Name: Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj protokół generowania, biobankowania i analizy sferoidów sercowych z hiPSC-CM. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe i modelowanie chorób kardiologicznych z zachowaniem funkcjonalności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować firmie VALA sciences za pakiet oprogramowania Cyteseer i optymalizację automatycznej analizy 3D wapnia. Pragniemy podziękować za wsparcie grantowe od fundacji PLN (RM). P.A.D. i F.S. są wspierane przez CUREPLaN Leducq. Projekt J.P.G.S. jest wspierany przez program H2020-EVICARE (#725229) Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC). J.W.B. jest wspierany przez UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship oraz CVON-Dosis Young Talent Grant; Holenderska Fundacja Kardiologiczna (CVON-Dosis 2014-40). N.C. jest wspierany przez program grawitacyjny "Materials Driven Regeneration" Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (RegmedXB #024.003.013) oraz działania Marie Skłodowska-Curie (umowa o grant RESCUE #801540). V.S.-P. jest wspierany przez Fundusz Sojuszu (UMCU, UU, TU/e). Projekt A.v.M. jest finansowany ze środków UE w ramach finansowanego ze środków UE projektu BRAVE (H2020, ID:874827)

<ol><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134(2010).</li>
<li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li>
<li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178(2020).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813(2022).</li>
<li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Genomic+and+Precision+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043(2018).</li>
<li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li>
<li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334(2021).</li>
<li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li>
<li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142(2021).</li>
<li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li>
<li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li>
<li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229(2019).</li>
<li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scienctific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464(2017).</li>
<li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228(2021).</li>
<li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li>
<li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li>
<li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+heart+regenerative+therapies%3A+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30(2021).</li>
<li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799(2019).</li>
<li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22National+Library+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , Identifier NCT04396899 (2020).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li>
<li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135(2020).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).</li>
<li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).</li>
<li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+maturation%3A+New+phase+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li>
<li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells%3A+Generation%2C+optimization%2C+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066(2020).</li>
<li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li>
<li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).</li>
<li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cardiac+action+potential+measurements%3A+2D+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioengineering+and+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168(2015).</li>
<li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+Strategies%2C+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Science%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li>
<li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li>
<li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li>
<li>Yeh, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li>
<li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+spheroids+to+organoids%3A+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Odkrywanie leków nasercowych jest utrudnione przez poleganie na modelach zwierzęcych i komórkowych innych niż ludzie, o niewystarczającej przepustowości i wierności fizjologicznej, aby dokładnie wykonywać odczyty. Biologia hiPSC-CM w połączeniu z oprzyrządowaniem HT i sondami fizjologicznymi może potencjalnie ponownie wprowadzić modele ludzkie do najwcześniejszych etapów modelowania chorób serca i odkrywania leków. Opracowaliśmy metodę generowania tkanki serca 3D, która wytwarza wysokiej jakości i funkcjonalne CS w celu optymalnego modelowania chorób serca i platformy badań przesiewowych leków. Ponadto połączenie technologii sferoidowej w systemach bioreaktorów 3D do przemysłowej produkcji pojazdów elektrycznych stanowi niezbędny krok w kierunku klinicznego przełożenia terapii opartej na pojazdach elektrycznych. Opisana tutaj metoda opiera się na kilku kluczowych czynnikach i jest wariantem istniejących protokołów 9,10,28,29. Metody te obejmują: 1) generowanie trójwymiarowych konstruktów tkankowych, 2) optymalną liczbę komórek i czas przed badaniem przesiewowym, 3) poprawę czułości i wysokiej przepustowości narzędzi oraz 4) możliwość zamrożenia sferoid przed jakąkolwiek analizą funkcjonalną. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych protokołów, proponowany protokół opisuje generowanie do 1500 sferoid dziennie i przydatność dla HTS. Konwencjonalna analiza stu związków w dawkach 6 x 0,5 log dla 10 powtórzeń przy użyciu istniejących 96-dołkowych systemów obrazowania wapnia lub 24-dołkowych multipleksowanych zmodyfikowanych tkanek serca wymaga około 500 milionów do 3 miliardów hiPSC-CM31,32. Proponowane zastosowanie sprawia, że badania przesiewowe serca są mniej kosztowne i efektywne czasowo w porównaniu z konwencjonalnymi systemami, ponieważ 96-dołkowe płytki wymagały tylko 10% gęstości wysiewu w porównaniu z opisaną metodą. Co więcej, w porównaniu z poprzednimi protokołami, takimi jak metoda wiszącej kropli, generowanie sferoid przez samoagregację w płytkach o bardzo niskim mocowaniu umożliwia wysokiej jakości zautomatyzowane obrazowanie pojedynczych mikrotkanek33.
Ten mały model 3D naśladuje biologiczny i fizjologiczny fenotyp środowiska sercowo-naczyniowego in vivo . Jak wykazano wcześniej, stany przejściowe wapnia dramatycznie zwiększają się w trójwymiarowych konstruktach tkanki serca w porównaniu z jednowarstwowymi hodowlami komórkowymi2D 34.
