<li>Aby zmyć wszelkie resztki pożywki o gradiencie gęstości, dodaj 1x PBS do każdej probówki o pojemności 15 ml do oznaczenia 15 ml.</li>
		<li>Wirować przy 400 × g przez 5 minut przy suchej temperaturze rynkowej z włączonym hamulcem. Jeśli komórki nie tworzą twardego osadu, a zamiast tego pozostają zawieszone, powtórzyć ten etap płukania, wskazując na obecność pozostałego podłoża o gradiencie gęstości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zliczanie komórek i dalsze aplikacje
	<ol>
		<li>Policz komórki w każdej frakcji i przystąp do dalszych zastosowań, takich jak eksperymenty metaboliczne, barwienie cytometrią przepływową, ekstrakcja RNA lub liza białek w razie potrzeby. 
		UWAGA: Po wysianiu ogniw zaleca się obracanie płytki z prędkością 210 × g przez 1 minutę (hamulec wyłączony).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Fenotypowanie izolowanych LDN i NDN
<ol>
	<li>Wyizoluj ~ 0,5-1 × 106 LDN i NDN. Wykonaj 2x skoncentrowany mastermix przeciwciał przy użyciu bloku CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc i barwienia żywotności.</li>
	<li>Wyizolowane populacje LDN i NDN wybarwić równoważną objętością mastermixu przeciwciał tak, aby końcowe rozcieńczenie przeciwciał barwiących komórki wynosiło odpowiednio 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, blok Fc) i 1:50 (barwienie żywotności).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 10 minut w ciemności w temperaturze RT. 
	UWAGA: Upewnij się, że komórki są dokładnie wymieszane z mieszanką główną przeciwciał i blokiem Fc.</li>
	<li>Umyć komórki raz PBS, a następnie odwirować przy 400 × g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Utrwal komórki w 1% paraformaldehydzie (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Ponownie przemyć komórki PBS, odwirować przy 400 × g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 200 μl PBS lub w razie potrzeby i jak najszybciej pobrać komórki na cytometrze przepływowym. 
	UWAGA: Barwione i utrwalone komórki mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze 4 ◦C w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu fluoroforów. Jednak najlepiej byłoby, gdyby procedura fenotypowania została przeprowadzona natychmiast po barwieniu i utrwaleniu, aby zapewnić optymalną żywotność komórek i dokładne wyniki.</li>
</ol>

