Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Protokoły te umożliwiają kwantyfikację rozdzielczości pojedynczej komórki, koekspresję markerów i specjalną analizę przy użyciu utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanek oraz świeżo zamrożonych w celu wyjaśnienia roli komórek odpornościowych w raku. Technika ta jest potężnym narzędziem, które ułatwia jednoczesną charakterystykę 40 markerów na pojedynczym odcinku tkanki, szeroko zachowując strukturę tkanki w próbkach. Krytycznym krokiem jest optymalizacja i walidacja przeciwciał.

Niewykonanie tego kroku może skutkować niską jakością obrazów, co może zagrozić zachowaniu wysokiej jakości powtarzalnych danych i wyników. Zacznij od odkręcenia wszystkich probówek zawierających przeciwciała w temperaturze 10 000 x G przez pięć minut, dodaj pojedyncze przeciwciała do buforu blokującego i dobrze wymieszaj. Nie należy naruszać dna probówki z przeciwciałami podczas pipetowania.

Przefiltruj panel przeciwciał, wstępnie zwilżając odśrodkowy filtr odśrodkowy o średnicy 0,1 mikrometra ze 100 mikrolitrami buforu blokującego. Obracać filtr przy ciśnieniu 10 000 x G przez dwie minuty i usunąć blokujący przepływ buforu za pomocą pipety. Następnie przenieś panel przeciwciał do kolumny wirowej i obracaj filtr przy 10 000 x G przez dwie minuty.

Odrzucić kolumnę wirową i użyć przepływowej jako przefiltrowanego panelu przeciwciał. W celu barwienia przeciwciałami usuń bufor blokujący ze szkiełek, przechylając każde szkiełko na bok i delikatnie stukając krawędziami o wycieraczkę zadaniową. Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej i dodać do tkanki od 100 do 200 mikrolitrów głównej mieszanki przeciwciał.

Dodać szkiełka kontrolne dodatnie i ujemne do partii barwiącej i inkubować szkiełka w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Aby skonfigurować instrument, zaloguj się do oprogramowania sterującego i kliknij Obudź się, jeśli instrument jest w trybie uśpienia. Kliknij Exchange Sample, aby załadować slajd, a następnie kliknij Kontynuuj, aby otworzyć drzwi.

Umieść szkiełko w szczelinie ładunkowej z próbką skierowaną do góry i etykietą po prawej stronie, kliknij Kontynuuj, aby zamknąć drzwi. Wybierz projekt, a następnie wybierz nazwę slajdu dla załadowanego przykładu. Wizualizuj obraz panoramiczny na panelu obrazu optycznego slajdu dla pola view lub wyboru pola widzenia, kliknij menu Tryb i wybierz Wtórny detektor elektronów, a następnie kliknij menu Tryb obrazowania i wybierz mikrometr QC 300.

Kliknij Jog Stage, aby kontrolować lokalizację FOV, a następnie kliknij strzałki, aby nawigować i wybrać pozycję FOV. Kliknij dodaj FOV, ustaw 400 mikrometrów na 400 mikrometrów jako rozmiar pola i wybierz Fine jako tryb obrazowania i 1 milisekundę czasu oczekiwania, kliknij Potwierdź. Po utworzeniu listy FOV przejdź do ostrości obrazu i dostosuj stygmatyzację, przesuwając wiązkę do obszaru tkanki, który nie będzie obrazowany.

Dostosuj parametry, aż uzyskasz wyraźny centralny obraz, kliknij Rozpocznij uruchamianie. Pozyskane obrazy zostaną automatycznie przesłane i zapisane w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami. Pokazana tutaj matryca opisuje procentowy przesłuch pochodzący z czystości sondy i tlenków.

Tutaj niebieskie pola wskazują przesłuch większy lub równy 0,5%, a przezroczyste pola wskazują mniej niż 0,5% przesłuchu. W przypadku tagów Mass pokazane są tutaj sondy, które przyczyniły się do co najmniej 0,5% przesłuchu do żadnego kanału, jednego lub dwóch kanałów lub więcej niż dwóch kanałów. Pokazane są również kanały masowe odbierające co najmniej 0,5% przesłuchu z braku sond, jednej lub dwóch sond lub więcej niż dwóch sond.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy barwienia w różnych tkankach, takich jak gruczolakorak płuc, nienowotworowy nerek i migdałków. Przedstawiono tutaj obraz wycinka tkanki migdałka wybarwionego tą techniką i zobrazowanego za pomocą oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu innej firmy przed filtrowaniem i korekcją. Obraz tej samej sekcji w tych samych warunkach po krokach filtrowania i korekty jest pokazany tutaj.

Ta metoda generuje obrazy, które można przesłać do oprogramowania do cyfrowej analizy obrazów innej firmy, umożliwiając kompleksową analizę, taką jak przedziały tkankowe, segmentacja komórek, koekspresja markerów, a także analiza sąsiadów i analiza odległości. Dzięki badaniom naukowym dostępne są metody obrazowania o wysokiej multipleksowości. Konstruując różne panele, naukowcy mogą badać próbki nowotworowe, normalne, paranowotworowe, zapalne i zakaźne.