Name: Technika cienkiego okienka czaszki do przewlekłego dwufotonowego obrazowania in vivo mysiego mikrogleju w modelach zapalenia nerwów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Poznaj technikę cienkiego okienka czaszki do przewlekłego dwufotonowego obrazowania mikrogleju mysiego in vivo w modelach zapalenia nerwów. Ta metoda pozwala obserwować dynamikę komórkową w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Emily A. Kelly za projekt płytki głowowej.
Jesteśmy wdzięczni za wsparcie z grantów NIH przyznanych H.A.G.: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 oraz za hojne wsparcie z Geoffrey Waasdorp Pediatric Neurology Fund, bez których ta praca nie byłaby możliwa. A.K.M jest finansowany przez NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Alfred P. Sloan Foundation oraz Career Award in the Biomedical Sciences z Burroughs Wellcome Fund. M.E.T jest finansowany z grantu na staż podoktorski Fonds de la recherche en sante du Quebec (FRSQ). D.F.M jest stażystą w programie Medical Scientist Training Program, finansowanym przez NIH T32 GM07356 oraz T32 AI049815.

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania
<ol>
<li>W naszych eksperymentach wykorzystujemy dorosłe myszy CX3CR1GFP/+, które wykazują ekspresję GFP w liniach komórek jednojądrzastych, w tym w mikrogleju.4 W zależności od potrzeb konkretnego projektu można zastosować różne szczepy myszy.</li>
<li>Zanurz mysz w znieczuleniu poprzez dostarczenie do jamy otrzewnej koktajlu trzech leków w składzie: 0,05 mg/kg Fentanylu, 5,0 mg/kg Midazolamu oraz 0,5 mg/kg Medetomidyny.5 Przygotowanie chirurgiczne do TSCW rozpoczyna się, gdy zwierzę przestaje reagować na bodźce bólowe, takie jak ściśnięcie ogona. Przez cały czas trwania operacji i obrazowania zwierzę pozostaje na macie grzewczej, aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu. W razie potrzeby można podać dawkę uzupełniającą w wysokości jednej trzeciej pierwotnej dawki koktajlu anestetycznego, aby przywrócić pierwotny poziom znieczulenia.</li>
<li>Oczy zwierzęcia należy pokryć ochronną maścią oftalmiczną, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia, które znosi odruch mrugania. Usuń owłosienie ze skóry głowy zwierzęcia za pomocą maszynki, trymera, nożyczek lub metod chemicznych. Zdezynfekuj skórę głowy, używając 10% roztworu powidonu jodowego i 70% etanolu. Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą zostać poddane autoklawowaniu, sterylizacji w sterylizatorze perłowym lub dezynfekcji 70% etanolem.</li>
<li>Wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej za pomocą małych nożyczek, zaczynając 4-5 mm gorszo (caudalnie) od czaszki i przesuwając się do przodu, aż do przedniej części oczu. Ważne jest, aby nacięcie było wystarczająco długie, tak aby skóra nie przeszkadzała w przyklejaniu płytki głowowej służącej do stabilizacji głowy myszy podczas obrazowania dwufotonowego (Rycina 1). Pod stereomikroskopem zidentyfikuj obszar przeznaczony do ścieńczenia. Unikaj obszarów zainteresowania znajdujących się bezpośrednio nad szwami czaszkowymi, ponieważ czaszka jest w tych miejscach mniej stabilna, a leżące pod nimi duże naczynia i opony będą utrudniać obrazowanie.</li>
<li>Za pomocą sterylnego patyczka nasączonego 10% etanolem, a następnie 10% roztworem chlorku żelaza, osusz błony na szczycie czaszki, a następnie zeskrob je za pomocą precyzyjnych pęset lub żyletki. Pozostawienie błon prowadzi do niestabilnego mocowania płytki głowowej.</li>
<li>Nanieś cienką warstwę kleju Permabond 910 wokół krawędzi okna obserwacyjnego pod płytką głowową. Przyłóż pokrytą klejem płytkę głwową do obszaru zainteresowania na czaszce zwierzęcia, wywierając lekki nacisk (Rycina 1). Ważne jest, aby płytka głowowa była przyklejona wyłącznie do kości czaszki. Jakakolwiek skóra lub błony uwięzione między płytką a czaszką zmniejszą stabilność wiązania. Za pomocą strzykawki nanieś niewielką ilość akrylatu wokół okna obserwacyjnego, aby natychmiast utrwalić klej. Na koniec nanieś niewielką ilość Loctite 454 na krawędzie okna obserwacyjnego, aby zapobiec nieszczelnościom.</li>
<li>Przykręć płytkę głwową do uchwytu zwierzęcia (Rycina 1) i sprawdź stabilność płytki pod stereomikroskopem, delikatnie dotykając jej pęsetą. Czaszka nie powinna przemieszczać się względem płytki głowowej. Umieść kroplę soli fizjologicznej na oknie obserwacyjnym, aby upewnić się, że nie ma wycieków.</li>
</ol>
2. Przygotowanie okna korowego poprzez ścieńczenie czaszki
<ol>
<li>W celu przygotowania do ścieńczenia czaszki, należy osuszyć ją, używając sterylnych patyczków bawełnianych oraz sprężonego powietrza. Początkowo ścieńczamy czaszkę za pomocą sterylnego wiertła IRF 007 wiertarce Microtorque II ustawionej na 40 rpm. Bardzo delikatnie należy rozpocząć ścieńczanie okrągłego obszaru czaszki o średnicy 2-2,5 mm. Stosować wyłącznie lekkie ruchy zamiatające, niemal równoległe do powierzchni czaszki; nie wywierać bezpośredniego nacisku w dół. Należy przerywać wiercenie co 20-30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza. Przerwy w wierceniu pozwalają czaszce ostygnąć, co zapobiega uszkodzeniom tkanki mózgowej wywołanym ciepłem.