<ol><li>Tracchi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neutrophil+lifespan+in+patients+with+congestive+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Increased neutrophil lifespan in patients with congestive heart failure.</a> Eur J Heart Fail. 11 (4), 378-385 (2009).</li>
<li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-option+of+neutrophil+fates+by+tissue+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Co-option of neutrophil fates by tissue environments.</a> Cell. 183 (5), 1282-1297.e18 (2020).</li>
<li>Mckenna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Need+for+standardized+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Need for standardized nomenclature.</a> Front Immunol. 12, 602963(2021).</li>
<li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis Rheumatol. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Hardisty, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+isolation+of+low+density+neutrophils+casts+doubt+on+their+exceptionality+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease.</a> Front Immunol. 12, 625922(2021).</li>
<li>Scapini, P., Marini, O., Tecchio, C., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neutrophils+in+the+saga+of+cellular+heterogeneity%3A+Insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human neutrophils in the saga of cellular heterogeneity: Insights and open questions.</a> Immunol Rev. 273 (1), 48-60 (2016).</li>
<li>Ssemaganda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neutrophil+subsets+in+healthy+human+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of neutrophil subsets in healthy human pregnancies.</a> PLoS One. 9 (2), e85696(2014).</li>
<li>Tay, S. H., Celhar, T., Fairhurst, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+neutrophils+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Rheumatol. 72 (10), 1587-1595 (2020).</li>
<li>Hassani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+low-density+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">On the origin of low-density neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).</li>
<li>Cowland, J. B., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neutrophil+precursors+from+bone+marrow+for+biochemical+and+transcriptional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of neutrophil precursors from bone marrow for biochemical and transcriptional analysis.</a> J Immunol Methods. 232 (1-2), 191-200 (1999).</li>
<li>Blanco-Camarillo, C., Aleman, O. R., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+neutrophils+in+healthy+individuals+display+a+mature+primed+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype.</a> Front Immunol. 12, 672520(2021).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes+display+immature+cells+with+enhanced+NET+formation+in+people+living+with+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes display immature cells with enhanced NET formation in people living with HIV.</a> Sci Rep. 13 (1), 13282(2023).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Ui Mhaonaigh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+granulocytes+in+anca+vasculitis+are+heterogenous+and+hypo-responsive+to+anti-myeloperoxidase+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Low density granulocytes in anca vasculitis are heterogenous and hypo-responsive to anti-myeloperoxidase antibodies.</a> Front Immunol. 10, 2603(2019).</li>
<li>Mosca, T., Forte, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficiency+and+impact+on+the+activity+of+blood+neutrophils+isolated+by+Percoll%2C+Ficoll+and+spontaneous+sedimentation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Comparative efficiency and impact on the activity of blood neutrophils isolated by Percoll, Ficoll and spontaneous sedimentation methods.</a> Immunol Invest. 45 (1), 29-37 (2016).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+apoptotic+neutrophils+and+macrophages+and+impaired+macrophage+phagocytic+clearance+of+apoptotic+neutrophils+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Rheum. 48 (10), 2888-2897 (2003).</li>
<li>Connelly, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+methods+for+the+accurate+characterization+of+whole+blood+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils.</a> Sci Rep. 12 (1), 3667(2022).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes+in+systemic+autoimmunity+and+autoinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation.</a> Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).</li>
<li>Yennemadi, A. S., Keane, J., Leisching, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetic+changes+in+systemic+lupus+erythematosus+immune+cell+subsets%3A+Contributions+to+pathogenesis+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetic changes in systemic lupus erythematosus immune cell subsets: Contributions to pathogenesis and clinical applications.</a> Lupus. 32 (5), 603-611 (2023).</li>
<li>Futoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+low-density+granulocytes+after+colorectal+cancer+surgery+in+predicting+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22BJS+Open%22%5BJournal%5D)">Peripheral low-density granulocytes after colorectal cancer surgery in predicting recurrence.</a> BJS Open. 7 (1), zrac154(2023).</li>
<li>Dwivedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+dysfunctional+neutrophils+with+a+defect+in+arginase-1+release+in+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19.</a> JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę podziału całkowitej populacji neutrofili na neutrofile o niskiej i normalnej gęstości, wraz z charakterystyką fenotypową każdego typu komórek za pomocą cytometrii przepływowej dostosowanej do poprzednich metod5.
Protokół ten opiera się na izolacji LDN i NDN z krwi pełnej. Kluczowym krokiem jest wyizolowanie całkowitej liczby neutrofili za pomocą metod selekcji negatywnej. Metody selekcji pozytywnej polegają na zastosowa...

Neutrofile to ziarniste komórki odpornościowe i najliczniejsza leukocyty we krwi obwodowej, stanowiące średnio około 50%-70% leukocytów. Rozwijają się one w szpiku kostnym z prekursorów granulocytów-monocytów (GMP), które z kolei rozwijają się z hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) w obecności czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF). W homeostazie mają długość życia ~24 godziny, ale badania wykazały, że ich żywotność może być przedłużona w określonych warunkach fizjologicznych i związanych z nimi mikrośrodowiskach, takich jak przewlekła aktywacja immunologiczna1, zapalenie1, a nawet pobyt tkankowy w stanie stacjonarnym2. Neutrofile od dawna uważane są za pierwszą linię obrony przed patogenami i wywołują ich działanie przeciwdrobnoustrojowe poprzez 3 główne funkcje efektorowe - degranulację, fagocytozę oraz aktywację i uwalnianie pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) (NETosis).
Większość badań nad funkcją neutrofili i biologią analizuje wyniki dla całej populacji neutrofili. Jednak od badań nad nowotworami określających podtypy N1 (przeciwnowotworowe) / N2 (pronowotworowe) do klasyfikacji neutrofili na podstawie dojrzałości, choroby i stanu fizjologicznego, a nawet gęstości komórkowej (neutrofile o niskiej gęstości i normalnej gęstości), staje się coraz bardziej oczywiste, że ludzka populacja neutrofili stanowi fenotypowo zróżnicowane podtypy. Niezależnie od tego, czy istnienie tych podtypów neutrofili można przypisać całkowicie odrębnym typom komórek, czy też złożonej naturze plastyczności, istnieje coraz więcej literatury na temat atypowych neutrofili i stanowi ona fascynującą okazję do badania neutrofili o niskiej gęstości oddzielnie od neutrofili o normalnej gęstości3.
Opisany po raz pierwszy u pacjentów z TRU jako podzbiór prozapalnych neutrofili4, LDN zostały zidentyfikowane w chorobach przewlekłych, ciąży, a nawet w zdrowym krążeniu, zarówno w zdolnościach prozapalnych, jak i supresyjnych5,6,7,8. LDN znajdują się jednocześnie z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC), gdy krew pełna jest odwirowywana na pożywkach o gradiencie gęstości. Ich gęstość właściwa odpowiada około 1,077 g/ml, w porównaniu do NDN o stężeniu 1,083 g/ml9. Chociaż wciąż toczy się poważna debata na ten temat, istnieją spekulacje, że LDN przypominają bardziej niedojrzały fenotyp granulocytów (podobny do promielocytów i mielocytów, o gęstości poniżej 1,080 g / ml)9,10. Inni nadal spekulują, że istnieją zarówno dojrzałe, jak i niedojrzałe fenotypy LDN w zależności od obecności lub braku choroby11,12,13. Niemniej jednak LDN wykryto również u osób zdrowych; Jednak ich włączenie do niektórych badań jest ograniczone ze względu na trudności w wyizolowaniu ich w wystarczającej liczbie5.
To badanie miało na celu wyizolowanie tych dwóch populacji w ilościach, które pozwoliłyby nam na przeprowadzenie dalszych eksperymentów metabolicznych in situ (minimum 0,5 × 106 komórek/ml). W ten sposób istniejący protokół5 został zoptymalizowany za pomocą powszechnie zgłaszanych markerów fenotypowych13,14, które zapewniają najlepszy wynik dla izolacji i charakterystyki LDN i NDN z krwi pełnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).

<table><tbody><tr><td>14 ml polipropylenowa probówka z okrągłym dnem (17 x 100 mm)</td><td>Corning Science</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-ludzki CD14 (63D3)</td><td>BioLegend</td><td>367118</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anty-ludzki CD10 (25 testów)</td><td>BioLegend</td><td>312217</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Saline buforowany fosforanem</td><td>Sigma</td><td>D8537-1L</td><td></td></tr><tr><td>Magnes</td> <td>EasySep EasyEightsStemCell Technologies</td><td>#18103</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Buffer (bufor do separacji komórek)</td><td>StemCell Technologies</td><td>#20144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Bezpośredni zestaw do izolacji ludzkich neutrofili</td><td>StemCell Technologies</td><td>#19666</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-ludzki CD16 (3G8)</td><td>BioLegend</td><td>302005</td><td></td></tr><tr><td>Kulki kompensacyjne OneComp eBeads</td><td>eBioscience Inc.</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anty-ludzki CD86 (BU63)</td><td>BioLegend</td><td>374209</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anty-ludzki CD15 (SSEA-1)</td><td>BioLegend</td><td>323037</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do naprawy Zombie NIR BioLegend</td><td></td><td>423105</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

The Isolation and Characterization of Low- and Normal- Density Neutrophils from Whole Blood

