Name: Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj obrazowanie spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie w celu analizy mikrośrodowiska guza. Ta technika umożliwia jednoczesną charakterystykę do 40 markerów na jednym przekroju tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Donowi Norwoodowi z Editing Services, Research Medical Library w MD Anderson za edycję tego artykułu oraz Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory w Department of Translational Molecular Pathology w MD Anderson. Publikacja ta jest częściowo wynikiem badań ułatwionych przez naukowe i finansowe wsparcie dla Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) udzielone za pośrednictwem National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) dla The University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Monitoring and Analysis Center (CIMAC).

<ol><li>Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Beyond the tumour microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).</li>
<li>Galli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+immune+cell+and+tumor+microenvironment+imaging+in+the+new+era+of+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89(2020).</li>
<li>Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+approaches+for+characterizing+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment.</a> Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).</li>
<li>Eisenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sorting%3A+Divide+and+conquer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell sorting: Divide and conquer.</a> Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).</li>
<li>Scognamiglio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+immunohistochemistry+assay+to+evaluate+the+melanoma+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment.</a> Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).</li>
<li>Guo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+34-marker+panel+for+imaging+mass+cytometric+analysis+of+human+snap-frozen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue.</a> Frontiers in Immunology. 11, 1466(2020).</li>
<li>Fu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+architecture+of+the+immune+microenvironment+orchestrates+tumor+immunity+and+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98(2021).</li>
<li>Rost, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+ion+beam+imaging+analysis+for+quantitation+of+protein+expresssion+in+cancer+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).</li>
<li>Keren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structured+tumor-immune+microenvironment+in+triple+negative+breast+cancer+revealed+by+multiplexed+ion+beam+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging.</a> Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).</li>
<li>Mathieson, W., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+biospecimens+must+be+used+in+genomic+medicine%3A+An+evidence-based+review+and+conclusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).</li>
<li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+spatial+bioimaging+for+combination+therapy+design%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).</li>
<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).</li>
<li>Rad, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pandora%27s+box+of+novel+technologies+that+may+revolutionize+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer.</a> Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Commununications%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+ion+beam+imaging+%28MIBI%29+for+characterization+of+the+tumor+microenvironment+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types.</a> Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Kompleksowe wyjaśnienie złożonych, zawiłych interakcji między wieloma składnikami TME pozostaje kluczowym celem badań nad rakiem. W ramach tych wysiłków producenci wprowadzili wiele testów multipleksowych, zwłaszcza w ciągu ostatnich 5 lat. Multipleksowa analiza przestrzenna to wszechstronne i potężne narzędzie, które ułatwia jednoczesną kategoryzację kilku celów przy jednoczesnym zachowaniu morfologii strukturalnej w próbkach guza. Techniki analizy przestrzennej można przeprowadzić przy użyciu obrazowania fluorescencyjn...