<ol class="lalpha">
<li>W miarę postępu wiercenia należy zwrócić uwagę na przejście do wilgotniejszej warstwy kości gąbczastej (tzw. "diploe"). Po dotarciu do tej warstwy należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z wiertarką.</li>
</ol></li>
<li>Okazyjnie sprawdzać stopień ścieńczenia czaszki, nakładając sól fizjologiczną na ścieńczony obszar i obserwując go pod mikroskopem stereoskopowym. Sól fizjologiczna dodatkowo wspomaga odprowadzanie ciepła. W miarę ścieńczania czaszki widoczne stają się mniejsze naczynia krwionośne.</li>
<li>Aby uzyskać końcowe ścieńczenie w środowisku soli fizjologicznej, należy użyć sterylnego dentystycznego mikrodłuta, ponieważ zapewnia ono znacznie lepsze sprzężenie zwrotne w zakresie stabilności czaszki. Pozwala to na przygotowanie znacznie cieńszych okien niż przy użyciu samej wiertarki. Z naszego doświadczenia wynika, że optymalna grubość czaszki wynosi 10-30 μm.
<ol class="lalpha">
<li>Podczas pierwszych kilku prób wykonania okna w czaszce ważne jest wielokrotne sprawdzanie stopnia jej ścieńczenia pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Wyrazistość i głębokość widocznej mikroglei oraz naczyń krwionośnych stanowią dobrą wskazówkę, kiedy okno jest gotowe do obrazowania.</li>
</ol></li>
<li>Gdy okno jest gotowe, należy przykleić nad nim dopasowany prostokątny kawałek szkiełka podstawkowego #0 o wymiarach mniejszych niż 2 mm na każdym boku. Używając szklanej pipety o średnicy 1,0 mm, nanieść małą kroplę kleju cyjanoakrylowego na ścieńczony obszar czaszki, ostrożnie opuścić mały kawałek szkiełka, a następnie delikatnie docisnąć go do czaszki, aby wycisnąć nadmiar kleju. Ważne jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza między szkłem a klejem, ponieważ uwięzione powietrze spowoduje, że obszar pod nim stanie się optycznie nieprzezroczysty. Stosuje się klej cyjanoakrylowy, ponieważ pozostaje on przezroczysty po wyschnięciu oraz zapobiega odrostowi kości i błon, utrzymując czaszkę pod oknem w stanie cienkim i półprzezroczystym. Jeśli na górnej powierzchni szkiełka znajduje się klej, należy go ostrożnie usunąć mikrodłutem po umieszczeniu szkiełka i wyschnięciu kleju.</li>
<li>Bezpośrednio po operacji podaje się lek przeciwbólowy (na przykład Buprenorphine 2 mg/kg podskórnie), który jest ponownie podawany przy wszelkich oznakach bólu, w tym przy niechęci do poruszania się, jedzenia lub picia, utracie masy ciała, ślinotoku, piloerekcji, specyficznych dźwiękach oddechowych itp.</li>
</ol>
3. Obrazowanie dwufotonowe
<ol>
<li>W ramach przygotowania do obrazowania dwufotonowego, przykryj TSCW solą fizjologiczną i zlokalizuj obszar zainteresowania w świetle epifluorescencyjnym (Rysunek 2). Aby umożliwić późniejsze obrazowanie tego obszaru, wykonaj zdjęcie za pomocą aparatu fotograficznego.</li>
<li>Do obrazowania dwufotonowego wykorzystujemy specjalnie skonstruowany mikroskop dwufotonowy6 z laserem Ti:Szafir nastrojonym na 920 nm. Fluorescencję wykrywa się za pomocą fotopowielacza w trybie detekcji całego pola z zastosowaniem filtru emisyjnego 580/180. Przez całą sesję obrazowania używany jest obiektyw z imersją wodną 20X (0,95 N.A.). Maksymalna moc wyjściowa lasera na obiektywie jest ustawiona w zakresie od 50 do 65 mW.</li>
<li>Wybierz obszar zainteresowania w warstwach I lub II kory (do 150 μm poniżej powierzchni pialnej). Aby ułatwić ponowne obrazowanie, wykonaj zdjęcia tego samego pola widzenia przy 1X, 2X i 3X cyfrowym powiększeniu. Naczynia krwionośne mogą służyć jako punkty orientacyjne, ułatwiające odnalezienie tego samego pola widzenia podczas kolejnych sesji obrazowania. Przy powiększeniu 3X co 5 minut przez maksymalnie 30 minut można pozyskiwać wiele stosów z-stack z 80-90 krokami Z w każdym stosie i krokiem 0,69 μm, co pozwala na dobre próbkowanie morfologii i zachowania mikrogleju w czasie (Rysunek 3). Pomiędzy akwizycjami stosów z-stack należy sprawdzić poziom soli fizjologicznej nad TSCW oraz głębokość znieczulenia zwierzęcia.</li>
</ol>
4. Iniekcja neurotoksyny HIV-1, Tat
<ol>
<li>W pierwszej kolejności należy zsilanizować wewnętrzną powierzchnię igły o rozmiarze 35 G oraz strzykawki Microvolume o pojemności 10 μL, aby zapobiec osadzaniu się białka Tat. Należy pobrać roztwór silanizujący (Sigmacote), aż wypełni on zarówno igłę, jak i strzykawkę. Roztwór powinien pozostać wewnątrz przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy opróżnić strzykawkę z roztworu, wyjąć tłok i pozwolić strzykawce oraz igle całkowicie wyschnąć. Na koniec strzykawkę i igłę należy dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną.</li>
<li>Należy wykonać niewielką kraniotomię o średnicy 0,5 mm, w odległości 3 mm w kierunku rostralnym lub bocznym od TSCW, w miejscu, gdzie uzyskano obrazy dwufotonowe, używając mniejszego wiertła i ostrożnie ścieńczając czaszkę, aż do momentu, gdy pęseta z ostrymi końcówkami będzie mogła z łatwością usunąć cienką warstwę kości. Wykorzystujemy strzykawkę Microvolume o pojemności 10 μL z igłą 35 G, sterowaną przez pompę strzykawkową Ultramicropump III zamontowaną na trójosiowym mikromanipulatorze. Po ustawieniu końcówki igły nad otworem kraniotomii, należy ją ostrożnie wprowadzić na głębokość od 70 do 90 μm poniżej powierzchni oponowej, gdzie podaje się 3 μL Tat1-72 (lub inne czynniki prozapalne) bądź sól fizjologiczną (lub nośnik kontrolny) z prędkością 80 nL/min.</li>
</ol>
5. Zakwaterowanie zwierząt
<ol>
<li>Jeśli zwierzę ma być poddawane obrazowaniu wielokrotnie w ciągu jednego dnia, należy pokryć otwarty obszar czaszki mieszaniną maści oftalmicznej i wazeliny, aby zapobiec dyskomfortowi lub uszkodzeniu czaszki pomiędzy sesjami obrazowania. Odłączyć mostek wspierający od małej płytki głownej (patrz Rycina 1B) i umieścić zwierzę w ogrzewanej klatce z łatwo dostępnym pokarmem i wodą. Wszystkie zwierzęta po operacji muszą być przez cały czas utrzymywane w pojedynczych klatkach. Po zakończeniu sesji obrazowania zwierzęcia w danym dniu, ostrożnie usunąć całą płytkę głowną i zaszyć skórę nad czaszką nicią chirurgiczną o rozmiarze #6 lub mniejszą. Ponownie umieścić zwierzęta w pojedynczych klatkach z łatwo dostępnym pokarmem i wodą pomiędzy dniami eksperymentalnymi. Codziennie sprawdzać, czy u zwierząt nie występują oznaki stresu, bólu lub infekcji.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Układ doświadczalny okna czaszkowego u myszy, schematyczny rysunek wymiarowy dla badań optycznych in vivo." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Stabilizacja zwierzęcia do zabiegu chirurgicznego i obrazowania dwufotonowego (A) oraz konstrukcja płytki głownej (B).
 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; zielona emisja w analizie struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Mikroglej znakowany GFP wizualizowany za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.
 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna hodowli neuronalnych ukazująca efekty kontrolne w porównaniu z efektami białka tat HIV, porównanie w technice time-lapse." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mikroglicia znakowana GFP uwidoczniona za pomocą obrazowania dwufotonowego po implantacji TSCW, około 50 μm poniżej powierzchni pialnej. Pojedyncze przekroje dwufotonowe wykonane 15–30 minut po implantacji TSCW (dzień 0), a także 7 i 17 dni później, wykazują, że okna pozostają przejrzyste, a mikroglej nieaktywny w przypadku braku bodźców zapalnych. Projekcje osi z wykonane 6 i 24 godziny po wstrzyknięciu neurotoksyny tat wirusa HIV wykazują wyraźne zmiany morfologiczne aktywowanego mikrogleju. Pasek skali: 10 μm.

<ol><li>Mostany, R., &amp, P. ortera-C. ailliau, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li>
<li>Majewska, A., Yiu, G., &amp, Y. uste, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li>
<li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22A+review.+J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li>
<li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp, B. alcerzyk, M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li>
<li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp, Q. uinlan, M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li>
<li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp, U. pender, B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li>
<li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp, M. cA. rthur, C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain%3A+correlations+with+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Rośnie przekonanie, że faktycznym podłożem deficytów neuropoznawczych związanych z HIV-1 (HAND) jest destrukcja architektury synaptycznej, prawdopodobnie wywołana przez mediatory prozapalne uwalniane z zainfekowanych HIV-1 fagocytów jednojadrowych. Aktywacja mikrogleju, wielojądrowe komórki olbrzymie oraz glioza wynikająca z hipertrofii astrocytów są uważane za nieswoiste cechy charakterystyczne dla infekcji HIV-1 i stanu zapalnego w OUN 7. W przeciwieństwie do nich, ciężkość przedśmiertnej choroby neurologicznej skorelowano z utratą złożoności synaptycznej, a także z obciążeniem makrofagami w OUN 8,9,10,11. Jednakże dynamiczne interakcje między mikroglejem, naciekającymi makrofagami obwodowymi a neuronami u pacjentów z HAND nie mogą być modelowane przy użyciu konwencjonalnego przetwarzania statycznego uzyskiwanego z tradycyjnych badań immunocytochemicznych. Niedawne badania w naszych laboratoriach zasugerowały, że przynajmniej niektóre z tych interakcji między obwodowymi i centralnymi komórkami jednojadrowymi a neuronami mogą być częściowo modelowane poprzez stereotaktyczną iniekcję białka Tat1-72 HIV-1 do miąższu mózgu (Lu, Marker, Tremblay, Qi oraz Gelbard, dane nieopublikowane). Zdecydowaliśmy się zatem zastosować obrazowanie dwufotonowe in vivo, aby zbadać współdziałanie między makrofagami pochodzącymi z monocytów, mikroglejem rezydentnym w mózgu a neuronami w łatwym w obsłudze modelu neuroAIDS u małych zwierząt. Podczas gdy preparaty z otwartą czaszką lub z cienką czaszką umożliwiają jednorazowe badanie architektury kory przez krótki czas (godziny), badacze zainteresowani przebiegiem zdarzeń podostrych nie mogą stosować tych preparatów bez artefaktycznej aktywacji mikrogleju/makrofagów w wyniku chirurgicznej manipulacji oknem czaszkowym. Tutaj demonstrujemy prosty sposób obejścia tych ograniczeń poprzez przyklejenie małego kawałka szkiełka nakrywowego nad obszarem cienkiej czaszki, co zapobiega regeneracji sklepienia czaszki w TSCW oraz utrzymuje przezroczystość przez ≥3 tygodnie. Wykazujemy ponadto, że technika ta pozwala nam monitorować zachowanie monocytów obwodowych wnikających do mikrokrążenia mózgowego, a także mikrogleju rezydentnego w mózgu w odpowiedzi na stereotaktyczną iniekcję HIV Tat1-72 do kory myszy heterozygotycznych dla CX3CR1/GFP (w celu identyfikacji komórek linii jednojadrowej). Technikę tę można łatwo dostosować do myszy o innym tle genetycznym; na przykład rutynowo stosujemy myszy heterozygotyczne CX3CR1/GFP X Thy-1 YFP 12 do badania interakcji między makrofagami pochodzącymi z monocytów, mikroglejem rezydentnym w mózgu a neuronami w modelach in vivo neurozapalenia istotnych dla HAND. Nasz preparat TSCW pozwala badaczom badać interakcje międzykomórkowe między obwodem a OUN, które mogą występować w okresie wielu tygodni, podczas których zwierzę może być wielokrotnie obrazowane przed i po leczeniu eksperymentalnym. W ten sposób każde zwierzę może służyć jako własna kontrola. Jedynym zastrzeżeniem dla tego modelu TSCW jest to, że badane komórki docelowe muszą być albo genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji ulepszonych białek fluorescencyjnych (eXFP), albo znakowane barwnikiem fluorescencyjnym bez mechanicznego naruszania sklepienia czaszki; ponadto ekspresja eXFP musi być wystarczająco silna, aby umożliwić wizualizację architektury komórkowej po wielokrotnych sesjach obrazowania w okresie wielu tygodni.

<table><tbody><tr><td>Cytrynian fentanylu</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorochlorek midazolamu</td><td>Baxter International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydrochlororek medetomidyny (Domitor)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podkładki grzewcze</td><td>Poza ciepłem ciała</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu z tobramycyną i deksametazonem (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór powidonu z jodem</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór chlorku żelaza(III)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan metylowy 910</td><td>Permabond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan 454</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sieciowanie materiału protetycznego TEETS metakrylan metylu</td><td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw końcówek Microtorque II</td><td>Testy Pearsona</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>Wiertła IRF 007</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>mikroostrzyże Norland z pełnym promieniem, wyginalne</td><td>Salvin Dental</td><td>BLAD-NORLAND-69</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan</td><td>Oryginalny superklej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełko podstawowe nr 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63750-01</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;Strzykawka mikrolitrowa</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ILS010LT</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>igła NanoFil 35 G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NL35BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Młyn kulowy, wiertła węglikowe 1/4"</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501860</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100</td><td></td></tr><tr><td>Pomnożnik fotonowy </td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Laser tytano-szafirowy Mai-Tai</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Tradycyjnie w neuronauce obrazowanie dwufotonowe in vivo ośrodkowego układu nerwowego myszy opierało się na zastosowaniu preparatów z otwartą czaszką1,2 lub z cieńszą czaszką 3. Chociaż technika otwartej czaszki jest bardzo wszechstronna, nie jest ona optymalna do badania mikrogleju, ponieważ jest inwazyjna i może powodować aktywację mikrogleju. Mimo że podejście z cieńszą czaszką jest minimalnie inwazyjne, powtarzane ścieńczanie czaszki wymagane przy obrazowaniu chronicznym zwiększa ryzyko uszkodzenia tkanek i aktywacji mikrogleju oraz pozwala na ograniczoną liczbę sesji obrazowania. Przedstawiamy tutaj metodę chronicznego okna z cienką czaszką do monitorowania mikrogleju mysiego in vivo przez dłuższy czas przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy, jak przygotować stabilne, dostępne okno korowe z cieńszą czaszką (TSCW) z przyłożoną szklaną lamką, która pozostaje przezroczysta w ciągu trzech tygodni przerywanej obserwacji. Preparat TSCW jest znacznie bardziej obojętny immunologicznie pod kątem aktywacji mikrogleju niż otwarta kraniotomia lub powtarzane ścieńczanie czaszki i pozwala na dowolną liczbę sesji obrazowania w okresie wielu tygodni. Przygotowujemy TSCW u myszy CX3CR1 GFP/+ 4, aby wizualizować mikroglej z wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym do głębokości ≤150 μm poniżej powierzchni opony miękkiej. Wykazujemy również, że preparat ten można stosować w połączeniu ze stereotaktycznymi iniekcjami do mózgu neurotoksycznego białka Tat wirusa HIV-1, w sąsiedztwie TSCW, które jest zdolne do indukowania trwałej mikroglejozy. Zatem metoda ta jest niezwykle użyteczna do badania zmian w morfologii i ruchliwości mikrogleju w czasie w żywym mózgu w modelach zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV (HAND) oraz innych chorób neurodegeneracyjnych z komponentem neurozapalnym.

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Tradycyjnie w neuronauce obrazowanie dwufotonowe in vivo ośrodkowego układu nerwowego myszy wiązało się z zastosowaniem metody otwartej czaszki1,2 lub...

U dorosłych pacjentów zakażonych HIV neuroinflammation zakłóca prawidłową sygnalizację synaptyczną, co prowadzi do deficytów neuropoznawczych, obejmujących trudności z abstrakcyjnym myśleniem, płynnością werbalną, uwagą, uczeniem się nowych informacji oraz pamięcią. HIV-1 tat indukuje wydzielanie cząsteczek zapalnych, które mogą naśladować dysfunkcję synaptyczną obserwowaną u pacjentów z HIV. W celu zbadania neuroinflammation indukowanego przez HIV-1 tat wykorzystuje się dorosłe myszy wykazujące ekspresję GFP w komórkach jednojądrowych, w tym w mikrogleju, z zastosowaniem dwufotonowej mikroskopii przez cienką czaszkę.Reakcje mikrogleju po wstrzyknięciu tat można obrazować in vivo. Powstałe obrazy wykazują skracanie i pogrubianie wypustek mikroglialnych oraz tworzenie struktur przypominających czachy fagocytarne, a także migrację monocytów obwodowych w naczyniach krwionośnych mózgu. Cześć, jestem Dan Marker z laboratorium Harrisa Galbarda oraz Centrum Rozwoju i Chorób Neurologicznych na Uniwersytecie w Rochester.Witajcie, jestem EF Trombley z Laboratorium Esca w Katedrze Neurobiologii i Anatomii na Uniwersytecie w Rochester. Cześć, jestem Shain Luu, również z laboratorium Albas. Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania dwufotonowego z wykorzystaniem preparatu cienkiej czaszki.Stosujemy tę procedurę do badania przewlekłego stanu zapalnego układu nerwowego. Zacznijmy zatem. W przedstawionym tutaj eksperymencie wykorzystano myszy, w których GFP jest ekspresowane w liniach komórek jednojądrastych, w tym w mikrogleju.W zależności od potrzeb konkretnego projektu można wykorzystać różne szczepy myszy. Rozpocznij przygotowanie myszy znieczulonej fentanylem i midazolamem do zabiegu chirurgicznego. Najpierw upewnij się, że zwierzę nie reaguje już na bodźce bólowe, takie jak ściśnięcie ogona.Umieść zwierzę na podkładce grzewczej, aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu. Następnie pokryj oczy zwierzęcia ochronną maścią oftalmiczną, aby utrzymać ich wilgotność. Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny zostać poddane autoklawowaniu lub sterylizacji w sterylizatorze koralikowym; dodatkowo zdezynfekuj narzędzia, namaczając je w 70% etanolu.Za pomocą nożyczek usuń sierść ze skóry głowy zwierzęcia, a następnie zdezynfekuj ten obszar, używając 10% roztworu powidonu jodowego oraz 70% etanolu. Rozpocznij zabieg chirurgiczny, wykonując małymi nożyczkami cięcie pośrodku skóry głowy, zaczynając od czterech do pięciu milimetrów od czaszki i przesuwając się do przodu w stronę oczu. Cięcie to powinno być wystarczająco długie, aby skóra nie przeszkadzała w przyklejeniu płytki stabilizującej głowę myszy podczas obrazowania dwufotonowego.Następnie, za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego nasączonego 100% ethanol, osusz błony na wierzchu czaszki. Usuń je, zeskrobując pęsetą precyzyjną. Jeśli błony nie zostaną usunięte, mocowanie płytki czaszkowej będzie niestabilne.Pod mikroskopem stereoskopowym zidentyfikuj obszar przeznaczony do pocienienia. Unikaj obszarów zainteresowania znajdujących się bezpośrednio nad szwami czaszkowymi, ponieważ czaszka jest w tych miejscach mniej stabilna, a znajdujące się pod nimi duże naczynia i opony mogą zakłócać obraz przesyłany do okna obserwacyjnego w obszarze zainteresowania. Następnie, ponownie używając patyczka higienicznego, potraktuj czaszkę 10% roztworem chlorku żelaza.Nanieś cienką warstwę kleju perma bond, nine 10 wokół krawędzi okna obserwacyjnego pod płytką głowową. Następnie umieść płytkę nad obszarem zainteresowania na czaszce zwierzęcia, wywierając lekki nacisk w celu związania kleju. Za pomocą strzykawki nanieś niewielką ilość akrylu wokół krawędzi okna obserwacyjnego.Na koniec nałóż niewielką ilość Tite 4 54 na krawędzie okna obserwacyjnego, aby zapobiec wyciekom. Przykręć płytkę głowową do uchwytu zwierzęcia i sprawdź stabilność pod mikroskopem dissectingowym. Delikatnie sprawdzając pęsetą, należy upewnić się, że czaszka nie przemieszcza się względem płytki głowowej.Nanieś kroplę soli fizjologicznej na okno obserwacyjne, aby upewnić się, że nie ma wycieków