Name: Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowego obrazowania tkanki nośnej guza z wykorzystaniem iteracyjnego wybielania, która rozszerza analizę multipleksową. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie mikrośrodowiska nowotworowego w immunoterapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health i National Cancer Institute (NCI). Badania te były również częściowo wspierane przez CAT-I, współpracę badawczą między NIAID i NCI, kierowaną przez Ronalda Germaina. Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność Andrei Radtke za jej entuzjastyczne, wspólne wysiłki. Jej wiedza specjalistyczna bardzo pomogła w tym badaniu.

Badanie zostało przeprowadzone za zgodą National Institutes of Health Institutional Review Board na podstawie protokołu NCT01915225. Tkanka ludzka została pobrana za pisemną świadomą zgodą w czasie laparoskopii diagnostycznej. Wszystkie tkanki były zawierające guz, co stwierdzono na podstawie widocznej oględzin i potwierdzono końcowym badaniem histopatologicznym. Szczegółowe informacje na temat wszystkich używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów. Schematyczna ilustracja całego przepływu pracy znajduje się w Rysunek 1.
1. Platformy drukujące, adapter do obrazowania i płyta inkubacyjna
<ol>
	<li>Krojenie/ Druk 3D/ procedury obróbki końcowej dla platformy i 9-dołkowych części płytki (opisane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A-C)
	<ol>
		<li>Krojenie: Otwórz oprogramowanie do krojenia i zaimportuj pliki projektu w formacie . Format STL (plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2). Zorientuj modele, aby uzyskać optymalne drukowanie i dodaj podpory. Wybierz drukarkę klasy medycznej, wybierz przezroczystą żywicę i wysokość warstwy 50 μm. Sprawdź możliwość wydrukowania i wyślij zadanie do drukarki.</li>
		<li>Drukowanie 3D: Sprawdź, czy drukarka jest gotowa (odpowiedni wkład z żywicą, zbiornik i platforma na miejscu). Na ekranie dotykowym drukarki wybierz przesłane zadanie z oprogramowania slicera, aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania użyj narzędzia do usuwania, aby odłączyć wydrukowaną część od platformy.</li>
		<li>Obróbka końcowa: Płucz część w jednostce myjącej wypełnionej 99% alkoholem izopropylowym (IPA) przez 15 minut. Wyjmij części z jednostki myjącej i zanurz ją w świeżym IPA przez 5 minut.</li>
		<li>Utwardzaj część przez 60 minut w temperaturze 60 °C. Usuń podpory za pomocą noży do spłukiwania. W razie potrzeby zeszlifuj wszelkie ślady podparcia za pomocą drobnoziarnistego papieru ściernego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krojenie/ Druk 3D/procedury przetwarzania końcowego dla regulatora wysokości i zewnętrznej pokrywy (przedstawione w <silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-C)
	<ol>
		<li>Krojenie: Otwórz oprogramowanie do drukowania i zaimportuj pliki projektu w formacie . Format STL (plik uzupełniający 3 i plik uzupełniający 4). Zorientuj modele i przypisz materiały. Wybierz żądany tryb drukowania (Wysoki poziom mieszania, Duża szybkość) i ustaw ustawienia modelu na wykończenie na Matowy. Sprawdź możliwość wydrukowania i wyślij zadanie do drukarki.</li>
		<li>Drukowanie 3D: Upewnij się, że drukarka ma załadowane odpowiednie materiały, a taca robocza jest czysta. W interfejsie monitora drukarki wybierz przesłane zadanie, aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania użyj skrobaka, aby delikatnie wyjąć wydrukowaną część z tacy roboczej.</li>
		<li>Obróbka końcowa: Umieść wydrukowane elementy w urządzeniu do czyszczenia strumieniem wody lub systemie czyszczenia mieszanego, aby usunąć materiał podporowy. W razie potrzeby wykonaj ręczne usuwanie podpory za pomocą narzędzi takich jak pęseta lub szczypce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laserowe cięcie suwaka platformy (pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A,C)
	<ol>
		<li>Przygotowanie projektu: Zaimportuj plik *. Plik projektowy DWG w oprogramowaniu wektorowym (plik uzupełniający 5). Ustaw kolory linii na czerwony (RGB) dla cięcia wektorowego. Wyślij zadanie do wycinarki laserowej.</li>
		<li>Konfiguracja wycinarki laserowej: Otwórz oprogramowanie wycinarki laserowej i zaimportuj plik projektowy. Wybierz rodzaj materiału i dostosuj ustawienia mocy, szybkości i rozdzielczości akrylu o grubości 1/32". Umieść materiał na stole laserowym, upewnij się, że jest prawidłowo wyrównany i ustaw ostrość laser.</li>
		<li>Cięcie laserowe: Rozpocznij proces cięcia laserowego i monitoruj, aby upewnić się, że materiał jest prawidłowo cięty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montaż tkanek na platformach drukowanych
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża do zbioru i stołu przygotowawczego
	<ol>
		<li>Uzupełnij 100 ml DMEM (o niskiej zawartości glukozy) środkiem Anti-Anti i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C do czasu uzyskania potrzebnego (podłoże do zbiorów).</li>
		<li>Ustaw "stół przygotowawczy" na sali operacyjnej z następującymi przedmiotami: autoklawizowane platformy drukowane w 3D, paczka jedwabnych opasek do szwów 2-0, płyta grzewcza, kubek na próbkę z 50 ml podgrzanego podłoża do zbiorów, 15-centymetrowa płytka hodowlana zawierająca 30 ml podgrzanej pożywki do zbioru i 24-dołkowa płytka z 4 dołkami zawierającymi 1,5 ml pożywki do zbioru (umieść wszystko na płycie grzewczej), 1 para kleszczy i 1 para nożyc chirurgicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resekcja i montaż tkanek 
	UWAGA: Tkanka pobierana jest z sali operacyjnej. Obszary otrzewnej z ogniskami guza o grubości i średnicy mniejszej niż 0,5 mm są identyfikowane podczas oględzin (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D). Warto zauważyć, że do przygotowania jednej platformy potrzebne jest ~ 2cm2 tkanki (otrzewnej).
	<ol>
		<li>Ostrożnie oddziel otrzewną zawierającą guz od leżącej poniżej mięśni ściany brzucha i powięzi (wykonywane przez chirurga). Przenieś powstałe arkusze tkanek do kubka na próbkę zawierającego ciepłe podłoże do zbioru i umieść na płycie grzewczej (stół przygotowawczy).</li>
		<li>Zamontuj tkankę na platformach w 15-centymetrowej płytce zawierającej pożywkę do pożywki. Ostrożnie ułóż tkankę zawierającą guz (strona międzybłonka skierowana do góry) na małej stronie otworu platformy i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą jedwabnego szwu 2-0. Umieść przygotowaną platformę tkankową odwrotnie (zanurzoną) w 24-dołkowej płytce zawierającej pożywkę do pobierania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E-G). 
		UWAGA: Zamontuj tkankę na tyle nauczoną, aby zapobiec fałdom na powierzchni platformy, ale nie generuj napięcia, ponieważ wywoła to niepożądane zmiany biomechaniczne i fizjologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedura utrwalania/barwienia/wybielania
UWAGA: Zmiany w stosunku do oryginalnego protokołu dostosowane do cienkiego FFPE 4 μm lub stałych sekcji zamrożonych są opisane w Rysunek 3. Tabela 1 zawiera listę przeciwciał (z rozcieńczeniami) stosowanych w rundach IBEX 1-6.
<ol>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Przygotować 40 ml buforu utrwalającego, dodając 10 ml bulionu utrwalającego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml zimnego 1x PBS.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy przenieść tkankę zamontowaną na platformach do buforu utrwalającego i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zdekantować utrwalacz i zastąpić go 40 ml zimnego 1x PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml buforu blokującego (1% BSA, 0,3% Triton-X-100, 1% Fc Block w 1x PBS przefiltrowany filtrem strzykawkowym 0,22 μm) do każdej studzienki i wprowadź platformy tkankowe. Blokuj przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej na kołysce ustawionej na niską prędkość (30 obr./min). 
		UWAGA: Upewnij się, że wycięcie na platformie i rowek w studni są wyrównane. Ten etap nie jest wrażliwy na czas i można go wykonać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 0,8 ml roztworu przeciwciała/barwnika w probówce do mikrowirówki i odwirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 0,75 ml do czystego dołka na 9-dołkowej płytce inkubacyjnej i włożyć umytą platformę.</li>
		<li>Zawiń płytkę w folię aluminiową i inkubuj przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej na bujaku ustawionym na niską prędkość (30 obr./min).</li>
		<li>Umyć platformę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 40 ml 1x PBS przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Platforma jest teraz gotowa do włożenia do adaptera do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>bielenie
	<ol>
		<li>Po każdej rundzie barwienia i obrazowania należy wybielić fluorofory za pomocą środka redukującego estry borowodorku litu (LiBH4). Zabieg ten wyeliminuje sygnały fluorescencyjne z Alexa Fluor (AF)488, AF647 i AF750, ale nie z AF594 i barwnika jądrowego Hoechst. 
		UWAGA: Borowodorek litu jest wyjątkowo reaktywny z wodą. Łatwopalne gazy wodorowe uwalniają się w kontakcie z wodą; Zużyty borowodorek litu i materiały jednorazowego użytku zanieczyszczone borowodorkiem litu należy utylizować jako odpady niebezpieczne.</li>
		<li>Przygotować 5 ml roztworu LiBH4 o stężeniu 1,5 mg/ml w wodzie destylowanej (w kapturze chemicznym) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Roztwór LiBH4 straci swoją skuteczność redukcyjną/wybielającą, jeśli zostanie przygotowany >4 godziny przed użyciem.</li>
		<li>Przenieść 1 ml roztworu LiBH4 do czystego dołka na 9-dołkowej płytce inkubacyjnej i włożyć umytą platformę na 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj platformę krótko w 20 ml 1x PBS w stożkowej probówce i sprawdź, czy pozostały sygnał fluorescencyjny przy użyciu najwyższego ustawienia lasera dla kompensacji Z w poprzedniej rundzie obrazowania przed przystąpieniem do kolejnych rund barwienia.</li>
		<li>Powtórzyć blokowanie próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przed przejściem do następnego etapu inkubacji przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Procedura obrazowania
<ol>
	<li>Montaż adapterów/platform do obrazowania
	<ol>
		<li>Dodaj 0,1 ml 1x PBS na środek szklanego dna 3,5 cm naczynia do obrazowania i odstaw na bok. Przykręć luźno pierścień regulacji wysokości zgodnie z ruchem wskazówek zegara do zewnętrznej pokrywy i zamontuj platformę w wewnętrznym plastikowym uchwycie (wyrównanie wycięcia). Zabezpiecz platformę za pomocą suwaka.</li>
		<li>Umieść zmontowany adapter do obrazowania na naczyniu ze szklanym dnem i ostrożnie opuść pierścień regulacji wysokości, aż tkanka dotknie bufora. Unikaj obracania platformy na szklanym dnie.</li>
		<li>Po osiągnięciu optymalnej odległości od szkła dodaj 0,2 ml 1x PBS na tkankę (teraz dolną stroną do góry), aby uniknąć odwodnienia tkanek podczas obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie konfokalne
	<ol>
		<li>Włącz wszystkie elementy odwróconego mikroskopu konfokalnego, w tym komputer, mikroskop, laser i źródło światła LED do użytku z okularem. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni obiektyw (np. 20x lub 40x) i dodaj odpowiedni medium immersyjne. Na przykład w tym badaniu używany jest obiektyw z 20-krotnym powiększeniem wody; Do obiektywu dodaje się ~200 μl wody, aby uniknąć wysuszenia podczas długich akwizycji obrazu.</li>
		<li>Umieść zmontowaną miskę do obrazowania w uchwycie próbki na stoliku mikroskopu i upewnij się, że próbka jest bezpieczna (nie porusza się). 
		UWAGA: Umieszczając zmontowaną próbkę na stoliku mikroskopu, zwróć uwagę na położenie wycięcia i używaj tej samej pozycji w cyklach iteracyjnych, aby ułatwić wyrównanie obrazu. Ważne jest, aby adapter obrazowania był ustawiony na optymalną wysokość podczas kolejnych rund.</li>
		<li>Wyśrodkuj preparat za pomocą regulatora XY i przyłóż obiektyw do szkła nakrywkowego. Patrząc przez okular i używając sygnału Hoechsta jako punktu odniesienia, przesuń obiektyw, aby uzyskać precyzyjną ostrość na tkance.</li>
		<li>Dobierz odpowiednie linie laserowe lub dostosuj WLL do widm wzbudzenia i emisji fluoroforów używanych do barwienia próbki tkanki. Wyeliminuj nakładanie się kanałów, dostosowując ustawienia i dodając sekwencje, jeśli fluorofory mają podobne widma wzbudzenia.</li>
		<li>Wybierz następujące parametry akwizycji obrazu: szybkość skanowania 600 Hz, rozdzielczość XY 1024 x 1024, średnie 3-liniowe i skanowanie dwukierunkowe.</li>
		<li>Wybierz następujące parametry stosu Z: (1) użyj rozmiaru kroku Z zoptymalizowanego pod kątem używanego celu, (2) zdefiniuj początek i koniec stosu, (3) dostosuj parametry kompensacji Z, aby uzyskać równą jasność w całym stosie i (4) uzyskaj stos testowy 1 kafelka z jedną średnią.</li>
		<li>Zdefiniuj obszar, który ma być obrazowany, i uzyskaj stos kafelków Z o wysokiej rozdzielczości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, N. M., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment.</a> Curr Biol. 30 (16), R921-R925 (2020).</li>
<li>Li, Z., Li, J., Bai, X., Huang, X., Wang, Q. Tumor microenvironment as a complex milieu driving cancer progression: A mini-review. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22Clin+Transl+Oncol%22">Clin Transl Oncol</a>. , (2024).</li>
<li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nat Rev Clin Oncol. 14 (12), 717-734 (2017).</li>
<li>Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+microenvironment+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor microenvironment for cancer therapy.</a> Int J Mol Sci. 20 (4), 840(2019).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+immunofluorescence%3A+A+powerful+tool+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiplex immunofluorescence: A powerful tool in cancer immunotherapy.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).</li>
<li>Bollhagen, A., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+tissue+imaging+in+precision+oncology+and+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed tissue imaging in precision oncology and translational cancer research.</a> Cancer Discov. 14 (11), 2071-2088 (2024).</li>
<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+spatial+transcriptomics+and+its+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Advances in spatial transcriptomics and its applications in cancer research.</a> Mol Cancer. 23 (1), 129(2024).</li>
<li>Kashyap, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+tumor+heterogeneity%3A+From+data+acquisition+to+metric+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantification of tumor heterogeneity: From data acquisition to metric generation.</a> Trends Biotechnol. 40 (6), 647-676 (2022).</li>
<li>Chang, Q., Hedley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+applications+of+flow+cytometry+in+solid+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Emerging applications of flow cytometry in solid tumor biology.</a> Methods. 57 (3), 359-367 (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. Single-cell analyses inform mechanisms of myeloid-targeted therapies in colon cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+L+%22Cell%22">Cell</a>. 181 (2), 442-459.e29 (2020).</li>
<li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+predictors+of+immunotherapy+response+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial predictors of immunotherapy response in triple-negative breast cancer.</a> Nature. 621 (7980), 868-876 (2023).</li>
<li>Maestri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proximity+of+tumor-immune+interactions+predicts+patient+outcome+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Spatial proximity of tumor-immune interactions predicts patient outcome in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 79 (4), 768-779 (2024).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+microenvironment+in+cancer+progression+and+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Role of tumor microenvironment in cancer progression and therapeutic strategy.</a> Cancer Med. 12 (10), 11149-11165 (2023).</li>
<li>Veninga, V., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+organoids%3A+Opportunities+and+challenges+to+guide+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine.</a> Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).</li>
<li>Lin, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3d+atlas+of+state+transitions+and+immune+interaction+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3d atlas of state transitions and immune interaction in colorectal cancer.</a> Cell. 186 (2), 363-381.e19 (2023).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibex%3A+An+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibex%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li>
<li>Van Baal, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histophysiology+and+pathophysiology+of+the+peritoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">The histophysiology and pathophysiology of the peritoneum.</a> Tissue Cell. 49 (1), 95-105 (2017).</li>
<li>Bridda, A., Padoan, I., Mencarelli, R., Frego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+mesothelioma%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22MedGenMed%22%5BJournal%5D)">Peritoneal mesothelioma: A review.</a> MedGenMed. 9 (2), 32(2007).</li>
<li>Demuytere, J., Ernst, S., Van Ovost, J., Cosyns, S., Ceelen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+immune+microenvironment+in+peritoneal+carcinomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The tumor immune microenvironment in peritoneal carcinomatosis.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 371, 63-95 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. Heterogeneity of tertiary lymphoid structures predicts the response to neoadjuvant therapy and immune microenvironment characteristics in triple-negative breast cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+Q+%22Br+J+Cancer%22">Br J Cancer</a>. , (2024).</li>
<li>Kepenekian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+mesothelioma%3A+Systematic+review+of+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+%28HIPEC%29+protocol+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal mesothelioma: Systematic review of hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) protocol outcomes.</a> Indian J Surg Oncol. 14 (Suppl 1), 39-59 (2023).</li>
<li>Mcquade, C., Renton, M., Chouhan, A., Macdermott, R., O'brien, C. Review of imaging peritoneal disease and treatment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcquade%2C+C+%22Can+Assoc+Radiol+J%22">Can Assoc Radiol J</a>. , (2024).</li>
<li>Kenerson, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+as+a+biologic+surrogate+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture as a biologic surrogate of human cancer.</a> Ann Transl Med. 8 (4), 114(2020).</li>
<li>Arrizabalaga, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+for+ex+vivo+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system for ex vivo immunotherapy studies.</a> Methods Cell Biol. 189, 55-69 (2024).</li>
<li>Neumeister, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+effect+of+preanalytic+cold+ischemic+time+on+protein+expression+in+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of effect of preanalytic cold ischemic time on protein expression in breast cancer tissues.</a> J Natl Cancer Inst. 104 (23), 1815-1824 (2012).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%3A+A+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes: A series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47 (9), 1179-1188 (1999).</li>
<li>Rajaram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+strategies+to+capture+single-cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sampling strategies to capture single-cell heterogeneity.</a> Nat Methods. 14 (10), 967-970 (2017).</li>
<li>Bella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+peritoneal+carcinomatosis+to+develop+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mouse models of peritoneal carcinomatosis to develop clinical applications.</a> Cancers (Basel). 13 (5), 963(2021).</li>
</ol>

Obecne techniki multipleksowe do obrazowania fluorescencyjnego są ograniczone do cienkich przekrojów i nie zapewniają kontekstu 3D. W niniejszym badaniu opisano protokół zastosowania metody obrazowania IBEX16,17 do nienaruszonych guzów zamontowanych na specjalnie zaprojektowanych platformach. Zmiany nowotworowe otrzewnej zostały wybrane w celu podkreślenia techniki, ponieważ u pacjentów często występuje wiele złogów guza o idealnej wielkości, które są pobierane wraz z otaczającą normalną otrzewną w ramach standardowej operacji cytoredukcji przeprowadzanej w większości ośrodków referencyjnych trzeciego stopnia na całym świecie22,23. Protokół ma jednak zastosowanie zarówno do przerzutów miąższowych, jak i guzów mysich przy użyciu plastrów guza, jak opisano wcześniej24,25. Co więcej, średnica pierścienia montażowego na platformach może być dostosowana do potrzeb eksperymentalnych/tkankowych, chociaż większe obszary są podatne na zwiotczenie tkanek i wydłużony czas obrazowania. Niezależnie od źródła i wielkości tkanki, czas między pobraniem a konserwacją musi być minimalny, aby zapewnić optymalną jakość26. Ustawienie stołu przygotowawczego na sali operacyjnej gwarantuje szybką obsługę w przypadku zaangażowania pacjentów. Należy odnotować czas od pobrania do utrwalenia tkanki w celu zapewnienia porównywalności między doświadczeniami.
