Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

U dorosłych pacjentów zakażonych HIV neuroinflammation zakłóca prawidłową sygnalizację synaptyczną, co prowadzi do deficytów neuropoznawczych, obejmujących trudności z abstrakcyjnym myśleniem, płynnością werbalną, uwagą, uczeniem się nowych informacji oraz pamięcią. HIV-1 tat indukuje wydzielanie cząsteczek zapalnych, które mogą naśladować dysfunkcję synaptyczną obserwowaną u pacjentów z HIV. W celu zbadania neuroinflammation indukowanego przez HIV-1 tat wykorzystuje się dorosłe myszy wykazujące ekspresję GFP w komórkach jednojądrowych, w tym w mikrogleju, z zastosowaniem dwufotonowej mikroskopii przez cienką czaszkę.

Reakcje mikrogleju po wstrzyknięciu tat można obrazować in vivo. Powstałe obrazy wykazują skracanie i pogrubianie wypustek mikroglialnych oraz tworzenie struktur przypominających czachy fagocytarne, a także migrację monocytów obwodowych w naczyniach krwionośnych mózgu. Cześć, jestem Dan Marker z laboratorium Harrisa Galbarda oraz Centrum Rozwoju i Chorób Neurologicznych na Uniwersytecie w Rochester.

Witajcie, jestem EF Trombley z Laboratorium Esca w Katedrze Neurobiologii i Anatomii na Uniwersytecie w Rochester. Cześć, jestem Shain Luu, również z laboratorium Albas. Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania dwufotonowego z wykorzystaniem preparatu cienkiej czaszki.

Stosujemy tę procedurę do badania przewlekłego stanu zapalnego układu nerwowego. Zacznijmy zatem. W przedstawionym tutaj eksperymencie wykorzystano myszy, w których GFP jest ekspresowane w liniach komórek jednojądrastych, w tym w mikrogleju.

W zależności od potrzeb konkretnego projektu można wykorzystać różne szczepy myszy. Rozpocznij przygotowanie myszy znieczulonej fentanylem i midazolamem do zabiegu chirurgicznego. Najpierw upewnij się, że zwierzę nie reaguje już na bodźce bólowe, takie jak ściśnięcie ogona.

Umieść zwierzę na podkładce grzewczej, aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu. Następnie pokryj oczy zwierzęcia ochronną maścią oftalmiczną, aby utrzymać ich wilgotność. Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny zostać poddane autoklawowaniu lub sterylizacji w sterylizatorze koralikowym; dodatkowo zdezynfekuj narzędzia, namaczając je w 70% etanolu.

Za pomocą nożyczek usuń sierść ze skóry głowy zwierzęcia, a następnie zdezynfekuj ten obszar, używając 10% roztworu powidonu jodowego oraz 70% etanolu. Rozpocznij zabieg chirurgiczny, wykonując małymi nożyczkami cięcie pośrodku skóry głowy, zaczynając od czterech do pięciu milimetrów od czaszki i przesuwając się do przodu w stronę oczu. Cięcie to powinno być wystarczająco długie, aby skóra nie przeszkadzała w przyklejeniu płytki stabilizującej głowę myszy podczas obrazowania dwufotonowego.

Następnie, za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego nasączonego 100% ethanol, osusz błony na wierzchu czaszki. Usuń je, zeskrobując pęsetą precyzyjną. Jeśli błony nie zostaną usunięte, mocowanie płytki czaszkowej będzie niestabilne.

Pod mikroskopem stereoskopowym zidentyfikuj obszar przeznaczony do pocienienia. Unikaj obszarów zainteresowania znajdujących się bezpośrednio nad szwami czaszkowymi, ponieważ czaszka jest w tych miejscach mniej stabilna, a znajdujące się pod nimi duże naczynia i opony mogą zakłócać obraz przesyłany do okna obserwacyjnego w obszarze zainteresowania. Następnie, ponownie używając patyczka higienicznego, potraktuj czaszkę 10% roztworem chlorku żelaza.

Nanieś cienką warstwę kleju perma bond, nine 10 wokół krawędzi okna obserwacyjnego pod płytką głowową. Następnie umieść płytkę nad obszarem zainteresowania na czaszce zwierzęcia, wywierając lekki nacisk w celu związania kleju. Za pomocą strzykawki nanieś niewielką ilość akrylu wokół krawędzi okna obserwacyjnego.

