Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych
4 kwietnia 2018
Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.
Ogólnym celem ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji jest wyjaśnienie genetycznych uwarunkowań różnych chorób konstytucyjnych poprzez skupienie się na regionach genomu o szczególnym znaczeniu. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące genetycznej ideologii choroby, zwłaszcza gdy istnieją wcześniej znane powiązania genetyczne. Ta technika jest bardzo wydajna.
Generuje miliony odczytów w krótkim czasie, uzyskujemy je stosunkowo niskim kosztem, występuje stosunkowo niskie obciążenie obliczeniowe, zwłaszcza gdy porównamy to z innymi podejściami do sekwencjonowania nowej generacji. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania chorób neurodegeneracyjnych, które są fenotypowo i genetycznie heterogenne, ale mają wiele znanych powiązanych loci genetycznych. Chociaż metoda ta jest szczególnie ukierunkowana na choroby neurodegeneracyjne, może być również stosowana do różnych innych chorób konstytucyjnych z wcześniej zidentyfikowanymi regionami genomowymi będącymi przedmiotem zainteresowania.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ przetwarzanie bioinformatyczne wymagane do końcowej analizy rzadkich wariantów może być intensywne obliczeniowo i tworzyć wiele źródeł błędów. W tej procedurze próbki krwi ludzkiej są pobierane w trzech, czterech mililitrowych probówkach EDTA K2, aby uzyskać całkowitą objętość około 12 mililitrów. Odwiruj próbki krwi pod ciśnieniem 750 razy większym niż grawitacja przez 20 minut.
Spowoduje to frakcjonowanie każdej próbki na górną fazę osocza, cienką środkową fazę leukocytów i dolną fazę erytrocytów. Odpipetować osocze z górnej części próbki krwi za pomocą jednorazowej pipety do przenoszenia. Dozować do wielu porcji o pojemności 500 mikrolitrów i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej analizy biochemicznej.
Ekstrahuj DNA z próbki krwi za pomocą zestawu do ekstrakcji krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowane DNA jest następnie wykorzystywane do przygotowania biblioteki sekwencjonowania do sekwencjonowania nowej generacji. Po zakończeniu sekwencjonowania na komputerze znajdź pliki w środowisku obliczeniowym opartym na chmurze, wybierając pozycję Uruchamia w panelu nawigacyjnym.
Wybierz odpowiedni przebieg sekwencjonowania, aby przejść do strony podsumowania przebiegu. Wybierz pozycję Pobierz, aby uzyskać dane z chmury. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz pliki FASTQ jako typ pliku do pobrania i kliknij przycisk Pobierz.
Na stronie Podsumowanie przebiegu środowiska obliczeniowego opartego na chmurze przejdź do pozycji Wykresy, aby przeanalizować jakość przebiegu sekwencjonowania z różnymi wartościami wygenerowanymi przez środowisko obliczeniowe. Na stronie Uruchamianie wykresów znajdź rysunek z etykietą Dane według cyklu, w obszarze Wykres wybierz pozycję Intensywność, a następnie w obszarze Kanał wybierz pozycję Wszystkie kanały, aby utworzyć wykres intensywności sygnału. W panelu Uruchom nawigację wybierz kartę Indeksowanie kontroli jakości, aby znaleźć histogram kontroli jakości indeksowania, który znajduje się po prawej stronie strony.
Na stronie Podsumowanie uruchamiania środowiska obliczeniowego opartego na chmurze kliknij pozycję Metryki w panelu nawigacyjnym Uruchamianie, aby przejść do metryk jakości. W obszarze Gęstość kelwinów na milimetr kwadratowy upewnij się, że gęstość klastra w przebiegu sekwencjonowania mieści się w zakresie zalecanym przez używany zestaw do wzbogacania. W tym przypadku od 1 200 do 1 400 kelwinów na milimetr kwadratowy.
W polu Łączny procent większy lub równy Q30 upewnij się, że wartość jest większa lub równa 85%odzwierciedlającej jakość odczytów sekwencjonowania. W obszarze Wyrównane upewnij się, że wartość jest podobna do procentu kontroli dodatniej, która została uwzględniona w przebiegu sekwencjonowania. Na przykład, jeśli zastosowano 1% kontroli dodatniej, oczekiwany wyrównany procent wynosiłby około 1 do 5%, a dopuszczalne są odchylenia w granicach kilku miejsc po przecinku.
Rozpocznij ten proces od zaimportowania odczytów sekwencjonowania FASTQ do oprogramowania do przetwarzania danych. W obszarze nawigacji kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Nowy folder. Nazwij folder w taki sposób, aby była jasna co do przebiegu sekwencjonowania, który został wykonany.
Z paska narzędzi u góry wybierz Importuj i z listy rozwijanej wybierz platformę, za pomocą której przeprowadzono sekwencjonowanie. Na potrzeby ONDRISeq wybrano Ilumina. W oknie dialogowym przejdź do plików FASTQ i wybierz je z przebiegu sekwencjonowania, który jest przetwarzany.
W opcjach ogólnych okna dialogowego kliknij pole obok opcji Sparowane odczyty, jeśli sekwencjonowanie używało sparowanych końców chemicznych. Z informacji o odczycie sparowanym w oknie dialogowym wybierz opcję Sparowany koniec, jeśli plik FASTQ z odczytem do przodu pojawia się przed odczytem wstecznym na liście plików. Ustaw minimalną odległość odczytu dla par na jeden, a maksymalną odległość na 1000.
Z opcji Ilumina w oknie dialogowym wybierz opcję Usuń nieudane odczyty. Z listy rozwijanej Wynik jakości wybierz potok NGS, który został użyty do sekwencjonowania. Wybierz pozycję Dalej w dolnej części okna dialogowego.
Wybierz opcję Zapisz i utwórz podfoldery na jednostkę wsadową. Wybierz pozycję Dalej w dolnej części okna dialogowego. Wybierz folder, który został utworzony wcześniej.
W tym miejscu zostaną zaimportowane pliki FASTQ. Wybierz opcję Zakończ u dołu okna dialogowego i poczekaj, aż pliki FASTQ zostaną zaimportowane. Kliknij kartę Procesy, aby zobaczyć stan importu pliku.
Następnie zaprojektuj przepływ pracy w oprogramowaniu, aby wykonać ponowne sekwencjonowanie i wywoływanie wariantów zgodnie z instrukcjami producenta. Projektowanie przepływu pracy z sekwencjonowaniem i wywoływaniem wariantów jest najtrudniejszym aspektem tej procedury. Nasz zespół zbadał najlepsze praktyki i zastosował metodę prób i błędów, aby opracować najbardziej niezawodny przepływ pracy dopasowany do naszych potrzeb.
Aby uruchomić zaimportowane pliki odczytu sekwencjonowania FASTQ przez dostosowany przepływ pracy bioinformatyki, zacznij od zidentyfikowania przepływu pracy w przyborniku oprogramowania i kliknięcia go dwukrotnie. W wyświetlonym oknie dialogowym zlokalizuj foldery z plikami FASTQ, które zostały zaimportowane w obszarze nawigacji. Wyróżnij wszystkie foldery, zaznaczając je w obszarze nawigacji, a następnie kliknij pole obok opcji Partia.
Użyj strzałki skierowanej w prawo, aby przenieść pliki do wybranych elementów. Kliknij przycisk Dalej u dołu okna dialogowego. W oknie dialogowym przejrzyj przegląd wsadu, aby upewnić się, że wybrano właściwe pliki FASTQ, a następnie kliknij przycisk Dalej.
Zapoznaj się z krokami przepływu pracy w oknie dialogowym, aby upewnić się, że podczas projektowania przepływu pracy wybrano poprawne pliki i lokalizacje eksportu. Te kroki obejmują mapowanie odczytów na sekwencję odwołań, usuwanie zduplikowanych zmapowanych odczytów, tworzenie statystyk dla regionów docelowych, eksportowanie plików BAM, eksportowanie tekstu rozdzielanego tabulatorami, filtrowanie na podstawie nakładania się i eksportowanie plików VCF. W ostatnim kroku w oknie dialogowym, Obsługa wyników, wybierz opcję Zapisz w folderze wejściowym.
Kliknij przycisk Zakończ u dołu okna dialogowego. Ostatnim krokiem jest wykonanie adnotacji wariantu w pliku VCF każdej próbki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Metodologie zademonstrowane w tym filmie zostały zastosowane do 528 próbek DNA uczestników od osób, które zostały włączone do ONDRI.
Próbki zostały uruchomione na panelu ONDRISeq w 22 seriach po 24 próbki na serię. Ogólnie rzecz biorąc, dane sekwencjonowania określono jako wysokiej jakości, ze średnim pokryciem próbki 78 razy. Średnio 95,6% odczytów zostało dopasowanych do sekwencji referencyjnej, a wszystkie przebiegi ONDRISeq miały ponad 90% zmapowanych odczytów.
Spośród zmapowanych odczytów 92,0%i wynik Phred większy lub równy Q30. Aby zademonstrować użyteczność tego ukierunkowanego przepływu pracy NGS, przedstawiono przykład 68-letniego mężczyzny z chorobą Parkinsona, który wykazał zmniejszoną ilość azotu w stosunku do wydajności. Wariancja z adnotacjami jest dobierana w celu zidentyfikowania tych, które z największym prawdopodobieństwem będą miały znaczenie kliniczne, zgodnie z czerwonymi polami.
Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o odpowiednim dopasowaniu kroków do platformy sekwencjonowania, zestawu wzbogacającego, który został użyty oraz do potrzeb badania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie genetyki do uzyskania wysokiej jakości danych specyficznych dla regionu, pozostając jednocześnie tańszymi niż jej odpowiedniki z całego egzomu i całego genomu.
Przegląd
Celowane sekwencjonowanie następnej generacji jest kosztowo efektywną metodą identyfikacji wariantów genetycznych związanych z chorobami, w szczególności z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Niniejszy protokół opisuje schemat pracy dla sekwencjonowania oraz zaangażowane w ten proces etapy bioinformatyczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Bioinformatyka
- Neuronauka
Wstęp
- Sekwencjonowanie celowane koncentruje się na specyficznych, istotnych obszarach genomu.
- Metoda ta jest wydajna i kosztowo efektywna w porównaniu z innymi podejściami do sekwencjonowania.
- Jest ona szczególnie użyteczna w badaniu genetycznie heterogenicznych chorób neurodegeneracyjnych.
- Przetwarzanie bioinformatyczne może być złożone i podatne na błędy dla osób rozpoczynających pracę z tą techniką.
Cel badania
- Wyjaśnienie determinant genetycznych chorób konstytucjonalnych.
- Poprawa możliwości diagnostycznych w przypadku chorób neurodegeneracyjnych.
- Usprawnienie przepływu pracy bioinformatycznej w analizie wariantów.
Zastosowane metody
- Pobieranie i przetwarzanie próbek krwi ludzkiej.
- Ekstrakcja DNA i przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania.
- Wykorzystanie obliczeń w chmurze do zarządzania danymi.
- Projektowanie przepływu pracy bioinformatycznej do resekwencjonowania i wywoływania wariantów.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja wariantów genetycznych powiązanych z chorobami.
- Wykazana efektywność w sekwencjonowaniu i przetwarzaniu danych.
- Ustanowienie wskaźników kontroli jakości dla cykli sekwencjonowania.
- Opracowanie solidnego przepływu pracy bioinformatycznej do analizy.
Wnioski
- Celowane sekwencjonowanie następnej generacji jest cennym narzędziem w badaniach nad chorobami.
- Wyzwania bioinformatyczne można rozwiązać poprzez odpowiednie zaprojektowanie przepływu pracy.
- Metoda ta znajduje szerokie zastosowanie poza zakresem chorób neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Celowane sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) z wykorzystaniem solidnego rurociągu bioinformatycznego umożliwia precyzyjną analizę znanych determinant genetycznych w chorobach konstytucjonalnych i neurodegeneracyjnych. Podejście to zapewnia wysoką pewność identyfikacji wariantów, wspierając wczesne odkrycia oraz badania translacyjne, przy jednoczesnej optymalizacji alokacji zasobów. Jego wydajność i skalowalność czynią go strategicznym atutem dla organizacji badawczo-rozwojowych zorientowanych na portfolio, poszukujących praktycznych informacji genetycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ukierunkowaną analizę regionów genomowych o potwierdzonych powiązaniach z chorobami, co zwiększa pewność walidacji celów terapeutycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie podłoża genetycznego chorób o heterogenicznym fenotypie.
- Ułatwia szybką selekcję potencjalnych celów na podstawie patogeniczności i częstości występowania wariantów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia wysokiej jakości dane z sekwencjonowania specyficzne dla danego regionu, niezbędne do późniejszego opracowania testów.
- Standaryzuje procesy wywoływania i adnotacji wariantów, co poprawia powtarzalność między badaniami.
- Dostarcza ilościowe wyniki nadające się do benchmarkingu i porównywania międzyplatformowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników badań genetycznych z biomarkerami istotnymi dla choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowanie postępu prac nad kandydatami do poziomu ryzyka w oparciu o zweryfikowaną istotność wariantów.
- Wspiera wybór modeli przedklinicznych poprzez potwierdzenie czynników genetycznych w kohortach pacjentów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten ukierunkowany proces NGS i bioinformatyczny integruje etapy od wczesnego odkrycia po badania translacyjne, łącząc identyfikację wariantów z walidacją funkcjonalną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez w odniesieniu do znanych loci, ograniczając niejednoznaczność biologiczną.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość testów dzięki zwalidowanym danym sekwencjonowania o wysokim pokryciu.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wskaźniki wariantów i progi jakości dla rzetelnej interpretacji danych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genetyczne z adnotacjami klinicznymi i strategiami biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, zestandaryzowany przepływ pracy, który można dostosować do wielu paneli chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i walidację celu poprzez wysokiej jakości detekcję wariantów.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje sekwencjonowanie i analizę, zmniejszając obciążenie obliczeniowe oraz ryzyko błędów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz efektywne rozmieszczenie zasobów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz harmonizację danych pomiędzy programami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu bibliotek NGS oraz projektowaniu przepływów bioinformatycznych.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obliczeniowej w chmurze lub wysokowydajnych systemów obliczeniowych do przetwarzania danych.
- Konieczne jest rygorystyczne przestrzeganie wskaźników kontroli jakości oraz standardów adnotacji wariantów.
- Musi być dostosowane do platformy sekwencjonowania, zestawu do wzbogacania oraz panelu specyficznego dla danej choroby.
- Ograniczone do znanych regionów genomowych, co zawęża możliwość wykrywania nowych wariantów poza celowanymi locus.
