Protokół izolacji neutrofili
23 lipca 2008
Neutrofile są jednymi z pierwszych komórek, które docierają do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej, a ich funkcje i mechanizmy były intensywnie badane in vitro. Demonstrujemy standardową metodę separacji gradientu gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu dostępnych na rynku pożywek separacyjnych.
Protokół izolacji neutrofili. Ta procedura spowoduje ekstrakcję białych krwinek z próbki krwi pełnej, wirówki i fiolek. Vortex sir filtr strzykawkowy do igieł i strzykawek.
Milli pour marka MX gv 0,22 Materiały mikrometryczne. Separacja neutrofili w roztworze zaklęcia Hanka i soli wymaga dwóch rodzajów roztworów HBSS. HBSS z chlorkiem wapnia zostanie użyty do przygotowania roztworu z albuminą surowicy ludzkiej.
HBSS bez chlorku wapnia będzie używany do zawieszania i płukania neutrofili. Należy zachować szczególną ostrożność, aby w tej procedurze użyć odpowiedniego roztworu HBSS. Albumina surowicy ludzkiej lub HSA jest białkiem w osoczu krwi, które utrzymuje pH i ciśnienie SMO.
Nie należy stosować buforu do lizy krwinek czerwonych z mieszaniną surowicy bydlęcej. Jest to produkowane przez Roche Diagnostics, pożywkę izolacyjną neutrofili NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separacyjne media chronione przed światłem i przechowywane w lodówce w celu uzyskania najlepszych wyników. Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową w momencie użycia.
Wyjmij odczynniki z lodówki na godzinę przed eksperymentem. Przygotować roztwór H-B-S-S-H-S-A do separacji neutrofili. Odpipetować HBSS z chlorkiem wapnia do fiolki.
Pobrać HSA do strzykawki. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza. Wyjąć igłę strzykawki i zastąpić ją filtrem.
Wstrzyknij HSA przez filtr do fiolki HBSS wir dwa mieszać, gdy masz gotowe inne materiały i w temperaturze pokojowej uzyskaj około 15 mililitrów pełnej krwi. Da to od 10 do 15 mililitrów od 10 do ósmych neutrofili. Dawca nie powinien był spożywać alkoholu ani leków dostępnych bez recepty przez 24 godziny przed oddaniem próbki krwi.
Mogą one zakłócić proces separacji. Krew pełna może być antykoagulowana cytrynianem EDTA lub heparyną, dodając dziewięć części krwi do jednej części K, trzy EDTA, cytrynian sodu lub heparynę zgodnie z instrukcjami producenta. Poniższe kroki zostaną opisane w tej procedurze.
Oddziel i usuń osocze i monocyty. Oddzielić i uzyskać warstwę neutrofili, lizę czerwonych krwinek wolne, zawiesić neutrofile w pierwszej separacji. Pozyskiwanie neutrofili w warstwie NIM.
Zebrać pięć mililitrów pożywki izolacyjnej w probówce wirówkowej. Umieszczenie medium izolacyjnego niżej w probówce pozwala mu działać jak filtr, ponieważ wirówka będzie ostrożnie przetłaczać przez nią krew. Nałóż pięć mililitrów krwi na NIM, aby uzyskać czystą separację.
Bądź bardzo ostrożny, aby uniknąć mieszania roztworów. Wykonaj ten krok powoli i ostrożnie, trzymając końcówkę pipety blisko powierzchni rozdzielczego medium, aby zapobiec mieszaniu się wirówki. Roztwór przy 500 RCF przez 35 minut.
W temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza krew powinna rozdzielić się na sześć wyraźnych pasm. Sześć prążków to monocyty osocza, pożywki izolacyjne, neutrofile, więcej pożywki izolacyjnej i osad czerwonych krwinek na dole. Jeśli te sześć pasm nie jest jasnych i wyraźnych, oznacza to, że proces separacji nie był czysty i musiałby zostać powtórzony.
Częstymi przyczynami złej separacji są stare podłoże izolacyjne, dawca spożywający alkohol w ciągu ostatnich 72 godzin lub dawca, który spożył inne leki, takie jak Tylenol lub aspiryna. Ostrożnie usunąć i wyrzucić monocyty osocza i pożywki izolacyjne. Umieść te warstwy w zamykanej probówce i ostrożnie wyrzuć pipetowanie warstwy neutrofili i wszystkich pożywek izolacyjnych znajdujących się pod neutrofilami do czystego pliku wirówkowego, aby odzyskać jak najwięcej neutrofili.
Często najłatwiej jest dołączyć również niektóre nośniki izolacyjne z warstwy poniżej. Nie naruszaj palety na dole. Druga deklaracja, udoskonalić warstwę neutrofili.
Rozcieńczyć roztwór neutrofili do 10 mililitrów HBSS bez wapnia. Odwróć probówkę kilka razy, aby zawiesić odwirowanie komórek. Roztwór neutrofili.
350 RCF przez 10 minut. W temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza na dnie probówki powinna znajdować się czerwona osadka zawierająca neutrofile i resztki czerwonych krwinek. Usuń nadnatyn za pomocą pipety.
Bądź ostrożny. aby zakłócić granulkę na dole. Liza czerwonych krwinek.
Czerwone krwinki w próbce muszą teraz zostać zniszczone przez lizę. Aby usunąć resztki czerwonych krwinek, dodaj dwa mililitry buforu do lizy krwinek czerwonych do probówki do resus. Zawiesić wir osadu w fiolce w ustawieniu od trzech do czterech.
Unikaj zwiększania ustawienia wiru powyżej czterech, ponieważ może to spowodować aktywację neutrofili. Może być konieczne wirowanie przez kilka sekund lub pulsowanie wiru w celu rozpuszczenia podniebienia. Odwirować roztwór do lizy przy 250 RCF przez pięć minut.
Użyj opcji łagodnego startu, aby zminimalizować uszkodzenia próbki. Usuń nadnatynkę za pomocą pipety. Powtórz proces lizy.
W razie potrzeby uwolnić zawiesinę neutrofili, dodać 500 mikrolitrów HBSS bez wapnia do każdej probówki. Wirować osad w ustawieniu od trzech do czterech, rozcieńczyć do 10 mililitrów za pomocą HPSS bez wirówki wapnia. Neutrofile w temperaturze 250 RCF przez pięć minut odsysają snat i odrzucają.
Ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach HBSS z roztworem HSA, dwa razy 10 do sześciu. Zwykle zbiera się neutrofile na mililitr.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę izolacji ludzkich neutrofili z pełnej krwi z wykorzystaniem standardowej techniki separacji gradientu gęstości. Neutrofile odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej na stan zapalny, a zrozumienie ich izolacji jest niezbędne dla dalszych badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Neuronauka
Tło
- Neutrofile są jednymi z pierwszych komórek odpowiadających na reakcje zapalne.
- Ich funkcje i mechanizmy były szeroko badane in vitro.
- Techniki izolacji są niezbędne do badania zachowania i funkcji neutrofili.
- Standaryzowane metody poprawiają powtarzalność badań.
Cel badania
- Przedstawić niezawodną metodę izolacji neutrofili z ludzkiej krwi.
- Ułatwić dalsze badania nad funkcjami neutrofili w stanie zapalnym.
- Dostarczyć protokół, który można łatwo przyjąć w laboratoriach.
Stosowane metody
- Metoda separacji gradientu gęstości.
- Wykorzystanie komercyjnie dostępnych mediów separacyjnych.
- Wyposażenie obejmuje wirówkę i fiolki.
- Przygotowanie roztworów z wykorzystaniem HBSS z chlorkiem wapnia i albuminą surowicy ludzkiej.
Główne wyniki
- Udana izolacja neutrofili z próbek pełnej krwi.
- Wykazanie skuteczności metody separacji.
- Dostarczenie jasnego protokołu dla badaczy.
- Potencjalne zastosowania w badaniu zachowania neutrofili w różnych warunkach.
Wnioski
- Przedstawiona metoda jest skuteczna w izolowaniu neutrofili.
- Ten protokół może poprawić badania nad odpowiedziami immunologicznymi.
- Dalsze badania mogą opierać się na tej technice izolacji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
