Name: Protokół izolacji neutrofili (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji neutrofili z ludzkiej krwi pełnej przy użyciu gradientu gęstości. Ten protokół umożliwia badanie funkcji komórek odpornościowych w odpowiedzi zapalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie z grantu NIH R01 HL56621.

&nbsp;Protokół izolacji neutrofili
<ol>
<li>Doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. </li>
<li>Do probówki do wirowania odmierzyć 5,0 ml medium do izolacji neutrofili. Ostrożnie nanieść 5,0 ml krwi na medium separacyjne. Krok ten należy wykonywać powoli i ostrożnie, prowadząc końcówkę pipety blisko powierzchni medium, aby uniknąć zmieszania krwi z medium.</li>
<li>Wirować przy 500 RCF przez 35 min w temperaturze 20-25°C. Krew powinna rozdzielić się na 6 wyraźnych warstw: plazmę, monocyty, medium do izolacji, neutrofile, kolejną warstwę medium do izolacji oraz osad erytrocytów (Rycina 1). Jeśli warstwy te nie są wyraźne, proces separacji nie przebiegł prawidłowo i należy go powtórzyć.</li>
<li>Ostrożnie usunąć trzy górne warstwy (plazmę, monocyty i medium do izolacji) za pomocą pipety. Warstwy te należy zutylizować.</li>
<li>Ostrożnie pobrać pipetą warstwę neutrofili oraz całe medium do izolacji znajdujące się pod neutrofilami. Przenieść roztwór do czystej probówki do wirowania.</li>
<li>Rozcieńczyć roztwór neutrofili do objętości 10 ml za pomocą HBSS bez Ca2+/Mg2+. Odwrócić probówkę kilka razy, aby zawiesić komórki. </li>
<li>Wirować roztwór neutrofili przy 350 RCF przez 10 minut. Na dnie probówki powinien pojawić się czerwony osad zawierający neutrofile i pozostałe erytrocyty (RBC). Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety, tak aby nie naruszyć osadu.</li>
<li>W celu lizy pozostałych erytrocytów dodać do probówki 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (Red Cell Lysis Buffer). Aby resuspenderć osad, mieszać fiolkę w wibratorze laboratoryjnym (vortex) przy ustawieniu 3-4. Należy unikać zwiększania mocy vortexu powyżej 4, ponieważ może to doprowadzić do aktywacji neutrofili. Może być konieczne mieszanie przez kilka sekund lub stosowanie krótkich impulsów w celu rozpuszczenia osadu. </li>
<li>Wirować probówkę przy 250 RCF przez 5 min. Usunąć nadsącz pipetą. W razie potrzeby powtórzyć proces lizy.</li>
<li>Dodać 500 μl HBSS bez Ca2+/Mg2+ do każdej probówki. Ponownie resuspenderć osad w vortexie przy ustawieniu 3-4. Rozcieńczyć do 10 ml za pomocą HBSS bez Ca2+/Mg2+.</li>
<li>Wirować probówki przy 250 RCF przez 5 min. Odessać nadsącz i go zutylizować.</li>
<li>Resuspenderć osad w 250 μl roztworu HBSS/HSA (2% HSA). Następnie można policzyć komórki i dostosować je do pożądanego stężenia.</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

Metoda separacji w gradiencie gęstości jest stosowana do izolacji ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu mieszaniny metrizoanu sodu i Dextran 500. Metoda ta opiera się na procedurze separacji leukocytów jednojądrowych opracowanej przez Boyuma (1968), która została zmodyfikowana pod kątem separacji neutrofili przez Ferrante i Thonga (1980).
Po pobraniu od dawcy, krew pełną można przeciwkrzeplić za pomocą EDTA, cytrynianu lub heparyny. Ze względu na krótki czas życia, neutrofile należy wy...

<table><tbody><tr><td>Limfocyt Poly(R)</td><td>Odczynnik</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>PolymorphprepTM może być stosowany jako alternatywa</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli bez chlorku wapnia</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin surowicy ludzkiej</td><td>Odczynnik</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy erytrocytów</td><td>Odczynnik</td><td>Grupa Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło wirusowe</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura i gruszki</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Odczynnik</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Alternatywny odczynnik dla Lymphocyte-Poly (R)</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Inne</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0,22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, sterylizowalny gamma</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Zrównoważony roztwór soli z chlorkiem wapnia</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół izolacji neutrofili

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrofilowe granulocyty wielojądrzaste (PMN) są najliczniejszą populacją leukocytów u ludzi i należą do pierwszych komórek docierających do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej. Ze względu na ich kluczową rolę w zapaleniu, szeroko bada się funkcje neutrofili, takie jak lokomocja, produkcja cytokin, fagocytoza oraz zwalczanie komórek nowotworowych. Aby scharakteryzować specyficzne funkcje neutrofili, w badaniach in vitro pożądana jest czysta, szybka i niezawodna metoda ich oddzielania od pozostałych komórek krwi, szczególnie że neutrofile mają krótki czas przeżycia i powinny zostać wykorzystane w ciągu 2–4 godzin od pobrania. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy standardową metodę rozdziału w gradiencie gęstości w celu izolacji ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu dostępnego komercyjnie medium do rozdziału, które stanowi mieszaninę metrizoanu sodu i Dextranu 500. Procedura polega na nałożeniu krwi pełnej na medium gradientowe, wirowaniu, oddzieleniu frakcji neutrofili oraz lizie pozostałych erytrocytów. Następnie komórki są płukane, liczone i resuspendowane w buforze do pożądanego stężenia. Wykazano, że przy prawidłowym przeprowadzeniu metoda ta pozwala na uzyskanie próbek zawierających >95% neutrofili o żywotności >95%.

Neutrofile należą do pierwszych komórek docierających do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej, a ich funkcje i mechanizmy zostały szeroko zbadane in vitro. Prezentujemy standardową metodę separacji w gradiencie gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu komercyjnie dostępnych mediów separacyjnych.

Protokół izolacji neutrofili

Neutrofile, czyli wielojądrowe granulocyty (PMN), są najliczniejszymi leukocytami u ludzi i należą do pierwszych komórek docierających do miejsca stanu zapalnego...

Protokół izolacji neutrofili. Procedura ta służy do wydzielenia leukocytów z próbki krwi pełnej przy użyciu wirówki i probówek. Mieszadło wortex, igła i strzykawka, filtr strzykawkowy.Materiały marki Milli pore MX gv 0,22 Mikrometra. Separacja neutrofili w roztworze soli Hanksa wymaga dwóch rodzajów roztworów HBSS. HBSS z chlorkiem wapnia zostanie użyty do przygotowania roztworu z albuminą surowicy ludzkiej.HBSS bez chlorku wapnia zostanie użyty do zawieszenia i przemywania neutrofili. Należy zachować szczególną ostrożność, aby w tej procedurze użyć odpowiedniego roztworu HBSS. Albumina surowicy ludzkiej lub HSA to białko w osoczu krwi, które utrzymuje pH i ciśnienie osmotyczne.Nie należy używać buforu do lizy czerwonych krwinek z amalgamatem surowicy bydlęcej. Produkt ten jest wytwarzany przez Roche Diagnostics, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media; należy chronić go przed światłem i przechowywać w lodówce, aby uzyskać najlepsze wyniki. Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową w momencie użycia.Wyjąć odczynniki z lodówki na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotować roztwór H-B-S-S-H-S-A do separacji neutrofili. P

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół izolowywania neutrofili

Ten film demonstruje test in vitro do badania interakcji neutrofil-biofilm. Bakterie chorobotwórcze osadzone w biofilmie i wyizolowanych neutrofilach oznaczono za pomocą znaczników fluorescencyjnych, a odpowiedź immunologiczną neutrofili i unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

W poniższym protokole opisujemy bardzo prosty sposób izolowania neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych (NET) z ludzkiej krwi pełnej za pomocą łatwo dostępnych odczynników. Następnie pokazujemy, w jaki sposób wyizolowane NET można wykorzystać w teście adhezji in vitro z komórkami nowotworowymi.

Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET)

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Opisujemy tutaj metodę uzyskiwania i identyfikowania nowo scharakteryzowanej subpopulacji gigantycznych fagocytów pochodzących z neutrofili. Komórki te rozwijają się w hodowli ze świeżych neutrofili ludzkiej krwi i charakteryzują się fagocytozą, autofagią, niezwykle dużymi rozmiarami i wydłużoną żywotnością. Metoda ta jest niezbędna do dalszego badania tej unikalnej subpopulacji pochodzącej z neutrofili.

Opracowanie i identyfikacja nowej subpopulacji ludzkich fagocytów olbrzymich pochodzących z neutrofili in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolacji neutrofili z krwi pełnej, kożuchów lub błon leukaferezy, osiągając dobrą wydajność, wysoką czystość i minimalną aktywację komórek. Wykorzystujemy oczyszczanie gradientowe, sedymentację czerwonych krwinek (RBC) i lizę RBC, aby uzyskać wysokiej jakości / czysty preparat neutrofili.

Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Tutaj oferujemy niezawodne podejście do izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej za pomocą izolacji magnetycznej (selekcja negatywna) i podłoża o nieciągłym gradinie gęstości. Zapewnia nietkniętą izolację komórek o wysokiej czystości (≥93%), ułatwiając dokładną analizę subpopulacji neutrofili, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w zdrowiu i chorobie.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj metodę izolacji neutrofili z ludzkiej krwi pełnej przy użyciu gradientu gęstości. Ten protokół umożliwia badanie funkcji komórek odpornościowych w odpowiedzi zapalnej.

Protokół izolacji neutrofili

Przeglądaj więcej filmów