Następnie odkryliśmy, że gęstość siewu i właściwy czas hodowli są również kluczowymi czynnikami dla udanego badania przesiewowego CS. Zagęszczenie 10K-20K hiPSC-CM na sferoidę i badanie przesiewowe między 2-3 tygodniami po potworzeniu były optymalne, podczas gdy zbyt małe lub zbyt stare sferoidy wykazują zaburzone obchodzenie się z wapniem (ryc. 2 i ryc. 3). Dlatego ważne jest, aby utrzymać jak najbardziej stałą gęstość wysiewu, ponieważ wielkość wpływa na parametry funkcjonalne. Ponadto, chociaż ta metoda optyczna zapewnia dobre wyniki dla żywych kultur 3D jako całej tkanki, uzyskanie danych w obrębie większych sferoid na poziomie (sub)komórkowym jest wyzwaniem bez polegania na czasochłonnych metodach histologicznych. Ostatnio opublikowano kilka podejść, w których zastosowano "optycznie oczyszczanie", które umożliwia pozyskiwanie całych sferoid 3D z możliwością ilościowego oznaczania markerów w pojedynczych komórkach. W tym przypadku dostosowaliśmy 3-dniowy protokół od zbierania CS do analizy obrazu, który jest zoptymalizowany pod kątem obrazowania 3D przy użyciu mikroskopii konfokalnej29 (ryc. 1C i ryc. 4D).
Wreszcie, wraz ze wzrostem liczby zastosowań 3D tkanek serca i zastosowań komercyjnych, rośnie zapotrzebowanie na długoterminowe przechowywanie i biobankowanie dostosowane do potrzeb pacjenta od różnych dawców. Kriokonserwacja to skuteczna strategia generowania płytek HTS z wielu partii w czasie. Zamrażanie hiPSC-CM zostało opisane wcześniej i nie różni się od innych typów hodowanych komórek 10,35,36. Ostatnio opisano podejścia do zamrażania płytek z komórkami 2D37. W tym przypadku stwierdziliśmy, że zestaw do krioprezerwacji PSC jest najbardziej optymalnym warunkiem w porównaniu z trzema innymi (dane nie pokazane) i użyliśmy tego podłoża do wydajnego zamrażania sferoid. Po krioprezerwacji, żywotność pozostaje wysoka (ryc. 4B,C), ale wpływa to na właściwości elektrofizjologiczne CS i wymagany jest okres inkubacji po rozmrożeniu. Rzeczywiście, 1 tydzień po rozmrożeniu CS wykazywały spontaniczną aktywność bicia i radzenie sobie z wapniem. Opisano jednak, że świeże i odzyskane hiPSC-CM nie zawsze wykazują identyczne właściwości molekularne i fizjologiczne38. Ograniczenie to należy wziąć pod uwagę, gdy kriokonserwowane hiPSC-CM są używane do oceny odczytów serca wywołanych lekiem. Co więcej, chociaż skutecznie modulujemy liczbę komórek na sferoidę i optymalny czas obrazowania przejściowego wapnia, sferoidy serca można poprawić, mieszając komórki kardiomiocytów pochodzące z hiPSC z komórkami śródbłonka, fibroblastami, połączeniami komórka-komórka i matrycami zewnątrzkomórkowymi, takimi jak chitozan, kolagen IV, fibronektyna, matrigel lub laminina, naśladując środowisko serca in vivo 39, Lokal mieszkalny 40. Ogólnie rzecz biorąc, proponujemy protokół krok po kroku, aby skutecznie generować CS, które są odpowiednie do dalszych zastosowań, takich jak modelowanie chorób i badania przesiewowe leków HT.

Odkrycie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) dało bezprecedensowe możliwości badania rozwoju i chorób człowieka na poziomie komórkowym. W ciągu ostatniej dekady, korzystając z lekcji rozwojowych, opracowano różne protokoły zapewniające skuteczne różnicowanie hiPSC w kardiomiocyty (CM)1,2,3,4. Kardiomiocyty pochodzące z hiPSC (hiPSC-CMs) mogą służyć jako źródło do modelowania genetycznie dziedziczonych chorób sercowo-naczyniowych (CVD), testowania bezpieczeństwa kardiologicznego dla nowych leków i strategii regeneracyjnych serca5,6,7,8. Pomimo ukierunkowanego różnicowania serca hiPSC, nieokreślona liczba CM pozostaje wyzwaniem w dziedzinie serca, ponieważ dojrzałe hiPSC-CM na ogół nie proliferują, a pierwotne komórki ludzkie nie są dostępne w dużych ilościach.
Niedawno opisaliśmy, że jednoczesna aktywacja sygnalizacji Wnt z hodowlą o niskiej gęstości komórek skutkowała masową odpowiedzią proliferacyjną (do 250-krotności) hiPSC-CMs9,10. Ta ekonomiczna strategia masowej ekspansji hiPSC-CM poprzez szeregowe pasażowanie w formacie kolby hodowlanej ułatwia standaryzację i kontrolę jakości dużej liczby funkcjonalnych hiPSC-CM. Dodatkowo, aby nadążyć za zapotrzebowaniem na duże partie hiPSC-CM od różnych dawców, opisano biobankowanie hiPSC-CMs10. Jednak monowarstwy kardiomiocytów osadzone w tych standardowych naczyniach hodowlanych nie są reprezentatywne dla złożonej struktury 3D obecnej w sercu. Co więcej, przeszkodą pozostaje niedojrzałość hiPSC-CM, w związku z czym nie udaje się naśladować biologicznego i fizjologicznego fenotypu środowiska sercowo-naczyniowego in vivo.
Nowatorskie modele 3D in vitro zostały opracowane, w których hiPSC-CM wykazują bliższe zachowania fizjologiczne, takie jak samoorganizacja11,12, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)13, enhanced maturation14,15,16, oraz zsynchronizowany skurcz17,18,19. Modele 3D zostały wykorzystane do odkrywania leków, testowania kardiotoksyczności leków, modelowania chorób, terapii regeneracyjnych, a nawet pierwszych badań klinicznych20,21,22,23,24. Jednym z najczęściej używanych modeli jest inżynieryjna tkanka serca (EHT) oparta na fibrynie, która wykazuje układ podobny do tkanki i kurczliwość serca13,17,25. Wcześniej wykazaliśmy, że EHT generowane z ekspandowanych hiPSC-CM wykazywały porównywalną kurczliwość do tych z nieekspandowanych hiPSC-CM, wykazując nienaruszoną funkcjonalność komórkową po rozszerzeniu9. Niemniej jednak, mimo że proces generowania EHT z hiPSC-CM jest dobrze ugruntowany, przewiduje się dalszy rozwój w zakresie ustanowienia platformy oceny HT. W tym przypadku szybkie generowanie dużej liczby samoagregujących sferoid serca (CS) w formacie 96-dołkowym pozwala na poprawę warunków 3D do celów wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS).
Ogólnie rzecz biorąc, zaletą CS jako hodowli komórek 3D jest ich wysoka powtarzalność i skalowalność. W szczególności CS w połączeniu z zrobotyzowaną obsługą próbek mogą standaryzować i automatyzować hodowlę CS, leczenie farmakologiczne i analizę o wysokiej zawartości20. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły do generowania CS o wysokiej czystości i jakości, które można skutecznie kriokonserwować i badać pod kątem funkcji serca, wykonując pomiary stanów nieustalonych Ca2+ za pomocą optycznego systemu akwizycji i analizy wapnia. Model ten zapewnia proste, ale potężne narzędzie do wykonywania przesiewów o wysokiej przepustowości na setkach do tysięcy sferoid17,18.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płyta wisząca&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-&alfa;-aktyninowe (sarkomeryczne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw sercowej troponinie T (ab45932)</td><td>Abcam</td><td>ab45932</td><td>Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca frakcja albuminy frakcji V (BSA)</td><td>Roche</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520, AM&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab171868</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica&nbsp;</td><td>DMi8&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopu konfokalnego&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Las X</td><td></td></tr><tr><td>Tubki stożkowe 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat kreatyny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3630</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Stężenie: 1 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM bez glukozy&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fruktoza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76050771.05</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Wysięgnik</td><td>glicerolowy</td><td>76050771.05</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Koza anty-królik Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11011</td><td>Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Wytrząsarka pozioma</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie indukowane pluripotencjalne linie komórek macierzystych</td> <td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td><td>CVI-273 (kontrola 1)</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie indukowane pluripotencjalne linie komórek macierzystych</td><td>Niemcy&nbsp;</td><td>141 (kontrola 2) 144 (kontrola 3)</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)&nbsp;</td><td>Ajax Firechem</td><td>265.2.5L-PL</td><td>10 M roztwór podstawowy,</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu, mysz FITC IgM &kappa; izotyp</td><td>BD</td><td>556652</td><td></td></tr><tr><td>Wymiana surowicy KnockOut&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828</td><td>Ochrona przed światłem</td></tr><tr><td>L-karnityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>System wapniowo-kurczliwości miocytów</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Grzmot, DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu 4% w 1x PBS, pH 7,0&ndash; 7.6</td><td>Santa Cruz</td><td>SC281692</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna&nbsp;</td>System filtrów próżniowych <td>membranowych Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PES</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>431097</tr><tr><td>Roztwór do barwienia PI/RNazy</td><td>Invitrogen</td><td>F10797</td><td>Rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>Pluronic&nbsp; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kriokonserwacji PSC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2644601</td><td></td></tr><tr><td>RevitaCell</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2644501</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>SYLGARD</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dodecylosiarczanu sodu (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td></td></tr><tr><td>L-mleczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Tris Fisher&nbsp;</td><td>Naukowe&nbsp;</td><td></td><td></td>11486631</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>X100-1L</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Witamina B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek (inhibitor kinazy Rho)</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>1254</td><td>Chronić przed światłem</td></tr></tbody></table>

generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) mają ogromne znaczenie dla modelowania i terapii chorób serca u ludzi. Niedawno opublikowaliśmy opłacalną strategię masowej ekspansji hiPSC-CM w dwóch wymiarach (2D). Dwa główne ograniczenia to niedojrzałość komórek oraz brak trójwymiarowego (3D) rozmieszczenia i skalowalności w platformach wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, rozszerzone kardiomiocyty stanowią idealne źródło komórek do generowania 3D hodowli komórek serca i technik inżynierii tkankowej. Ten ostatni ma ogromny potencjał w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego, zapewniając bardziej zaawansowany i fizjologicznie istotny HTS. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy zgodny z HTS z łatwą skalowalnością do generowania, konserwacji i analizy optycznej sferoid serca (CS) w formacie 96-dołkowym. Te małe CS są niezbędne do wypełnienia luki obecnej w obecnych modelach chorób in vitro i/lub generowaniu dla platform inżynierii tkankowej 3D. CS prezentują wysoce ustrukturyzowaną morfologię, rozmiar i skład komórkowy. Co więcej, hiPSC-CM hodowane jako CS wykazują zwiększoną dojrzałość i kilka cech funkcjonalnych ludzkiego serca, takich jak spontaniczne obchodzenie się z wapniem i aktywność skurczowa. Poprzez automatyzację całego przepływu pracy, od generowania CS po analizę funkcjonalną, zwiększamy odtwarzalność wewnątrz i między partiami, czego dowodem jest obrazowanie o wysokiej przepustowości (HT) i analiza obchodzenia się z wapniem. Opisany protokół umożliwia modelowanie chorób serca i ocenę efektów leku/terapii na poziomie pojedynczej komórki w złożonym środowisku komórkowym 3D w pełni zautomatyzowanym przepływie pracy HTS. Ponadto w badaniu opisano prostą procedurę długoterminowego przechowywania i biobankowania całych sferoidów, dając w ten sposób naukowcom możliwość stworzenia funkcjonalnego przechowywania tkanek nowej generacji. HTS w połączeniu z długoterminowym przechowywaniem znacząco przyczyni się do badań translacyjnych w szerokim zakresie dziedzin, w tym w odkrywaniu i testowaniu leków, medycynie regeneracyjnej i rozwoju spersonalizowanych terapii.

Protokół przedstawiony na Ryc. 1A opisuje generowanie CS z wcześniej namnożonych hiPSC-CM. CS nabierają struktury 3D w 1. dniu po wysianiu w płytkach z okrągłym dnem o ultra-niskim przywieraniu i mogą być hodowane do 6 tygodni (Ryc. 1B). Jak oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, większość komórek w 3-tygodniowych CS wykazywała ekspresję białek sarkomerowych, takich jak α-actinin i troponina T, oraz prezentowała regularną organizację sarkomerów (Ryc. 1C). W celu kwantyfikacji komórek dodatnich pod kątem α-actinin przeprowadzono analizę cytometryczną. Zgodnie z wynikami immunofluorescencji, dane z cytometrii przepływowej wykazały porównywalnie wysokie poziomy α-actinin zarówno w dniu 0 (76,9% ± 16,6%), jak i w 3-tygodniowych CS (71,1% ± 22,7%) (Ryc. 1D), co wskazuje na stały i bardzo czysty skład komórkowy podczas hodowli. Odnotowano zwiększoną ekspresję genów sercowych odpowiedzialnych za połączenia (GJA1, JPH2 i PKP2), desmosomy (DES) oraz mitochondria (ATP5A) w sferoidach pochodzących z hiPSC-CM (dzień 42) w porównaniu do hiPSC-CM hodowanych w 2D przez 90 dni (Ryc. 1E). Ekspresja tych genów jest charakterystyczną cechą oddziaływań międzykomórkowych oraz dojrzewania30.
Następnie oceniono właściwości funkcjonalne CS, a mianowicie częstotliwość skurczów oraz gospodarkę Ca2+, w różnych punktach czasowych (Rysunek 2). Parametry przejściowe wapnia, takie jak czas narastania, czas szczytu, czas zaniku oraz czas trwania przejściowego stężenia wapnia (CTD90), oceniono zgodnie z opisem na Rysunku 2A,B. Odsetek kurczących się CS był zbliżony w ciągu pierwszych 3 tygodni po wytworzeniu, lecz uległ znacznemu spadkowi w CS w 6. tygodniu (Wk6) (Rysunek 2C). Częstotliwość skurczów była istotnie obniżona w Wk3 w porównaniu do Wk1 i, podobnie jak w przypadku odsetka kurczących się CS, gwałtownie spadła w Wk6 (Rysunek 2D). W Wk6 zaobserwowano degradację CS, co może wyjaśniać spadek zarówno częstotliwości skurczów, jak i liczby kurczących się CS. Pomiar parametrów przejściowych wapnia wykazał istotnie wyższą wartość szczytową w Wk2 (Rysunek 2E), podczas gdy czas narastania, czas zaniku oraz CTD90 uległy istotnemu wydłużeniu w Wk3 w porównaniu do Wk1 (Rysunek 2F-H). Podsumowując, wyniki te wskazują, że sferoidy pochodzące z hiPSC-CM są optymalne pod względem funkcjonalnym około 2. i 3. tygodnia po wytworzeniu.
Rysunek 3 przedstawia wpływ wielkości sferoidów na częstotliwość skurczów i gospodarkę wapniową. Sferoidy CS generowano poprzez wysiew 2,5 x 104, 5 x 104, 10 x 104 oraz 20 x 104 hiPSC-CMs do dołka płytki 96-dołkowej, co dało łącznie 24 CS/dołki na warunek (Rysunek 3A). Zgodnie z oczekiwaniami, wielkość sferoidów zwiększała się wraz ze wzrostem liczby użytych komórek, w zakresie od 178 ± 36 µm do 351 ± 65 µm (Rysunek 3A, prawy panel). Przejściowe zmiany stężenia Ca2+ mierzono w 3-tygodniowych CS przy czterech różnych gęstościach wysiewu (Rysunek 3B). Pomiary kurczących się CS wykazały, że tylko około 50% mniejszych sferoidów (2,5K- oraz 5K-CS) wykazywało skurcze, podczas gdy odsetek kurczących się sferoidów większych (10K- oraz 20K-CS) był znacznie wyższy (około 85%) (Rysunek 3C). Podobna częstotliwość skurczów (około 28 bpm) została zaobserwowana dla 5K-, 10K- i 20K-CS, co było wartością istotnie wyższą w porównaniu do 2,5K-CS (Rysunek 3D). Szczytowe wartości obrazowania wapnia były podobne we wszystkich badanych warunkach (Rysunek 3E), jednak czas narastania (Rysunek 3F), czas zaniku (Rysunek 3G) oraz CTD90 (Rysunek 3H) były istotnie zwiększone w większych sferoidach (10K- oraz 20K-CS) w porównaniu do mniejszych (2,5K- oraz 5K-CS). Podsumowując, wyniki te pokazują, że sferoidy pochodzące z hiPSC-CM są optymalne do badań przesiewowych gospodarki wapniowej przy zastosowaniu gęstości wysiewu między 10K- a 20K hiPSC-CMs/dołek.
Następnie oceniliśmy wpływ kriokonserwacji na żywotność i funkcję CS. Przed analizą rozmrożone CS utrzymywano w hodowli przez 1 tydzień (Rycina 4A). Jak wykazały testy żywotności komórek przeprowadzone zarówno metodą cytometrii przepływowej (Rycina 4B), jak i przy użyciu Calcein-AM (Rycina 4C), kriokonserwacja nie wpłynęła na żywotność komórek wewnątrz CS. Dodatkowo rozmrożone CS wykazały podobne poziomy ekspresji białek sarkomerowych w porównaniu do świeżych CS w tym samym wieku (Rycina 4D). Dane te wskazują, że CS mogą być skutecznie kriokonserwowane w celu przeprowadzenia późniejszych analiz funkcji serca oraz wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
Na koniec zmierzono aktywność skurczową oraz gospodarkę Ca2+ w świeżych i kriokonserwowanych CS (Rysunek 5). Procent bijących CS mierzono w różnych punktach czasowych po rozmrażaniu, odpowiednio w 2., 5. i 7. dniu. Podczas gdy większość świeżych CS wykazywała aktywność skurczową w czasie, wyraźnie widać, że kriokonserwowane CS wymagały do 1 tygodnia hodowli, aby odzyskać aktywność skurczową (Rysunek 5B). Nie odnotowano istotnych zmian w częstotliwości skurczów rozmrożonych CS w porównaniu do świeżych; jednak w niektórych zamrożonych CS nie zaobserwowano spontanicznej aktywności skurczowej (Rysunek 5C). Choć wartości szczytowe były znacząco obniżone w zamrożonych/rozmrożonych CS w porównaniu do świeżych (Rysunek 5D), nie zaobserwowano istotnych zmian w czasie narastania, czasie zaniku oraz CTD90 w zamrożonych/rozmrożonych CS w porównaniu do świeżych (Rysunek 5E-G). Dane te wskazują, że po rozmrażaniu ważne jest, aby pozwolić CS na regenerację w inkubatorze przez co najmniej 1 tydzień przed pomiarem aktywności skurczowej i przejściowego stężenia Ca2+.
Wzięte razem, wyniki te pokazują, że kriokonserwacja sferoidów pochodzących z hiPSC-CM zachowuje żywotność kardiomiocytów, strukturę sarkomerów oraz ich charakterystyki funkcjonalne, takie jak spontaniczna aktywność skurczowa i gospodarka wapniowa. Zatem sferoidy pochodzące z hiPSC-CM stanowią odpowiedni model do dokładnego odtworzenia elektrofizjologii serca in vitro.
<img alt="Różnicowanie hiPSC w CM; oś czasu, obrazy sferoidów, immunofluorescencja; dane dotyczące markerów sercowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Generowanie sferoidów sercowych. (A) Schematyczne przedstawienie kierowanego różnicowania sercowego opartego na szlaku Wnt, późniejszej ekspansji hiPSC-CM oraz generowania CS. Utworzone za pomocą biorender.com. (B) Obrazy w jasnym polu w różnych punktach czasowych hodowli CS. Pasek skali, 200 µm. Wk oznacza tydzień. (C) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencji dla sercowych białek sarkomerowych α-actinin i troponiny T w 3-tygodniowych CS. Immunofluorescencja: Hoechst (niebieski), α-actinin (zielony) i troponina T (czerwony). Pasek skali, 200 µm. Powiększony obraz scalony po prawej stronie przedstawia organizację sarkomerów. Pasek skali, 50 µm. (D) Ilościowa analiza cytometrii przepływowej komórek dodatnich pod kątem α-actinin przed (dzień 0) i 3 tygodnie po utworzeniu CS. (n = 14-23 na warunek). (E) RT-qPCR przeprowadzony na hiPSC-CM hodowanych przez 90 dni (2D) oraz próbkach sferoidów hodowanych przez 42 dni w celu ustalenia poziomów ekspresji różnych genów sercowych związanych z połączeniami międzykomórkowymi, filamentami pośrednimi i mitochondriami. (n = 1-3 partii). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. NS (nieistotne statystycznie) obliczone za pomocą nieparzystego testu t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zaniku fluorescencji, obrazy mikroskopowe i wykresy statystyczne analizujące dynamikę skurczów komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Częstotliwość skurczów i gospodarka wapniowa w CS w różnych tygodniach po wytworzeniu. (A) Przykłady parametrów przejściowych wapnia obliczonych przez algorytm analizy Vala sciences w oprogramowaniu Cyteseer. (B) Reprezentatywne ślady przejściowych stężeń wapnia oraz obrazy time-lapse CS w różnych punktach czasowych (tygodniach) po wytworzeniu. Pasek skali, 200 µm. (C) Ilościowe określenie przebiegu czasowego spontanicznej aktywności skurczowej wyrażone jako procent skurczowych CS. (D) Częstotliwość skurczów CS w czasie hodowli. (E-H) Ilościowe określenie przejściowych stężeń wapnia z uwzględnieniem wartości szczytowej, czasu narastania, czasu zaniku oraz CTD90. Przedstawione dane to średnia ± SD. Powtórzenia biologiczne = trzy, powtórzenia techniczne = odpowiednio 38, 50, 66 i 7. *p &lt; 0.05, ****p &lt; 0.001; jednoczynnikowa ANOVA, a następnie wielokrotny test porównawczy post hoc Tukeya. Skróty; CTD = czas trwania przejścia wapnia, Wk = tydzień, CSs = ludzkie sferoidy sercowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost sferoidów komórkowych i analiza fluorescencji; obejmuje porównanie rozmiarów, mikroskopię fluorescencyjną i dane dotyczące częstotliwości skurczów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Częstotliwość skurczów i gospodarka wapniowa w sferoidach sercowych (CSs) generowanych przy użyciu różnych gęstości wysiewu komórek. (A) Obrazowanie w polu jasnym (lewo) i pomiary rozmiarów (prawo) sferoidów CSs generowanych przy użyciu różnych liczb hiPSC-CMs. Pasek skali, 200 µm. (B) Reprezentatywne przebiegi przejściowych zmian stężenia wapnia oraz obrazy time-lapse dla 2.5K-20K-CSs. (C,D) Procent sferoidów kurczących się oraz częstotliwość skurczów w 2.5K-20K-CSs. (E-H) Wartość szczytowa, czas narastania, czas zaniku i CTD90 w 2.5K-20K-CSs. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Powtórzenia biologiczne = trzy, powtórzenia techniczne = 28-39. *p &lt; 0.05, ****p &lt; 0.001; jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA), a następnie test wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Skróty: CTD = czas trwania przejściowego wzrostu stężenia wapnia, Wk = tydzień, k = x 1,000 komórek, CSs = sferoidy sercowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie kriotransformacji ludzkich iPSC-CM; testy żywotności (live/dead); wyniki FACS; analiza żywotności; mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wpływ krio konserwacji na żywotność i strukturę sferoidów sercowych. (A) Schematyczne przedstawienie generowania CS, późniejszego biobankowania i rozmrażania. (B) Test żywotności komórek metodą cytometrii przepływowej w świeżych i kriokonserwowanych CS. Jako kontrolę pozytywną zastosowano traktowanie 10% roztworem Triton-X przez 5 min. (n = 4 na grupę). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. ****p &lt; 0.001; jednoczynnikowa analiza ANOVA z następującym testem wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. (C) Test żywotności komórek z użyciem Calcein-AM w świeżych i rozmrożonych CS po 7 dniach hodowli (n = 15-17 na grupę, ****p &lt; 0.001, testem t-studenta dla prób zależnych; pasek skali, 200 µm). (D) Reprezentatywne obrazy w polu jasnym (lewo) oraz barwienie immunofluorescencyjne na ekspresję α-actininy i troponiny T w świeżych i rozmrożonych CS. Immunofluorescencja: Hoechst (niebieski), α-actinin (zielony) i troponina T (czerwony). Połączone obrazy po prawej stronie pokazują prążkowanie sarkomerów w CS. Pasek skali, 50 µm. Skróty: X = wybrany dzień rozmrażania, PI = jodek propidyny, Cal-AM = Calcein-AM, EthD-I = etydinium homodimer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza sferoidów sercowych; obrazowanie fluorescencyjne, wykresy słupkowe częstotliwości skurczów, żywotność, świeże vs mrożone." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przejściowe zmiany stężenia wapnia w świeżych oraz rozmrożonych CSs. (A) Reprezentatywne zapisy przejść wapniowych oraz obrazy time-lapse CSs przed kriokonserwacją i 1 tydzień po rozmrożeniu. (B) Procent sferoidów sercowych wykazujących skurcze w grupie świeżych i mrożonych/rozmrożonych. Słupki reprezentują poszczególne eksperymenty. (C) Częstotliwość skurczów świeżych i mrożonych/rozmrożonych sferoidów sercowych. (D-G) Ilościowe oznaczenie parametrów przejść wapniowych: wartości szczytowej, czasu narastania, czasu opadania oraz CTD90. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. *p &lt; 0.05, ****p &lt; 0.001; jednoczynnikowa analiza ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Skróty; CTD = czas trwania przejścia wapniowego, CSs = sferoidy sercowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Reprezentatywne strategie bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. (A) Reprezentatywna strategia bramkowania dla hiPSC-CMs dodatnich pod kątem α-aktyniny w czystej populacji w porównaniu z kontrolą negatywną i kontrolą izotypową. Liczba analizowanych komórek dodatnich pod kątem α-aktyniny wynosi 25 x 105. Skróty; SSC = rozproszenie boczne, PI+ = dodatnie pod kątem jodku propidyny. (B) Reprezentatywna strategia bramkowania dla analizy żywotności w przypadku próbek świeżych, rozmrożonych, kontroli dodatniej (Triton-X) oraz kontroli negatywnej (niebarwionej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Protokół ten opisuje przebieg procesu generowania, konserwacji i analizy optycznej sferoid serca. Te sferoidy serca są niezbędne do wypełnienia luki w obecnych modelach chorób in vitro. Technika ta pozwala naukowcom na stworzenie wysokoprzepustowych badań przesiewowych nowej generacji i funkcjonalnego przechowywania sferoid serca.Zacznij od dodania jednego mililitra na centymetr kwadratowy sterylnego roztworu odrywającego serce do każdej studzienki płytki hodowlanej zawierającej zbiegające się indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Potwierdź oderwanie komórek, obserwując białe i okrągłe komórki pod 4-krotnym powiększeniem mikroskopu jasnego pola.Za pomocą pięciomililitrowej pipety mechanicznie rozdziel komórki, przepłukując je dwoma mililitrami ciepłej pożywki podstawowej, aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki i wiruj przez trzy minuty w temperaturze 300 g. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki do powlekania hiPSC-CM.Użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby oddzielić osad komórkowy. Po trzech lub czterech mieszaniach, gdy roztwór wydaje się jednorodny, załaduj go do kasety, aby policzyć komórki i przenieś odpowiednią ilość komórek w 100 mikrolitrach pożywki do powlekania do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce, okrągłodennej. Umieść sferoidę serca na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze z prędkością 70 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, 21% tlenu i wilgotności 90% przez 24 godziny.Aby uniknąć pęknięcia sferoidy, odessaj tylko 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj 100 mikrolitrów pożywki RPMI plus B27 na studzienkę przez pierwsze 48 godzin. Następnie odessać 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodać 100 mikrolitrów pożywki do dojrzewania na studzienkę. Utrzymuj komórki w pożywce do dojrzewania i odświeżaj pożywkę co dwa do trzech dni.Umieść sferoidalną płytkę na lodzie na 10 minut w celu wstępnego schłodzenia, a następnie odwiruj płytkę przez trzy minuty w temperaturze 70 g. Usuń pożywkę, aż w studzience pozostanie 50 mikrolitrów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów lodowatej pożywki zamrażającej hiPSC do dołka.Uszczelnij płytę folią uszczelniającą płytę. Aby przygotować formę silikonową, wymieszaj składniki zestawu elastomeru silikonowego w stosunku 10 do 1 i dodaj roztwór do dolnej części płytki studzienki. Usuń bąbelki roztworu za pomocą pompy próżniowej przez 15 do 20 minut.Formę wkładamy do piekarnika i utwardzamy w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez osiem godzin, aby uzyskać półelastyczny elastomer, który odkleja się od płyty. Ostrożnie umieść zapieczętowaną płytkę w silikonowej formie, zapewniając równomierną wymianę ciepła między płytą studzienki a zamrażarką. Zamroź płytkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza na minimum cztery godziny w przygotowanej silikonowej formie przed przeniesieniem płytki do zbiornika z ciekłym azotem lub zamrażarki o temperaturze 150 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.Aby zapewnić szybkie rozmrożenie sferoid serca, należy pobrać po jednej płytce komórkowej ze sferoidami serca z ciekłym azotem i umieścić ją w inkubatorze na 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zawierającej 5% dwutlenku węgla, 21% tlenu i wilgotności 90%. Usuń folię uszczelniającą z płytki i odessaj 150 mikrolitrów z każdej studzienki przed dodaniem 200 mikrolitrów ciepłej pożywki podstawowej do każdej studzienki. Odwirować płytkę o wadze 70 g przez trzy minuty i powtórzyć płukanie ciepłą pożywką podstawową.Po zakończeniu usuń 150 mikrolitrów pożywki i dodaj 200 mikrolitrów pożywki do rozmrażania kardiomiocytów do każdej studzienki. Następnie powtórz płukanie RPMI, jak wspomniano podczas generowania sferoidów serca, a następnie utrzymuj komórki w pożywce dojrzewającej. Po tygodniu hodowli rozmrożone sferoidy serca są optymalne do obrazowania optycznego wapnia.Odessać 150 mikrolitrów z każdej studzienki. Potraktuj rozmrożone sferoidy serca 100 mikrolitrami pożywki z barwnikiem wapniowym Cal-520 AM na dołek w ciemnych warunkach i inkubuj płytkę przez 60 minut. Przygotuj system pozyskiwania i analizy wapnia, zasilając mikroskop i upewniając się, że opcja kontroli środowiska jest włączona.Dostosuj wymiary przysłony aparatu i kadrowania, aby zminimalizować obszar tła. Aby zmierzyć sygnał wapniowy, za pomocą lasera o długości fali 488 nanometrów, ustaw kontrast na czarnym tle z jasnozielonym sygnałem podczas uwalniania wapnia. Nagraj wideo ze stałym strumieniem od 2 do 10 szczytów w ciągu 10 sekund.Nagraj 10-sekundowy film i zeskanuj 96-dołkową płytkę, początkowo przesuwając się w lewo, a następnie w dół w zygzakowaty sposób, aby pokryć całą płytkę. Po uzyskaniu stanów nieustalonych wapnia przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy śladów fluorescencji. Sferoidy serca uzyskały strukturę 3D już pierwszego dnia po wysiewie, którą można było hodować przez okres do sześciu tygodni.Większość trzytygodniowych sferoid serca wykazywała regularną organizację sarkomerową z alfa aktyniną i troponiną T. Wysokie poziomy alfa aktyniny w dniu zero i trzytygodniowych sferoidach serca wskazywały na stały i wysoce czysty skład komórkowy podczas hodowli. Zwiększoną ekspresję genów serca, desmosomów i mitochondriów zaobserwowano w sferoidach niż w hiPSC-CM hodowanych w 2D przez 90 dni. Odsetek bijących sferoid serca był podobny w pierwszych trzech tygodniach po porodzie i znacznie spadł w szóstym tygodniu z powodu pogorszenia sferoid serca.Wskaźnik bicia był znacznie zmniejszony w trzecim tygodniu w porównaniu i spadł w szóstym tygodniu w wyniku pogorszenia. Parametry przejściowe wapnia wskazywały na wyższą wartość piku w drugim tygodniu, podczas gdy czas narastania, czas rozpadu i czas trwania przejściowego wapnia przy 90% rozpadu były znacznie zwiększone w trzecim tygodniu, co pokazuje, że sferoidy pochodzące z hiPSC-CM były funkcjonalnie optymalne w drugim i trzecim tygodniu po pogeneracji. Rozmiar sferoidy zwiększał się wraz z liczbą komórek użytych do wysiewu.W większych rozmiarach, starych sferoidach, bicie było znacznie większe. Podobny i znacznie wyższy współczynnik dudnienia wykazały sferoidy 5k, 10k i 20k w porównaniu do sferoid 2,5k. Kriokonserwacja nie wpłynęła na żywotność komórek w sferoidach serca.Podobna ekspresja białek sarkomerycznych w sferoidach rozmrożonych i świeżo dopasowanych do wieku wskazuje na skuteczność kriokonserwacji. Nie stwierdzono istotnej zmiany w szybkości dudnienia rozmrożonych lub świeżych sferoid serca. Nie zaobserwowano istotnych zmian w czasie narastania, czasie rozpadu i CTD90 rozmrożonego lub świeżego CS. Oprócz modelowania chorób i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, sferoidy te mogą być również wykorzystywane w bioreaktorach do produkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i terapii związanych z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi.Ponadto biobankowanie tych sferoidów może być wykorzystane jako nowe źródło kardiomiocytów dla strategii regeneracyjnych. Coraz więcej dowodów sugeruje, że biobanki modeli komórek macierzystych pochodzących od pacjentów dla mukowiscydozy, raka i sferoidów serca mają ogromny potencjał w odkrywaniu mechanizmów molekularnych na potrzeby badań przesiewowych leków i medycyny spersonalizowanej.

generation-high-throughput-screening-biobanking-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Ten protokół ma na celu wytworzenie sferoid 3D serca (CS) poprzez kokulturację komórek w wiszących kroplach. CS z kolagenem są leczone doksorubicyną (DOX, środek kardiotoksyczny) w stężeniach fizjologicznych w celu modelowania niewydolności serca. Badania in vitro z wykorzystaniem CS poddanych działaniu DOX mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych terapii dla pacjentów z niewydolnością serca.

Sferoidy serca jako bioinżynieryjne tkanki serca in vitro do badania patofizjologii ludzkiego serca

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Poznaj protokół generowania, biobankowania i analizy sferoidów sercowych z hiPSC-CM. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe i modelowanie chorób kardiologicznych z zachowaniem funkcjonalności komórek.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów