Name: Wysokoprzepustowy, trójwymiarowy model tkankowy do ilościowego oznaczania progów elektroporacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj modelowanie obliczeniowe progowe elektroporacji w trójwymiarowych mimetykach tkankowych. Ta metoda umożliwia ilościowe oznaczanie progów odwracalnej i nieodwracalnej elektroporacji dla optymalizacji protokołów transfekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została wykonana na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej i sfinansowana przez National Institutes of Health (R01CA272550).

Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego, płytka 1 × 105 komórek/ml linii komórkowej HEK293 w objętości 10 ml na kulturę tkankową kolba T75 w minimalnym niezbędnym podłożu Eagle'a uzupełnionym 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Inkubować komórki HEK293 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 .</li>
	<li>Zbierz komórki do eksperymentów 2 dni po wysianiu, usuwając pożywkę hodowlaną i traktując komórki 4 ml 0,25% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Inkubować komórki i trypsynę przez 3-5 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 lub do momentu, gdy komórki oderwą się od powierzchni hodowli.</li>
	<li>Dezaktywuj aktywność enzymatyczną trypsyny, dodając 4 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Osadzać komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 180 × g i ponownie zawiesić w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 8 × 106 komórek/ml.</li>
</ol>
2. 3D tworzenie modelu tkankowego
UWAGA: W tym celu należy użyć pipetowania wstecznego, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków powietrza do mieszaniny.
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dokładnie wymieszaj przygotowane 8 × 106 komórek/ml zawiesiny komórek z roztworem kolagenu bydlęcego typu I (3 mg/ml) w stosunku 1:1. Umieścić na lodzie lub w zimnej kąpieli perełkowej, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji podczas pracy z mieszanką.</li>
	<li>Odpipetować 500 μl połączonego roztworu, aby pokryć dno każdego dołka na 12-dołkowej płytce. Upewnij się, że żel równomiernie pokrywa dno, zaczynając dozowanie roztworu na środku studzienki, a następnie delikatnie przesuwając spiralnie na zewnątrz.</li>
	<li>Delikatnie zakręć płytką, aby krawędzie żelu stykały się ze ściankami studzienki.</li>
	<li>Żele inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% środowisku CO2 przez 6 godzin lub do momentu, gdy żele staną się twarde i nie będą się przesuwać podczas przechylania płytki.</li>
	<li>Przechylić płytkę dołka i delikatnie dodać 500 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki co najmniej 1 godzinę przed poddaniem działaniu substancji. Żele należy leczyć w ciągu 48 godzin od utworzenia.</li>
</ol>
3. Produkcja elektrod
<ol>
	<li>Usuń plastikowe złącze Luer z dwóch igieł strzykawkowych ze stali nierdzewnej 304 o średnicy 1.64 mm z końcówką. Odłóż jedną igłę na bok, aby służyła jako elektroda szpilkowa. W przypadku drugiej igły spłaszcz ostatnie 5 mm jednego końca.</li>
	<li>Utwórz elektrodę pierścieniową, przecinając odcinek rurki ze stali nierdzewnej 316 o średnicy zewnętrznej 19 mm, który jest wystarczająco długi, aby przylegać do dna płyty studziennej.</li>
	<li>Zaprojektuj uchwyt elektrody, jak pokazano na rysunku 1 , za pomocą oprogramowania CAD. Upewnij się, że uchwyt ma centralny otwór na elektrodę kołkową, rowek na elektrodę oczkową oraz otwór, który przecina rowek, tak aby można było włożyć spłaszczoną igłę w celu utworzenia pasowania wtłaczanego, które utrzymuje elektrodę pierścieniową na miejscu.<ol>
		<li>Upewnij się również, że uchwyt ma wargę zaprojektowaną tak, aby ściśle pasowała do 12-dołkowej płytki i aby wyśrodkować elektrody pierścieniowe i kołkowe w studzience tak, aby elektrody i studzienka były współosiowe38.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj uchwyt elektrody z akrylu przy użyciu sprawdzonych technik cięcia laserowego40.</li>
	<li>Zamontuj elektrodę, wkładając elektrody pierścieniowe i kołkowe do uchwytu elektrody.</li>
