Wysokoprzepustowy, trójwymiarowy model tkankowy do ilościowego oznaczania progów elektroporacji

Nasze badania koncentrują się na wykorzystaniu elektroporacji, a konkretnie bipolarnych impulsów mikrosekundowych, w leczeniu raka. Obecnie przyglądamy się ablacji tkanek miękkich, ale zamierzamy również przejść do transfekcji in vivo z wykorzystaniem tych impulsów. Nasz protokół umożliwia bardziej efektywne wyświetlanie nieodwracalnych i odwracalnych progów elektroporacji.

Może być również nieco lepszy niż system oparty na kostkach, ponieważ pozwala nam widzieć w 3D, a nie w środowisku 2D. A środowisko 3D byłoby znacznie bardziej podobne do tego, co widzimy w tkance. W przyszłości będziemy próbować przełożyć to, co widzimy w tym modelu na in vivo, a to, co ten model naprawdę robi, to informowanie o wyborach parametrów, których zamierzamy dokonać, gdy próbujemy dostarczyć takie rzeczy, jak szczepionki DNA, chemioterapia, a także systemy takie jak CRISPR-Cas9.

Aby rozpocząć, umieść zawiesinę komórek i wymagane odczynniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotowaną zawiesinę komórkową dokładnie wymieszać z roztworem kolagenu bydlęcego typu 1 w stosunku 1:1. Umieść mieszaninę na lodzie lub w zimnej kąpieli perełkowej, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.

Następnie odpipetować 500 mikrolitrów połączonego roztworu, aby pokryć dno każdej studzienki 12-dołkowej płytki. Delikatnie zakręć płytką, aby upewnić się, że żel styka się ze ściankami każdej studzienki. Żele inkubować w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 6 godzin lub do momentu, gdy żele staną się twarde.

Następnie przechyl płytkę dołka i delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki. Usuń plastikowe połączenie przynęty z dwóch igieł strzykawkowych ze stali nierdzewnej 304 o średnicy 1,64 milimetra. Odłóż jedną igłę na bok, aby służyła jako elektroda szpilkowa.

W przypadku drugiej igły spłaszcz ostatnie 5 milimetrów jednego końca. Następnie wytnij odcinek rurki ze stali nierdzewnej 316 o średnicy 19 milimetrów wystarczająco długiej, aby przylegała równo do dna płytki studziennej, aby utworzyć elektrodę pierścieniową. Zaprojektuj uchwyt elektrody za pomocą oprogramowania CAD, aby dopasować elementy elektrody.

Dopasuj elektrody pierścieniowe i szpilkowe do uchwytu elektrody, aby zmontować elektrodę i wciśnij igłę ze spłaszczonym końcem w uchwyt, aby zabezpieczyć elektrodę pierścieniową. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przechyl przygotowaną płytkę i odessaj 400 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Dodaj 20 mikrolitrów po 5 mikrogramów na mikrolitr roztworu plazmidu białka zielonej fluorescencji do zasysanych studzienek.

Delikatnie obracaj płytką, aby upewnić się, że roztwór równomiernie rozprowadza się po powierzchni żelu. Inkubuj żele w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 minut. Następnie włóż światłowodową sondę temperatury do elektrody kołkowej i rozpocznij rejestrację temperatury.

Podłącz dodatni przewód elektroporatora do elektrody sworzniowej, a przewód ujemny do igły, zabezpieczając elektrodę pierścieniową. Teraz włącz płytę grzejną i podgrzej żele, aby utrzymać temperaturę 37 stopni Celsjusza. Następnie włóż zmontowany pierścień i elektrodę kołkową z sondą temperatury do studzienki i upewnij się, że żel osiągnął temperaturę 37 stopni Celsjusza.

Aktywuj elektroporator, aby dostarczyć zabieg. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej do wszystkich żeli, które wydają się suche i kontynuuj elektryzowanie nieleczonych żeli. Po zakończeniu wszystkich zabiegów inkubuj żele w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 minut.

Po inkubacji delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdej studzienki wzdłuż ścianki płytki. Ponownie inkubować żele w nawilżanym inkubatorze przez 24 godziny. Przechylić płytkę i zassać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki.

Następnie delikatnie dodaj 500 mikrolitrów PBS do każdego dołka wzdłuż ścianek płytki. Inkubuj żele w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 5 minut. Następnie odessaj PBS z każdej studzienki.

Delikatnie dodaj 500 mikrolitrów PBS do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki. Delikatnie zakręć płytką, a następnie przechyl ją i zassaj PBS z każdej studzienki. Teraz dodaj 100 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki, aby żele były nawodnione do obrazowania.

Następnie zobrazuj płytkę przy użyciu standardowych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Po zobrazowaniu dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdego dołka płytki i inkubuj przez 24 godziny. Powtórz pełny proces obrazowania i odzyskiwania dla każdego wyznaczonego punktu czasowego.

Po utworzeniu modelu obliczeniowego użyj oprogramowania mikroskopowego, aby zmierzyć średnicę zarówno zewnętrznej, jak i wewnętrznej krawędzi obszaru w kształcie torusa wzdłuż osi pionowej i poziomej. Uśrednij odpowiednio średnicę zewnętrzną i wewnętrzną i podziel przez 2, aby obliczyć odpowiednie promienie. Na koniec, korzystając z utworzonej wcześniej tabeli przeglądowej, wyprowadź natężenie pola elektrycznego na zmierzonych promieniach.

Zewnętrzny promień transfekowanego obszaru wykorzystano do ilościowego określenia odwracalnego progu elektroporacji lub RE poprzez skorelowanie go z natężeniami pola elektrycznego z modelu obliczeniowego. Natomiast promień wewnętrzny został wykorzystany do wyznaczenia nieodwracalnej elektroporacji lub progu IRE. Wszystkie trzy dwubiegunowe protokoły impulsów mikrosekundowych skutkowały obszarami transfekcji w kształcie torusa z wyraźnie widocznymi granicami RE i IRE.

Spośród badanych przebiegów, przebieg zbalansowany 2-1-1 burst wygenerował najwyższy próg IRE, podczas gdy przebieg niezbalansowany 2-1-1 wykazał się najniższym. Standardowy protokół monopolarnej elektroporacji wykorzystujący 420 woltów spowodował powstanie kołowego obszaru transfekcji z progiem RE wynoszącym 642 wolty na centymetr, ale nie spowodował śmierci komórki, uniemożliwiając określenie progu IRE. Deformacja tkanki w czasie spowodowana degradacją żelu spowodowała, że transfekowane obszary straciły swój okrągły kształt, co utrudniło dokładną kwantyfikację RE i IRE.

Niewspółosiowość elektrod pierścieniowych i kołkowych z dnem studni powodowała również asymetryczne, niekołowe wzory transfekcji, co komplikowało pomiar progowy.