Technika cienkiego okienka czaszki do przewlekłego dwufotonowego obrazowania in vivo mysiego mikrogleju w modelach zapalenia nerwów

U dorosłych pacjentów zakażonych wirusem HIV zapalenie nerwów zakłóca normalną sygnalizację synaptyczną, prowadząc do deficytów neuropoznawczych, które obejmują trudności z abstrakcjami, płynnością werbalną, uczeniem się uwagi, nowymi informacjami i pamięcią. HIV jeden tat indukuje wydzielanie cząsteczek zapalnych, które mogą naśladować dysfunkcję synaps obserwowaną u pacjentów z HIV. Dorosłe myszy wykazujące ekspresję GFP w komórkach jednojądrzastych, w tym mikrogleju, są wykorzystywane do badania zapalenia nerwów wywołanego przez HIV za pomocą mikroskopii dwufotonowej cienkiej czaszki.

Reakcje mikrogleju po wstrzyknięciu tat można obrazować in vivo. Uzyskane obrazy wskazują na skrócenie i zagęszczenie procesów mikrogleju oraz tworzenie się fagocytarnych struktur przypominających miseczki, a także obwodowy transport monocytów w mikronaczyniach mózgowych. Cześć, nazywam się Dan Marker i pracuję w laboratorium Harrisa Galbarda oraz w Centrum Rozwoju i Chorób Neuronalnych na Uniwersytecie w Rochester.

Cześć, nazywam się EF Trombley i pracuję w Laboratorium Esca na Wydziale Neurobiologii i Anatomii Uniwersytetu w Rochester. Cześć, nazywam się Shain Luu i również pracuję w Albas Lab. Dzisiaj pokażemy Wam procedurę obrazowania dwóch fotonów przy użyciu cienkiego preparatu czaszki.

Używamy tej procedury do badania przewlekłego zapalenia nerwów. Więc zacznijmy w pokazanym tutaj eksperymencie. Stosuje się ekspresję OT GFP w liniach komórek jednojądrzastych, w tym mikrogleju.

Różne szczepy myszy mogą być wykorzystywane do zaspokojenia potrzeb konkretnego projektu. Zacznij przygotowywać znieczuloną mysz znieczuloną fentanylem, midazolamem meine do operacji. Po pierwsze, upewnij się, że zwierzę nie reaguje już na bolesne bodźce, takie jak szczypanie ogona.

Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu. Następnie zakryj oczy zwierzęcia ochronną maścią okulistyczną, aby oczy były wilgotne. Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być sterylizowane w autoklawie lub sterylizowane sterylizatorem z kulkami szklanymi, a następnie dezynfekować narzędzia, mocząc je w 70% etanolu.

Za pomocą nożyczek usuń sierść ze skóry głowy zwierzęcia, a następnie zdezynfekuj obszar za pomocą 10% roztworu jodu powidonu i 70% etanolu. Rozpocznij operację za pomocą małych nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy, zaczynając od czterech do pięciu milimetrów, sercem do czaszki i przesuwając się do przodu do przodu oczu. Nacięcie to powinno być na tyle długie, aby skóra nie przeszkadzała w sklejaniu płytki stabilizującej głowę myszy podczas obrazowania dwufotonowego.

Następnie nałóż 100% etanol na sterylny bawełniany wacik, aby wysuszyć błony na wierzchu czaszki. Zeskrob je delikatną pęsetą. Jeśli membrany nie zostaną usunięte, mocowanie płyty czołowej będzie niestabilne.

Pod lunetą preparacyjną zidentyfikuj obszar, który ma zostać przerzedzony. Unikaj obszarów zainteresowania znajdujących się bezpośrednio nad szwami czaszkowymi, ponieważ czaszka jest mniej stabilna w tych obszarach, a leżące pod nią duże naczynia i opony mózgowe będą zakłócać obrazowanie wysyłane do okna obserwacyjnego w obszarze zainteresowania. Następnie ponownie, za pomocą bawełnianego wacika, spróbuj ponownie zmierzyć czaszkę, używając 10% roztworu chlorku żelaza.

Umieść cienką warstwę kleju perma bond, dziewięć 10 wokół krawędzi okienka podglądu pod płytą główną. Następnie umieść płytkę nad obszarem zainteresowania na czaszce zwierzęcia z lekkim naciskiem, aby związać klej. Nałóż niewielką ilość akrylu wokół krawędzi viewokienko za pomocą strzykawki.

Na koniec nałóż niewielką ilość Tite 4 54 na krawędzie viewokienko. Aby zapobiec wyciekom. Przykręć płytkę głowicy do uchwytu na zwierzę i sprawdź stabilność pod mikroskopem preparacyjnym Lekko sondując parą kleszczy, nie powinno być ruchu czaszki względem płyty głowy.

Umieść kroplę soli fizjologicznej na viewokienko, aby upewnić się, że nie ma wycieków w ramach przygotowań do rozcieńczenia. Osusz czaszkę za pomocą kombinacji sterylnych wacików bawełnianych i sprężonego powietrza. Rozcieńczyć czaszkę za pomocą wiertła IRF 0 0 7 w mikro lub dwóch wiertłach.

Przy 4 000 obr./min. Bardzo delikatnie rozpocznij przerzedzanie okrągłego obszaru o średnicy od dwóch do 2,5 milimetra. Używaj tylko lekkich, zamaszystych ruchów prawie równolegle do czaszki.

Nie używaj bezpośredniego nacisku w dół. Przerwij wiercenie co 20 do 30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza. Te przerwy w wierceniu pozwalają czaszce schłodzić się, dzięki czemu nie dochodzi do uszkodzenia tkanki mózgowej wywołanego ciepłem.

W miarę postępu wiercenia zwróć uwagę na przejście do bardziej wilgotnej warstwy kości kolczastej zwanej Diplo. Po osiągnięciu tej warstwy należy zachować szczególną ostrożność podczas używania wiertła. Od czasu do czasu sprawdzaj cienkość czaszki, umieszczając sól fizjologiczną na cienkim obszarze i oglądając pod lunetą sekcyjną.

Sól fizjologiczna dodatkowo umożliwi odprowadzanie ciepła. W miarę przerzedzania czaszki widoczne stają się mniejsze naczynia krwionośne. Użyj mikroostrza dentystycznego, aby uzyskać ostateczne rozrzedzenie pod solą fizjologiczną.

Mikroostrze zapewnia znacznie bardziej dotykową informację zwrotną na temat stabilności czaszki. Pozwala to na znacznie cieńsze przygotowanie niż w przypadku samego wiertła. Optymalna grubość czaszki do obrazowania wynosi od 10 do 30 mikrometrów.

Cały proces przerzedzania trwa zwykle od 15 do 30 minut. Sprawdź cienkość czaszki pod wpływem epifluorescencji wiele razy, wykonując cienkie okienko czaszki. Ostrość i głębokość widocznego mikrogleju i układu naczyniowego dają dobrą wskazówkę, kiedy okno jest gotowe do obrazowania.

Gdy okno będzie gotowe, użyj szklanej pipety o średnicy jednego milimetra, aby umieścić małą kroplę kleju akrylowego Cy na cienkim obszarze czaszki i ostrożnie opuść na nią kawałek szkła nakrywkowego. Następnie delikatnie dociśnij do czaszki, aby wycisnąć nadmiar kleju, unikając tworzenia się pęcherzyków między nią a szkłem nakrywkowym, które mogą zasłaniać widok. Po wyschnięciu użyj mikroostrza, aby ostrożnie usunąć klej pozostawiony na wierzchu szkła nakrywkowego, przygotowując się do obrazowania dwufotonowego.

Przykryj cienkie okienko kory mózgowej czaszki solą fizjologiczną i zlokalizuj obszar zainteresowania pod wpływem epifluorescencji. Aby umożliwić późniejsze obrazowanie obszaru, zrób zdjęcie za pomocą aparatu fotograficznego do obrazowania. Pokazany tutaj używany jest wykonany na zamówienie mikroskop fotograficzny z szafirowym laserem ti dostrojonym do 920 nanometrów.

Fluorescencja jest wykrywana za pomocą fotopowielacza lub PMT w trybie detekcji całego pola i filtra emisyjnego 5 81 80. Soczewka zanurzająca w wodzie 20 x jest używana przez cały czas trwania sesji obrazowania. Ustaw maksymalną moc wyjściową lasera obiektywu w zakresie od 50 do 65 miliwatów.

Następnie wybierz obszar zainteresowania warstwą korową jedną lub dwie do 150 mikrometrów poniżej powierzchni odklejania. Aby ułatwić ponowne obrazowanie, rób zdjęcia tego samego pola widzenia z zoomem cyfrowym jeden x przy dwóch x i trzech krotnym zoomie cyfrowym. Naczynia krwionośne mogą służyć jako punkty orientacyjne, aby łatwo znaleźć to samo pole widzenia podczas kolejnych sesji obrazowania.

Przy powiększeniu trzech x uzyskaj wiele Zacków z krokami od 80 do 90 Z każdy i krokiem 0,69 mikrometra co pięć minut przez maksymalnie 30 minut. Umożliwia to dobre pobieranie próbek morfologii i zachowania mikrogleju w czasie między przejęciami Zacksa, weryfikację poziomu soli fizjologicznej i głębokości znieczulenia. W razie potrzeby podczas zabiegu można podać dawkę przypominającą w wysokości jednej trzeciej pierwotnej dawki koktajlu znieczulającego, aby zapobiec osadzaniu się tat na strzykawce i igle podczas wstrzyknięcia na kilka dni przed wstrzyknięciem.

Silosowanie wewnętrznej wyściółki igły o rozmiarze 35 i strzykawki o mikroobjętości 10 mikrolitrów, poprzez pobranie roztworu do zaklejania, aż wypełni zarówno igłę, jak i strzykawkę. Pozostawić roztwór na pięć minut w temperaturze pokojowej, następnie opróżnić roztwór ze strzykawki, usunąć tłok i pozostawić strzykawkę i igłę do całkowitego wyschnięcia. Na koniec dokładnie umyć strzykawkę i igłę wodą dejonizowaną.

Po odizolowaniu strzykawka i igła mogą być używane przez ponad sześć miesięcy, zanim konieczne będzie ponowne odkodowanie. W dniu wstrzyknięcia umieścić małą kroplę roztworu TAT na silikonowym szkiełku podstawowym. Za pomocą silikonowanej końcówki pipety załadować żądaną ilość roztworu do strzykawki z mikroobjętości z tej kropli.

Za pomocą wiertła wykonaj małą kraniotomię o średnicy 0,5 milimetra, trzy milimetry rostralnie lub bocznie do cienkiego okna korowego czaszki, w którym uzyskano dwa obrazy fotonowe. Aby to osiągnąć, ostrożnie przerzedź czaszkę. Następnie użyj ostrych kleszczy, aby usunąć cienką warstwę kości.

Użyj mikromanipulatora, aby wyrównać igłę i strzykawkę o rozmiarze 35 z kraniotomią. Następnie ostrożnie przesuń igłę na głębokość od 700 do 900 mikrometrów poniżej powierzchni skórki. Dostarczyć trzy mikrolitry z prędkością 80 nanolitrów na minutę za pomocą sterowanej mikroprocesorem pompy strzykawkowej.

Rysunek ten przedstawia mikroglej oznaczony GFP uwidoczniony za pomocą obrazowania dwufotonowego po implantacji cienkiego okna korowego czaszki, około 50 mikrometrów poniżej powierzchni skórki. Pojedyncze dwa skrawki fotonów wykonane w dniu zero, 15 do 30 minut po implantacji cienkiego okienka korowego czaszki, a także te wykonane siedem i 17 dni później pokazują, że okna pozostają czyste, podczas gdy mikroglej pozostaje aktywny przy braku uszkodzeń zapalnych. Podkreśla to przydatność tej metody do badania zarówno normalnych, jak i zapalnych interakcji między komórkami efektorowymi układu odpornościowego a innymi typami komórek nerwowych.

In vivo projekcje Z pobrane po sześciu i 24 godzinach od wstrzyknięcia neurotoksyny HIV TAT wykazują wyraźne zmiany morfologiczne aktywowanego mikrogleju. Dalsze demonstrowanie naszej zdolności do badania zmian morfologicznych mikrogleju w czasie rzeczywistym w ostrych i przewlekłych modelach zapalenia nerwów. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować cienkie okienko czaszki i wykorzystać je do badania zapalenia nerwów Podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby pamiętać, aby nie spieszyć się z pielęgnacją czaszki, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym przez sam preparat. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.