Próbki tkanek są pobierane za pomocą protokołu IBEX, ponieważ wykonuje się całe mocowania, tj. etapy fiksacji i obrazowania, a także wybielania, z nienaruszoną tkanką przymocowaną do platformy. Gwarantuje to zachowanie próbki w iteracyjnych cyklach barwienia/obrazowania/wybielania, ponieważ nie ma półtrwałego interfejsu sekcja-szkło i nie ma potrzeby wielokrotnego umieszczania/usuwania szkła nakrywkowego z tkanki, co może prowadzić do utraty tkanki. Aby zaoszczędzić na odczynnikach, specjalnie zaprojektowana 9-dołkowa płytka gwarantuje optymalne dopasowanie platformy przy minimalnej "martwej objętości". Wszystkie przeciwciała używane do barwienia są pierwotnymi przeciwciałami sprzężonymi, a wszystkie użyte koniugaty fluoroforowe (z wyjątkiem barwnika Hoechsta) to barwniki Alexa Fluor, które zostały wybrane ze względu na ich doskonałą jasność27. Inne panele przeciwciał fluoroforowych zostały zaprojektowane zgodnie z danymi zdeponowanymi przez społeczność obrazowania IBEX, otwarte, globalne repozytorium gromadzące zestawy danych, protokoły i informacje zwrotne od międzynarodowej grupy naukowców korzystających z IBEX (https://ibeximagingcommunity.github.io/ibex_imaging_knowledge_base/). Sekwencja paneli przeciwciał została starannie dobrana. Ogólnie rzecz biorąc, cele o niskiej liczebności umieszczono we wcześniejszych cyklach. Cykl IBEX 1 (CD45, CD44 i Podoplanina) jest wyjątkiem, ponieważ te trzy markery zostały wykorzystane do identyfikacji zmian nowotworowych w początkowej rundzie barwienia.
Panele przeciwciał są porównywalnie małe, aby zmniejszyć przesłuchy kanałowe przy wysokich ustawieniach intensywności lasera, co jest niezbędne do zobrazowania tkanki głębiej za pomocą mikroskopu konfokalnego. Tam, gdzie to możliwe, włączono koniugaty AF750, aby rozszerzyć panel z 2 do 3 przeciwciał. Warto zauważyć, że nie ma wielu koniugatów AF750 dostępnych na rynku, a fakt, że cel dla tego kanału powinien być bardzo obfity, ogranicza stosowanie tego fluoroforu. Przykładem jest przeciwciało anty-SMA sprzężone z AF750, które zostało użyte w tym protokole. Chociaż jest to klon, który działa niezawodnie skoniugowany z AF488 lub AF594, intensywność sygnału dla tego przeciwciała sprzężonego z AF750 jest znacznie niższa, co utrudnia generowanie wysokiej jakości stosów Z.
Inkubacje przeciwciał trwające 3 godziny w temperaturze pokojowej są krótkie w porównaniu z oryginalnym protokołem i najprawdopodobniej odzwierciedlają niższą gęstość komórek w próbkach tkanki otrzewnej. Natomiast etap wybielania z użyciem 1,5 mg/ml borowodorku litu przez 60 minut był bardziej rygorystyczny. Parametry te zostały określone empirycznie i mogą się różnić w zależności od użytej tkanki i przeciwciał. Warto zauważyć, że w wyniku inkubacji w reaktywnym roztworze wybielającym małe pęcherzyki powietrza mogą zostać uwięzione w tkance. Za każdym razem, gdy stawało się to widoczne na etapie obrazowania procedury, próbki odgazowywano, wystawiając platformę na 9-dołkowej płytce inkubacyjnej na działanie próżni za pomocą kanistra ssącego. Proste rejestracje próbek ITK, często stosowane w badaniach IBEX, nie mogły być wykonane ze względu na przytłaczającą ilość danych wprowadzanych do oprogramowania do analizy obrazu. Niemniej jednak identyczne populacje komórek można łatwo zidentyfikować, porównując poszczególne zestawy danych. Ogólnie rzecz biorąc, cykle iteracyjne były tak rozłożone w czasie, że jeden cykl można było ukończyć w ciągu jednego dnia, przy czym obrazowanie zajmowało większość całego cyklu (~ 8 godzin).
Technika ta ma ograniczenia, o których warto wspomnieć. Wymóg czasowy określony w protokole sprawia, że jest mało prawdopodobne, aby metoda ta została przyjęta na szeroką skalę, ale raczej w wybranych okolicznościach. Przewidujemy, że protokół ten najlepiej wykorzysta się do scharakteryzowania zmian w mikrośrodowisku immunologicznym guza przed i po leczeniu (np. Przeciwciała bispecyficzne do immunoterapii raka) lub do przewidywania ogólnych wyników leczenia. Chociaż protokół ten oferuje charakterystykę 3D, nie wiadomo, jak duży obszar musi zostać zbadany, aby skutecznie opisać guz, w tym jego złożone populacje komórek28. Dostęp do świeżych tkanek ludzkich może być również utrudniony w niektórych ośrodkach, ale przewidujemy, że protokół ten ma zastosowanie również do modeli zwierzęcych29.
Zastosowania tego protokołu są różnorodne, od badań podstawowych analizujących skład TME w wielu guzach litych po biopsje tkanek przed / po biopsjach u pacjentów włączonych do badań klinicznych. Chociaż dane możliwe do uzyskania z przekroju tkanki o grubości pojedynczej warstwy komórkowej są ogromne, biologię 3D można łatwo przeoczyć. Postrzegamy obrazowanie 3D jako dodatek do innych technik biologii przestrzennej, prawdopodobnie pomagając w wyborze przekrojów 2D do późniejszych analiz. Ponadto aktywnie trwa opracowywanie protokołu włączającego komponent obrazowania na żywo przez wiele godzin przy użyciu opisanej konfiguracji montażu i obrazowania tkanki.

Guzy lite są bardzo zmienne, ze skomplikowanym składem typów komórek (złośliwe i niezłośliwe), białek macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników rozpuszczalnych1,2. Ostatecznie to wysoce złożone, heterogenne mikrośrodowisko guza (TME) decyduje o podatności na leczenie takie jak immunoterapia3,4. W związku z tym technologie takie jak wysoce multipleksowana immunofluorescencja5,6 i transkryptomika przestrzenna7 zostały zastosowane do scharakteryzowania złożoności TME w sekcjach o grubości warstwy komórki (~4 μM).
W przeciwieństwie do metod dyspersji komórek, takich jak sekwencjonowanie pojedynczych komórek i cytometria przepływowa8,9,10, techniki te zachowują relacje przestrzenne, dostarczając krytycznych informacji o przesłuchach komórkowych i mogą być wykorzystane do identyfikacji potencjalnych biomarkerów do przewidywania odpowiedzi na leczenie11,12,13. Jednak zmiany nowotworowe są z natury strukturami trójwymiarowymi (3D), a podejścia 2D, takie jak te wymienione powyżej, nie oddają odpowiednio złożonego krajobrazu komórkowego. Znaczenie biologii 3D zostało docenione w tej dziedzinie, czego dowodem jest szerokie wykorzystanie kultur organoidów nowotworowych pochodzących od pacjentów14. Jednak organoidy nie zachowują złożoności komórkowej oryginalnego TME in vivo, co ogranicza możliwość zastosowania w lekach immunomodulujących lub do charakteryzowania różnych populacji komórek TME.
Chociaż możliwe jest przeprowadzanie analiz na seryjnych przekrojach 2D i obliczeniowe "zszywanie" obrazów w celu renderowania 3D, technika ta jest zbyt kosztowna i trudna do osiągnięcia przy wysokiej wierności15. Aby w opłacalny sposób scharakteryzować tkanki 3D (np. nowotwory) w powtarzalny sposób, opracowano unikalną metodę przygotowania i barwienia/analizy immunofluorescencji multipleksowej, którą zademonstrowano przy użyciu zmian nowotworowych otrzewnej od pacjenta z pierwotnym rakiem otrzewnej.