Pojawiające się badania pokazują, że populacja krążących neutrofili u ludzi składa się z różnych podtypów i nie powinna być badana jako pojedyncza populacja, jak to miało miejsce w przeszłości. W szczególności wykazano, że neutrofile o niskiej i normalnej gęstości (LDN, NDN) mają funkcjonalnie i metabolicznie odrębne profile, co należy wziąć pod uwagę przy publikowaniu badań nad neutrofilami. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowaną metodę nietkniętej izolacji i separacji LDN i NDN od krwi pełnej.
Medium o gradiencie gęstości (1,135 g/ml) jest łączone o 9:10 z 10x PBS. Specyficzne gradienty gęstości 55%, 70% i 81% są następnie wytwarzane przez połączenie pożywki o gradinie gęstości 100% z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Neutrofile wyizolowane z 12 ml obwodowej krwi pełnej uzyskanej od dawców, którzy wyrazili zgodę przy użyciu zestawu do izolacji magnetycznej opartej na selekcji negatywnej, są ponownie zawieszane we frakcji 55%. Objętość 3 ml frakcji 81% i 70% umieszcza się warstwami w probówce o pojemności 15 ml, a następnie frakcję 55% zawierającą całkowitą liczbę neutrofili. Gradienty gęstości są następnie odwirowywane przy 720 x g przez 30 minut. Dwa odrębne pasma są uzyskiwane na granicy faz 55%/70% (LDN) i 70%/81% (NDN). Komórki są ostrożnie pipetowane do oddzielnych probówek i przemywane za pomocą PBS. Czystość wyizolowanych frakcji określa się za pomocą cytometrii przepływowej. Zarówno LDN, jak i NDN zdefiniowano jako CD14lo CD15+ SSChi za pomocą cytometrii przepływowej. Czystość izolacji obliczono na ≥93% komórek żywotnych dla obu typów.
Ta metoda zapewnia niezawodne i skuteczne podejście do oddzielania LDN i NDN od krwi obwodowej, zapewniając wysoką czystość i żywotność izolowanych komórek. Zwiększenie precyzji izolacji neutrofili ułatwia dokładniejsze dalsze analizy tych odrębnych subpopulacji neutrofili. Mają one kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat heterogeniczności neutrofili i jej implikacji w różnych kontekstach fizjologicznych i patologicznych.

Prawidłowe nałożenie całkowitej populacji neutrofili na medium gradientu gęstości można zaobserwować na Rysunku 1B. Powinny powstać dwa wyraźne pasma. Jeśli dojdzie do wymieszania gradientów lub jeśli liczba nałożonych neutrofili na probówkę jest zbyt wysoka (powyżej około 5-6 × 106), pasma będą rozmyte (Rysunek 1C), co znacznie zwiększa ryzyko wymieszania się dwóch podtypów neutrofili. Aby tego uniknąć, zaleca się nakładanie do 5-6 × 106 c...

Tutaj oferujemy niezawodne podejście do izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej za pomocą izolacji magnetycznej (selekcja negatywna) i podłoża o nieciągłym gradinie gęstości. Zapewnia nietkniętą izolację komórek o wysokiej czystości (≥93%), ułatwiając dokładną analizę subpopulacji neutrofili, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w zdrowiu i chorobie.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Emerging research shows that the circulating neutrophil population in humans consists of diverse subtypes and should not be studied as a single ...

Nasze badania mają na celu zrozumienie roli podzbiorów neutrofili i tego, w jaki sposób przyczyniają się one do patogenezy chorób zapalnych, takich jak toczeń. W szerszym sensie nasza praca pokazuje również niejednorodność populacji neutrofili w biologii człowieka i to, jak może się ona zmieniać w zależności od różnych stanów fizjologicznych. Nowe badania pokazują, że populacje neutrofili u ludzi są niejednorodne.Jednak neutrofile są nadal badane jako pojedyncza populacja ze względu na trudności w niezawodnym wyizolowaniu podtypów bez aktywacji i w wystarczającej ilości. Nasz protokół zapewnia metodę nietkniętej izolacji i podstawowej charakterystyki podtypów neutrofili, przezwyciężając te problemy. Ostatnie badania, choć ograniczone, wykazały, że podtypy neutrofili, takie jak neutrofile o niskiej gęstości, odgrywają rolę w zmienionych stanach fizjologicznych, takich jak ciąża i stan zapalny, a także w chorobach takich jak gruźlica, autoimmunizacja i rak.Nasz protokół umożliwi powtarzalne, rzetelne badania nad wkładem tych komórek w zdrowie i choroby ludzkie. Teraz, gdy mamy przetestowany, solidny protokół oddzielania neutrofili o niskiej gęstości od neutrofili o normalnej gęstości, skupiamy się na odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące tego, jak te neutrofile o niskiej gęstości prezentują się w stanach zapalnych. Jesteśmy szczególnie zainteresowani tym, czym różnią się one od neutrofili o normalnej gęstości pod względem liczby komórek, fenotypu immunologicznego, metabolizmu immunologicznego i nie tylko.Na początek oznacz cztery 50-mililitrowe stożkowe rurki do izotonicznych roztworów roboczych 100%81%70% i 55%Dodaj 27 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do pierwszej probówki oznaczonej 100%Dodaj 3 mililitry 10X PBS. Następnie odmierz wymagane objętości izotonicznych 100% roztworów roboczych i 1X PBS dla każdego stężenia roztworów roboczych. Dodaj go do odpowiednich stożkowych rurek.Użyj pipety Pasteura, aby dokładnie wymieszać w celu uzyskania jednorodności. Teraz ostrożnie ułóż 3 mililitry izotonicznego 81% roztworu roboczego na dnie 15-mililitrowej stożkowej tuby. Następnie powoli i delikatnie nałóż 3 mililitry izotonicznego 70% roztworu roboczego na wierzch, upewniając się, że warstwy się nie mieszają.Aby przygotować bufor do separacji komórek, połącz 2% płodową surowicę bydlęcą, 1 milimol EDTA i PBS do całkowitej objętości 500 mililitrów. Odpipetować do dokładnego wymieszania w celu uzyskania jednorodności. Dokładnie obracaj kulki magnetyczne przez 30 sekund, aby upewnić się, że są całkowicie zawieszone przed użyciem.Dla każdego dawcy podaj 4 mililitry krwi pełnej do trzech oddzielnych 14-mililitrowych probówek z okrągłym dnem. Odpipetować 200 mikrolitrów koktajlu izolacyjnego neutrofili i 200 mikrolitrów kulek magnetycznych do każdej probówki. Delikatnie odpipetować roztwór, aby ponownie zawiesić mieszaninę przed inkubacją, aby umożliwić odczynnikom związanie się z niechcianymi komórkami.Następnie dodaj bufor do separacji komórek do każdej probówki, aby uzupełnić objętość do 12 mililitrów i dobrze wymieszaj. Umieść probówki bez pokrywek na stojaku magnetycznym i inkubuj. Teraz użyj pipety serologicznej, aby ostrożnie przenieść przezroczystą zawiesinę komórek zawierającą neutrofile z każdej probówki do nowej, czystej probówki.Następnie wyjmij oryginalną rurkę z magnesu. Ponownie wiruj kulki magnetyczne przez 30 sekund. Dodaj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych do nowo przeniesionej zawiesiny komórek przed ponownym zawieszeniem i inkubacją, jak pokazano wcześniej.Umieść rurki z powrotem na magnesie bez pokrywek. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej przenieść klarowną zawiesinę komórek zawierającą wyizolowane neutrofile do nowej probówki. Wyciągnij izolowane zawiesiny neutrofili uzyskane z krwi pełnej do jednej 50-mililitrowej probówki.Uzupełnij probówkę do całkowitej objętości 50 mililitrów za pomocą bufora do separacji komórek. Odwirować z włączoną przerwami, a następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 1 mililitrze buforu do separacji komórek. Po ponownym odwirowaniu zawiesiny wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 3 mililitrach pożywki o gradiencie gęstości 55%.Powoli ułóż 3 mililitry pożywki o gradiencie gęstości 55% zawierającej zawiesinę komórek na wcześniej przygotowanych rurkach gradientu gęstości, unikając zakłóceń gradientu. Odwirować probówki o sile 720 G przez 30 minut bez użycia przerwy. Po odwirowaniu należy ostrożnie obchodzić się z probówkami, aby nie naruszyć warstw.Za pomocą pipety transferowej ostrożnie odizoluj oddzielne warstwy zawierające neutrofile o niskiej i normalnej gęstości i przenieś je do oddzielnych oznakowanych 15-mililitrowych probówek. Aby zmyć resztki pożywki o gradiencie gęstości, dodaj PBS do każdej 15-mililitrowej probówki do oznaczenia 15 mililitrów. Następnie odwirować przy 400 G przez 5 minut w temperaturze pokojowej z włączoną przerwami.Policz komórki w każdej frakcji na hemocytometrze przed dalszymi eksperymentami. Nawarstwienie całkowitej liczby neutrofili na ośrodku gradientu gęstości doprowadziło do pomyślnego uformowania się dwóch odrębnych pasm. Przy czym neutrofile o niskiej gęstości tworzą górne pasmo, a neutrofile o normalnej gęstości tworzą dolne pasmo.Przeciążenie pożywki gradientu gęstości neutrofilami powyżej 5-6 milionów komórek na mililitr spowodowało, że prążki wydawały się rozproszone, zwiększając ryzyko mieszania się podtypów. Średnia czystość izolacji wynosiła 93,8% dla neutrofili o niskiej gęstości i 96,3% dla neutrofili o normalnej gęstości z minimalnym zanieczyszczeniem innymi typami komórek.