przed przystąpieniem do cieńczenia. Osusz czaszkę, używając sterylnych patyczków bawełnianych oraz sprężonego powietrza. Wycień czaszkę, używając wiertła IRF 0 0 7 w mikro-wiertarce.Przy 4 000 RPM. Bardzo delikatnie rozpocząć ścieńczenie okrągłego obszaru o średnicy od 2 do 2,5 mm. Stosować wyłącznie lekkie, zamiatające ruchy, niemal równolegle do czaszki.Nie należy wywierać bezpośredniego nacisku w dół. Należy przerywać wiercenie co 20 do 30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza. Przerwy w wierceniu pozwalają na schłodzenie czaszki, co zapobiega termicznemu uszkodzeniu tkanki mózgowej znajdującej się pod spodem.W miarę postępów wiercenia zwróć uwagę na przejście do bardziej wilgotnej warstwy kości gąbczastej, nazywanej diploë. Po dotarciu do tej warstwy zachowaj szczególną ostrożność podczas wiercenia. Okazjonalnie sprawdzaj grubość czaszki, nakładając sól fizjologiczną na cienki obszar i obserwując go pod stereomikroskopem.Sól fizjologiczna zapewni dodatkowe odprowadzanie ciepła. W miarę ścieńczania czaszki widoczne stają się mniejsze naczynia krwionośne. Należy użyć stomatologicznego mikroostrza, aby dokonać końcowego ścieńczenia w obecności soli fizjologicznej.Mikroostrze zapewnia znacznie lepsze odczucia dotykowe dotyczące stabilności czaszki. Pozwala to na wykonanie znacznie cieńszych preparatów niż przy użyciu samego wiertła. Optymalna grubość czaszki dla obrazowania wynosi od 10 do 30 micrometers.Cały proces ścieńczania trwa zazwyczaj od 15 do 30 minut. Podczas przygotowywania okna w czaszce należy wielokrotnie sprawdzać stopień jej ścienienia pod mikroskopem z epi fluorescencją. Ostrość i głębokość widocznej mikroglei oraz naczyń krwionośnych stanowią dobrą wskazówkę, że okno jest gotowe do obrazowania.Po przygotowaniu okna należy za pomocą szklanej pipety o średnicy 1 mm nanieść małą kroplę akrylowego kleju Cy na cienki obszar czaszki, a następnie ostrożnie położyć na nim kawałek szkiełka nakrywkowego. Następnie należy delikatnie docisnąć szkiełko do czaszki, aby wycisnąć nadmiar kleju, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza pomiędzy czaszką a szkiełkiem, które mogłyby ograniczyć widoczność. Po wyschnięciu należy użyć mikroostrza, aby ostrożnie usunąć pozostałości kleju z górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego w ramach przygotowania do obrazowania dwufotonowego.Przykryj cienkie okno korowe czaszki solą fizjologiczną i zlokalizuj obszar zainteresowania w świetle fluorescencji epi. Aby umożliwić późniejsze obrazowanie tego obszaru, wykonaj zdjęcie za pomocą kamery fotograficznej do obrazowania. Przedstawiono tutaj zastosowanie specjalnie wykonanego mikroskopu dwifotonowego z laserem szafirowym Ti dostrojonym do 920 nanometrów.Fluorescencję wykrywa się przy użyciu fotopowielacza (PMT) w trybie detekcji pełnego pola oraz filtra emisyjnego 581/80. Przez całą sesję obrazowania stosowany jest obiektyw imersyjny 20x w wodzie. Maksymalną moc wyjściową lasera obiektywu należy ustawić w zakresie od 50 do 65 milliwatów.Następnie wybierz obszar zainteresowania: warstwę korową pierwszą lub drugą, do 150 µm poniżej powierzchni powłoki. Aby ułatwić ponowne obrazowanie, wykonaj zdjęcia tego samego pola widzenia przy cyfrowym powiększeniu 1x, 2x oraz 3x. Naczynia krwionośne mogą służyć jako punkty orientacyjne, ułatwiające odnalezienie tego samego pola widzenia podczas kolejnych sesji obrazowania.Przy powiększeniu trzykrotnym wykonaj wielokrotne zeskanowania typu Zacks, obejmujące od 80 do 90 kroków Z, z krokiem 0,69 µm co pięć minut przez maksymalnie 30 minut. Pozwala to na dokładne próbkowanie morfologii i zachowania mikrogleju w czasie pomiędzy akwizycjami Zacks; w tym czasie sprawdź poziom soli fizjologicznej oraz głębokość anestezji. Jeśli jest to konieczne, podczas procedury można podać dawkę przypominającą w ilości jednej trzeciej pierwotnej dawki koktajlu anestetycznego, aby zapobiec osadzaniu się substancji na strzykawce i igle podczas wstrzykiwania w dniach poprzedzających iniekcję.Zasiliconizowano wewnętrzną wyściółkę igły o rozmiarze 35 G oraz strzykawki mikropojemnościowej 10 µL poprzez zaciągnięcie roztworu silikonizującego, aż wypełni on zarówno igłę, jak i strzykawkę. Pozostawiono roztwór na pięć minut w temperaturze pokojowej, następnie opróżniono strzykawkę z roztworu, wyjęto tłok i pozostawiono strzykawkę oraz igłę do całkowitego wyschnięcia. Na koniec strzykawkę i igłę dokładnie przemyto wodą dejonizowaną.Po sylikonizacji strzykawkę z igłą można wykorzystywać przez ponad sześć miesięcy, zanim konieczne będzie ponowne kodowanie. W dniu iniekcji nanieś małą kroplę roztworu TAT na sylikonizowany szkiełko przedmiotowe. Za pomocą zylikonizowanego końcówki pipety nabierz z tej kropli odpowiednią ilość roztworu do strzykawki mikropojemnościowej.Za pomocą wiertła wykonaj niewielką kraniotomię o średnicy 0,5 mm, w odległości 3 mm rostralnie lub bocznie od cienkiego okna korowego czaszki, w którym uzyskano obrazy dwufotonowe. W tym celu ostrożnie odcienij czaszkę. Następnie użyj ostrych pęset, aby usunąć cienką warstwę kości.Za pomocą mikromanipulatora należy ustawić igłę o rozmiarze 35 G i strzykawkę w linii z otworem trepanacyjnym. Następnie ostrożnie wprowadzić igłę na głębokość od 700 do 900 µm poniżej powierzchni odsłoniętej tkanki. Podać 3 µL z prędkością 80 nL/min, korzystając z pompy strzykawkowej sterowanej mikroprocesorem.Rysunek ten przedstawia mikroglej znakowany GFP, wizualizowany za pomocą obrazowania dwufotonowego po implantacji cienkiego okna korowego czaszki, w odległości około 50 µm poniżej powierzchniy nacięcia. Pojedyncze przekroje dwufotonowe wykonane w dniu zerowym, od 15 do 30 minut po implantacji cienkiego okna korowego czaszki, a także przekroje wykonane siedem i 17 dni później, wykazują, że okna pozostają przejrzyste, podczas gdy mikroglej pozostaje aktywowany w przypadku braku bodźców zapalnych. Podkreśla to przydatność tej metody do badania zarówno prawidłowych, jak i zapalnych interakcji między efektorowymi komórkami odpornościowymi a innymi typami komórek neuronalnych.In vivo projekcje Z wykonane sześć i 24 godziny po wstrzyknięciu neurotoksyny HIV TAT wykazują wyraźne zmiany morfologiczne aktywowanej mikroglej. Stanowi to dalszy dowód na naszą zdolność do badania zmian morfologicznych mikrogleju w czasie rzeczywistym w ostrych i przewlekłych modelach neurostanu zapalnego. Przedstawiliśmy sposób przygotowania cienkiego okna czaszkowego i jego wykorzystania do badania neurostanu zapalnego podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu spokoju i staranności podczas obróbki czaszki, aby zapobiec jakimkolwiek uszkodzeniom spowodowanym samym procesem preparacji. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Technika okna o cienkiej czaszce do przewlekłych dwufotonowych in vivo obrazowania mikroglii u myszy w modelach neurozapalenia

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Źródło: Bisht, K., et al. Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej u transgenicznej myszy z implantem czaszki. Stabilność naczyniowa i neuronalna jest obrazowana wraz z dynamicznymi zmianami mikrogleju, odzwierciedlającymi odpowiedzi immunologiczne na aktywność neuronów.

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej za pomocą implantu czaszki

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Źródło: Kamei, R., et al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)Film przedstawia proces konfiguracji i obrazowania do mikroskopii dwufotonowej in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie CA1 (Cornu ammonis 1) i zakręcie zębatym, zapewniając optymalne wyrównanie optyczne i ocenę integralności strukturalnej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie myszy

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Poznaj technikę cienkiego okienka czaszki do przewlekłego dwufotonowego obrazowania mikrogleju mysiego in vivo w modelach zapalenia nerwów. Ta metoda pozwala obserwować dynamikę komórkową w czasie rzeczywistym.

Technika cienkiego okienka czaszki do przewlekłego dwufotonowego obrazowania in vivo mysiego mikrogleju w modelach zapalenia nerwów (Wideo) | JoVE Journal

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Przeglądaj więcej filmów