Znaczenie licznych typów komórek otaczających klonalne populacje nowotworów jest kluczowym elementem w kategoryzacji rakotwórczości. Zainteresowanie wyjaśnieniem składu i interakcji mikrośrodowiska nowotworu (TME) stale rosło po ustanowieniu terapii immunologicznej jako części arsenału leczenia raka. W związku z tym strategie leczenia przesunęły się z podejścia skoncentrowanego na nowotworze na podejście skoncentrowane na TME1.
Wysiłki mające na celu wyjaśnienie roli komórek odpornościowych w nadzorze nad nowotworami i ich rozwoju znacznie wzrosły w ostatnich latach2,3. W badaniach medycznych pojawiło się mnóstwo metod, w tym metody oparte na cytometrii oraz technologie obrazowania singleplex i multiplex, w ramach tej próby rozszyfrowania unikalnych interakcji wielu elementów TME.
Pionierskie metody, takie jak cytometria przepływowa (wynaleziona w latach 60.), sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i cytometria masowa, koncentrują się głównie na identyfikacji i ilościowym określaniu składników TME4. Mimo że techniki ilościowe oparte na cytometrii pozwalają na fenotypowanie krajobrazu immunologicznego, określenie przestrzennego rozmieszczenia komórek jest niemożliwe. I odwrotnie, metody takie jak standardowa immunohistochemia pojedynczego pleksu zachowują architekturę tkankową i umożliwiają badaczom analizę dystrybucji komórkowej, chociaż zmniejszona liczba celów w pojedynczym odcinku tkanki jest ograniczeniem tych metod5,6. W ciągu ostatnich kilku lat technologie obrazowania multipleksowego do rozdzielczości pojedynczej komórki, takie jak immunofluorescencja multipleksowa, obrazowanie fluorescencyjne z kodowaniem kreskowym i obrazowa spektrometria mas, pojawiły się jako kompleksowe strategie pozyskiwania informacji na temat jednoczesnego barwienia markerów przy użyciu tego samego przekroju tkanki<klasa sup = "xref">7.
Tutaj prezentujemy technologię, która łączy przeciwciała oznaczone metalem i spektrometrię mas jonów wtórnych oraz umożliwia kwantyfikację rozdzielczości pojedynczej komórki, koekspresję markerów (fenotypowanie) i analizę przestrzenną przy użyciu próbek tkanek utrwalonych w formalinie, parafinie (FFPE) i świeżo mrożonych (FF)8,9. Próbki FFPE są najczęściej używanymi materiałami do archiwizacji próbek tkanek i stanowią łatwiej dostępne zasoby dla technologii obrazowania multipleksowego niż świeże próbki mrożone10. Dodatkowo technologia ta oferuje możliwość ponownego pozyskania obrazów kilka miesięcy później. W tym artykule omawiamy nasze protokoły barwienia i przetwarzania obrazu przy użyciu próbek tkanek FFPE.

<table><tbody><tr><td>100% odczynnik Alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td></td></tr><tr><td>95% Odczynnik Alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3404</td><td></td></tr><tr><td>80% Odczynnik Alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3279</td><td></td></tr><tr><td>70% Odczynnik Alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R315</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS-T</td><td>Ionpath</td><td>567005</td><td></td></tr><tr><td>10X Nisko-Barowa ścieżka jonowa PBS pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td>567004</tr><tr><td>10X Tris pH 8,5&nbsp;</td><td>Ścieżka jonowa</td><td>567003</td><td></td></tr><tr><td>4&deg; C Lodówka</td><td>ThermoScientific</td><td>REVCO</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową P10</td><td>Olympus</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową P20</td><td>Olympus</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową P200</td><td>Olympus</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową P1000</td><td>Olympus</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Ultrafree-MC</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowana</td><td>ścieżka jonowa</td> H2O <td>567002</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Słoik do barwienia szkiełek EasyDip, zielona</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71385-G</td><td></td></tr><tr><td>Słoik do barwienia szkiełek EasyDip, Żółta</td><td>Mikroskopia Elektronowa Sciences</td><td>71385-Y</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip Zestaw do barwienia szkiełek (słoik + stojak), biała</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71388-01</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt ze stali nierdzewnej EasyDip</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71388-50</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 70% EM Mikroskopia</td><td>elektronowa Sciences</td><td>16360</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do odzyskiwania epitopów indukowanych ciepłem (HIER): 10X Tris z EDTA, pH 9</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko żaroodporne komora</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>62705-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis barierowy</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MIBI/O</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MIBIcontrol</td><td>Ionpath</td><td>NA</td> MIBIslide Ionpath 567001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIBIscope</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa (komora wilgotna)</td><td>Simport</td><td>M922-1</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>Moduł PT</td><td>Termo Scientific</td><td>A80400012</td><td></td></tr><tr><td>sterylne jednorazowe jednostki filtrujące o szybkim przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td>097403A</td> Shaker BioRocker S2025 Kolumna <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> wirująca (filtr wirowy Ultrafree-MC, 0,5 ml 0,1 i mu;<td></td></tr><tr><td> m )</td> <td>MillQ</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik przesuwny</td><td>Fisher Scientific</td><td>6901</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>VWR</td><td>30621-076</td><td></td></tr><tr><td>Wóz zadaniowy</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Postępy w terapiach immunologicznych zrewolucjonizowały leczenie i badania nad rakiem. Wywołało to rosnące zapotrzebowanie na charakterystykę krajobrazu immunologicznego nowotworu. Chociaż standardowa immunohistochemia nadaje się do badania architektury tkankowej, ogranicza się do analizy niewielkiej liczby markerów. I odwrotnie, techniki takie jak cytometria przepływowa mogą oceniać wiele markerów jednocześnie, chociaż informacje o morfologii tkanek są tracone. W ostatnich latach strategie multipleksowe, które integrują analizę fenotypową i przestrzenną, pojawiły się jako kompleksowe podejścia do charakterystyki krajobrazu immunologicznego nowotworu. W tym artykule omówiono innowacyjną technologię łączącą przeciwciała znakowane metalem i spektrometrię mas jonów wtórnych, koncentrując się na etapach technicznych w opracowywaniu i optymalizacji testów, przygotowaniu tkanek oraz pozyskiwaniu i przetwarzaniu obrazów. Przed barwieniem należy opracować i zoptymalizować panel przeciwciał znakowany metalem. Ten system obrazowania hi-plex obsługuje do 40 przeciwciał znakowanych metalem w jednym wycinku tkanki. Warto zauważyć, że ryzyko zakłóceń sygnału wzrasta wraz z liczbą znaczników zawartych w panelu. Po zaprojektowaniu panelu należy zwrócić szczególną uwagę na przypisanie izotopu metalu do przeciwciała, aby zminimalizować tę interferencję. Wstępne badanie panelowe przeprowadza się przy użyciu niewielkiego podzbioru przeciwciał, a następnie testuje cały panel w tkankach kontrolnych. Utrwalone formaliną, zatopione w parafinie skrawki tkanek są uzyskiwane i montowane na pozłacanych szkiełkach, a następnie barwione. Barwienie trwa 2 dni i bardzo przypomina standardowe barwienie immunohistochemiczne. Po wybarwieniu próbki umieszcza się je w przyrządzie do akwizycji obrazu. Wybierane są pola widzenia, a obrazy są pobierane, przesyłane i przechowywane. Ostatnim etapem jest przygotowanie obrazu do filtrowania i usuwania zakłóceń za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu systemu. Wadą tej platformy jest brak oprogramowania analitycznego. Jednak generowane obrazy są obsługiwane przez różne oprogramowanie do patologii obliczeniowej.