Na koniec nałóż niewielką ilość Tite 4 54 na krawędzie okna obserwacyjnego, aby zapobiec wyciekom. Przykręć płytkę głowową do uchwytu zwierzęcia i sprawdź stabilność pod mikroskopem dissectingowym. Delikatnie sprawdzając pęsetą, należy upewnić się, że czaszka nie przemieszcza się względem płytki głowowej.

Nanieś kroplę soli fizjologicznej na okno obserwacyjne, aby upewnić się, że nie ma wycieków przed przystąpieniem do cieńczenia. Osusz czaszkę, używając sterylnych patyczków bawełnianych oraz sprężonego powietrza. Wycień czaszkę, używając wiertła IRF 0 0 7 w mikro-wiertarce.

Przy 4 000 RPM. Bardzo delikatnie rozpocząć ścieńczenie okrągłego obszaru o średnicy od 2 do 2,5 mm. Stosować wyłącznie lekkie, zamiatające ruchy, niemal równolegle do czaszki.

Nie należy wywierać bezpośredniego nacisku w dół. Należy przerywać wiercenie co 20 do 30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza. Przerwy w wierceniu pozwalają na schłodzenie czaszki, co zapobiega termicznemu uszkodzeniu tkanki mózgowej znajdującej się pod spodem.

W miarę postępów wiercenia zwróć uwagę na przejście do bardziej wilgotnej warstwy kości gąbczastej, nazywanej diploë. Po dotarciu do tej warstwy zachowaj szczególną ostrożność podczas wiercenia. Okazjonalnie sprawdzaj grubość czaszki, nakładając sól fizjologiczną na cienki obszar i obserwując go pod stereomikroskopem.

Sól fizjologiczna zapewni dodatkowe odprowadzanie ciepła. W miarę ścieńczania czaszki widoczne stają się mniejsze naczynia krwionośne. Należy użyć stomatologicznego mikroostrza, aby dokonać końcowego ścieńczenia w obecności soli fizjologicznej.

Mikroostrze zapewnia znacznie lepsze odczucia dotykowe dotyczące stabilności czaszki. Pozwala to na wykonanie znacznie cieńszych preparatów niż przy użyciu samego wiertła. Optymalna grubość czaszki dla obrazowania wynosi od 10 do 30 micrometers.

Cały proces ścieńczania trwa zazwyczaj od 15 do 30 minut. Podczas przygotowywania okna w czaszce należy wielokrotnie sprawdzać stopień jej ścienienia pod mikroskopem z epi fluorescencją. Ostrość i głębokość widocznej mikroglei oraz naczyń krwionośnych stanowią dobrą wskazówkę, że okno jest gotowe do obrazowania.

Po przygotowaniu okna należy za pomocą szklanej pipety o średnicy 1 mm nanieść małą kroplę akrylowego kleju Cy na cienki obszar czaszki, a następnie ostrożnie położyć na nim kawałek szkiełka nakrywkowego. Następnie należy delikatnie docisnąć szkiełko do czaszki, aby wycisnąć nadmiar kleju, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza pomiędzy czaszką a szkiełkiem, które mogłyby ograniczyć widoczność. Po wyschnięciu należy użyć mikroostrza, aby ostrożnie usunąć pozostałości kleju z górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego w ramach przygotowania do obrazowania dwufotonowego.

Przykryj cienkie okno korowe czaszki solą fizjologiczną i zlokalizuj obszar zainteresowania w świetle fluorescencji epi. Aby umożliwić późniejsze obrazowanie tego obszaru, wykonaj zdjęcie za pomocą kamery fotograficznej do obrazowania. Przedstawiono tutaj zastosowanie specjalnie wykonanego mikroskopu dwifotonowego z laserem szafirowym Ti dostrojonym do 920 nanometrów.

Fluorescencję wykrywa się przy użyciu fotopowielacza (PMT) w trybie detekcji pełnego pola oraz filtra emisyjnego 581/80. Przez całą sesję obrazowania stosowany jest obiektyw imersyjny 20x w wodzie. Maksymalną moc wyjściową lasera obiektywu należy ustawić w zakresie od 50 do 65 milliwatów.

Następnie wybierz obszar zainteresowania: warstwę korową pierwszą lub drugą, do 150 µm poniżej powierzchni powłoki. Aby ułatwić ponowne obrazowanie, wykonaj zdjęcia tego samego pola widzenia przy cyfrowym powiększeniu 1x, 2x oraz 3x. Naczynia krwionośne mogą służyć jako punkty orientacyjne, ułatwiające odnalezienie tego samego pola widzenia podczas kolejnych sesji obrazowania.

Przy powiększeniu trzykrotnym wykonaj wielokrotne zeskanowania typu Zacks, obejmujące od 80 do 90 kroków Z, z krokiem 0,69 µm co pięć minut przez maksymalnie 30 minut. Pozwala to na dokładne próbkowanie morfologii i zachowania mikrogleju w czasie pomiędzy akwizycjami Zacks; w tym czasie sprawdź poziom soli fizjologicznej oraz głębokość anestezji. Jeśli jest to konieczne, podczas procedury można podać dawkę przypominającą w ilości jednej trzeciej pierwotnej dawki koktajlu anestetycznego, aby zapobiec osadzaniu się substancji na strzykawce i igle podczas wstrzykiwania w dniach poprzedzających iniekcję.

Zasiliconizowano wewnętrzną wyściółkę igły o rozmiarze 35 G oraz strzykawki mikropojemnościowej 10 µL poprzez zaciągnięcie roztworu silikonizującego, aż wypełni on zarówno igłę, jak i strzykawkę. Pozostawiono roztwór na pięć minut w temperaturze pokojowej, następnie opróżniono strzykawkę z roztworu, wyjęto tłok i pozostawiono strzykawkę oraz igłę do całkowitego wyschnięcia. Na koniec strzykawkę i igłę dokładnie przemyto wodą dejonizowaną.

Po sylikonizacji strzykawkę z igłą można wykorzystywać przez ponad sześć miesięcy, zanim konieczne będzie ponowne kodowanie. W dniu iniekcji nanieś małą kroplę roztworu TAT na sylikonizowany szkiełko przedmiotowe. Za pomocą zylikonizowanego końcówki pipety nabierz z tej kropli odpowiednią ilość roztworu do strzykawki mikropojemnościowej.

Za pomocą wiertła wykonaj niewielką kraniotomię o średnicy 0,5 mm, w odległości 3 mm rostralnie lub bocznie od cienkiego okna korowego czaszki, w którym uzyskano obrazy dwufotonowe. W tym celu ostrożnie odcienij czaszkę. Następnie użyj ostrych pęset, aby usunąć cienką warstwę kości.

Za pomocą mikromanipulatora należy ustawić igłę o rozmiarze 35 G i strzykawkę w linii z otworem trepanacyjnym. Następnie ostrożnie wprowadzić igłę na głębokość od 700 do 900 µm poniżej powierzchni odsłoniętej tkanki. Podać 3 µL z prędkością 80 nL/min, korzystając z pompy strzykawkowej sterowanej mikroprocesorem.

Rysunek ten przedstawia mikroglej znakowany GFP, wizualizowany za pomocą obrazowania dwufotonowego po implantacji cienkiego okna korowego czaszki, w odległości około 50 µm poniżej powierzchniy nacięcia. Pojedyncze przekroje dwufotonowe wykonane w dniu zerowym, od 15 do 30 minut po implantacji cienkiego okna korowego czaszki, a także przekroje wykonane siedem i 17 dni później, wykazują, że okna pozostają przejrzyste, podczas gdy mikroglej pozostaje aktywowany w przypadku braku bodźców zapalnych. Podkreśla to przydatność tej metody do badania zarówno prawidłowych, jak i zapalnych interakcji między efektorowymi komórkami odpornościowymi a innymi typami komórek neuronalnych.

In vivo projekcje Z wykonane sześć i 24 godziny po wstrzyknięciu neurotoksyny HIV TAT wykazują wyraźne zmiany morfologiczne aktywowanej mikroglej. Stanowi to dalszy dowód na naszą zdolność do badania zmian morfologicznych mikrogleju w czasie rzeczywistym w ostrych i przewlekłych modelach neurostanu zapalnego. Przedstawiliśmy sposób przygotowania cienkiego okna czaszkowego i jego wykorzystania do badania neurostanu zapalnego podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu spokoju i staranności podczas obróbki czaszki, aby zapobiec jakimkolwiek uszkodzeniom spowodowanym samym procesem preparacji. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.