Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Badania te koncentrują się na identyfikacji celów dla leków immunomodulujących i złożonych guzów litego przewodu pokarmowego. Analiza krajobrazu komórkowego mikrośrodowiska guza jest absolutnie kluczowa dla zrozumienia podatności na leczenie, takie jak immunoterapia. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek i cytometria przepływowa pomagają scharakteryzować mikrośrodowisko guza, ale brakuje im kontekstu przestrzennego. Ostatnio pojawiły się platformy obrazowania multipleksowego i transkryptomicznego do badania mikrośrodowiska guza w kontekście in vivo.

Dostępne technologie multipleksowe do analizy mikrośrodowiska guza, zarówno iteracyjne, jak i typu "wszystko w jednym", są ograniczone do dwóch wymiarów. Protokół ten rozszerza charakterystykę na wymiar głębokości, zapewniając wgląd wykraczający poza pojedyncze FFPE lub zamrożone sekcje.

[Narrator] Na początek przenieś arkusze chusteczek do kubka na próbkę zawierającego ciepłe podłoże do zbioru i umieść je na płycie grzewczej przy stole przygotowawczym. Zamontuj tkankę na platformach w 15-centymetrowej płytce zawierającej pożywkę do pobierania. Ostrożnie ułóż tkankę zawierającą guz stroną międzybłonka skierowaną do góry nad małym otworem platformy i zabezpiecz ją jedwabnym szwem 2-0. Umieścić przygotowaną platformę tkankową odwrotnie całkowicie zanurzoną w 24-dołkowej płytce zawierającej pożywkę do pobierania. W celu utrwalenia dodaj 10 mililitrów bulionu utrwalającego do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 30 mililitrów zimnego PBS, aby przygotować 40 mililitrów buforu utrwalającego. Za pomocą kleszczy przenieś tkankę zamontowaną na platformach do bufora mocującego. I inkubować przez 24 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zdekantować utrwalacz. Zastąp go 40 mililitrami zimnego PBS. I inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Do barwienia dodaj 1 mililitr buforu blokującego do studzienki i włóż platformę tkankową. Blokuj przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej na bujaku ustawionym na niską prędkość 30 obr./min. Przygotuj 0,8 mililitra roztworu barwnika przeciwciał w probówce do mikrowirówek i odwiruj przy 10 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść 0,75 mililitra supernatantu do czystej studzienki na 9-dołkowej płytce inkubacyjnej. I włóż umytą platformę. Zawiń talerz w folię aluminiową. I inkubować przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej na bujaku ustawionym na niską prędkość 30 obr./min. Umyj platformę w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 40 mililitrów PBS przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodaj 0,1 mililitra PBS na środek szklanego dna 3,5-centymetrowej naczynia do obrazowania i odłóż ją na bok. Przykręć luźno pierścień regulacji wysokości w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara do zewnętrznej pokrywy. I zamontuj platformę w wewnętrznym plastikowym uchwycie, upewniając się o wyrównaniu rowka wycięcia. Zabezpiecz platformę za pomocą suwaka. Umieść zmontowany adapter do obrazowania na naczyniu ze szklanym dnem i ostrożnie opuść pierścień regulacji wysokości, aż tkanka dotknie bufora. Po osiągnięciu optymalnej odległości od szkła dodaj 0,2 mililitra PBS na tkankę dolną stroną do góry, aby zapobiec odwodnieniu tkanki podczas obrazowania. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów. Wybierz odpowiedni obiektyw, na przykład 20X lub 40X, i dodaj odpowiedni medium zanurzeniowe. Wybierz parametry akwizycji obrazu, takie jak szybkość skanowania 600 Hz, rozdzielczość XY 1024 na 1024 piksele, średnie trzyliniowe i skanowanie dwukierunkowe. Wybierz odpowiednie linie laserowe lub dostosuj laser światła białego, aby dopasować go do widm wzbudzenia i emisji fluoroforów używanych do barwienia. Umieść zmontowaną miskę do obrazowania w uchwycie próbki na stoliku mikroskopu. Wyśrodkuj próbkę za pomocą regulatora XY, przyłóż obiektyw do szkła nakrywkowego i rozpocznij akwizycję obrazu. Po każdej rundzie obrazowania wykonaj etap wybielania. Przygotuj 5 mililitrów 1,5 miligrama na mililitr roztworu borowodorku litu w wodzie destylowanej i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 1 mililitr roztworu borowodorku litu do czystego dołka 9-dołkowej płytki inkubacyjnej i włożyć umytą platformę na 60 minut w temperaturze pokojowej. Krótko umyj platformę w 20 mililitrach PBS w stożkowej rurce. Sprawdź pozostały sygnał fluorescencyjny, używając najwyższego ustawienia lasera dla kompensacji Z. Próbka otrzewnowej zawierająca guz wybarwiona pierwszą rundą iteracyjnego wybielania rozszerza multipleksowość lub IBEX 1, panel do wizualizacji jest pokazany tutaj. Zmiany nowotworowe zidentyfikowano jako struktury przypominające rozetę, które były podwójnie dodatnie dla CD44 i podoplaniny z układami jądrowymi charakterystycznymi dla międzybłoniaka brodawkowatego. Przedstawiono tutaj obrazy immunofluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości wybranych obszarów z próbki otrzewnej zawierającej guz. Obrazy te ujawniają regiony guza i interfejsy trzeciorzędowej struktury limfoidalnej guza, podkreślając konsekwentną infiltrację komórek odpornościowych z dużą gęstością komórek CD45-dodatnich. Rysunek ten przedstawia iteracyjne barwienie immunofluorescencyjne w cyklach IBEX od pierwszego do sześciu, ilustrując przestrzenny rozkład markerów immunologicznych i strukturalnych w obrębie zmiany nowotworowej i granicy faz struktury limfoidalnej guza. Poniżej przedstawiono maksymalne rzuty różnych przekrojów optycznych. To obrazowanie 3D potwierdziło, że zmiany nowotworowe i trzeciorzędowe struktury limfatyczne znajdują się na różnych głębokościach Z, demonstrując ograniczenia obrazowania 2D w uchwyceniu złożonej architektury tkanki.