	<li>Zabezpiecz elektrodę oczkową, wciskając igłę ze spłaszczonym końcem w uchwyt.</li>
</ol>
4. Obróbka modelu tkankowego 3D za pomocą elektroporacji
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego przechylić płytkę i odessać 400 μl pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Uważaj, aby nie dotknąć żelu. W każdej zasysanej studzience należy pozostawić 100 μl pożywki, aby utrzymać nawodnienie żelu. Jeśli do odessania jest mniej niż 400 μl płynu (pipeta nie pozostawia płynu/zasysa powietrze), dodaj 100 μl pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodaj 20 μl 5 μg/μl roztworu plazmidu GFP do tych zasysanych studzienek (dla całkowitej objętości 120 μl na studzienkę), przechylając płytkę i dodając odczynnik do płynu, który gromadzi się przy ścianie każdej studzienki. Delikatnie zamieszaj, aby upewnić się, że równomiernie rozprowadza się po powierzchni żelu.</li>
	<li>Inkubować żele w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 przez 10 minut.</li>
	<li>Włóż światłowodową sondę temperatury do elektrody kołkowej i rozpocznij odczyt temperatury.</li>
	<li>Podłącz dodatni przewód elektroporatora do elektrody sworzniowej, a przewód ujemny do igły mocującej elektrodę pierścieniową.</li>
	<li>Włącz płytę grzejną i podgrzej żele tak, aby utrzymały temperaturę 37 °C.</li>
	<li>Włóż elektrodę pierścieniowo-szpilkową ze światłowodową sondą temperatury do kołka do studni. Upewnij się, że kołek jest prostopadły do płytki i że obie elektrody całkowicie stykają się z żelem.</li>
	<li>Upewnij się, że żel ma temperaturę 37 °C.</li>
	<li>Zapewnij zabieg elektroporacji.</li>
	<li>Dodaj 100 μl pożywki do wszystkich żeli, które wydają się suche.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.7-4.10.</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich zabiegów inkubować żele w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% środowisku CO2 przez 10 minut.</li>
	<li>Przechylić płytkę dołka i delikatnie dodać 500 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki.</li>
	<li>Żele inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
5. Mycie i obrazowanie
<ol>
	<li>Przechyl płytkę i zasysaj pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Uważaj, aby nie dotknąć żelu.</li>
	<li>Przechylić płytkę i delikatnie dodać 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki.</li>
	<li>Żele inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% środowiskuCO2 przez 5 minut.</li>
	<li>Przechyl płytkę i zassaj PBS z każdej studzienki. Uważaj, aby nie dotknąć żelu.</li>
	<li>Przechylić płytkę i delikatnie dodać 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki.</li>
	<li>Delikatnie zakręć płytką, przechyl ją i zassaj PBS z każdej studzienki. Uważaj, aby nie dotknąć żelu.</li>
	<li>Dodaj 100 μl świeżego PBS, aby żele były nawodnione do obrazowania.</li>
	<li>Płytka pamięciowa przy użyciu standardowych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Powinno to dać obrazy żeli z wyraźnym zielonym obszarem w kształcie torusa, w którym odwracalne i nieodwracalne progi pola elektrycznego wiązały odpowiednio zewnętrzne i wewnętrzne krawędzie obszaru.</li>
	<li>Przechylić płytkę dołka i delikatnie dodać 500 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki.</li>
	<li>Żele inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.1–5.10 dla każdego punktu czasowego.</li>
</ol>
6. Tworzenie modeli obliczeniowych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do symulacji fizyki i utwórz nowy model osiowosymetryczny 2D, który wykorzystuje fizykę prądów elektrycznych, wymiany ciepła w ciałach stałych i ogrzewania elektromagnetycznego.</li>
	<li>Utwórz parametry napięcia, temperatury otoczenia, temperatury płyty grzejnej, wartości zadanej temperatury, szybkości dostarczania impulsów, zintegrowanej dawki elektrycznej oraz wymiarów elektrod pierścieniowych i kołkowych, żelu i płytki studziennej w układzie eksperymentalnym.</li>
	<li>Utwórz geometrie domenowe reprezentujące przekrój promieniowy elektrod pierścieniowych i kołkowych, żelu i płytki studzienkowej układu doświadczalnego, jak pokazano na rysunku 2A.</li>
	<li>Umieść punkt sondy wewnątrz elektrody środkowej w połowie wysokości żelu, aby reprezentować światłowodową sondę temperatury używaną podczas eksperymentów in vitro.</li>
	<li>Utwórz funkcję fragmentaryczną, która używa temperatury jako argumentu wejściowego.</li>
	<li>Zdefiniuj funkcję w taki sposób, aby jej wartość wynosiła 1, gdy temperatura jest mniejsza niż parametr nastawy temperatury zdefiniowany w kroku 6.2, a w przeciwnym razie 0.</li>
	<li>Zastosuj warunek brzegowy napięcia do najwyższej powierzchni geometrii domeny reprezentującej elektrodę sworzniową i ustaw wartość napięcia na parametr napięcia zdefiniowany w kroku 6.2 pomnożony przez funkcję odcinkową z kroku 6.6 obliczoną w temperaturze punktu sondy utworzonego w kroku 6.4.</li>
	<li>Zastosuj warunek brzegowy Grunt do najwyższej powierzchni geometrii domeny reprezentującej elektrodę pierścieniową.</li>
	<li>Zastosuj warunek brzegowy izolacji elektrycznej do wszystkich pozostałych granic domeny.</li>
	<li>Utwórz funkcję ciągłą, która używa temperatury.</li>
	<li>Zdefiniuj funkcję przy użyciu ustalonego modelu27 przewodności zależnej od temperatury żelu kolagenowego jako 0,8277 + 0,0323*T.</li>
	<li>Zdefiniuj materiał niestandardowy i ustaw przewodność elektryczną na funkcję ciągłą zdefiniowaną w kroku 6.11. Nałóż ten materiał na domenę żelu.</li>
	<li>Zdefiniuj materiały lub użyj domyślnych ustawień oprogramowania, jeśli są dostępne, aby przypisać materiały ze stali nierdzewnej 304 i 316 odpowiednio do domen elektrod kołkowych i pierścieniowych, a polistyren do domen płytek studzienkowych.</li>
	<li>Zastosuj warunek brzegowy Temperatura do podstawy modelu i ustaw wartość temperatury na 37 °C.</li>
	<li>Zastosuj warunek brzegowy Powierzchniowe promieniowanie otoczenia do wszystkich innych krawędzi domeny, które nie łączą się z inną domeną, i ustaw emisyjność na 0,97, 0,9 i 0,075, w zależności od tego, czy domena była częścią płytki, żelu czy elektrody,odpowiednio27.</li>
	<li>Dodaj do modelu dowolną siatkę trójkątną. Ustaw rozmiar elementu na drobniejszy.</li>
	<li>W przypadku oceniania różnych poziomów parametrów należy utworzyć zamiatanie parametryczne, które zawiera listę wszystkich wartości, dla których parametr ma być oceniany.</li>
	<li>Uruchom symulację, klikając przycisk Oblicz .</li>
	<li>Po zakończeniu utwórz wykres przekroju 2D pola elektrycznego w sekcji Wyniki.</li>
	<li>Zdefiniuj linię cięcia, która ma przechodzić od elektrody kołkowej do elektrody pierścieniowej przez środek domeny żelu. Powinno to spowodować wykładniczy zanik od krawędzi elektrody kołkowej do krawędzi elektrody pierścieniowej.</li>
	<li>Wyeksportuj dane wykresu jako plik .csv lub .xlsx, aby utworzyć tabelę przeglądową.</li>
</ol>
7. Wyprowadzenie progu
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania mikroskopu zmierz średnicę zewnętrznej i wewnętrznej krawędzi obszaru w kształcie torusa wzdłuż osi pionowej i poziomej. Jeśli oprogramowanie nie ma tej możliwości, użyj do tego ImageJ.</li>
	<li>Uśrednij odpowiednio średnicę zewnętrzną i wewnętrzną i podziel przez dwa, aby obliczyć zewnętrzny i wewnętrzny promień obszaru w kształcie torusa. Promień zewnętrzny wyznacza próg RE. Promień wewnętrzny wyznacza próg IRE.</li>
	<li>Korzystając z tabeli przeglądowej utworzonej w kroku 6.21, wyznacz natężenie pola elektrycznego w zmierzonych promieniach.</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Dzięki tej metodzie można zidentyfikować odwracalne i nieodwracalne progi elektroporacji bez konieczności badania wielu próbek przy dyskretnych napięciach. Zastosowanie niejednorodnego pola elektrycznego umożliwia kwantyfikację w oparciu o rozkład przestrzenny transfekowanych komórek w modelu. Istnieją jednak ograniczenia związane z tym niejednorodnym rozkładem. Przede wszystkim opisane tutaj progi RE i IRE są progami odpowiednio udanej transfekcji i śmierci komórki, które mogą nie być bezpośrednimi pomiarami zakresu ele...

