Name: Protokół izolacji neutrofili (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji neutrofili z ludzkiej krwi pełnej przy użyciu gradientu gęstości. Ten protokół umożliwia badanie funkcji komórek odpornościowych w odpowiedzi zapalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie z grantu NIH R01 HL56621.

&nbsp;Protokół izolacji neutrofili
<ol>
<li>Doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. </li>
<li>Do probówki do wirowania odmierzyć 5,0 ml medium do izolacji neutrofili. Ostrożnie nanieść 5,0 ml krwi na medium separacyjne. Krok ten należy wykonywać powoli i ostrożnie, prowadząc końcówkę pipety blisko powierzchni medium, aby uniknąć zmieszania krwi z medium.</li>
<li>Wirować przy 500 RCF przez 35 min w temperaturze 20-25°C. Krew powinna rozdzielić się na 6 wyraźnych warstw: plazmę, monocyty, medium do izolacji, neutrofile, kolejną warstwę medium do izolacji oraz osad erytrocytów (Rycina 1). Jeśli warstwy te nie są wyraźne, proces separacji nie przebiegł prawidłowo i należy go powtórzyć.</li>
<li>Ostrożnie usunąć trzy górne warstwy (plazmę, monocyty i medium do izolacji) za pomocą pipety. Warstwy te należy zutylizować.</li>
<li>Ostrożnie pobrać pipetą warstwę neutrofili oraz całe medium do izolacji znajdujące się pod neutrofilami. Przenieść roztwór do czystej probówki do wirowania.</li>
<li>Rozcieńczyć roztwór neutrofili do objętości 10 ml za pomocą HBSS bez Ca2+/Mg2+. Odwrócić probówkę kilka razy, aby zawiesić komórki. </li>
<li>Wirować roztwór neutrofili przy 350 RCF przez 10 minut. Na dnie probówki powinien pojawić się czerwony osad zawierający neutrofile i pozostałe erytrocyty (RBC). Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety, tak aby nie naruszyć osadu.</li>
<li>W celu lizy pozostałych erytrocytów dodać do probówki 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (Red Cell Lysis Buffer). Aby resuspenderć osad, mieszać fiolkę w wibratorze laboratoryjnym (vortex) przy ustawieniu 3-4. Należy unikać zwiększania mocy vortexu powyżej 4, ponieważ może to doprowadzić do aktywacji neutrofili. Może być konieczne mieszanie przez kilka sekund lub stosowanie krótkich impulsów w celu rozpuszczenia osadu. </li>
<li>Wirować probówkę przy 250 RCF przez 5 min. Usunąć nadsącz pipetą. W razie potrzeby powtórzyć proces lizy.</li>
<li>Dodać 500 μl HBSS bez Ca2+/Mg2+ do każdej probówki. Ponownie resuspenderć osad w vortexie przy ustawieniu 3-4. Rozcieńczyć do 10 ml za pomocą HBSS bez Ca2+/Mg2+.</li>
<li>Wirować probówki przy 250 RCF przez 5 min. Odessać nadsącz i go zutylizować.</li>
<li>Resuspenderć osad w 250 μl roztworu HBSS/HSA (2% HSA). Następnie można policzyć komórki i dostosować je do pożądanego stężenia.</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

Metoda separacji w gradiencie gęstości jest stosowana do izolacji ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu mieszaniny metrizoanu sodu i Dextran 500. Metoda ta opiera się na procedurze separacji leukocytów jednojądrowych opracowanej przez Boyuma (1968), która została zmodyfikowana pod kątem separacji neutrofili przez Ferrante i Thonga (1980).
Po pobraniu od dawcy, krew pełną można przeciwkrzeplić za pomocą EDTA, cytrynianu lub heparyny. Ze względu na krótki czas życia, neutrofile należy wy...

<table><tbody><tr><td>Limfocyt Poly(R)</td><td>Odczynnik</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>PolymorphprepTM może być stosowany jako alternatywa</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli bez chlorku wapnia</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin surowicy ludzkiej</td><td>Odczynnik</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy erytrocytów</td><td>Odczynnik</td><td>Grupa Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło wirusowe</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura i gruszki</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Odczynnik</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Alternatywny odczynnik dla Lymphocyte-Poly (R)</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Inne</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0,22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, sterylizowalny gamma</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Zrównoważony roztwór soli z chlorkiem wapnia</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół izolacji neutrofili

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrofilowe granulocyty wielojądrzaste (PMN) są najliczniejszą populacją leukocytów u ludzi i należą do pierwszych komórek docierających do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej. Ze względu na ich kluczową rolę w zapaleniu, szeroko bada się funkcje neutrofili, takie jak lokomocja, produkcja cytokin, fagocytoza oraz zwalczanie komórek nowotworowych. Aby scharakteryzować specyficzne funkcje neutrofili, w badaniach in vitro pożądana jest czysta, szybka i niezawodna metoda ich oddzielania od pozostałych komórek krwi, szczególnie że neutrofile mają krótki czas przeżycia i powinny zostać wykorzystane w ciągu 2–4 godzin od pobrania. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy standardową metodę rozdziału w gradiencie gęstości w celu izolacji ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu dostępnego komercyjnie medium do rozdziału, które stanowi mieszaninę metrizoanu sodu i Dextranu 500. Procedura polega na nałożeniu krwi pełnej na medium gradientowe, wirowaniu, oddzieleniu frakcji neutrofili oraz lizie pozostałych erytrocytów. Następnie komórki są płukane, liczone i resuspendowane w buforze do pożądanego stężenia. Wykazano, że przy prawidłowym przeprowadzeniu metoda ta pozwala na uzyskanie próbek zawierających >95% neutrofili o żywotności >95%.

Neutrofile należą do pierwszych komórek docierających do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej, a ich funkcje i mechanizmy zostały szeroko zbadane in vitro. Prezentujemy standardową metodę separacji w gradiencie gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu komercyjnie dostępnych mediów separacyjnych.

Protokół izolacji neutrofili

Neutrofile, czyli wielojądrowe granulocyty (PMN), są najliczniejszymi leukocytami u ludzi i należą do pierwszych komórek docierających do miejsca stanu zapalnego...

Protokół izolacji neutrofili. Procedura ta służy do wydzielenia leukocytów z próbki krwi pełnej przy użyciu wirówki i probówek. Mieszadło wortex, igła i strzykawka, filtr strzykawkowy.Materiały marki Milli pore MX gv 0,22 Mikrometra. Separacja neutrofili w roztworze soli Hanksa wymaga dwóch rodzajów roztworów HBSS. HBSS z chlorkiem wapnia zostanie użyty do przygotowania roztworu z albuminą surowicy ludzkiej.HBSS bez chlorku wapnia zostanie użyty do zawieszenia i przemywania neutrofili. Należy zachować szczególną ostrożność, aby w tej procedurze użyć odpowiedniego roztworu HBSS. Albumina surowicy ludzkiej lub HSA to białko w osoczu krwi, które utrzymuje pH i ciśnienie osmotyczne.Nie należy używać buforu do lizy czerwonych krwinek z amalgamatem surowicy bydlęcej. Produkt ten jest wytwarzany przez Roche Diagnostics, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media; należy chronić go przed światłem i przechowywać w lodówce, aby uzyskać najlepsze wyniki. Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową w momencie użycia.Wyjąć odczynniki z lodówki na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotować roztwór H-B-S-S-H-S-A do separacji neutrofili. Pipetować HBSS z chlorkiem wapnia do fiolki.Naciągnąć HSA do strzykawki. Należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza. Zdjąć igłę ze strzykawki i zastąpić ją filtrem.Wstrzyknij HSA przez filtr do fiolki z HBSS, wymieszaj w wortexie; gdy pozostałe materiały będą przygotowane i doprowadzone do temperatury pokojowej, pobierz około 15 ml krwi pełnej. Pozwoli to na uzyskanie od 10 do 15 ml zawiesiny neutrofili o stężeniu 10⁸. Dawca nie powinien spożywać alkoholu ani przyjmować leków dostępnych bez recepty na 24 godziny przed pobraniem próbki krwi.Mogą one zakłócić proces separacji. Krew pełną można przeciwzakrzepić za pomocą EDTA, cytrynianu lub heparyny, dodając dziewięć części krwi do jednej części K3EDTA, cytrynianu sodu lub heparyny zgodnie z instrukcjami producenta. W niniejszej procedurze opisane zostaną następujące kroki.Oddziel i usuń osocze oraz monocyty. Oddziel i pobierz warstwę neutrofili, lizując erytrocyty w celu uzyskania zawiesiny neutrofili po pierwszej separacji. Pobierz neutrofile z warstwy NIM.Do probówki wirówkowej należy zebrać pięć mililitrów medium do izolacji. Umieszczenie medium do izolacji w dolnej części probówki pozwala mu pełnić funkcję filtra, ponieważ wirówka będzie wymuszać przepływ krwi w dół przez medium. Ostrożnie nanieś warstwę pięciu mililitrów krwi na NIM, aby zapewnić czystą separację.Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dopuścić do zmieszania roztworów. Ten krok należy przeprowadzać powoli i starannie, trzymając końcówkę pipety blisko powierzchni medium rozdzielczego, aby zapobiec wymieszaniu. Wirować roztwór przy 500 RCF przez 35 minut.W temperaturze od 20 do 25 °C krew powinna rozdzielić się na sześć wyraźnych warstw. Są to: osocze, monocyty, medium izolacyjne, neutrofile, kolejna warstwa medium izolacyjnego oraz pellet czerwonych krwinek na dnie. Jeśli te sześć warstw nie jest wyraźnych i odrębnych, proces separacji nie przebiegł prawidłowo i należy go powtórzyć.Do częstych przyczyn nieprawidłowej separacji należą: przeterminowane medium do izolacji, spożycie alkoholu przez dawcę w ciągu ostatnich 72 godzin lub przyjmowanie przez dawcę innych leków, takich jak Tylenol lub aspiryna. Ostrożnie usuń i odrzuć frakcję monocytów osocza oraz medium do izolacji. Umieść te warstwy w szczelnej probówce i zutylizuj; następnie ostrożnie pipetuj warstwę neutrofili oraz całe medium do izolacji znajdujące się pod neutrofilami do czystej probówki wirówkowej, aby odzyskać jak największą liczbę neutrofili.Często najprościej jest pobrać również nieco medium izolacyjnego z warstwy poniżej. Nie zakłócaj osadu na dnie. Kolejny krok: oczyszczanie warstwy neutrofili.Rozcieńczyć roztwór neutrofili do 10 ml za pomocą HBSS bez wapnia. Kilka razy odwrócić probówkę, aby zawiesić komórki, a następnie odwirować roztwór neutrofili.350 RCF przez 10 minut. W temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza na dnie probówki powinien znajdować się czerwony osad zawierający neutrofile i pozostałe erytrocyty. Usunąć nadsącz za pomocą pipety.Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć osadu na dnie podczas lizy erytrocytów.Krwinki czerwone w próbce muszą teraz zostać zniszczone poprzez lizę. Aby przeprowadzić lizę pozostałych krwinek czerwonych, dodaj do probówki z osadem dwa mililitry buforu do lizy erytrocytów. Resuspenduj osad, mieszając fiolkę na wirówce typu vortex przy ustawieniu od trzech do czterech.Należy unikać zwiększania ustawień wirówki vortex powyżej poziomu cztery, ponieważ może to doprowadzić do aktywacji neutrofili. W celu rozpuszczenia osadu może być konieczne mieszanie w vortexie przez kilka sekund lub stosowanie trybu pulsacyjnego. Wirować roztwór lizujący z prędkością 250 RCF przez pięć minut.Użyj opcji miękkiego startu (soft start), aby zminimalizować uszkodzenia próbki. Usuń nadsącz za pomocą pipety. Powtórz proces lizy.W razie potrzeby, aby uwolnić zawiesinę neutrofili, dodać 500 µL HBSS bez wapnia do każdej probówki. Przewirrować osad na ustawieniu od trzech do czterech, rozcieńczyć do 10 mL za pomocą HPSS bez wapnia i odwirować. Neutrofile wirować przy 250 RCF przez pięć minut, a następnie odessać i usunąć nadsącz.Osad resuspendować w 250 µL roztworu HBSS z HSA; zazwyczaj zbiera się 2 × 10⁶ neutrofili na ml.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół izolowywania neutrofili

Ten film demonstruje test in vitro do badania interakcji neutrofil-biofilm. Bakterie chorobotwórcze osadzone w biofilmie i wyizolowanych neutrofilach oznaczono za pomocą znaczników fluorescencyjnych, a odpowiedź immunologiczną neutrofili i unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

W poniższym protokole opisujemy bardzo prosty sposób izolowania neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych (NET) z ludzkiej krwi pełnej za pomocą łatwo dostępnych odczynników. Następnie pokazujemy, w jaki sposób wyizolowane NET można wykorzystać w teście adhezji in vitro z komórkami nowotworowymi.

Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET)

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Opisujemy tutaj metodę uzyskiwania i identyfikowania nowo scharakteryzowanej subpopulacji gigantycznych fagocytów pochodzących z neutrofili. Komórki te rozwijają się w hodowli ze świeżych neutrofili ludzkiej krwi i charakteryzują się fagocytozą, autofagią, niezwykle dużymi rozmiarami i wydłużoną żywotnością. Metoda ta jest niezbędna do dalszego badania tej unikalnej subpopulacji pochodzącej z neutrofili.

Opracowanie i identyfikacja nowej subpopulacji ludzkich fagocytów olbrzymich pochodzących z neutrofili in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolacji neutrofili z krwi pełnej, kożuchów lub błon leukaferezy, osiągając dobrą wydajność, wysoką czystość i minimalną aktywację komórek. Wykorzystujemy oczyszczanie gradientowe, sedymentację czerwonych krwinek (RBC) i lizę RBC, aby uzyskać wysokiej jakości / czysty preparat neutrofili.

Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Tutaj oferujemy niezawodne podejście do izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej za pomocą izolacji magnetycznej (selekcja negatywna) i podłoża o nieciągłym gradinie gęstości. Zapewnia nietkniętą izolację komórek o wysokiej czystości (≥93%), ułatwiając dokładną analizę subpopulacji neutrofili, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w zdrowiu i chorobie.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj metodę izolacji neutrofili z ludzkiej krwi pełnej przy użyciu gradientu gęstości. Ten protokół umożliwia badanie funkcji komórek odpornościowych w odpowiedzi zapalnej.

Protokół izolacji neutrofili

Przeglądaj więcej filmów