Name: Identyfikacja i klasyfikacja specyficznych dla pozycji wariantów missense podjednostki receptora GABAA pod kątem ich roli w neuronach piramidowych hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T13:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj wieloskalową metodę badania mutacji w podjednostce receptora GABA A i ich wpływu na neurony piramidowe CA1. To podejście pomaga zrozumieć mechanizmy epilepsji na poziomie molekularnym i komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Çağli Koca za pomoc w budowie modelowego neuronu.

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Dzięki zastosowaniu kombinacji genetyki obliczeniowej, modelowania molekularnego i symulacji neuronalnych, podejście przedstawione w tym artykule może poprawić klasyfikację wariantów receptora GABAA, oferując cenne informacje zarówno dla badań nad padaczką, jak i zastosowań klinicznych. Przedstawiono kompleksową analizę mającą na celu identyfikację i priorytetyzację przewidywanych mutacji patogennych i rozszerzono ją na ramy, które potencjalnie wypełniają lukę między wpływem wariantów na białko i fenotyp komór...

W przypadku prawie wszystkich chorób człowieka zmienność genetyczna odgrywa znaczącą rolę w indywidualnej podatności. W związku z tym zrozumienie, w jaki sposób zmiany sekwencji odnoszą się do ryzyka choroby, stanowi cenny sposób na odkrycie kluczowych procesów związanych z rozwojem choroby i zidentyfikowanie nowych podejść do zapobiegania i leczenia1. Dotyczy to również zaburzeń neurorozwojowych, które należą do najczęstszych przewlekłych schorzeń w podstawowej opiece zdrowotnej u dzieci2. Stany takie jak zaburzenia ze spektrum autyzmu, niepełnosprawność intelektualna i padaczka ilustrują, w jaki sposób zmienność genetyczna znacząco wpływa na indywidualną podatność podczas rozwoju3.
Rozwijający się mózg jest bardziej podatny na napady padaczkowe niż mózg dorosłego z powodu genetycznie zaprogramowanego niedopasowania neurorozwojowego w krytycznej równowadze między pobudzeniem a hamowaniem4. Ponieważ GABA (kwas gamma-aminomasłowy), główny neuroprzekaźnik hamujący w dorosłym mózgu, jest pobudzający podczas rozwoju embrionalnego i wczesnego rozwoju pourodzeniowego, nie jest to korzystne dla stabilności potrzebnej do zapobiegania napadom w młodych mózgach. Ten tymczasowy stan, spowodowany brakiem wystarczającej ekspresji kotransporterów K-Cl5, może przyczyniać się do zwiększonego ryzyka aktywności napadowej w obecności dysfunkcyjnych receptorów GABAA . Receptory GABA A pośredniczą w pobudzającym i hamującym działaniu GABA, w zależności od wewnątrzkomórkowego stężenia jonu Cl- 6. Tak więc, w miarę dojrzewania mózgu, mutacje w genach kodujących receptor GABAA , a także w innych kanałach jonowych, zniekształcają pobudliwość, a mutacje w genach zaangażowanych w metabolizm neuronalny, sygnalizację komórkową i tworzenie synaps7 mogą powodować stany takie jak padaczka w dzieciństwie8.
Interwencje kliniczne w coraz większym stopniu wykorzystują analizę genetyczną w celu poprawy precyzji w leczeniu zaburzeń neurorozwojowych2. Badania genetyczne w padaczce dziecięcej stanowią potencjalne cele dla podejść medycyny precyzyjnej9, podkreślając znaczenie wariantów genetycznych w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia. Ponadto ~25% pacjentów z padaczką z mutacjami de novo otrzymuje diagnozy genetyczne, które identyfikują potencjalne cele dla medycyny precyzyjnej, co podkreśla istotną wartość wariantów genetycznych w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia10. Było to napędzane przez postępy w technologiach sekwencjonowania nowej generacji, takich jak celowane panele genowe, sekwencjonowanie całego eksomu i sekwencjonowanie całego genomu, które znacznie przyspieszyły odkrycia genetyczne11. Jednak rosnąca liczba nowych odkryć genów wiąże się z wyzwaniem, gdy wyniki dają wariant o nieznanym znaczeniu (VUS), klasyfikację, która odzwierciedla sprzeczne dowody lub niewystarczające informacje dotyczące molekularnej roli wariantu w patogenezie choroby. Warianty sklasyfikowane jako VUS odpowiadają jednej kategorii w ramach pięciopoziomowego systemu klasyfikacji wariantów zaproponowanego przez American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) i Association for Molecular Pathology (AMP)12.
Sprostanie wyzwaniu, jakim są funkcjonalnie nieznane warianty genetyczne, wymaga wysiłków w dwóch kluczowych wymiarach: praktyki klinicznej i badań. Z klinicznego punktu widzenia niepewność związana z VUS może komplikować postępowanie z pacjentem i podejmowanie decyzji13. Z perspektywy badań naukowych kluczowe znaczenie ma identyfikacja wariantów patogennych wśród rosnącej liczby wariantów o niepewnym znaczeniu oraz określenie ich roli w patofizjologii choroby i skutkach fenotypowych1. Jeden z idealnych scenariuszy obejmowałby dokładne przewidywanie molekularnych, neuronalnych i sieciowych skutków wszystkich funkcjonalnie niescharakteryzowanych wariantów, minimalizując w ten sposób zasoby, czas i wysiłek wymagany do badań laboratoryjnych. Aspekty te podkreślają znaczenie dokładnej klasyfikacji wariantów genetycznych, aby umożliwić precyzyjną diagnozę padaczki genetycznej, wspierać spersonalizowane leczenie i ułatwiać odkrywanie potencjalnych celów farmakologicznych. Obecne narzędzia predykcyjne 14,15,16,17 są stosunkowo dokładne, ale zazwyczaj dostarczają tylko binarnych klasyfikacji (patogenny vs. łagodny) i brakuje specyficznego dla choroby wglądu w patofizjologię molekularną, konsekwencje fenotypowe i mechanizmy leżące u podstaw. Koncentrując się na nieznanych wariantach missense wybranych genów kodujących podjednostki receptora GABAA, w artykule przedstawiono ramy mające na celu ulepszenie wytycznych badawczych poprzez włączenie czynników kontekstowych wariantów, takich jak aspekty molekularne, ewolucyjne i strukturalne, a także symulacje patologii neuronalnej pochodzące z danych biofizycznych in vitro mutacji związanych z padaczką. Nasza metodologia dotyczy identyfikacji nieznanych wariantów patogennych podjednostki γ2 receptora GABAA, kluczowej podjednostki zaangażowanej w patofizjologię padaczki 18,19,20. Następnie prowadzone są badania nad dopasowaniem tych przewidywanych wariantów w zależności od pozycji z mutacjami związanymi z padaczką, charakteryzującymi się danymi strukturalnymi i elektrofizjologicznymi. Dane te są następnie wykorzystywane do oszacowania wpływu wariantu na model neuronu piramidowego hipokampa wyrażającego podtyp receptora GABAA, złożony z podjednostek γ2, α1 i β3 (receptory γ2-GABAA), odpowiedzialnych za szybkie hamowanie synaptyczne6. Ważne jest, aby pamiętać, że receptory GABAA składają się z dużej puli podjednostek (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π i ρ1-ρ3) i w zależności od składu podjednostek, receptoryGABA A różnią się modulacją, cechami biofizycznymi, a także regionalnymi, komórkowymi, i subkomórkowe wzorce ekspresji sprzężone ze specyficznymi funkcjami 6,21,22,23,24,25. W związku z tym niniejsze badanie koncentruje się tylko na receptorach γ2-GABAA lub tylko na receptorach GABAA zawierających γ2.
Podjednostki receptora GABAA składają się z charakterystycznych cech strukturalnych - długiej N-końcowej domeny zewnątrzkomórkowej (ECD), czterech transbłonowych domen rozpiętych (TM1 do TM4), łącznika wewnątrzkomórkowego łączącego TM1 i TM2, łącznika zewnątrzkomórkowego łączącego TM2 i TM3, dużej pętli wewnątrzkomórkowej między TM3 i TM4 (pętla TM3-TM4) oraz krótkiego zewnątrzkomórkowego końca C 6,26, Lokal mieszkalny 27. Sugeruje się, że receptor GABAA funkcjonuje poprzez złożony mechanizm "lock and pull", w którym wiązanie GABA blokuje podjednostki β i α, powodując ich ciągnięcie za domeny zewnątrzkomórkowe (ECD) podjednostek, obracając je w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara27. Ruch ten wygina domeny transbłonowe (TMD), otwierając w ten sposób kanał jonowy27. Tak więc aktywność kanału wydaje się być skoordynowana z kasetami strukturalnymi w obrębie receptorów GABAA. Okazuje się, że mutacje padaczki powodują dysfunkcję aktywności kanałów poprzez zniekształcenie tych kaset strukturalnych28. W związku z tym nasze badanie opiera się na założeniu, że przewidywane warianty patogenne w pobliżu funkcjonalnie zidentyfikowanych mutacji padaczkowych w specyficznych kasetach strukturalnych podjednostek receptoraGABA A mogą wykazywać podobne wzorce elektrofizjologicznych lub biofizycznych zakłóceń funkcji kanałów, jak obserwowano w przypadkach tych mutacji padaczkowych. Podczas gdy obecność epileptogennych kaset strukturalnych w podjednostkach receptora GABAA 28 pośrednio wspiera to pogląd, nasze badanie pokazuje złożoność i wyzwanie korelacji parametrów biofizycznych mutacji padaczkowych z parametrami przewidywanych mutacji patogennych. Aby zdemaskować te złożone relacje, nasze ramy są istotne, ponieważ podkreślają wieloskalowe podejście, od DNA po funkcję białek i zachowania neuronalne, które mają kluczowe znaczenie dla badań nad padaczką. Podejście to integruje genetykę obliczeniową z modelowaniem molekularnym i symulacjami neuronalnymi, jednocześnie podkreślając znaczenie metod uzupełniających, takich jak uczenie maszynowe trenowane na dużych zbiorach danych, które mogą uchwycić wpływ mutacji na strukturę kanału, aktywność i pobudliwość neuronalną. Ponadto symulacja aktywności padaczkowego receptora γ2-GABAA na modelu neuronu piramidowego hipokampa pozwala na replikację fenotypu komórkowego in vitro związanego z kanałopatią receptora GABAA i wykazanie zmienionych odpowiedzi pojedynczego neuronu w centrum dysfunkcji sieci.

<table><tbody><tr><td>Brian2&nbsp;</td><td>Sorbonne Universit&eacute;, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, Francja; Imperial College London, Wielka Brytania</td><td>2.8.0.4</td><td>Stimberg i wsp., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )</td></tr><tr><td>Serwer dbNSFP&nbsp; &nbsp;</td><td>Genos Bioinformatics LLC, Stany Zjednoczone</td><td>Wersja 3.0</td><td>Liu i in., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)</td></tr><tr><td>NADZIEJA&nbsp; &nbsp;</td><td>Centrum Informatyki Molekularnej i Biomolekularnej CMBI, Uniwersytet Radboud, Holandia&nbsp;</td><td>1.1.1</td><td>Venselaar i wsp., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)</td></tr><tr><td>Jalview&nbsp; &nbsp;</td><td>Uniwersytet w Dundee, Wielka Brytania</td><td>JV2</td><td>Waterhouse i wsp., 2009 (https://www.jalview.org/)</td></tr><tr><td>Notes Jupyter</td><td>Projekt Jupyter, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>https://jupyter.org/install&nbsp;</td></tr><tr><td>Phyton (Phyton)</td><td>Python Software Foundation, Stany Zjednoczone</td><td>3.13</td><td>https://www.python.org/downloads/</td></tr><tr><td>Protter&nbsp; &nbsp;</td><td>ETH Zurych, Szwajcaria</td><td>Wersja 1.0</td><td>Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)</td></tr><tr><td>R&nbsp;</td><td>R Foundation for Statistical Computing, Stany Zjednoczone</td><td>R wersja 4.3.2&nbsp;</td><td>&nbsp; https://www.r-project.org/&nbsp;</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>Oprogramowanie Posit, PBC, Stany Zjednoczone</td><td>Wydanie RStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm"</td><td>https://posit.co/downloads/</td></tr></tbody></table>

identyfikacja i klasyfikacja specyficznych dla pozycji wariantów missense podjednostki receptora gabaa pod kątem ich roli w neuronach piramidowych hipokampa

Identification and Classification of Position-specific GABAA Receptor Subunit Missense Variants for Their Role In Hippocampal Pyramidal Neurons

Zrozumienie wpływu nieznanych funkcjonalnie wariantów na geny związane z padaczką ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia patofizjologii choroby i opracowania spersonalizowanych metod leczenia. Dzięki wieloskalowym ramom, obejmującym sekwencję DNA po funkcję białka i zachowanie neuronalne, opisujemy nowatorskie podejście do przewidywania i badania mutacji patogennych, stawiając hipotezę, że mutacje padaczkowe w podjednostce receptora GABAA i pobliskie przewidywane mutacje mogą mieć podobny wpływ na model neuronu piramidowego CA1. Badając charakterystyczne zależności między przewidywanymi mutacjami patogennymi a proksymalnymi mutacjami padaczkowymi, badanie ma na celu oszacowanie skutków przewidywanych mutacji w oparciu o wpływ mutacji padaczkowych na symulacje neuronów piramidowych hipokampa.
Metodologia rozpoczyna się od zebrania danych genetycznych podjednostki receptora GABAA γ2, a następnie czyszczenia i formatowania danych w R za pomocą niestandardowego skryptu. Następnie zostaną zastosowane predyktory zespołowe w celu identyfikacji i priorytetyzacji patogennych wariantów missense podjednostki γ2 . Zilustrowane zostanie mapowanie specyficznego wariantu patogennego (przewidywanego) do podjednostkowych domen strukturalnych wspólnych dla mutacji padaczkowych, któremu towarzyszyć będzie modelowanie molekularne ich skutków i uwzględnienie ochrony ewolucyjnej. Następnie zostanie przeprowadzona metaanaliza specyficzna dla wariantu i normalizacja parametrów, a następnie analiza korelacji w celu zidentyfikowania wszelkich istotnych zależności między przewidywanymi mutacjami a proksymalnymi mutacjami padaczkowymi. Za pomocą symulatora neuronalnego opartego na języku Python opisany zostanie wieloprzedziałowy model neuronów oparty na przewodnictwie, odzwierciedlający wpływ mutantów typu dzikiego i epileptogennego. Symulacja odpowiedzi neuronalnych generowanych przez podtyp padaczkowego receptoraGABA A zostanie uwzględniona w celu przybliżonego oszacowania wpływu przewidywanych wariantów patogennych na odpowiedź neuronalną. Według naszej wiedzy jest to pierwszy protokół badający wieloskalowe ramy do oszacowania wpływu wariantów receptora GABAA na zachowanie neuronów, co ma kluczowe znaczenie dla badań nad padaczką. Protokół ten może służyć jako podstawa do poprawy przewidywań fenotypów komórkowych spowodowanych przez potencjalnie patogenne warianty receptorów GABAA związane z padaczką.

W niniejszym badaniu zastosowano podejście wielkoskalowe w celu przewidzenia i charakterystyki wariantów patogennych w podjednostce γ2 receptora GABAA, która jest kluczowym elementem w patofizjologii epilepsji. Dzięki wykorzystaniu modeli predykcyjnych, modelowania molekularnego, analizy konserwacji ewolucyjnej, badań strukturalnych, analizy korelacji oraz symulacji neuronowych, podejście to usprawnia klasyfikację wariantów, co ma istotne znaczenie dla badań nad epilepsją i pot...

Badanie to wprowadza wieloskalowe ramy, obejmujące od DNA po funkcję białek i zachowanie neuronalne. Przedstawiono w nim nowatorskie podejście do badania przewidywanych mutacji patogennych w podjednostce receptora GABAA , stawiając hipotezę, że mutacje padaczkowe i mutacje proksymalne, przewidywane jako patogenne, mogą mieć podobny wpływ na model neuronu piramidowego CA1.

Identyfikacja i klasyfikacja specyficznych dla pozycji wariantów missense podjednostki receptora GABAA pod kątem ich roli w neuronach piramidowych hipokampa

Understanding the effects of functionally unknown variants in epilepsy associated genes is crucial for elucidating disease pathophysiology and developing ...

Nasze badanie opiera się na założeniu, że mutacje padaczkowe i proksymalnie przewidywane w podjednostkach receptora GABA-A mogą podobnie wpływać na model neuronu piramidowego CA1. Badamy to w ramach wieloskalowych. Eksperymenty laboratoryjne są niezbędne do odkrycia prawdy, ale nie są w stanie w pełni uchwycić różnorodności i złożoności życia we wszystkich skalach, od molekuł po organizmy. Jest po prostu zbyt wiele możliwości, na tym polega problem.Nasz protokół i odkrycia utorowały drogę do ustawienia obliczeniowego, które można wykorzystać do zbadania wpływu polimorfizmów, takich jak polimorfizmy podjednostek receptora GABA-A na funkcje neuronalne.Nasze badanie rodzi nowe pytania dotyczące zakresu, w jakim przewidywane warianty patogenne i mutacje padaczkowe wykazują podobne właściwości oraz w jaki sposób te zależności można skutecznie uchwycić i symulować.Obecnie skupiamy się na funkcji mikroobwodu kory śródwęchowej i hipokampa. Będziemy dążyć do uzyskania modeli zwierzęcych in vivo i obliczeniowych modeli mikroukładów, aby zbadać kontrolę przegrody w tym obwodzie, szczególnie w zaburzeniach neuropsychiatrycznych.[Narrator] Aby rozpocząć, otwórz oryginalny plik Excel zawierający

identification-classification-position-specific-gabaa-receptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Tutaj demonstrujemy użycie fluorescencyjnego barwnika Alexa sprzężonego z α-bungarotoksyną do pomiaru lokalizacji powierzchni receptora GABA A i endocytozy w neuronach hipokampa. Dzięki zastosowaniu konstruktów z krótkim znacznikiem zewnątrzkomórkowym, który wiąże α-bungarotoksynę, można uzyskać analizę transportu endocytarnego białek błony komórkowej.

Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Mechanizmy molekularne, które koordynują powstawanie hamujących synaps GABA-ergicznych podczas ontogenezy, są w dużej mierze nieznane. Aby zbadać te procesy, opracowaliśmy system modelu kohodowli, który obejmuje embrionalne średnio kolczaste neurony GABA-ergiczne hodowane razem ze stabilnie transfekowanymi ludzkimi embrionalnymi komórkami nerkowymi 293 (HEK293) wyrażającymi funkcjonalne receptoryGABA A.

Hamujące tworzenie synaps w modelu kokultury obejmującym średnie neurony kolczaste GABA-ergiczne i komórki HEK293 stabilnie eksprymujące receptory GABAA

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Opisujemy technikę zaciągania się, za pomocą której odczynniki farmakologiczne mogą być podawane podczas rejestracji krostek na całe komórki, i podkreślamy różne aspekty cech, które są kluczowe dla jej sukcesu.

Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Poznaj wieloskalową metodę badania mutacji w podjednostce receptora GABA A i ich wpływu na neurony piramidowe CA1. To podejście pomaga zrozumieć mechanizmy epilepsji na poziomie molekularnym i komórkowym.

Identyfikacja i klasyfikacja specyficznych dla pozycji wariantów missense podjednostki receptora GABAA pod kątem ich roli w neuronach piramidowych hipokampa (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja i klasyfikacja specyficznych dla pozycji wariantów missense podjednostki receptora GABA_A pod kątem ich roli w neuronach piramidowych hipokampa

Przeglądaj więcej filmów