Name: Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę monitorowania zmian w generowaniu potencjału czynnościowego wywołanych elektroporacją w genetycznie modyfikowanych komórkach HEK Tet-On Spiking. Protokół umożliwia optyczną analizę dynamiki potencjałów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Słoweńską Agencję Badań i Innowacji (ARIS) w ramach programu badawczego P2-0249, programu infrastrukturalnego I0-0022 oraz projektu badawczego J2-2503. Prace były częściowo wspierane przez ARIS i Uniwersytet w Lublanie poprzez finansowanie programów badawczych dla start-upów. Prace były częściowo wspierane przez Unię Europejską i ARIS poprzez finansowanie NextGenerationEU i NOO w ramach projektu MN-0023. Prace były częściowo wspierane przez Unię Europejską w ramach ERC Starting Grant (nr 101115323 - REINCARNATION) oraz stypendium Marie Skłodowska-Curie (nr 893077 - EPmIC). Wyrażone poglądy i opinie są jednak wyłącznie poglądami i opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy i opinie Unii Europejskiej lub Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych. Ani Unia Europejska, ani organ przyznający pomoc nie mogą być za nie pociągnięte do odpowiedzialności. Autorzy dziękują grupie Adama E. Cohena z Uniwersytetu Harvarda za uprzejme dostarczenie komórek HEK z wybijanymi tet-onami oraz Dušy Hodžić za pomoc w laboratorium hodowli komórkowych.

