Identyfikacja i klasyfikacja specyficznych dla pozycji wariantów missense podjednostki receptora GABA_A pod kątem ich roli w neuronach piramidowych hipokampa

Nasze badanie opiera się na założeniu, że mutacje padaczkowe i proksymalnie przewidywane w podjednostkach receptora GABA-A mogą podobnie wpływać na model neuronu piramidowego CA1. Badamy to w ramach wieloskalowych. Eksperymenty laboratoryjne są niezbędne do odkrycia prawdy, ale nie są w stanie w pełni uchwycić różnorodności i złożoności życia we wszystkich skalach, od molekuł po organizmy. Jest po prostu zbyt wiele możliwości, na tym polega problem.

Nasz protokół i odkrycia utorowały drogę do ustawienia obliczeniowego, które można wykorzystać do zbadania wpływu polimorfizmów, takich jak polimorfizmy podjednostek receptora GABA-A na funkcje neuronalne.

Nasze badanie rodzi nowe pytania dotyczące zakresu, w jakim przewidywane warianty patogenne i mutacje padaczkowe wykazują podobne właściwości oraz w jaki sposób te zależności można skutecznie uchwycić i symulować.

Obecnie skupiamy się na funkcji mikroobwodu kory śródwęchowej i hipokampa. Będziemy dążyć do uzyskania modeli zwierzęcych in vivo i obliczeniowych modeli mikroukładów, aby zbadać kontrolę przegrody w tym obwodzie, szczególnie w zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

[Narrator] Aby rozpocząć, otwórz oryginalny plik Excel zawierający dane genetyczne i usuń niepotrzebne kolumny z pliku, pozostawiając tylko cztery kolumny, GRCh38Chromosome, GRCh38Lokalizacja, Nazwa i Zmiana białka, przed zapisaniem pliku jako data1.xlsx w katalogu roboczym odpowiednim dla oprogramowania R. Aby dokładniej wyczyścić i sformatować dane, otwórz oprogramowanie R i RStudio. Następnie otwórz skrypt języka R Data_GABAA R. Ustaw katalog roboczy i załaduj niezbędne biblioteki, klikając przycisk uruchom. Załaduj plik danych i rozpocznij czyszczenie danych dla kolumn, które wymagają tego procesu. Następnie wyczyść i połącz dane w jednej kolumnie, oddzielonej pojedynczą spacją. Utwórz nową ramkę danych dla połączonych danych wyjściowych i dodaj żądany identyfikator wariantu transkrypcji zespołu. Zapisz wynik w nowym pliku programu Excel o nazwie data1output.xlsx. Aby zbudować biofizyczny model synapsy GABA-ergicznej na wieloprzedziałowym neuronie piramidowym hipokampa opartym na przewodnictwie, zainstaluj Brian 2 i zaimportuj wymagane pakiety. Zaprojektuj model oparty na przewodności, definiując kinetykę bramkowania kanałów jonowych, parametry pasywne i aktywne oraz przewodnictwa postsynaptyczne. Użyj zmodyfikowanych przewodnictw typu Hodgkina-Huxleya dla neuronów piramidowych hipokampa. Dostosuj rozkład gęstości kanałów sodowych bramkowanych napięciem dla somy, początkowego segmentu aksonu, węzłów Ranviera i dendrytów. Ustaw przewodnictwo kanałów sodowych i potasowych jako zero w segmentach mielinizowanych. Wbudowana kinetyka bramkowania kanałów jonowych dla bramkowanych napięciem kanałów sodowych i potasowych. Wprowadź prądy synaptyczne jako sumę wszystkich synaps glutaminergicznych i GABA-ergicznych w kompartmencie. Uwzględnij zarówno szybki prąd, w którym pośredniczy receptor AMPA, jak i wolny prąd, w którym pośredniczy receptor NMDA, w prądzie glutaminergicznym. Uwzględnij tylko szybki prąd za pośrednictwem receptora GABA w prądzie GABA-ergicznym. Załóżmy, że stała ilość glutaminianu jest uwalniana do synapsy dla każdego skoku presynaptycznego. Dlatego aktywacja receptorów jest zależna od czasu skoku, a całkowite przewodnictwa receptorów, G-AMPA i G-NMDA, odzwierciedlają ilość glutaminianu, który jest uwalniany przez każde zdarzenie. Ustaw parametry morfologiczne, używając eksperymentalnie zmierzonej średnicy somy i neurytów oraz długości każdego przedziału neurytów i wzorów rozgałęzień. Zmniejsz rzeczywistą morfologię neuronów do modelu wielokompartmentowego, dzieląc komórkę na wiele przedziałów, które dokładnie zachowują główną strukturę rozgałęzień i utrzymują dwustronną symetrię. Określ parametry biofizyczne dla modelu synapsy GABA-ergicznej, oceniając uzyskane wcześniej pomiary kontrolne typu dzikiego i importując je do użycia w modelu. Zdefiniuj stałe czasu narastania i dezaktywacji dla prądu postsynaptycznego, w którym pośredniczy receptor GABA-A. Zaprojektuj topologię modelu neuronu i przypisz parametry morfologiczne i biofizyczne, co obejmuje określenie układu przestrzennego i wzajemnych połączeń przedziałów na podstawie wcześniej uzyskanych informacji morfologicznych i rozgałęzień. Przypisz odpowiednie parametry morfologiczne, takie jak długość i średnica segmentu oraz parametry biofizyczne, do każdego przedziału modelu. Utwórz aktywność presynaptyczną za pomocą SpikeGeneratorGroup. Podłącz generator szczytów do docelowego przedziału neuronu modelowego za pomocą klasy Synapses do modelowania połączeń synaptycznych. Ustaw stały prąd o natężeniu 0,85 nanoampera i umieść elektrodę na somie, aby naśladować aktywność podprogową napędzaną przez podstawowe obciążenie prądem jonowym w danym momencie. Aby zbudować monitory rejestrujące, rejestruj ślady napięcia z przedziałów docelowych za pomocą StateMonitor. Na koniec zbuduj sieć i uruchom ją. Neuronalne pociągi kolców pod wpływem pojedynczego dystalnego wejścia glutaminergicznego i somatycznego hamowania GABA-ergicznego ujawniły wyniki wypalania dzikich i zmutowanych receptorów GABA-A. Mutacja beta-3N110D upośledzała hamowanie, powodując, że wystrzeliwanie neuronów blokowało się na pobudzającym wejściu Glu-S1 po czwartym skoku presynaptycznym, z krótkim opóźnieniem postsynaptycznym. Mutacja gamma-2K328M upośledzała również hamowanie przy wypalaniu neuronów zachodzącym wokół piątego kolca Glu-S1 i z dłuższym opóźnieniem postsynaptycznym niż beta-3N110D. Pod wpływem podwójnego wejścia synaptycznego mutacja gamma-2P302L spowodowała wystrzelenie prawie zsynchronizowane z przyśrodkowym wierzchołkowym wejściem Glu-S2, prawdopodobnie odzwierciedlając opóźnione sumowanie z Glu-S1. Mutacja beta-3T288N wykazywała podobny wzorzec z kolcami wyrównanymi do wejść Glu-S2 i drugim impulsem pojawiającym się prawie synchronicznie. Mutacja beta-3N110D w warunkach podwójnego wejścia wywołała skoki dla prawie wszystkich wejść pobudzających z wyjątkiem pierwszych dwóch, z zauważalnie skróconymi interwałami między skokami. Mutant gamma-2K328M wykazywał porównywalny wzorzec odpalania, ale nie reagował na drugie i trzecie wejście pobudzające. W warunkach potrójnego pobudzania wejściowego zarówno mutanty beta-3N110D, jak i gamma-2K328M reagowały na prawie wszystkie skoki presynaptyczne, wystrzeliwując pary kolców w odpowiedzi na skumulowany napęd pobudzający.