Przekroje tkankowe TMA z migdałka oraz gruczolakoraka płuca (o grubości 5 µm) zostały pobrane i umieszczone na środku szkiełek pokrytych złotem, zgodnie ze specyfikacjami dotyczącymi wielkości tkanki i bezpiecznych marginesów szkiełek. Dla optymalnego barwienia niezbędne są wolne marginesy szklane o szerokości 5 mm i 10 mm odpowiednio między krawędzią tkanki a bocznymi i dolnymi krawędziami szkiełek przedmiotowych. Przed barwieniem przekroje tkankowe suszono przez noc w inkubatorze, aby zapewnić prawidłowe przyleganie pr...

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Protokoły te umożliwiają kwantyfikację rozdzielczości pojedynczej komórki, koekspresję markerów i specjalną analizę przy użyciu utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanek oraz świeżo zamrożonych w celu wyjaśnienia roli komórek odpornościowych w raku. Technika ta jest potężnym narzędziem, które ułatwia jednoczesną charakterystykę 40 markerów na pojedynczym odcinku tkanki, szeroko zachowując strukturę tkanki w próbkach. Krytycznym krokiem jest optymalizacja i walidacja przeciwciał.Niewykonanie tego kroku może skutkować niską jakością obrazów, co może zagrozić zachowaniu wysokiej jakości powtarzalnych danych i wyników. Zacznij od odkręcenia wszystkich probówek zawierających przeciwciała w temperaturze 10 000 x G przez pięć minut, dodaj pojedyncze przeciwciała do buforu blokującego i dobrze wymieszaj. Nie należy naruszać dna probówki z przeciwciałami podczas pipetowania.Przefiltruj panel przeciwciał, wstępnie zwilżając odśrodkowy filtr odśrodkowy o średnicy 0,1 mikrometra ze 100 mikrolitrami buforu blokującego. Obracać filtr przy ciśnieniu 10 000 x G przez dwie minuty i usunąć blokujący przepływ buforu za pomocą pipety. Następnie przenieś panel przeciwciał do kolumny wirowej i obracaj filtr przy 10 000 x G przez dwie minuty.Odrzucić kolumnę wirową i użyć przepływowej jako przefiltrowanego panelu przeciwciał. W celu barwienia przeciwciałami usuń bufor blokujący ze szkiełek, przechylając każde szkiełko na bok i delikatnie stukając krawędziami o wycieraczkę zadaniową. Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej i dodać do tkanki od 100 do 200 mikrolitrów głównej mieszanki przeciwciał.Dodać szkiełka kontrolne dodatnie i ujemne do partii barwiącej i inkubować szkiełka w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Aby skonfigurować instrument, zaloguj się do oprogramowania sterującego i kliknij Obudź się, jeśli instrument jest w trybie uśpienia. Kliknij Exchange Sample, aby załadować slajd, a następnie kliknij Kontynuuj, aby otworzyć drzwi.Umieść szkiełko w szczelinie ładunkowej z próbką skierowaną do góry i etykietą po prawej stronie, kliknij Kontynuuj, aby zamknąć drzwi. Wybierz projekt, a następnie wybierz nazwę slajdu dla załadowanego przykładu. Wizualizuj obraz panoramiczny na panelu obrazu optycznego slajdu dla pola view lub wyboru pola widzenia, kliknij menu Tryb i wybierz Wtórny detektor elektronów, a następnie kliknij menu Tryb obrazowania i wybierz mikrometr QC 300.Kliknij Jog Stage, aby kontrolować lokalizację FOV, a następnie kliknij strzałki, aby nawigować i wybrać pozycję FOV. Kliknij dodaj FOV, ustaw 400 mikrometrów na 400 mikrometrów jako rozmiar pola i wybierz Fine jako tryb obrazowania i 1 milisekundę czasu oczekiwania, kliknij Potwierdź. Po utworzeniu listy FOV przejdź do ostrości obrazu i dostosuj stygmatyzację, przesuwając wiązkę do obszaru tkanki, który nie będzie obrazowany.Dostosuj parametry, aż uzyskasz wyraźny centralny obraz, kliknij Rozpocznij uruchamianie. Pozyskane obrazy zostaną automatycznie przesłane i zapisane w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami. Pokazana tutaj matryca opisuje procentowy przesłuch pochodzący z czystości sondy i tlenków.Tutaj niebieskie pola wskazują przesłuch większy lub równy 0,5%, a przezroczyste pola wskazują mniej niż 0,5% przesłuchu. W przypadku tagów Mass pokazane są tutaj sondy, które przyczyniły się do co najmniej 0,5% przesłuchu do żadnego kanału, jednego lub dwóch kanałów lub więcej niż dwóch kanałów. Pokazane są również kanały masowe odbierające co najmniej 0,5% przesłuchu z braku sond, jednej lub dwóch sond lub więcej niż dwóch sond.Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy barwienia w różnych tkankach, takich jak gruczolakorak płuc, nienowotworowy nerek i migdałków. Przedstawiono tutaj obraz wycinka tkanki migdałka wybarwionego tą techniką i zobrazowanego za pomocą oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu innej firmy przed filtrowaniem i korekcją. Obraz tej samej sekcji w tych samych warunkach po krokach filtrowania i korekty jest pokazany tutaj.Ta metoda generuje obrazy, które można przesłać do oprogramowania do cyfrowej analizy obrazów innej firmy, umożliwiając kompleksową analizę, taką jak przedziały tkankowe, segmentacja komórek, koekspresja markerów, a także analiza sąsiadów i analiza odległości. Dzięki badaniom naukowym dostępne są metody obrazowania o wysokiej multipleksowości. Konstruując różne panele, naukowcy mogą badać próbki nowotworowe, normalne, paranowotworowe, zapalne i zakaźne.

expanding-comprehension-tumor-microenvironment-using-mass

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Ten protokół przedstawia metodę zwiększania procentowej zawartości guza w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie.

Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Poznaj obrazowanie spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie w celu analizy mikrośrodowiska guza. Ta technika umożliwia jednoczesną charakterystykę do 40 markerów na jednym przekroju tkanek.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Przeglądaj więcej filmów