Oparty na adaptacji dobrze znanej techniki IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity)16,17, ten protokół szczegółowo opisuje druk 3D uchwytu tkankowego i adaptera do obrazowania, pobieranie i montowanie tkanki otrzewnej, wielokrotne cykle barwienia różnymi markerami nowotworowymi i komórkowymi oraz konfokalne obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 750 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A30105</td><td>Barwnik F-aktynowy</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało antyludzkie CD206 (MMR)</td><td>Przeciwciało BioLegend</td><td>321114</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-ludzkie CD31</td><td>Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>303110</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało antyludzkie CD4</td><td>Przeciwciało BioLegend</td><td>300519</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało anty-ludzkie HLA-DR</td><td>Przeciwciało BioLegend</td><td>307656</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwko myszy/ludzkiemu CD44</td><td>Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>103016</td></tr><tr><td>Przeciwciało Alexa Fluor 594 przeciwko ludzkiemu CD45</td><td>Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>304060</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw kalretyninie Alexa Fluor 647 [EP1798]</td> <td>Przeciwciało Abcam</td><td>ab214244</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antyludzkie CD3 Alexa Fluor 647</td><td>Przeciwciało BioLegend</td><td>300416</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie przeciwko CD8 Alexa Fluor 647</td><td>Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>344726</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkiej podoplaninie Przeciwciało przeciw ludzkiej podoplaninie</td><td>Przeciwciało BioLegend</td><td>337007</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Vimentin Alexa Fluor 647</td><td></td><td>Przeciwciało</td><td>677807 BioLegend</td></tr><tr><td>Przeciwciało Alexa Fluor 647 CD68 (KP1)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20060AF647</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało Alexa Fluor 750 Cytokeratyna, pan Przeciwciało (AE-1 / AE-3)</td> <td>Przeciwciało</td> <td>Novus</td><td>NBP2-33200AF750</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 750 Ludzkie przeciwciało alfa-aktynowe mięśni gładkich</td><td>R& Przeciwciało IC1420S D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne Alexa Fluor 488 CD20 (L26) eBioscience</td><td>Thermo Fisher</td><td>53-0202-82</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicze</td><td>podłoże do zbioru</td>suplementu <td>Gibco</td><td>15240096</td></tr><tr><td>BioMed Clear Resin (forma 3)</td><td>Żywica FormLabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>używana do platformy + płytki inkubacyjnej</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-500g</td><td>Blokowanie składnika rozwiązania</td></tr><tr><td>Odlew akrylowy o grubości</td><td></td><td></td> 1/32" <td>używany do cięcia suwaka</td></tr><tr><td>CleanStation DT3&nbsp;</td>Obróbka końcowa <td>Stratasys</td><td>DT3</td><td>dla regulatora wysokości i pojemnika na pokrywę zewnętrzną</td></tr><tr><td>, próbka&nbsp;</td><td>McKesson</td><td>870203</td><td>przenoszeniu tkanki ze stołu do stołu przygotowawczego</td></tr><tr><td>CorelDraw&nbsp;</td><td>CorelDRAW</td><td></td><td>Oprogramowanie do przygotowania wektorowego pliku projektowego do cięcia laserowego</td></tr><tr><td>Cytofix</td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>utrwalacz</td></tr><tr><td>Talerz 15 cm</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>talerz używany podczas montażu</td></tr><tr><td>Talerz 35 mm nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe 14 mm Średnica szkła Niepowlekany</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Talerz obrazowy</td></tr><tr><td>DMEM (bez glukozy)</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td>pożywka do zbioru</td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Bioscience</td><td>564220</td><td>składnik roztworu blokującego</td></tr><tr><td>Form 3B+</td><td>Formlabs</td><td>Form 3B+</td><td>drukarka używana do platformy + płytki inkubacyjnej</td></tr><tr><td>Form Cure</td><td>Formlabs</td><td>FH-CU-01</td><td>obróbka końcowa dla platformy + płytki inkubacyjnej</td></tr><tr><td>Form Wash</td><td>Formlabs</td><td>FH-WA-01</td><td>obróbka końcowa dla platformy + płytki</td></tr> <tr>inkubacyjnej<td>GrabCAD Print</td><td></td><td>GrabCAD GrabCAD Oprogramowanie</td><td>do drukowania do przygotowywania modeli do drukarek Stratasys</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>barwnik jądrowy</td></tr><tr><td>J826 Prime Drukarka 3D</td><td>Stratasys</td><td>J826</td><td>używana do regulatora wysokości i zewnętrznej pokrywy</td></tr><tr><td>LAS X</td> Oprogramowanie <td>Leica</td><td>LAS X</td><td>Confocal</td></tr><tr><td>System cięcia laserowego&nbsp;</td><td>Uniwersalne systemy</td><td>laserowe ULS PLS6.150D</td><td>CO2 Cięcie laserowe używane do suwaka</td></tr><tr><td>Borowodorek litu</td><td>STREM Chemikalia</td><td>93-0397</td><td>substancja wybielająca</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td> Baza <td>10010023 Gibco</td><td></td><td>Bufor do mycia, blokowania, barwienia</td></tr><tr><td>PreForm</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td>PreForm do przygotowania modeli do drukarek Formlab</td></tr><tr><td>Szwy jedwabne&nbsp; 2-0&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>A305. Tkanka</td><td>przymocowana do platformy</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Stellaris 8 WLL</td><td>Obrazowanie</td> konfokalne Leica <td>STELLARIS 8</td><td>Obrazowanie konfokalne&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td></td><td></td><td>Filtr ab roztwór</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>American Bio</td><td>AB02025-00100</td><td>odczynnik permeabelizujący, składnik roztworu blokującego</td></tr><tr><td>Vero ContactClear</td><td>Stratasys</td><td>CTT610, żywica 4 KG</td><td>używana do regulatora wysokości i pokrywy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Taca grzewcza</td><td>Spring USA</td><td>ST-1220</td><td>utrzymuje ciepło podłoża i tkanek</td></tr><tr><td>Woda, destylowana</td><td>Gibco</td><td>15230-170</td><td>rozcieńczalnik do LiBH4</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

Przestrzenna heterogeniczność mikrośrodowiska guza (TME) jest krytycznym wyznacznikiem odpowiedzi terapeutycznej, szczególnie w przypadku leków immunoonkologicznych, gdzie sukces zależy od rozmieszczenia określonych subpopulacji komórek odpornościowych. W ciągu ostatniej dekady wprowadzono wiele zaawansowanych technologii w celu uzyskania szczegółowej rozdzielczości TME przy użyciu dwuwymiarowych przekrojów tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) lub utrwalonych. Chociaż te cienkie skrawki są łatwiejsze do pozyskania i analizy, brakuje im trójwymiarowej architektury potrzebnej do wiarygodnego i kompleksowego scharakteryzowania guza. Aby rozwiązać ten problem, opracowano technikę montowania i obrazowania tkanek, która umożliwia trójwymiarową analizę zmian nowotworowych w ich naturalnym stanie in vivo. Protokół ten określa pobieranie ludzkiej tkanki nowotworowej, montaż próbek na specjalnie wydrukowanych platformach oraz procedury barwienia próbek po utrwaleniu. Technika multipleksowanej immunofluorescencji, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), została zaadaptowana do scharakteryzowania trójwymiarowego TME za pomocą maksymalnie 15 markerów dla komórek nowotworowych, immunologicznych i zrębu przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał. Głębokość obrazowania do 100 μm uzyskano przy użyciu odwróconego laserowego mikroskopu konfokalnego ze światłem białym z specjalnie wydrukowanym adapterem do obrazowania i dostępnymi na rynku naczyniami ze szklanym dnem, aby zapewnić optymalną orientację tkanki. Protokół ten podkreśla potencjał metody IBEX w zakresie rozszerzania multipleksowanych badań immunofluorescencyjnych, zapewniając bardziej kompleksowe zrozumienie składu TME.

Otułka brzuszna jest błoniastą strukturą o grubości mniejszej niż 1 mm, która wyścieła powierzchnię ściany brzusznej i przylega do powierzchni narządów jamy brzusznej. Składa się z powierzchniowego mezotelium oraz leżącej pod nim tkanki łącznej, w której rozmieszczone są komórki tłuszczowe, limfocyty, makrofagi i fibroblasty, a także naczynia krwionośne i limfatyczne. Nowotwory otrzewnej najczęściej wynikają z przerzutów guzów jamy brzusznej (np. raka jajnika lub raka żołądka)18 lub, rzadziej, mogą być pierwotnymi nowotworami otrzewnej (np. międzybłonniakiem)19. Te często małe (&lt;1 cm) zmiany nowotworowe są bardzo złożone, ale nadają się do charakterystyki 3D przy użyciu opisaną techniki. Maksymalna projekcja pięciu sekcji konfokalnych jest wykorzystywana do przeglądu całej próbki zamontowanej na platformie (Rycina 4, wstawka w lewym górnym rogu). Trzy podstawowe przeciwciała sprzężone (AF488-CD44, AF594-CD45 oraz AF647-Podoplanin) wraz z barwnikiem jądrowym Hoechst zostały użyte w pierwszej rundzie IBEX (IBEX1, Rycina 4). Zmiany nowotworowe stają się widoczne dzięki strukturom przypominającym rozetki, które są podwójnie dodatnie dla CD44 i Podoplaniny oraz wykazują układ jąder charakterystyczny dla brodawkowatego międzybłonniaka.
Komórki nowotworowe zidentyfikowano na podstawie morfologii komórek oraz przy użyciu dwóch przeciwciał, ponieważ zarówno anty-Podoplanina, jak i anty-CD44 rozpoznają komórki nienowotworowe, co potwierdzono poprzez wykrycie naczyń limfatycznych za pomocą anty-Podoplaniny oraz wiązanie przeciwciała CD44 z subpopulacjami komórek odpornościowych. Następnie mniejsze obszary zainteresowania (ROI) są rejestrowane w formacie skanowania kafelkowego w wyższej rozdzielczości, przy zoptymalizowanych rozmiarach kroku Z w celu renderowania projekcji 3D (Rycina 5A). Platformy poddano iteracyjnym procedurom barwienia, a te same ROI obrazowano w cyklach IBEX 1-6. Reprezentatywne obrazy dla nowotworu (żółta ramka) oraz styków nowotworu z trzeciorzędowymi strukturami limfatycznymi (TLS) (niebieska ramka) przedstawiono na Rycini 5B-M.
Obecność TLS oraz gęstość komórek CD3-dodatnich wskazują na znaczną infiltrację komórek odpornościowych20 i możliwą odpowiedź na leki immunomodulujące21. Warto zauważyć, że TLS i główna masa zmian nowotworowych znajdują się na różnych głębokościach Z tkanki, co wykazano poprzez porównanie projekcji stosów różnych przekrojów optycznych na Rysunku 6, co podkreśla zalety obrazowania 3D oraz potencjalne pominięcie aspektów biologicznych przy zastosowaniu obrazowania 2D do struktur 3D. Trójwymiarowy charakter tych zmian staje się bardziej widoczny w plikach wideo (Film 1-12), które przedstawiają renderingi wolumetryczne poszczególnych zmian z Rysunku 5.
<img alt="Proces obrazowania tkanek 3D; drukowanie platformy, montaż tkanki, inkubacja przeciwciał, rekonstrukcja 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat postępowania od druku 3D do obrazowania 3D guzów otrzewnej. Protokół składa się z sekwencji pięciu kroków służących do przygotowania multipleksowych obrazów 3D z tkanek otrzewnej z guzem. (1) Drukowanie platform przyjmujących tkankę, elementów adaptera obrazującego oraz płytki inkubacyjnej. (2) Procedury pozyskiwania i montażu tkanki. (3) Fixacja paraformaldehydem. (4) Cykle barwienia i obrazowania IBEX. (5) Rekonstrukcja 3D przy użyciu oprogramowania do obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat konfiguracji obrazowania tkanek, szalki wielokomorowe, obrazy mikroskopowe i proces biopsji eksperymentalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Komponenty sprzętowe z interfejsem tkankowym do obrazowania 3D. (A) Schemat montażu platformy w adaptorze obrazującym. (B) 9-dołkowa płytka inkubacyjna. (C) Fotografie komponentów adaptora obrazującego wraz z montażem. (D) Brzuch z miąższem międzybłoniowym z obecnością międzybłoniaka zaobserwowany podczas laparoskopii diagnostycznej. (E) Mocowanie tkanki na platformie. (F,G) Brzuch z obecnością guza zamocowany na platformach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu immunostainingu: fiksacja, płukanie, blokowanie, przeciwciała, wybielanie; kroki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat chronologiczny cykli IBEX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy organoidu nowotworowego; immunofluorescencja znakuje CD44, CD45; pasek skali 1 mm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przegląd platformy po inkubacji z panelem IBEX1. Maksymalna projekcja całej platformy po inkubacji z panelem IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 oraz AF647-Podoplanin). Przerywana linia okręgu zaznacza nowotwór. Wstawka: Fotografia otrzewnej z nowotworem zamocowanej na platformie obrazowej. Pasek skali: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna wielokanałowa; architektura tkanki; markery przeciwciał; wyniki analizy IBEX." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wysokorozdzielcze obrazy immunofluorescencyjne wybranych obszarów platformy. (A) Maksymalna projekcja złączonego obrazu Z-stack składającego się z 56 kafelków, pozyskanego po inkubacji z panelem IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 i AF647-Podoplanin). Żółty prostokąt: zmiana nowotworowa pokazana na panelach (B-G). Niebieski prostokąt: interfejs między guzem a trzeciorzędową strukturą limfatyczną pokazany w (H-M). (B-G) Pojedyncza zmiana nowotworowa z panelami IBEX 1-6 w renderingu wolumetrycznym. (B) IBEX1, zielony: CD44, czerwony: CD45, cyjan: Podoplanin. (C) IBEX2, zielony: CD20, czerwony: F-aktyna, cyjan: CD3. (D) IBEX3, zielony: CD8, czerwony: CD4, cyjan: panCK. (E) IBEX4, zielony: CD31, cyjan: CD68. (F) IBEX5, zielony: CD206, cyjan: Kalretynina. (G) IBEX6, zielony: Wimentyna, czerwony: HLADR. (H-M) Pojedynczy interfejs między guzem a trzeciorzędową strukturą limfatyczną z panelami IBEX 1-6 w renderingu wolumetrycznym. (H) IBEX1, zielony: CD44, czerwony: CD45, cyjan: Podoplanin. (I) IBEX2, zielony: CD20, czerwony: F-aktyna, cyjan: CD3. (J) IBEX3, zielony: CD4, czerwony: panCK, cyjan: CD8. (K) IBEX4, zielony: CD31, czerwony: SMA, cyjan: CD68. (L) IBEX5, zielony: CD206, cyjan: Kalretynina. (M) IBEX6, zielony: HLADR, cyjan: Wimentyna. Wszystkie panele, niebieski: Hoechst. Paski skali: (A, 1 mm); (B-M, 250 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie fluorescencyjne białek CD3, CD20; kanały połączone; analiza immunofluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Symulowane obrazowanie 2D. Porównanie projekcji ograniczonych (10 przekrojów optycznych) i pełnego stosu (102 przekroje optyczne) potwierdza utratę kontekstu tkankowego w symulacji 2D. (A) Projekcja maksymalna przekrojów 30-40 (10 µm). (B) Projekcja maksymalna przekrojów 85-95 (10 µm). (C) Projekcja maksymalna przekrojów 1-102 (~100 µm). Wszystkie panele, IBEX2 (Hoechst, AF488-CD20, AF647-CD3, AF790-faloidyna). Pasek skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Przeciwciała użyte w poszczególnych panelach IBEX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Table%201_IBEX%20panels.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Film 1: Animowana wizualizacja wolumetryczna pojedynczej zmiany z panelu 1 IBEX (niebieski: Hoechst, zielony: CD44, czerwony: CD45, cyjan: Podoplanin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie1_IBEX1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 2: Animowana rekonstrukcja objętościowa pojedynczej zmiany z panelu 2 IBEX (niebieski: Hoechst, zielony: CD20, czerwony: F-aktyna, cyjan: CD3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie2_IBEX2.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 3: Animowana rekonstrukcja objętościowa pojedynczej zmiany z panelu 3 IBEX (niebieski: Hoechst, zielony: CD8, czerwony: CD4, cyjan: panCK). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie3_IBEX3.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 4: Animowana wizualizacja wolumetryczna pojedynczej zmiany z panelu 4 IBEX (niebieski: Hoechst, zielony: CD31, cyjan: CD68). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie4_IBEX4.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 5: Animowana wizualizacja objętościowa pojedynczej zmiany z panelu 5 IBEX (niebieski: Hoechst, zielony: CD206, cyjan: Calretinin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie5_IBEX5.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 6: Animowana wizualizacja wolumetryczna pojedynczej zmiany z panelu 6 IBEX (niebieski: Hoechst, zielony: wimentyna, czerwony: HLADR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie6_IBEX6.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 7: Animowana wizualizacja objętościowa interfejsu między strukturą limfatyczną trzeciorzędową a zmianą chorobową z panelem IBEX 1 (niebieski: Hoechst, zielony: CD44, czerwony: CD45, cyjan: Podoplanina). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie7_TLS_IBEX1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 8: Animowana wizualizacja wolumetryczna interfejsu między trzeciorzędową strukturą limfatyczną a zmianą z panelem IBEX 2 (niebieski: Hoechst, zielony: CD20, czerwony: F-aktyna, cyjan: CD3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie8_TLS_IBEX2.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 9: Animowana wizualizacja wolumetryczna interfejsu między trzeciorzędową strukturą limfatyczną a zmianą chorobową z wykorzystaniem panelu IBEX 3 (niebieski: Hoechst, zielony: CD8, czerwony: CD4, cyjan: panCK). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie9_TLS_IBEX3.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 10: Animowana wizualizacja wolumetryczna interfejsu między strukturą limfatyczną trzeciorzędową a zmianą chorobową z wykorzystaniem panelu IBEX 4 (niebieski: Hoechst, zielony: CD31, czerwony: SMA, cyjan: CD68). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie10_TLS_IBEX4.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 11: Animowana wizualizacja wolumetryczna interfejsu między trzeciorzędową strukturą limfatyczną a zmianą chorobową z panelu IBEX 5 (niebieski: Hoechst, zielony: CD206, cyjan: Calretinin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie11_TLS_IBEX5.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 12: Animowana wizualizacja wolumetryczna interfejsu między trzeciorzędową strukturą limfatyczną a zmianą chorobową z panelem IBEX 6 (niebieski: Hoechst, zielony: Vimentin, czerwony: HLADR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie12_TLS_IBEX6.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Plik uzupełniający 1: Plik do druku płyty inkubacyjnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/incubation_plate.form" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Plik do druku dla 36 poszczególnych platform. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/platform_x36.form" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Plik do druku pierścienia regulacji wysokości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/SMART_imaging_heightAdjuster.STL" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Plik do druku zewnętrznej pokrywy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/SMART_imaging_petriDishLid_35mm.STL" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Plik do cięcia laserowego suwaka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/imaging_platform_slider.DWG" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Badania te koncentrują się na identyfikacji celów dla leków immunomodulujących i złożonych guzów litego przewodu pokarmowego. Analiza krajobrazu komórkowego mikrośrodowiska guza jest absolutnie kluczowa dla zrozumienia podatności na leczenie, takie jak immunoterapia. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek i cytometria przepływowa pomagają scharakteryzować mikrośrodowisko guza, ale brakuje im kontekstu przestrzennego. Ostatnio pojawiły się platformy obrazowania multipleksowego i transkryptomicznego do badania mikrośrodowiska guza w kontekście in vivo.Dostępne technologie multipleksowe do analizy mikrośrodowiska guza, zarówno iteracyjne, jak i typu "wszystko w jednym", są ograniczone do dwóch wymiarów. Protokół ten rozszerza charakterystykę na wymiar głębokości, zapewniając wgląd wykraczający poza pojedyncze FFPE lub zamrożone sekcje.[Narrator] Na początek przenieś arkusze chusteczek do kubka na próbkę zawierającego ciepłe podłoże do zbioru i umieść je na płycie grzewczej przy stole przygotowawczym. Zamontuj tkankę na platformach w 15-centymetrowej płytce zawierającej pożywkę do pobierania. Ostrożnie ułóż tkankę zawierającą guz stroną międzybłonka skierowaną do góry nad małym otworem platformy i zabezpiecz ją jedwabnym szwem 2-0. Umieścić przygotowaną platformę tkankową odwrotnie całkowicie zanurzoną w 24-dołkowej płytce zawierającej pożywkę do pobierania. W celu utrwalenia dodaj 10 mililitrów bulionu utrwalającego do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 30 mililitrów zimnego PBS, aby przygotować 40 mililitrów buforu utrwalającego. Za pomocą kleszczy przenieś tkankę zamontowaną na platformach do bufora mocującego. I inkubować przez 24 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zdekantować utrwalacz. Zastąp go 40 mililitrami zimnego PBS. I inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Do barwienia dodaj 1 mililitr buforu blokującego do studzienki i włóż platformę tkankową. Blokuj przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej na bujaku ustawionym na niską prędkość 30 obr./min. Przygotuj 0,8 mililitra roztworu barwnika przeciwciał w probówce do mikrowirówek i odwiruj przy 10 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść 0,75 mililitra supernatantu do czystej studzienki na 9-dołkowej płytce inkubacyjnej. I włóż umytą platformę. Zawiń talerz w folię aluminiową. I inkubować przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej na bujaku ustawionym na niską prędkość 30 obr./min. Umyj platformę w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 40 mililitrów PBS przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodaj 0,1 mililitra PBS na środek szklanego dna 3,5-centymetrowej naczynia do obrazowania i odłóż ją na bok. Przykręć luźno pierścień regulacji wysokości w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara do zewnętrznej pokrywy. I zamontuj platformę w wewnętrznym plastikowym uchwycie, upewniając się o wyrównaniu rowka wycięcia. Zabezpiecz platformę za pomocą suwaka. Umieść zmontowany adapter do obrazowania na naczyniu ze szklanym dnem i ostrożnie opuść pierścień regulacji wysokości, aż tkanka dotknie bufora. Po osiągnięciu optymalnej odległości od szkła dodaj 0,2 mililitra PBS na tkankę dolną stroną do góry, aby zapobiec odwodnieniu tkanki podczas obrazowania. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów. Wybierz odpowiedni obiektyw, na przykład 20X lub 40X, i dodaj odpowiedni medium zanurzeniowe. Wybierz parametry akwizycji obrazu, takie jak szybkość skanowania 600 Hz, rozdzielczość XY 1024 na 1024 piksele, średnie trzyliniowe i skanowanie dwukierunkowe. Wybierz odpowiednie linie laserowe lub dostosuj laser światła białego, aby dopasować go do widm wzbudzenia i emisji fluoroforów używanych do barwienia. Umieść zmontowaną miskę do obrazowania w uchwycie próbki na stoliku mikroskopu. Wyśrodkuj próbkę za pomocą regulatora XY, przyłóż obiektyw do szkła nakrywkowego i rozpocznij akwizycję obrazu. Po każdej rundzie obrazowania wykonaj etap wybielania. Przygotuj 5 mililitrów 1,5 miligrama na mililitr roztworu borowodorku litu w wodzie destylowanej i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 1 mililitr roztworu borowodorku litu do czystego dołka 9-dołkowej płytki inkubacyjnej i włożyć umytą platformę na 60 minut w temperaturze pokojowej. Krótko umyj platformę w 20 mililitrach PBS w stożkowej rurce. Sprawdź pozostały sygnał fluorescencyjny, używając najwyższego ustawienia lasera dla kompensacji Z. Próbka otrzewnowej zawierająca guz wybarwiona pierwszą rundą iteracyjnego wybielania rozszerza multipleksowość lub IBEX 1, panel do wizualizacji jest pokazany tutaj. Zmiany nowotworowe zidentyfikowano jako struktury przypominające rozetę, które były podwójnie dodatnie dla CD44 i podoplaniny z układami jądrowymi charakterystycznymi dla międzybłoniaka brodawkowatego. Przedstawiono tutaj obrazy immunofluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości wybranych obszarów z próbki otrzewnej zawierającej guz. Obrazy te ujawniają regiony guza i interfejsy trzeciorzędowej struktury limfoidalnej guza, podkreślając konsekwentną infiltrację komórek odpornościowych z dużą gęstością komórek CD45-dodatnich. Rysunek ten przedstawia iteracyjne barwienie immunofluorescencyjne w cyklach IBEX od pierwszego do sześciu, ilustrując przestrzenny rozkład markerów immunologicznych i strukturalnych w obrębie zmiany nowotworowej i granicy faz struktury limfoidalnej guza. Poniżej przedstawiono maksymalne rzuty różnych przekrojów optycznych. To obrazowanie 3D potwierdziło, że zmiany nowotworowe i trzeciorzędowe struktury limfatyczne znajdują się na różnych głębokościach Z, demonstrując ograniczenia obrazowania 2D w uchwyceniu złożonej architektury tkanki.

three-dimensional-imaging-tumor-bearing-tissue-using-iterative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Tutaj opisujemy metodę wielofotonowego obrazowania poklatkowego komórek mózgu w wysokiej rozdzielczości przed i po inwazyjnej interwencji chirurgicznej (np. biopsji) u tego samego żywego zwierzęcia. Metoda ta pozwala na badanie wpływu tych inwazyjnych zabiegów chirurgicznych na zachowanie migracyjne, inwazyjne i proliferacyjne komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Tutaj prezentujemy technikę ultrasonograficzną 5D łączącą wielopłaszczyznową rekonstrukcję 3D i fuzję kolorowego Dopplera, która umożliwia synchroniczną wizualizację informacji strukturalnych i funkcjonalnych tarczycy. Minimalizując martwe punkty, metoda ta umożliwia szybką i precyzyjną lokalizację zmian w celu poprawy dokładności diagnostycznej, co jest szczególnie korzystne dla początkujących lekarzy.

Synchroniczna rekonstrukcja trójpłaszczyznowa zintegrowana z kolorowym mapowaniem dopplerowskim w celu precyzyjnej i szybkiej lokalizacji zmian w tarczycy

Ilościowe mapy tlenowe 3D mysich guzów zostały zobrazowane nieinwazyjnie za pomocą pulsacyjnego rezonansu paramagnetycznego. Ultrasonografia B-mode i Power Doppler zostały wykorzystane do anatomii i struktury naczyniowej. Obrazy z obu modalności nałożono na siebie, umożliwiając wieloparametryczną analizę guza.

Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego

Tutaj opisujemy zastosowanie metody Iterative Bleaching Extended Multiplicity (IBEX), wykorzystującą komercyjnie dostępne, zautomatyzowane barwienia tkanek oraz rozważania optymalizacyjne dla stosowania odczynników opartych na wzmacnianiu sygnału tyramidowego.

Iteracyjne wybielanie zwiększa wielość poprzez zastosowanie automatyzacji barwienia w kluczowych obiektach

Zastosowanie taniej, wszechstronnej techniki fotonapromieniania manualną metodą IBEX pozwala na optymalne obrazowanie tkanki ludzkiej ze znaczną natywną autofluorescencją. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać multipleksowane obrazy całych preparatów z archiwalnych próbek klinicznych przy użyciu odwróconego mikroskopu, powszechnie dostępnych odczynników i oprogramowania typu open source do wyrównywania i przetwarzania obrazu.

Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

Poznaj metodę trójwymiarowego obrazowania tkanki nośnej guza z wykorzystaniem iteracyjnego wybielania, która rozszerza analizę multipleksową. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie mikrośrodowiska nowotworowego w immunoterapii.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Przeglądaj więcej filmów