Odwracalna elektroporacja (RE) jest dobrze ugruntowaną metodologią dostarczania do komórek 1,2,3 różnych normalnie nieprzepuszczalnych dla błony związków i cząsteczek. W tym przypadku pulsacyjne pola elektryczne (PEF) są wykorzystywane do osiągnięcia krytycznego natężenia pola elektrycznego, które indukuje przejściowe, zlokalizowane nanopory wzdłuż części błony komórkowej. RE jest używany do dostarczania różnych cząsteczek i związków, od barwników i kwasów nukleinowych po chemioterapeutyki i inne leki 4,5,6,7,8,9,10. Jeśli jednak natężenie pola elektrycznego zostanie wystarczająco zwiększone, może osiągnąć wyższy próg krytyczny, co skutkuje szybkim spadkiem żywotności ogniw 1,2,11,12. Proces ten jest znany jako nieodwracalna elektroporacja (IRE) i był badany pod kątem ablacji tkanek miękkich, w tym w leczeniu nieoperacyjnych guzów i zaburzeń rytmu serca 11,12,13,14,15,16. Aby zrozumieć wyniki leczenia i poinformować o przyszłych terapiach, kwantyfikacja tych progów RE i IRE jest powszechną praktyką w badaniach nad elektroporacją 12,17,18,19,20. Jednak progi RE i IRE różnią się w zależności od wielu czynników, w tym typu ogniwa, przyłożonego napięcia, czasu trwania impulsu, liczby impulsów i szybkości dostarczania impulsów 1,17,18,21,22.
Protokoły elektroporacji mają szereg parametrów, które skutkują różnymi progami RE i IRE 1,17,18,21,22. Optymalne napięcia i przebiegi zabiegu są od dawna badane. Większość dostępnych na rynku technologii elektroporacji wykorzystuje protokoły z monopolarnymi PEF rzędu 100 μs-10 ms23. Chociaż protokoły te osiągają klinicznie istotne wyniki, wywołują intensywne skurcze mięśni in vivo 24,25,26. Z tego powodu krótsze, bipolarne impulsy mikrosekundowe, które łagodzą tę stymulację, stały się ostatnio przedmiotem zainteresowania 1,11,24. Jednak impulsy te wprowadzają nowe czynniki, które wpływają na progi RE i IRE, w tym symetrię impulsów, czas trwania impulsu i zależność od temperatury 1,17,22,27. Ponadto wykazano również, że typ komórki i właściwości tkanek znacząco wpływają zarówno na wyniki RE, jak i IRE 19,28,29. Wraz z dalszym rozwojem tej dziedziny istnieje potrzeba dalszego scharakteryzowania, w jaki sposób te czynniki i ich interakcje ze sobą oraz inne możliwe czynniki środowiskowe wpływają na progi RE i IRE, co sprawia, że coraz bardziej konieczna jest poprawa wydajności eksperymentalnej, aby umożliwić eksperymenty o wyższej przepustowości.
Typowe eksperymenty z elektroporacją in vitro testują protokoły polegające na traktowaniu komórek w kuwecie z równoległymi płytkami przewodzącymi, co skutkuje równomiernym rozkładem pola elektrycznego w kuwecie podczas leczenia 19,30,31,32,33,34. Jak wspomniano powyżej, konieczne jest określenie progów RE i/lub IRE protokołu, aby określić optymalne zastosowane napięcie dla danego zabiegu. Aby można to osiągnąć w badaniach kuwetowych, należy poddać obróbce wiele kuwet, z których każda ma dyskretnie przyłożone napięcia. Wymaga to znacznej liczby próbek, które muszą być przygotowywane, poddawane obróbce i analizowane oddzielnie, co ogranicza przepustowość eksperymentalną. Aby usprawnić ten proces, opracowano modele hodowli 2D35,36 i 3D 13,20,27,37,38,39 w celu oceny kontinuum natężenia pola w pojedynczej próbce przy użyciu elektrod, które tworzą niejednorodne rozkłady pola 13,20,27 ,37,38,39. Progi RE i IRE są następnie wyprowadzane z modeli obliczeniowych rozkładu pola elektrycznego 13,20,27,37,38. To znacznie zmniejsza liczbę potrzebnych próbek, umożliwiając bardziej przepustowe podejście do oznaczania wartości progowej.
Niniejszy artykuł ma na celu zademonstrowanie tego podejścia do kwantyfikacji pola RE i IRE w modelu 3D in vitro , aby zademonstrować jego potencjał jako środka do efektywnej oceny protokołów elektroporacji w kilku środowiskach (np. typy komórek, parametry leczenia, cząsteczki, które mają być dostarczone).

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1000 μl</td><td>Fisher Naukowy</td><td>13-811-164</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Fisher Naukowy</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 200 μl</td><td>Fisher Naukowy</td><td>13-811-139</td><td></td></tr><tr><td>Igły z końcówką ze stali nierdzewnej 304</td><td>McMaster Carr</td><td>Zobacz materiał 75165A753 TGL</td><td></td></tr><tr><td>316 Rury ze stali nierdzewnej</td><td>McMaster Carr</td><td>Numer katalogowy: 89785K319</td><td></td></tr><tr><td>Akrylowe</td><td>McMaster Carr</td><td>Numer katalogowy: 8505K754</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Fisher Naukowy</td><td>13-261-312</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie CAD</td><td>Systemy Dassault</td><td>SolidWorks (SolidWorks)</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Nuaire powiedział:</td><td>NU-C200R</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Język hbio</td><td>45-0662</td><td>W badaniu wykorzystano specjalnie zbudowane urządzenie oraz system BTX ECM 830</td></tr><tr><td>EMEM (EMEM)</td><td>Fisher Naukowy</td><td>MT10009CV</td><td>Może się to różnić&nbsp; w przypadku korzystania z linii komórkowej innej niż HEK293</td></tr><tr><td>Falcon 12-dołkowa, przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowych z płaskim dnem i powłoką TC, z pokrywką</td><td>Corning</td><td>353043</td><td>Można użyć dowolnej płytki 12-dołkowej, należy tylko upewnić się, że wymiary studni są brane pod uwagę podczas produkcji uchwytu elektrody.</td></tr><tr><td>FBS (Sieć Usługowa</td><td>Fisher Naukowy</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowa sonda temperatury</td><td>Micronor Inc.</td><td>Zobacz materiał TS5-20MM-02</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid GFP</td><td>Aldeveron powiedział:</td><td>gWiz-GFP</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa HEK293</td><td>Kontroler ATCC (Kontroler T</td><td>CRL-1573</td><td>Można użyć innych linii komórkowych, wystarczy upewnić się, że używana jest odpowiednia pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Termoelectric Cooling America Corporation (Termoelektryczne Chłodzenie Ameryka)</td><td>AHP-301CPV</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel lodowa lub z kulkami chłodzącymi</td><td>Fisher Naukowy</td><td>10-876-001</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Księga Leica</td><td>LAS X</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Fisher Naukowy</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Księga Leica</td><td>DMi8 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Wycinarka laserowa</td><td>McMaster Carr</td><td>Zobacz materiał 7344N11 TGL</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Fisher Naukowy</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pipet</td><td>Fisher Naukowy</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie symulacyjne</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multifizyka 6.2</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Fisher Naukowy</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kolagenu bydlęcego typu I</td><td>Zaawansowana biomatryca</td><td>5005</td><td>3 mg/ml</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy, trójwymiarowy model tkankowy do ilościowego oznaczania progów elektroporacji

High-Throughput Capable Three-Dimensional Tissue Model for Quantification of Electroporation Thresholds

Elektroporacja to obiecująca technologia wykorzystująca impulsy elektryczne do dostarczania makrocząsteczek i ablacji tkanek miękkich, z zastosowaniami obejmującymi profilaktykę nowej generacji i leczenie chorób genetycznych, takich jak rak. W badaniu tym przedstawiono wysokoprzepustowy model 3D hodowli tkankowej do ilościowego określania odwracalnych i nieodwracalnych progów elektroporacji dla danego protokołu elektroporacji. Wykorzystując niejednorodne pole elektryczne i analizując rozkład przestrzenny transfekowanych komórek, w jednej próbce można zidentyfikować zarówno odwracalne, jak i nieodwracalne progi, co zwiększa efektywność, z jaką można scharakteryzować protokoły elektroporacji, zwłaszcza w przypadku translacji in vivo . Aby wykazać tę zdolność, tkanki 3D naśladujące komórki HEK293 zostały przetransfekowane za pomocą elektrody pierścieniowej i szpilkowej w celu dostarczenia plazmidu kodującego GFP. Następnie wyznaczono progi elektroporacji na podstawie obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej transfekowanych próbek. Model ten wykazuje potencjał do wykorzystania jako środek do wysokoprzepustowej oceny protokołów elektroporacji, co stanowi kluczową przewagę nad obecnymi metodami oceny tych progów, które są zwykle czasochłonne i mniej reprezentatywne dla warunków in vivo .

Elektroda pierścieniowo-igłowa skutecznie wprowadziła plazmid DNA kodujący zielone białko fluorescencyjne (GFP) do 3D kolagenowych imitacji tkanki z zatopionymi komórkami HEK293. Skuteczne ilościowe oznaczenie progu RE osiągnięto poprzez pomiar promienia zewnętrznego obszaru transfekcji i wyprowadzenie odpowiadającej mu natężenia pola z modelu obliczeniowego układu doświadczalnego, co przedstawiono na Rysunku 2. Próg IRE określono w podobny sposób, mierząc pr...

Protokół ten wykorzystuje modelowanie obliczeniowe do ilościowego określenia odwracalnych i nieodwracalnych progów elektroporacji przy użyciu przestrzennego rozkładu transfekowanych komórek w trójwymiarowym naśladownictwie tkankowym w celu wysokoprzepustowej analizy protokołów elektroporacji.

Wysokoprzepustowy, trójwymiarowy model tkankowy do ilościowego oznaczania progów elektroporacji

Electroporation is a promising technology utilizing electrical pulses for macromolecule delivery and soft-tissue ablation, with applications that include ...

Nasze badania koncentrują się na wykorzystaniu elektroporacji, a konkretnie bipolarnych impulsów mikrosekundowych, w leczeniu raka. Obecnie przyglądamy się ablacji tkanek miękkich, ale zamierzamy również przejść do transfekcji in vivo z wykorzystaniem tych impulsów. Nasz protokół umożliwia bardziej efektywne wyświetlanie nieodwracalnych i odwracalnych progów elektroporacji.Może być również nieco lepszy niż system oparty na kostkach, ponieważ pozwala nam widzieć w 3D, a nie w środowisku 2D. A środowisko 3D byłoby znacznie bardziej podobne do tego, co widzimy w tkance. W przyszłości będziemy próbować przełożyć to, co widzimy w tym modelu na in vivo, a to, co ten model naprawdę robi, to informowanie o wyborach parametrów, których zamierzamy dokonać, gdy próbujemy dostarczyć takie rzeczy, jak szczepionki DNA, chemioterapia, a także systemy takie jak CRISPR-Cas9.Aby rozpocząć, umieść zawiesinę komórek i wymagane odczynniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotowaną zawiesinę komórkową dokładnie wymieszać z roztworem kolagenu bydlęcego typu 1 w stosunku 1:1. Umieść mieszaninę na lodzie lub w zimnej kąpieli perełkowej, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.Następnie odpipetować 500 mikrolitrów połączonego roztworu, aby pokryć dno każdej studzienki 12-dołkowej płytki. Delikatnie zakręć płytką, aby upewnić się, że żel styka się ze ściankami każdej studzienki. Żele inkubować w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 6 godzin lub do momentu, gdy żele staną się twarde.Następnie przechyl płytkę dołka i delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki. Usuń plastikowe połączenie przynęty z dwóch igieł strzykawkowych ze stali nierdzewnej 304 o średnicy 1,64 milimetra. Odłóż jedną igłę na bok, aby służyła jako elektroda szpilkowa.W przypadku drugiej igły spłaszcz ostatnie 5 milimetrów jednego końca. Następnie wytnij odcinek rurki ze stali nierdzewnej 316 o średnicy 19 milimetrów wystarczająco długiej, aby przylegała równo do dna płytki studziennej, aby utworzyć elektrodę pierścieniową. Zaprojektuj uchwyt elektrody za pomocą oprogramowania CAD, aby dopasować elementy elektrody.Dopasuj elektrody pierścieniowe i szpilkowe do uchwytu elektrody, aby zmontować elektrodę i wciśnij igłę ze spłaszczonym końcem w uchwyt, aby zabezpieczyć elektrodę pierścieniową. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przechyl przygotowaną płytkę i odessaj 400 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Dodaj 20 mikrolitrów po 5 mikrogramów na mikrolitr roztworu plazmidu białka zielonej fluorescencji do zasysanych studzienek.Delikatnie obracaj płytką, aby upewnić się, że roztwór równomiernie rozprowadza się po powierzchni żelu. Inkubuj żele w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 minut. Następnie włóż światłowodową sondę temperatury do elektrody kołkowej i rozpocznij rejestrację temperatury.Podłącz dodatni przewód elektroporatora do elektrody sworzniowej, a przewód ujemny do igły, zabezpieczając elektrodę pierścieniową. Teraz włącz płytę grzejną i podgrzej żele, aby utrzymać temperaturę 37 stopni Celsjusza. Następnie włóż zmontowany pierścień i elektrodę kołkową z sondą temperatury do studzienki i upewnij się, że żel osiągnął temperaturę 37 stopni Celsjusza.Aktywuj elektroporator, aby dostarczyć zabieg. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej do wszystkich żeli, które wydają się suche i kontynuuj elektryzowanie nieleczonych żeli. Po zakończeniu wszystkich zabiegów inkubuj żele w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 minut.Po inkubacji delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdej studzienki wzdłuż ścianki płytki. Ponownie inkubować żele w nawilżanym inkubatorze przez 24 godziny. Przechylić płytkę i zassać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki.Następnie delikatnie dodaj 500 mikrolitrów PBS do każdego dołka wzdłuż ścianek płytki. Inkubuj żele w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 5 minut. Następnie odessaj PBS z każdej studzienki.Delikatnie dodaj 500 mikrolitrów PBS do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki. Delikatnie zakręć płytką, a następnie przechyl ją i zassaj PBS z każdej studzienki. Teraz dodaj 100 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki, aby żele były nawodnione do obrazowania.Następnie zobrazuj płytkę przy użyciu standardowych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Po zobrazowaniu dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdego dołka płytki i inkubuj przez 24 godziny. Powtórz pełny proces obrazowania i odzyskiwania dla każdego wyznaczonego punktu czasowego.Po utworzeniu modelu obliczeniowego użyj oprogramowania mikroskopowego, aby zmierzyć średnicę zarówno zewnętrznej, jak i wewnętrznej krawędzi obszaru w kształcie torusa wzdłuż osi pionowej i poziomej. Uśrednij odpowiednio średnicę zewnętrzną i wewnętrzną i podziel przez 2, aby obliczyć odpowiednie promienie. Na koniec, korzystając z utworzonej wcześniej tabeli przeglądowej, wyprowadź natężenie pola elektrycznego na zmierzonych promieniach.Zewnętrzny promień transfekowanego obszaru wykorzystano do ilościowego określenia odwracalnego progu elektroporacji lub RE poprzez skorelowanie go z natężeniami pola elektrycznego z modelu obliczeniowego. Natomiast promień wewnętrzny został wykorzystany do wyznaczenia nieodwracalnej elektroporacji lub progu IRE. Wszystkie trzy dwubiegunowe protokoły impulsów mikrosekundowych skutkowały obszarami transfekcji w kształcie torusa z wyraźnie widocznymi granicami RE i IRE.Spośród badanych przebiegów, przebieg zbalansowany 2-1-1 burst wygenerował najwyższy próg IRE, podczas gdy przebieg niezbalansowany 2-1-1 wykazał się najniższym. Standardowy protokół monopolarnej elektroporacji wykorzystujący 420 woltów spowodował powstanie kołowego obszaru transfekcji z progiem RE wynoszącym 642 wolty na centymetr, ale nie spowodował śmierci komórki, uniemożliwiając określenie progu IRE. Deformacja tkanki w czasie spowodowana degradacją żelu spowodowała, że transfekowane obszary straciły swój okrągły kształt, co utrudniło dokładną kwantyfikację RE i IRE.Niewspółosiowość elektrod pierścieniowych i kołkowych z dnem studni powodowała również asymetryczne, niekołowe wzory transfekcji, co komplikowało pomiar progowy.

high-throughput-capable-three-dimensional-tissue-model-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Platforma elektroporacji wspomagana wirami mikroprzepływowymi została opracowana do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do identycznych populacji komórek z precyzyjną i niezależną kontrolą dawkowania. Etap oczyszczania komórek docelowych w oparciu o rozmiar, poprzedzający elektroporację, przyczynił się do zwiększenia wydajności dostarczania molekularnego i żywotności komórek przetworzonych.

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Elektroporacja to użycie impulsowych pól elektrycznych (PEF) do tworzenia przejściowych porów w hodowlach komórkowych w celu wprowadzenia ładunku molekularnego. Technika ta stała się ostatnio szeroko stosowana w warunkach badawczych i klinicznych. W tym miejscu opisujemy techniki elektroporacji z wykorzystaniem niedawno opracowanego "systemu cytometrii elektroporacyjnej" do wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej na żywych komórkach.

Protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej U2 OS

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Ten protokół opisuje kompletny, możliwy do powtórzenia przepływ pracy do symulacji pola elektrycznego specyficznego dla pacjenta i walidacji elektrochemioterapii (ECT) w przypadku przerzutów do kręgosłupa. Przepływ pracy integruje wielomodalne obrazowanie, półautomatyczną i ręczną segmentację, modelowanie przewodności tkankowej, symulację pola elektrycznego liniowego elementu skończonego i walidację eksperymentalną poprzez analizę nakładania martwicy opartą na MRI po zabiegu.

Symulacja pola elektrycznego specyficzna dla pacjenta w elektrochemioterapii przerzutów do rdzenia kręgowego

Poznaj modelowanie obliczeniowe progowe elektroporacji w trójwymiarowych mimetykach tkankowych. Ta metoda umożliwia ilościowe oznaczanie progów odwracalnej i nieodwracalnej elektroporacji dla optymalizacji protokołów transfekcji.

Wysokoprzepustowy, trójwymiarowy model tkankowy do ilościowego oznaczania progów elektroporacji

Przeglądaj więcej filmów