1. Przygotowanie odczynników i hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych, uzupełniając Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM glutaminy, penicyliną-streptomycyną (penicylina 100 U/ml, streptomycyna 100 μg/ml), 2 μg/ml puromycyny, 5 μg/ml blasticydyny i 200 μg/ml genetycyny.</li>
	<li>Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) o stężeniu 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4 o pH 7,4. Przefiltruj go przez sterylizujący filtr membranowy o wielkości porów 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotuj roztwór Tyrode z 2 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 30 mM glukozy, pH 7,3. Przygotować roztwór Tyrode o niskiej zawartości potasu z 0,5 mM KCl, 126,5 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 30 mM glukozy, pH 7,3. Przefiltruj oba roztwory przez sterylizujący filtr membranowy o wielkości porów 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować 1 mg/ml roztwór podstawowy poli-L-lizyny, dodając 5 ml PBS do fiolki zawierającej 5 mg poli-L-lizyny.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny o stężeniu 2 mg/ml w wodzie destylowanej i przefiltrować przez sterylizujący filtr membranowy o wielkości porów 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować 4 mM potencjometryczny roztwór podstawowy barwnika ElectroFluor630 w czystym etanolu (dodać 25 μl czystego etanolu do probówki zawierającej 100 nM - 73 μg barwnika).</li>
	<li>Hodowla genetycznie zmodyfikowanych komórek HEK w kolbie T25 w 6 ml pożywki do hodowli komórek, jak wcześniej opisano8. Składniki pożywki hodowlanej są wrażliwe na światło; W ten sposób należy chronić podłoże przed światłem (owinąć pożywkę w folię aluminiową) i wykonywać pasażowanie w warunkach słabego oświetlenia.</li>
	<li>Komórki należy przepuszczać co 3-4 dni, wysiewając 3 x 105 lub 5 x 105 komórek do świeżej kolby T25. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Utrzymuj komórki w kolbie głównej jako niepobudliwe komórki NS-HEK bez dodatku doksycykliny, ponieważ nie tolerują one trwałej ekspresji Kir2,1. W eksperymentach używaj komórek z pasaży niższych niż 14.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Powłoka poli-L-lizynowa szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Odpipetować 1 ml PBS do jednego dołka z 2-dołkowymi szkiełkami przykrywkowymi, dodać 10 μl sterylnego roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 1 mg/ml i dobrze wymieszać pipetą.</li>
		<li>Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Usunąć PBS z poli-L-lizyną bez dalszego mycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny w stosunku 1:10 w pożywce hodowlanej w probówce o pojemności 1,5 ml. Na każdą studzienkę potrzeba 30 μl rozcieńczenia doksycykliny w stosunku 1:10 (3 μl roztworu podstawowego doksycykliny i 27 μl pożywki hodowlanej), należy przygotować końcową objętość w zależności od całkowitej liczby studzienek doświadczalnych.</li>
		<li>Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby T25 i trypsynizować komórki 2,5 ml roztworu trypsyny-EDTA w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 2,5 ml świeżej pożywki hodowlanej i delikatnym pipetowaniem oderwać komórki od powierzchni. Dobrze wymieszać zawiesinę komórkową.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ gęstość komórek w zawiesinie.</li>
		<li>Obliczyć objętość zawiesiny komórek trypsynizowanych potrzebna do założenia hodowli. W przypadku hodowli 2-dniowej wysiewaj 2,5 x 105 komórek, a w przypadku hodowli 3-dniowej wysiewaj 1 x 105 komórek na studzienkę. W razie potrzeby dostosuj dokładną liczbę komórek.</li>
		<li>Obliczyć objętość pożywki hodowlanej, odejmując poprzednio obliczoną objętość zawiesiny komórek od 1470 μl. Pozostałe 30 μl odpowiada objętości rozcieńczenia doksycykliny w stosunku 1:10. Całkowita objętość w każdym dołku wyniesie 1500 μl (komórki, doksycyklina i pożywka hodowlana).</li>
		<li>W celu przygotowania próbek z pobudliwymi komórkami S-HEK należy odpipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej i zawiesiny komórek trypsynizowanych do jednego dołka i dodać 30 μl doksycykliny w stosunku 1:10. Używaj tylko jednego dołka z komór dwudołkowych, ponieważ eksperyment trwa długo (około 40 minut). Dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie tuż przed umieszczeniem komór w inkubatorze CO2 .</li>
		<li>W celu przygotowania próbek z niepobudliwymi komórkami NS-HEK należy odpipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej do studzienki i dodać 90% obliczonej objętości zawiesiny komórek dla komórek S-HEK bez doksycykliny. Komórki NS-HEK rosną nieco szybciej niż komórki S-HEK.</li>
		<li>Inkubować komory w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 2-3 dni przed eksperymentem. W przypadku próbek z doksycykliną ten czas inkubacji jest wystarczający, aby komórki stały się pobudliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie komórek
	<ol>
		<li>Przed eksperymentem odpipetować 3 μl potencjometrycznego roztworu podstawowego barwnika do probówki o pojemności 1,5 ml i pozostawić otwartą probówkę w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym, aby etanol odparował, a barwnik potencjometryczny wyschł (około 15 min). Dodać 997 μl zimnej pożywki hodowlanej (z lodówki w temperaturze 4 °C) do probówki i rozpuścić barwnik do końcowego stężenia 12 μM.</li>
		<li>Usuń pożywkę hodowlaną z dołka i dodaj 1 ml potencjometrycznego roztworu barwnika do komórek. Wstaw je do lodówki w temperaturze 4 °C i inkubuj przez 20 minut.</li>
		<li>Usuń potencjometryczny roztwór barwnika i zachowaj go w probówce do dalszego ponownego użycia (do sześciu sekwencyjnych eksperymentów w ciągu 1 dnia).</li>
		<li>Delikatnie przemyj komórki 3x roztworem Tyrode, a po ostatnim płukaniu odpipetuj 1 ml roztworu Tyrode o niskiej zawartości potasu do studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Elektrostymulacja i elektroporacja
<ol>
	<li>Skonfiguruj synchronizację dostarczania impulsów z akwizycją obrazu za pomocą sygnału TTL z systemu mikroskopowego, który wyzwala generator impulsów. Do generowania impulsów wysokiego napięcia należy użyć niestandardowego generatora impulsów11 lub dowolnego generatora impulsów, który może być wyzwalany zewnętrznie za pomocą sygnału TTL. 
	UWAGA: W prezentowanej konfiguracji eksperymentalnej do akwizycji obrazu wykorzystywane jest oprogramowanie LAS X, które można skonfigurować tak, aby wysyłało sygnał TTL o wybranej godzinie podczas akwizycji poklatkowej.</li>
	<li>Umieść dwie równoległe elektrody drutowe Pt/Ir o średnicy 0,8 mm i odległości między krawędziami wewnętrznymi 5 mm na dnie komory i zamocuj komorę pod mikroskopem.</li>
	<li>Podłącz elektrody do generatora impulsów. Podłącz wyjście generatora impulsów do oscyloskopu za pomocą sondy napięciowej i prądowej, aby umożliwić weryfikację, czy impulsy zostały prawidłowo dostarczone podczas eksperymentu.</li>
	<li>Ustaw ostrość komórek w jasnym polu. Wyobraź sobie ogniwa, które znajdują się mniej więcej pośrodku między elektrodami.</li>
	<li>Rozpocznij pierwszą akwizycję obrazów fluorescencyjnych w trybie poklatkowym z obiektywem 40x, rejestrując sygnał fluorescencji w całym polu widzenia. Kamera powinna być na tyle szybka, aby uzyskać wyraźny przebieg czasowy potencjału czynnościowego (najlepiej wyższego niż 25 klatek/s).
	<ol>
		<li>Zdobądź 80 obrazów w trybie poklatkowym, z co najmniej 25 klatkami na sekundę, aby określić przebieg potencjału czynnościowego w czasie rzeczywistym. Całkowity czas akwizycji obrazu wynosi około 3 s. Podczas akwizycji obrazu należy oświetlić ogniwa falą wzbudzenia o długości fali 635 nm, czasie ekspozycji 10 ms i wykryć emisję przy około 700 nm. W tej pierwszej akwizycji nie należy stosować żadnego impulsu - ta akwizycja zostanie wykorzystana do skorygowania kolejnych akwizycji w celu fotowybielania barwnikiem. Po tym przejęciu poczekaj 2 min. 
		UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystuje się 27,8 klatek/s, czyli okres 36 ms, czyli czas od początku pierwszej akwizycji obrazu do początku następnej akwizycji obrazu w nagraniu poklatkowym).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Co 2 minuty nagrywaj film poklatkowy w taki sam sposób, jak w kroku 3.5. W przypadku tych akwizycji należy zastosować pojedynczy impuls 100 μs w momencie uzyskania 10. obrazu (przy 324 ms). Uzyskaj obrazy z następującymi napięciami impulsów: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V i 200 V. Oszacuj pole elektryczne, na które narażone są ogniwa, jako stosunek przyłożonego napięcia do odległości elektrody (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 i 400 V/cm). 
	UWAGA: Przy niższych polach elektrycznych impulsy wyzwalają potencjały czynnościowe; Przy wyższych polach elektrycznych wyzwalają elektroporację, która objawia się przedłużoną depolaryzacją. Czas trwania eksperymentu na każdej próbce komórek wynosi około 40 minut (20 minut w przypadku znakowania i 20 minut w przypadku mikroskopii).</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksportuj nagrania poklatkowe do formatu tiff.</li>
	<li>Umieść nagrania poklatkowe wszystkich zastosowanych napięć podczas pojedynczego eksperymentu (jednej próbki komórek) w jednym folderze. Zmień nazwy nagrań poklatkowych w takiej formie, aby pole elektryczne E mogło być rozpoznawane przez aplikację MATLAB: Vcm (np. 126Vcm na 126 V/cm). Pozostałe części nazwy mogą być dowolne. W przypadku akwizycji na początku eksperymentu, w której nie stosuje się impulsu, zmień nazwę, używając frazy 000Vcm. Przykładowe nazwy nagrań poklatkowych: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm itp.</li>
	<li>Otwórz aplikację, którą można pobrać ze strony 
	https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Kliknij Wybierz folder danych, aby wybrać folder zawierający nagrania poklatkowe z jednego eksperymentu.</li>
	<li>Wybierz piksele, które mają być używane do dalszej analizy danych. W tym celu należy za pomocą dwóch suwaków określić dolny próg dla wyraźnego obrazu membran (w kolorze fioletowym) oraz wysoki próg dla eliminacji zanieczyszczeń (duże plamy o wysokiej fluorescencji) z analizy (w kolorze zielonym).</li>
	<li>Wybierz pozycję Analizuj dane. Na karcie Analiza pojawi się tabela z wyodrębnionymi parametrami. Po prawej stronie tabeli pojawiają się wykresy względnej fluorescencji w czasie dla każdego użytego E. Wybierz wykresy dla danego E z rozwijanego menu po lewej stronie nad tabelą.</li>
	<li>Sprawdź wszystkie wykresy i wykonaj ręczną korektę w przypadku wykrycia fałszywego szczytu. Wybierz opcję Wyczyść szczyty AUTO u dołu karty Analiza, a szczyty, które zostały wykryte automatycznie, zostaną wyczyszczone. Kliknij wykres, aby ręcznie określić nowy punkt czasowy szczytu.</li>
	<li>Wybierz opcję Uruchom ponownie automatyczne wykrywanie wartości szczytowej u dołu karty Analiza, aby ponownie przeprowadzić automatyczne wykrywanie szczytu. Wyodrębnione parametry zostaną teraz dostosowane do nowego piku.</li>
	<li>Wybierz opcję Eksportuj dane w prawym dolnym rogu karty Analiza, aby wyeksportować dane do tego samego folderu w postaci pliku .mat, pliku arkusza kalkulacyjnego i obrazów PNG dla każdego użytego E.</li>
</ol>

Evaluating Electroporation Effects on Genetically Engineered Spiking HEK Cells

<ol><li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+Mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models.</a> Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Kotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based applications in biotechnology.</a> Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).</li>
<li>Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+food+processing+and+biorefinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Memb+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation in food processing and biorefinery.</a> J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+or+conventional+thermal+ablation+for+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).</li>
<li>Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contractions+and+pain+sensation+accompanying+high-frequency+electroporation+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses.</a> Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).</li>
<li>Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+strong+electrical+shock+on+cardiac+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue.</a> Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).</li>
<li>Batista Napotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+HEK+cells+as+a+valuable+tool+for+studying+electroporation+in+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells.</a> Sci Rep. 14 (1), 720(2024).</li>
<li>McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+controlled+oscillators+in+an+engineered+bioelectric+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+X%22%5BJournal%5D)">Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue.</a> Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-based+pooled+screening+yields+improved+far-red+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators.</a> Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).</li>
<li>Sweeney, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+membrane+permeability+induced+by+monopolar+and+high-frequency+bipolar+bursts+of+electrical+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses.</a> Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).</li>
<li>Pakhomov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+plasma+membrane+permeabilization+in+mammalian+cells+by+nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF).</a> Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+ratiometric+optical+mapping+enables+high-resolution+cardiac+electrophysiology+in+pig+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models.</a> Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Komórki S-HEK to prosty model komórek pobudliwych z dobrze zdefiniowanymi kanałami sodowymi i potasowymi, NaV1,5 i Kir2,19. Dzięki temu możemy przeprowadzić dogłębne badania nad tym, jak pobudliwe komórki reagują na zastosowane impulsy elektryczne i połączyć dane eksperymentalne z modelami matematycznymi opartymi na dobrze znanych teoretycznych charakterystykach kanałów ulegających ekspresji w komórkach S-HEK. W naszym poprzednim badaniu8 opisaliśmy odpowiedzi tych komórek na impulsy 100 μs o rosnącym E zarówno eksperymentalnie, jak i teoretycznie. Przy niższym E komórki S-HEK reagują pojedynczym lub wielokrotnym potencjałem czynnościowym, podczas gdy przy wyższym E AP wydłużają się i przekształcają w trwałą depolaryzację. Ponieważ utrzymująca się depolaryzacja jest wyraźnie widoczna również w niepobudliwej wersji tych ogniw (NS-HEK), przypisuje się ją elektroporacji i związanemu z nią wzrostowi nieselektywnego prądu jonowego.
Zastosowanie fluorescencyjnego barwnika potencjometrycznego okazało się bardzo skutecznym sposobem badania AP i elektroporacji w komórkach pobudliwych. W porównaniu z klasycznymi metodami elektrofizjologicznymi, takimi jak patch clamp, pomiary optyczne są znacznie wygodniejsze, oszczędzają czas i nie wymagają specjalnych umiejętności technicznych. Co więcej, zastosowanie impulsów elektrycznych o wysokim napięciu nie zakłóca pomiarów, co może stać się problemem w pomiarach zacisków krosowych12. Jednak główne wady tego protokołu są związane z charakterem barwnika. Ze względu na fotowybielanie, przechwycony sygnał fluorescencyjny wymaga korekcji. Barwnik spontanicznie dyfunduje do komórki, więc sygnał z błon zmniejsza się z czasem. Z tego powodu barwnik nadaje się do monitorowania potencjałów czynnościowych i innych krótkoterminowych zmian w TMV (~3 s w tych eksperymentach). Ponieważ barwnik umożliwia obrazowanie ratiometryczne13, takie obrazowanie może pozwolić uniknąć pewnych problemów z dyfuzją barwnika, ale kosztem niższej osiągalnej prędkości obrazowania. W tej eksperymentalnej konfiguracji obrazowanie ratiometryczne byłoby zbyt wolne, aby prawidłowo uchwycić kształt potencjałów czynnościowych. Ponadto zmierzone zmiany we fluorescencji barwnika dostarczają jakościowych informacji na temat zmiany TMV; Niemniej jednak barwnik można skalibrować, aby umożliwić pomiary ilościowe.
Zautomatyzowana analiza obrazu za pomocą niestandardowej aplikacji MATLAB umożliwia nam analizę dużej ilości danych i sprawne wyodrębnienie cennych cech odpowiedzi TMV w krótkim czasie. Aplikacja jest skonfigurowana do przechwytywania sygnału fluorescencji z błon wszystkich komórek w polu widzenia. Poprawia to stosunek sygnału do szumu, ale kosztem utraty informacji o tym, jak TMV zmienia się na poziomie poszczególnych komórek. W danej konfiguracji eksperymentalnej sygnał z poszczególnych komórek był zbyt zaszumiony, aby umożliwić użyteczne pomiary. Co więcej, błony sąsiednich komórek były trudne do odróżnienia. Niemniej jednak komórki HEK endogennie wyrażają połączenia szczelinowe, przez które są elektrycznie połączone. Modelowanie matematyczne, przedstawione w poprzednim badaniu8 wykazało, że ze względu na swoje połączenia elektryczne, komórki w polu widzenia są wystarczająco blisko, aby jednocześnie wywołać AP. Co więcej, AP rozchodzi się wzdłuż monowarstwy ogniwa z dużą prędkością (około 34 mm/s, oszacowaną na podstawie obrazowania przy 5-krotnym powiększeniu obiektywu)8,9. Biorąc pod uwagę boczną długość pola widzenia (~0,33 mm), AP pokonałby tę długość w około 10 ms, czyli krócej niż nasz okres pozyskiwania obrazu. W związku z tym efekt propagacji AP nie jest widoczny przy takim powiększeniu i prędkości nagrywania. Niemniej jednak propagacja AP od elektrod do pola widzenia może spowodować opóźnienie między przyłożonym impulsem a przechwyconym AP8.
W poprzednim badaniu8, jak również w niniejszej publikacji, opisano wpływ impulsów o czasie trwania 100 μs na wzajemne oddziaływanie między pobudliwością a elektroporacją. Protokół ten można jednak dostosować do badania impulsów elektrycznych o innych parametrach (o różnym czasie trwania, natężeniu, liczbie, częstotliwości powtarzania lub kształcie) lub innych pobudliwych komórek.

Podczas elektroporacji, impulsy elektryczne o wysokim napięciu powodują wzrost przepuszczalności błony plazmatycznej dla cząsteczek, które w innym przypadku są słabo przepuszczalne1. Techniki oparte na elektroporacji są obecnie szeroko stosowane w medycynie2, biotechnology3 i technologii żywności4.
Pobudzające komórki, takie jak komórki neuronalne i mięśniowe, są jednymi z głównych celów szybko pojawiających się terapii opartych na elektroporacji w sercu, mózgu i mięśniach szkieletowych5. Co więcej, mogą być one narażone na działanie impulsów elektrycznych nawet w terapiach, w których nie są głównymi celami, co może powodować niepożądane skutki uboczne, takie jak ból, drganie mięśni i uszkodzenie nerwów6. Mianowicie, impulsy elektryczne mogą powodować stymulację elektryczną komórek pobudliwych: aktywują kanały jonowe bramkowane napięciem i wyzwalają potencjały czynnościowe (AP). Jednak przy wyższych polach elektrycznych błona plazmatyczna komórek staje się przepuszczalna i pojawia się dodatkowy prąd jonowy przez pory/defekty7. Ten dodatkowy prąd jonowy wpływa na pobudliwość komórek w złożonej interakcji między wzbudzeniem a elektroporacją. Dlatego, aby zoptymalizować leczenie tkanek pobudliwych i niepobudliwych oparte na elektroporacji, istnieje potrzeba zbadania wpływu impulsów elektrycznych na pobudliwe komórki, ich kanały jonowe i pobudliwość in vitro.
W niedawnym badaniu8, zbadaliśmy genetycznie modyfikowane ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK) opracowane przez Cohen et al.9,10, jako cenne narzędzie do badania elektroporacji w komórkach pobudliwych. W tych skądinąd niepobudliwych komórkach wyraża się minimalny zestaw kanałów sodowych i potasowych (NaV1,5 i Kir2,1) potrzebnych do pobudliwości. Ekspresja Kir2,1 w tych komórkach jest kontrolowana przez indukowany doksycykliną system tet-on, który umożliwia ustanowienie dwóch wariantów komórek: pobudliwego impulsowego S-HEK (zawierającego NaV1,5 i Kir2,1) i niepobudliwych niewybijających komórek NS-HEK (zawierających tylko kanały NaV1,5). Pozwala nam to porównać wpływ impulsów elektrycznych na pobudliwe i niepobudliwe warianty tego samego typu komórek. W porównaniu z izolowanymi pierwotnymi komórkami pobudliwymi, komórkami pobudliwymi zróżnicowanymi z embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz liniami komórkowymi pochodzącymi z tkanek pobudliwych, komórki S-HEK mają kilka zalet: są łatwe w obsłudze, hodowli i rozmnażaniu, mają dobrze zdefiniowane kanały sodowe i potasowe oraz generują solidne APs8.
Zaprojektowaliśmy protokół monitorowania zmian napięcia transmembranowego (TMV) wywołanych impulsami elektrycznymi o różnych amplitudach za pomocą fluorescencyjnego barwnika potencjometrycznego. W ten sposób możemy zbadać, jak elektroporacja wpływa na wytwarzanie AP w ogniwach S-HEK i inne zmiany w TMV zarówno w ogniwach S-HEK, jak i NS-HEK. Krótko mówiąc, ogniwa S-HEK lub NS-HEK są wystawione na pojedynczy impuls elektryczny o wartości 100 μs co 2 minuty, a względne zmiany fluorescencji są rejestrowane przez około 3 sekundy wokół każdej aplikacji impulsu. Stosowane impulsy mają rosnące napięcie, najpierw wyzwalając AP w komórkach, a przy wyższym polu elektrycznym elektroporację. 2-minutowy odstęp między aplikacjami impulsów został wybrany, aby zminimalizować możliwe skumulowane efekty kolejnych impulsów, jednocześnie utrzymując eksperymenty wystarczająco krótkie, aby nie pogorszyć stanu komórek. Przetwarzanie obrazu zostało zautomatyzowane za pomocą niestandardowej aplikacji MATLAB w celu wyodrębnienia odpowiednich parametrów odpowiedzi fluorescencyjnych barwnika potencjometrycznego, a tym samym oceny zmian w TMV (AP i trwałej depolaryzacji spowodowanej elektroporacją) w komórkach S-HEK i NS-HEK.

<table><tbody><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>Ratiolab&nbsp;</td><td>5615000</td><td></td></tr><tr><td>2-dołkowy Nunc Lab-Tek II komorowy #1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowego</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>155379</tr><tr><td>ADP305 Sonda różnicowa napięcia</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AP015 Sonda prądowa</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113903</tr><tr><td>inkubator CO2&nbsp;</td><td>PHCbi&nbsp;</td><td>MCO -230AICUV</td><td></td></tr><tr><td>Doksycyklina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł" s Pożywka o średnim wzroście glukozy</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D5671</td><td></td></tr> <tr><td>Sondy potencjometryczne</td><td>ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)</td> <td>31795</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich/Merck</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10131035</tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Iskra Pio&nbsp;</td><td>MC 15-2</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P07681</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P9155-5MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Generator impulsów&nbsp;</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>patrz odniesienie11</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113803</tr><tr><td>T25 25cm&sup2; Kolba do hodowli tkankowych</td><td>TPP&nbsp;</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa HEK z tet-on</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC</td><td>CRL-3479</td><td></td></tr><tr><td>System Live Cell Thunder Imager do mikroskopii fluorescencyjnej</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyna-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>WavePro 7300A Oscyloskop</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach hek tet-on spiking

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Pobudzające komórki, takie jak komórki neuronalne i mięśniowe, mogą być głównymi celami w szybko rozwijających się terapiach opartych na elektroporacji. Jednak impulsy elektryczne mogą na nie wpływać nawet w terapiach, w których nie są głównymi celami, a to może powodować niepożądane skutki uboczne. Dlatego, aby zoptymalizować leczenie tkanek pobudliwych i niepobudliwych oparte na elektroporacji, istnieje potrzeba zbadania wpływu impulsów elektrycznych na pobudliwe komórki, ich kanały jonowe i pobudliwość in vitro. W tym celu opracowano protokół optycznego monitorowania zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w wyniku elektroporacji na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie zmodyfikowanych komórek HEK z tet-onem. Za pomocą fluorescencyjnego barwnika potencjometrycznego monitorowano zmiany napięcia transbłonowego pod mikroskopem fluorescencyjnym, a odpowiednie parametry odpowiedzi komórek ekstrahowano automatycznie za pomocą aplikacji MATLAB. W ten sposób można skutecznie ocenić pobudliwe reakcje komórek na różne impulsy elektryczne oraz wzajemne oddziaływanie między wzbudzeniem a elektroporacją.

Zmiany TMV w pobudliwych komórkach in vitro wywołane impulsami elektrycznymi mogą być monitorowane optycznie za pomocą tego protokołu, a sygnały fluorescencyjne mogą zostać poddane analizie w celu wyznaczenia istotnych parametrów.
Układ eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1A. Typowy sygnał impulsu elektrycznego o czasie trwania 100 µs stosowanego w eksperymentach pokazano na Rysunku 1B. Komórki w komorach umieszczonych pod mikroskopem zazwyczaj wyglądają jak komórki na Rysunku 1C (obraz w polu jasnym) oraz Rysunku 1D (obraz fluorescencyjny). Przeprowadzamy eksperyment, w którym co 2 min do tych samych komórek przykłada się impuls elektryczny o zwiększającym się napięciu. Należy zauważyć, że 2-minutowy odstęp między impulsami może nie być wystarczająco długi, aby umożliwić pełne zasklepienie i regenerację błon komórkowych, szczególnie w przypadku stosowania impulsów o najwyższej amplitudzie, które wiążą się z intensywną elektroporacją. W związku z tym można spodziewać się pewnych efektów kumulatywnych impulsów. Aby uniknąć tych efektów kumulatywnych, można wydłużyć opóźnienie między impulsami, jednak odbywa się to kosztem zmniejszenia liczby testowanych amplitud impulsów oraz konieczności uniknięcia zbyt długiego przebywania komórek pod mikroskopem.
Po zarejestrowaniu obrazów fluorescencyjnych w eksperymentach należy przeanalizować je za pomocą dedykowanej aplikacji MATLAB. Najpierw należy wyznaczyć progi pikseli (Rysunek 2A); poprzez dostosowanie progu dolnego otrzymujemy wyraźny obraz błon wokół komórek (na fioletowo), a poprzez dostosowanie progu górnego usuwamy sygnał z zanieczyszczeń (na zielono). Następnie aplikacja wyznacza średnią intensywność fluorescencji wszystkich pikseli powyżej progu dla każdego dostarczonego kolejnego impulsu, aby uzyskać zależny od czasu sygnał względnej zmiany fluorescencji F/F0. Sygnał ten jest korygowany o fotobleaching barwnika poprzez odjęcie nachylenia liniowego spadku F, wyznaczonego z kontrolnego zapisu time-lapse, w którym nie zastosowano impulsu (Rysunek 2B). Po skorygowaniu sygnału parametry odpowiedzi są ekstrahowane w formie tabeli w aplikacji oraz wykresu skorygowanego sygnału fluorescencji (Rysunek 2C). W rzadkich przypadkach algorytm nie wykrywa oczywistego piku lub wykrywa fałszywe sygnały szumowe jako wyniki fałszywie dodatnie. W takich sytuacjach użytkownik ma możliwość ręcznego wybrania odpowiedniego punktu w sygnale fluorescencji jako piku lub usunięcia wykrytego błędnego piku (Rysunek 2D – usunięcie małego piku, który został anomalnie wykryty przed zastosowaniem impulsu elektrycznego).
Dzięki zastosowaniu aplikacji MATLAB możemy uzyskać obrazy odpowiedzi TMV na impulsy elektryczne w obu przypadkach: w pobudliwych S-HEK (Rysunek 3A) oraz niepobudliwe komórki NS-HEK (Rysunek 3B). Wyekstrahowano następujące parametry odpowiedzi (Tabela 1): liczba pików (NoPeaks), średni czas od piku do piku (w przypadku wykrycia więcej niż jednego piku, MPPT), maksymalna odpowiedź (MR), czas do pierwszego piku (TtFP) oraz czas od piku do 25%, 50%, 75% i 90% powrotu (odpowiednio T25, T50, T75, T90). Parametry te umożliwiają ocenę odpowiedzi na różne impulsy elektryczne (np. określenie liczby pików wywołanych impulsami elektrycznymi o różnym E, Rycina 3C) oraz współzależność między pobudzeniem a elektroporacją.
<img alt="Układ mikroskopowy, wykres napięcia, obraz komórek i schemat fluorescencyjny komórek dla badania stymulacji elektrycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ, przebieg impulsu i komórki S-HEK. (A) Obraz komory na stole mikroskopu. (B) Przykład przebiegu impulsu zastosowanego w badaniu (napięcie (U) w funkcji czasu). (C, D) Obraz komórek S-HEK ((C): pole jasne, (D): fluorescencja), pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiekszoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza sygnału fluorescencji; mikroskopia, wykres zmiany fluorescencji; korekta danych; narzędzie badawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zastosowanie analizy danych. (A) Obraz interfejsu aplikacji – progowanie. (B) Wykres surowego i skorygowanego sygnału zmiany fluorescencji. (C) Obraz interfejsu aplikacji – wyekstrahowane dane. (D) Ręczna korekta detekcji piku (usunięcie małego piku, który został anomalnie wykryty przed przyłożeniem impulsu elektrycznego, zaznaczone czerwoną strzałką). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy zmian fluorescencji pokazujące wpływ napięcia; grafy czasowe, piki napięcia; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki. (A, B) Wywoływanie zmian w TMV w (A) pobudliwych S-HEK i (B) niepobudliwych NS-HEK za pomocą impulsów elektrycznych o czasie trwania 100 µs i różnych amplitud; wyniki z reprezentatywnych eksperymentów. Dla przejrzystości przedstawiono jedynie odpowiedzi na wybrane impulsy z zastosowanej sekwencji impulsów. (C) Parametry odpowiedzi TMV wywołane impulsami 100 µs o różnych amplitudach: przykład przedstawia liczbę pików. Wyniki wyrażone jako średnia ± SE, liczba eksperymentów: N = 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Indeks</td>
			<td>Wytrzymałość elektryczna 
			(V/cm)</td>
			<td>Brak pików 
			(-)</td>
			<td>MPPT (maksymalne śledzenie punktu mocy) 
			(ms)</td>
			<td>MR 
			(-)</td>
			<td>TtFP 
			(ms)</td>
			<td>T25 
			(ms)</td>
			<td>T50 
			(ms)</td>
			<td>T75 
			(ms)</td>
			<td>T90 
			(ms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>126</td>
			<td>9</td>
			<td>224</td>
			<td>0.104</td>
			<td>360</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>150</td>
			<td>6</td>
			<td>354</td>
			<td>0.097</td>
			<td>108</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>176</td>
			<td>2</td>
			<td>144</td>
			<td>0.089</td>
			<td>36</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>200</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.075</td>
			<td>0</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
			<td>252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>250</td>
			<td>2</td>
			<td>396</td>
			<td>0.064</td>
			<td>0</td>
			<td>108</td>
			<td>216</td>
			<td>432</td>
			<td>2052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.059</td>
			<td>0</td>
			<td>180</td>
			<td>1188</td>
			<td>2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>350</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.053</td>
			<td>0</td>
			<td>1008</td>
			<td>2340</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>400</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.047</td>
			<td>0</td>
			<td>1512</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry odpowiedzi TMV wywołanych impulsami o czasie trwania 100 µs i różnych amplitudach.

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

Elektroporacja tymczasowo zwiększa przepuszczalność błony komórkowej za pomocą impulsów elektrycznych o wysokim napięciu. Istnieje kilka szybko rozwijających się metod leczenia klinicznego opartych na elektroporacji, które są ukierunkowane na komórki mięśniowe i neuronalne. Dlatego tak ważne jest zbadanie, w jaki sposób elektroporacja wpływa na zdolność tych pobudliwych komórek do wyzwalania potencjałów czynnościowych.Eksperymenty in vitro są bardzo ważne dla zrozumienia wpływu elektroporacji na pobudliwe komórki. Jednak pierwotne miocyty i neurony mają bardzo złożony profil ekspresji kanałów jonowych, co sprawia, że niezwykle trudno jest rozplątać wzajemne oddziaływanie między wzbudzeniem a elektroporacją. Opracowaliśmy protokół monitorowania wywołanych elektroporacją zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przy użyciu ogniw HEK z tet-on.Komórki te wyrażają minimalny zestaw kanałów sodowych i potasowych, które sprawiają, że są pobudliwe. W związku z tym komórka ta uprościła eksperymenty i teoretyczną analizę uzyskanych wyników. Korzystając z naszego protokołu, odkryliśmy, że bardzo łagodna elektroporacja może już dramatycznie wpłynąć na akceptowalność komórek.Wyniki te utorują drogę do opracowania teoretycznych modeli elektroporacji i akceptowalności komórek, a to pomoże społeczności ulepszyć szybko pojawiające się terapie oparte na elektroporacji w sercu, mózgu i mięśniach szkieletowych. Na początek odpipetuj jeden mililitr PBS do jednego dołka z dwudołkowymi szkiełkami komory nakrywkowej. Dodaj 10 mikrolitrów sterylnego roztworu poli-L-lizyny o stężeniu jednego miligrama na mililitr i dobrze wymieszaj pipetą.Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym, a następnie usunąć PBS z poli-L-lizyną bez dalszego mycia. Aby wysiać komórki, przygotuj rozcieńczenie podstawowego roztworu doksycykliny od 1 do 10 w pożywce hodowlanej w 1,5-mililitrowej probówce. Teraz wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby T-25.Trypsynizuj komórki 2,5 mililitra roztworu trypsyny EDTA w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Dodaj 2,5 mililitra świeżej pożywki hodowlanej i delikatnie odpipetuj komórki, aby oderwać je od powierzchni. Obliczyć objętość zawiesiny komórek trypsynizowanych potrzebna do założenia hodowli.Odejmij poprzednio obliczoną objętość zawiesiny komórek od 1 470 mikrolitrów, aby obliczyć objętość pożywki hodowlanej. Aby przygotować próbki z pobudliwymi komórkami S HEK, należy pipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej i zawiesiny komórek trypsynizowanych do jednego dołka. Dodać 30 mikrolitrów rozcieńczenia doksycykliny.Dobrze wymieszać za pomocą delikatnego pipetowania tuż przed umieszczeniem komór w inkubatorze dwutlenku węgla. W celu przygotowania próbek z niepobudliwymi komórkami NS HEK należy odpipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej do dołka i dodać 90% obliczonej objętości zawiesiny komórek dla komórek S HEK bez doksycykliny. Inkubuj komory w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni przed eksperymentem.Przed eksperymentem odpipetuj trzy mikrolitry potencjometrycznego roztworu podstawowego barwnika do 1,5-mililitrowej probówki. Pozostawić otwartą probówkę w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym na około 15 minut, aby etanol odparował, a barwnik potencjometryczny wyschł, a następnie dodać 997 mikrolitrów zimnej pożywki hodowlanej o temperaturze czterech stopni Celsjusza do probówki, aby rozpuścić barwnik do końcowego stężenia 12 mikromolowych. Następnie usuń pożywkę hodowlaną ze studzienki.Dodaj jeden mililitr potencjometrycznego roztworu barwnika do komórek. Wstaw komórki do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubuj je przez 20 minut. Następnie usuń potencjometryczny roztwór barwnika i zachowaj go w tubce do dalszego ponownego wykorzystania w maksymalnie sześciu sekwencyjnych eksperymentach w ciągu jednego dnia.Delikatnie umyj ogniwa trzykrotnie roztworem tyrodowym. Po ostatnim płukaniu odpipetować jeden mililitr roztworu tyrodowego o niskiej zawartości potasu do studzienki. Na początek należy przygotować ogniwa HEK do elektroporacji, a następnie skonfigurować synchronizację dostarczania impulsów z akwizycją obrazu za pomocą sygnału TTL z systemu mikroskopowego, który wyzwala generator impulsów.Na dnie komory umieść dwie równoległe elektrody z drutu platynowo-irydowego o średnicy 0,8 milimetra i pięciomilimetrowej odległości między wewnętrznymi krawędziami. Zamocuj komorę pod mikroskopem, a następnie podłącz elektrody do generatora impulsów. Za pomocą sondy napięciowej i prądowej podłącz wyjście generatora impulsów do oscyloskopu, aby umożliwić weryfikację prawidłowego dostarczania impulsów podczas eksperymentu.Skoncentruj ogniwa na jasnym polu i zobrazuj ogniwa znajdujące się pośrodku między elektrodami. Zrób 80 zdjęć w trybie poklatkowym z szybkością co najmniej 25 klatek na sekundę. Oświetl ogniwa falą wzbudzenia o długości 635 nanometrów, ustaw czas ekspozycji na 10 milisekund i wykryj emisję na około 700 nanometrach.Po przejęciu odczekaj dwie minuty. Dostosuj napięcie na interfejsie generatora impulsów na 63 wolty. Nagrywaj film poklatkowy w ten sam sposób co dwie minuty.Podczas tych akwizycji należy zastosować pojedynczy impuls o długości 100 mikrosekund w momencie uzyskania 10. obrazu. Uzyskuj obrazy o napięciach impulsowych 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 i 200 woltów. Oszacuj pole elektryczne, na które narażone są ogniwa, jako przyłożony stosunek napięcia do odległości elektrody.W celu analizy danych wyeksportuj nagrania poklatkowe do formatu TIFF, a następnie umieść wszystkie nagrania poklatkowe zastosowanych napięć z pojedynczego eksperymentu w jednym folderze. Zmień nazwę każdego nagrania poklatkowego, aby MATLAB mógł rozpoznać pole elektryczne. W przypadku akwizycji na początku eksperymentu, w której nie stosuje się impulsu, zmień jego nazwę, używając frazy 000Vcm.Następnie otwórz aplikację pobraną z GitHub. Kliknij Wybierz folder danych", aby wybrać folder zawierający nagrania poklatkowe z jednego eksperymentu. Aby wybrać piksele, użyj dwóch suwaków, aby określić dolny próg dla wyraźnego obrazu membran i wysoki próg dla wyeliminowania zanieczyszczeń z analizy.Teraz kliknij Analizuj dane. W zakładce "Analiza" pojawi się tabela z wyodrębnionymi parametrami. Po prawej stronie tabeli zostaną wyświetlone wykresy względnej fluorescencji w czasie dla każdego użytego pola elektrycznego.Wybierz wykresy dla danego pola elektrycznego z menu rozwijanego po lewej stronie nad tabelą. Sprawdź wszystkie wykresy i wykonaj ręczną korektę w przypadku wykrycia fałszywego szczytu. wybierz Wyczyść piki AUTO"u dołu zakładki Analiza", aby usunąć automatycznie wykryte szczyty.Kliknij wykres, aby ręcznie określić nowy punkt czasowy szczytu. W razie potrzeby wybierz opcję Uruchom ponownie automatyczne wykrywanie szczytów" u dołu zakładki Analiza, aby ponownie przeprowadzić automatyczne wykrywanie szczytów. Wyodrębnione parametry zostaną teraz dostosowane do nowego piku.Następnie wybierz Eksportuj dane"w prawym dolnym rogu Analizy"kartę, aby wyeksportować dane do tego samego folderu, co plik mapy punktowej, plik arkusza kalkulacyjnego i obrazy PNG dla każdego użytego pola elektrycznego. Impulsy elektryczne o napięciu 126 woltów na centymetr wywołały wielokrotne piki fluorescencji w pobudliwych komórkach, o czym świadczą wyraźne oscylacje fluorescencji zmieniające się w czasie. Wraz ze wzrostem natężenia pola elektrycznego odpowiedź zmieniała się i wykazywała trwałą depolaryzację przy napięciu 400 woltów na centymetr.Niepobudliwe komórki nie wykazywały znaczących szczytów w odpowiedzi na najniższe natężenia pola elektrycznego, co wskazuje na brak wzbudzenia. Przy wyższych natężeniach pola elektrycznego niepobudliwe ogniwa wykazywały również trwałą depolaryzację, co wskazuje na elektroporację. Maksymalną liczbę pików w ogniwach pobudliwych zaobserwowano przy napięciu 150 woltów na centymetr, z tendencją spadkową liczby pików wraz ze wzrostem napięcia powyżej tego punktu.

monitoring-electroporation-induced-changes-action-potential

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) to specjalistyczna technika umożliwiająca dostarczenie DNA lub innych makrocząsteczek do poszczególnych komórek w obrębie nienaruszonej tkanki, w tym w preparatach in vivo. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy procedurę SCE w celu wprowadzenia barwnika fluorescencyjnego lub plazmidowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki Xenopus laevis.

Elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Źródło: Keener, D. G., et al. Elektroporacja pojedynczych komórek w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących. J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje proces elektroporacji pojedynczej komórki w celu wprowadzenia plazmidowego DNA do neuronów w hodowlach plastrów hipokampa myszy. Procedura obejmuje precyzyjne pozycjonowanie pipety, regulację ciśnienia i impulsy elektroporacyjne w celu przejściowej...

Ekspresja genów poprzez elektroporację pojedynczych komórek w mysich kulturach warstw hipokampa

W tym filmie, embrionalne hodowle komórek nerkowych wyrażające zależne od światła białka kanału jonowego połączone fluorescencyjnym reporterem demonstrują wpływ światła na ruch jonów. Zacisk krosowy na całe komórki służy do monitorowania ruchu jonów.

Zapis elektrofizjologii optogenetycznej komórek z kanałami jonowymi zależnymi od światła

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Opisano metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników napięcia.

Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

Poznaj metodę monitorowania zmian w generowaniu potencjału czynnościowego wywołanych elektroporacją w genetycznie modyfikowanych komórkach HEK Tet-On Spiking. Protokół umożliwia optyczną analizę dynamiki potencjałów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Przeglądaj więcej filmów