the-isolation-characterization-low-normal-density-neutrophils-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Neutrofile należą do pierwszych komórek docierających do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej, a ich funkcje i mechanizmy zostały szeroko zbadane in vitro. Prezentujemy standardową metodę separacji w gradiencie gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu komercyjnie dostępnych mediów separacyjnych.

Protokół izolacji neutrofili

W tym filmie opisujemy procedurę izolowania neutrofili o niskiej gęstości (LDN) z płynu z płukania otrzewnowej u pooperacyjnego pacjenta. Uzyskane w ten sposób LDN mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach w celu zrozumienia ich roli we wzroście i progresji guza.

Izolacja neutrofili o niskiej gęstości otrzewnej: technika uzyskiwania neutrofili o niskiej gęstości z płynu do płukania otrzewnej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

W tym filmie pokazujemy izolację cytotoksycznych neutrofili o wysokiej gęstości i neutrofili o niskiej gęstości z krwi myszy z nowotworem przez nieciągłe wirowanie w gradinie sacharozy.

Izolacja cytotoksycznych neutrofili z krwi myszy zawierającej nowotwór

Ten film demonstruje test in vitro do badania interakcji neutrofil-biofilm. Bakterie chorobotwórcze osadzone w biofilmie i wyizolowanych neutrofilach oznaczono za pomocą znaczników fluorescencyjnych, a odpowiedź immunologiczną neutrofili i unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Nowe protokoły są tutaj opisane do izolowania i charakteryzowania mikrocząsteczek pochodzących z neutrofili ludzkich i mysich. Protokoły te wykorzystują techniki ultrawirowania, cytometrii przepływowej i immunoblottingu do analizy zawartości mikrocząstek i mogą być wykorzystywane do badania roli mikrocząstek pochodzących z różnych typów komórek w funkcjonowaniu komórek.

Izolacja i charakterystyka mikrocząstek pochodzących z neutrofili do badań funkcjonalnych

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolacji neutrofili z krwi pełnej, kożuchów lub błon leukaferezy, osiągając dobrą wydajność, wysoką czystość i minimalną aktywację komórek. Wykorzystujemy oczyszczanie gradientowe, sedymentację czerwonych krwinek (RBC) i lizę RBC, aby uzyskać wysokiej jakości / czysty preparat neutrofili.

Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

To badanie przedstawia dwie techniki izolowania licznych pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) ze szpiku kostnego szczura. Jedna metoda łączy komercyjny zestaw do izolacji neutrofili z wirowaniem w gradionym przepływie gęstości, podczas gdy druga wykorzystuje tylko wirowanie w gradiencie gęstości. Oba podejścia dają funkcjonalne NET przewyższające te z neutrofili krwi obwodowej.

Unikalne podejście do izolowania neutrofili szpiku kostnego szczurów o porównywalnej pojemności

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj metodę izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej człowieka. Protokół wykorzystuje gradient gęstości i separację magnetyczną, zapewniając wysoką czystość próbek do badań immunologicznych.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów