Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Protokół ten opisuje przebieg procesu generowania, konserwacji i analizy optycznej sferoid serca. Te sferoidy serca są niezbędne do wypełnienia luki w obecnych modelach chorób in vitro. Technika ta pozwala naukowcom na stworzenie wysokoprzepustowych badań przesiewowych nowej generacji i funkcjonalnego przechowywania sferoid serca.

Zacznij od dodania jednego mililitra na centymetr kwadratowy sterylnego roztworu odrywającego serce do każdej studzienki płytki hodowlanej zawierającej zbiegające się indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Potwierdź oderwanie komórek, obserwując białe i okrągłe komórki pod 4-krotnym powiększeniem mikroskopu jasnego pola.

Za pomocą pięciomililitrowej pipety mechanicznie rozdziel komórki, przepłukując je dwoma mililitrami ciepłej pożywki podstawowej, aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki i wiruj przez trzy minuty w temperaturze 300 g. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki do powlekania hiPSC-CM.

Użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby oddzielić osad komórkowy. Po trzech lub czterech mieszaniach, gdy roztwór wydaje się jednorodny, załaduj go do kasety, aby policzyć komórki i przenieś odpowiednią ilość komórek w 100 mikrolitrach pożywki do powlekania do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce, okrągłodennej. Umieść sferoidę serca na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze z prędkością 70 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, 21% tlenu i wilgotności 90% przez 24 godziny.

Aby uniknąć pęknięcia sferoidy, odessaj tylko 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj 100 mikrolitrów pożywki RPMI plus B27 na studzienkę przez pierwsze 48 godzin. Następnie odessać 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodać 100 mikrolitrów pożywki do dojrzewania na studzienkę. Utrzymuj komórki w pożywce do dojrzewania i odświeżaj pożywkę co dwa do trzech dni.

Umieść sferoidalną płytkę na lodzie na 10 minut w celu wstępnego schłodzenia, a następnie odwiruj płytkę przez trzy minuty w temperaturze 70 g. Usuń pożywkę, aż w studzience pozostanie 50 mikrolitrów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów lodowatej pożywki zamrażającej hiPSC do dołka.

Uszczelnij płytę folią uszczelniającą płytę. Aby przygotować formę silikonową, wymieszaj składniki zestawu elastomeru silikonowego w stosunku 10 do 1 i dodaj roztwór do dolnej części płytki studzienki. Usuń bąbelki roztworu za pomocą pompy próżniowej przez 15 do 20 minut.

Formę wkładamy do piekarnika i utwardzamy w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez osiem godzin, aby uzyskać półelastyczny elastomer, który odkleja się od płyty. Ostrożnie umieść zapieczętowaną płytkę w silikonowej formie, zapewniając równomierną wymianę ciepła między płytą studzienki a zamrażarką. Zamroź płytkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza na minimum cztery godziny w przygotowanej silikonowej formie przed przeniesieniem płytki do zbiornika z ciekłym azotem lub zamrażarki o temperaturze 150 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.

Aby zapewnić szybkie rozmrożenie sferoid serca, należy pobrać po jednej płytce komórkowej ze sferoidami serca z ciekłym azotem i umieścić ją w inkubatorze na 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zawierającej 5% dwutlenku węgla, 21% tlenu i wilgotności 90%. Usuń folię uszczelniającą z płytki i odessaj 150 mikrolitrów z każdej studzienki przed dodaniem 200 mikrolitrów ciepłej pożywki podstawowej do każdej studzienki. Odwirować płytkę o wadze 70 g przez trzy minuty i powtórzyć płukanie ciepłą pożywką podstawową.

Po zakończeniu usuń 150 mikrolitrów pożywki i dodaj 200 mikrolitrów pożywki do rozmrażania kardiomiocytów do każdej studzienki. Następnie powtórz płukanie RPMI, jak wspomniano podczas generowania sferoidów serca, a następnie utrzymuj komórki w pożywce dojrzewającej. Po tygodniu hodowli rozmrożone sferoidy serca są optymalne do obrazowania optycznego wapnia.

Odessać 150 mikrolitrów z każdej studzienki. Potraktuj rozmrożone sferoidy serca 100 mikrolitrami pożywki z barwnikiem wapniowym Cal-520 AM na dołek w ciemnych warunkach i inkubuj płytkę przez 60 minut. Przygotuj system pozyskiwania i analizy wapnia, zasilając mikroskop i upewniając się, że opcja kontroli środowiska jest włączona.

Dostosuj wymiary przysłony aparatu i kadrowania, aby zminimalizować obszar tła. Aby zmierzyć sygnał wapniowy, za pomocą lasera o długości fali 488 nanometrów, ustaw kontrast na czarnym tle z jasnozielonym sygnałem podczas uwalniania wapnia. Nagraj wideo ze stałym strumieniem od 2 do 10 szczytów w ciągu 10 sekund.

Nagraj 10-sekundowy film i zeskanuj 96-dołkową płytkę, początkowo przesuwając się w lewo, a następnie w dół w zygzakowaty sposób, aby pokryć całą płytkę. Po uzyskaniu stanów nieustalonych wapnia przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy śladów fluorescencji. Sferoidy serca uzyskały strukturę 3D już pierwszego dnia po wysiewie, którą można było hodować przez okres do sześciu tygodni.

Większość trzytygodniowych sferoid serca wykazywała regularną organizację sarkomerową z alfa aktyniną i troponiną T. Wysokie poziomy alfa aktyniny w dniu zero i trzytygodniowych sferoidach serca wskazywały na stały i wysoce czysty skład komórkowy podczas hodowli. Zwiększoną ekspresję genów serca, desmosomów i mitochondriów zaobserwowano w sferoidach niż w hiPSC-CM hodowanych w 2D przez 90 dni. Odsetek bijących sferoid serca był podobny w pierwszych trzech tygodniach po porodzie i znacznie spadł w szóstym tygodniu z powodu pogorszenia sferoid serca.

Wskaźnik bicia był znacznie zmniejszony w trzecim tygodniu w porównaniu i spadł w szóstym tygodniu w wyniku pogorszenia. Parametry przejściowe wapnia wskazywały na wyższą wartość piku w drugim tygodniu, podczas gdy czas narastania, czas rozpadu i czas trwania przejściowego wapnia przy 90% rozpadu były znacznie zwiększone w trzecim tygodniu, co pokazuje, że sferoidy pochodzące z hiPSC-CM były funkcjonalnie optymalne w drugim i trzecim tygodniu po pogeneracji. Rozmiar sferoidy zwiększał się wraz z liczbą komórek użytych do wysiewu.

W większych rozmiarach, starych sferoidach, bicie było znacznie większe. Podobny i znacznie wyższy współczynnik dudnienia wykazały sferoidy 5k, 10k i 20k w porównaniu do sferoid 2,5k. Kriokonserwacja nie wpłynęła na żywotność komórek w sferoidach serca.

Podobna ekspresja białek sarkomerycznych w sferoidach rozmrożonych i świeżo dopasowanych do wieku wskazuje na skuteczność kriokonserwacji. Nie stwierdzono istotnej zmiany w szybkości dudnienia rozmrożonych lub świeżych sferoid serca. Nie zaobserwowano istotnych zmian w czasie narastania, czasie rozpadu i CTD90 rozmrożonego lub świeżego CS. Oprócz modelowania chorób i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, sferoidy te mogą być również wykorzystywane w bioreaktorach do produkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i terapii związanych z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi.

Ponadto biobankowanie tych sferoidów może być wykorzystane jako nowe źródło kardiomiocytów dla strategii regeneracyjnych. Coraz więcej dowodów sugeruje, że biobanki modeli komórek macierzystych pochodzących od pacjentów dla mukowiscydozy, raka i sferoidów serca mają ogromny potencjał w odkrywaniu mechanizmów molekularnych na potrzeby badań przesiewowych leków i medycyny spersonalizowanej.