Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Elektroporacja tymczasowo zwiększa przepuszczalność błony komórkowej za pomocą impulsów elektrycznych o wysokim napięciu. Istnieje kilka szybko rozwijających się metod leczenia klinicznego opartych na elektroporacji, które są ukierunkowane na komórki mięśniowe i neuronalne. Dlatego tak ważne jest zbadanie, w jaki sposób elektroporacja wpływa na zdolność tych pobudliwych komórek do wyzwalania potencjałów czynnościowych.

Eksperymenty in vitro są bardzo ważne dla zrozumienia wpływu elektroporacji na pobudliwe komórki. Jednak pierwotne miocyty i neurony mają bardzo złożony profil ekspresji kanałów jonowych, co sprawia, że niezwykle trudno jest rozplątać wzajemne oddziaływanie między wzbudzeniem a elektroporacją. Opracowaliśmy protokół monitorowania wywołanych elektroporacją zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przy użyciu ogniw HEK z tet-on.

Komórki te wyrażają minimalny zestaw kanałów sodowych i potasowych, które sprawiają, że są pobudliwe. W związku z tym komórka ta uprościła eksperymenty i teoretyczną analizę uzyskanych wyników. Korzystając z naszego protokołu, odkryliśmy, że bardzo łagodna elektroporacja może już dramatycznie wpłynąć na akceptowalność komórek.

Wyniki te utorują drogę do opracowania teoretycznych modeli elektroporacji i akceptowalności komórek, a to pomoże społeczności ulepszyć szybko pojawiające się terapie oparte na elektroporacji w sercu, mózgu i mięśniach szkieletowych. Na początek odpipetuj jeden mililitr PBS do jednego dołka z dwudołkowymi szkiełkami komory nakrywkowej. Dodaj 10 mikrolitrów sterylnego roztworu poli-L-lizyny o stężeniu jednego miligrama na mililitr i dobrze wymieszaj pipetą.

Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym, a następnie usunąć PBS z poli-L-lizyną bez dalszego mycia. Aby wysiać komórki, przygotuj rozcieńczenie podstawowego roztworu doksycykliny od 1 do 10 w pożywce hodowlanej w 1,5-mililitrowej probówce. Teraz wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby T-25.

Trypsynizuj komórki 2,5 mililitra roztworu trypsyny EDTA w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Dodaj 2,5 mililitra świeżej pożywki hodowlanej i delikatnie odpipetuj komórki, aby oderwać je od powierzchni. Obliczyć objętość zawiesiny komórek trypsynizowanych potrzebna do założenia hodowli.

Odejmij poprzednio obliczoną objętość zawiesiny komórek od 1 470 mikrolitrów, aby obliczyć objętość pożywki hodowlanej. Aby przygotować próbki z pobudliwymi komórkami S HEK, należy pipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej i zawiesiny komórek trypsynizowanych do jednego dołka. Dodać 30 mikrolitrów rozcieńczenia doksycykliny.

Dobrze wymieszać za pomocą delikatnego pipetowania tuż przed umieszczeniem komór w inkubatorze dwutlenku węgla. W celu przygotowania próbek z niepobudliwymi komórkami NS HEK należy odpipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej do dołka i dodać 90% obliczonej objętości zawiesiny komórek dla komórek S HEK bez doksycykliny. Inkubuj komory w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni przed eksperymentem.

Przed eksperymentem odpipetuj trzy mikrolitry potencjometrycznego roztworu podstawowego barwnika do 1,5-mililitrowej probówki. Pozostawić otwartą probówkę w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym na około 15 minut, aby etanol odparował, a barwnik potencjometryczny wyschł, a następnie dodać 997 mikrolitrów zimnej pożywki hodowlanej o temperaturze czterech stopni Celsjusza do probówki, aby rozpuścić barwnik do końcowego stężenia 12 mikromolowych. Następnie usuń pożywkę hodowlaną ze studzienki.

Dodaj jeden mililitr potencjometrycznego roztworu barwnika do komórek. Wstaw komórki do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubuj je przez 20 minut. Następnie usuń potencjometryczny roztwór barwnika i zachowaj go w tubce do dalszego ponownego wykorzystania w maksymalnie sześciu sekwencyjnych eksperymentach w ciągu jednego dnia.

Delikatnie umyj ogniwa trzykrotnie roztworem tyrodowym. Po ostatnim płukaniu odpipetować jeden mililitr roztworu tyrodowego o niskiej zawartości potasu do studzienki. Na początek należy przygotować ogniwa HEK do elektroporacji, a następnie skonfigurować synchronizację dostarczania impulsów z akwizycją obrazu za pomocą sygnału TTL z systemu mikroskopowego, który wyzwala generator impulsów.

Na dnie komory umieść dwie równoległe elektrody z drutu platynowo-irydowego o średnicy 0,8 milimetra i pięciomilimetrowej odległości między wewnętrznymi krawędziami. Zamocuj komorę pod mikroskopem, a następnie podłącz elektrody do generatora impulsów. Za pomocą sondy napięciowej i prądowej podłącz wyjście generatora impulsów do oscyloskopu, aby umożliwić weryfikację prawidłowego dostarczania impulsów podczas eksperymentu.

Skoncentruj ogniwa na jasnym polu i zobrazuj ogniwa znajdujące się pośrodku między elektrodami. Zrób 80 zdjęć w trybie poklatkowym z szybkością co najmniej 25 klatek na sekundę. Oświetl ogniwa falą wzbudzenia o długości 635 nanometrów, ustaw czas ekspozycji na 10 milisekund i wykryj emisję na około 700 nanometrach.

Po przejęciu odczekaj dwie minuty. Dostosuj napięcie na interfejsie generatora impulsów na 63 wolty. Nagrywaj film poklatkowy w ten sam sposób co dwie minuty.

Podczas tych akwizycji należy zastosować pojedynczy impuls o długości 100 mikrosekund w momencie uzyskania 10. obrazu. Uzyskuj obrazy o napięciach impulsowych 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 i 200 woltów. Oszacuj pole elektryczne, na które narażone są ogniwa, jako przyłożony stosunek napięcia do odległości elektrody.

W celu analizy danych wyeksportuj nagrania poklatkowe do formatu TIFF, a następnie umieść wszystkie nagrania poklatkowe zastosowanych napięć z pojedynczego eksperymentu w jednym folderze. Zmień nazwę każdego nagrania poklatkowego, aby MATLAB mógł rozpoznać pole elektryczne. W przypadku akwizycji na początku eksperymentu, w której nie stosuje się impulsu, zmień jego nazwę, używając frazy 000Vcm.

Następnie otwórz aplikację pobraną z GitHub. Kliknij Wybierz folder danych", aby wybrać folder zawierający nagrania poklatkowe z jednego eksperymentu. Aby wybrać piksele, użyj dwóch suwaków, aby określić dolny próg dla wyraźnego obrazu membran i wysoki próg dla wyeliminowania zanieczyszczeń z analizy.

Teraz kliknij Analizuj dane. W zakładce "Analiza" pojawi się tabela z wyodrębnionymi parametrami. Po prawej stronie tabeli zostaną wyświetlone wykresy względnej fluorescencji w czasie dla każdego użytego pola elektrycznego.

Wybierz wykresy dla danego pola elektrycznego z menu rozwijanego po lewej stronie nad tabelą. Sprawdź wszystkie wykresy i wykonaj ręczną korektę w przypadku wykrycia fałszywego szczytu. wybierz Wyczyść piki AUTO"u dołu zakładki Analiza", aby usunąć automatycznie wykryte szczyty.

Kliknij wykres, aby ręcznie określić nowy punkt czasowy szczytu. W razie potrzeby wybierz opcję Uruchom ponownie automatyczne wykrywanie szczytów" u dołu zakładki Analiza, aby ponownie przeprowadzić automatyczne wykrywanie szczytów. Wyodrębnione parametry zostaną teraz dostosowane do nowego piku.

Następnie wybierz Eksportuj dane"w prawym dolnym rogu Analizy"kartę, aby wyeksportować dane do tego samego folderu, co plik mapy punktowej, plik arkusza kalkulacyjnego i obrazy PNG dla każdego użytego pola elektrycznego. Impulsy elektryczne o napięciu 126 woltów na centymetr wywołały wielokrotne piki fluorescencji w pobudliwych komórkach, o czym świadczą wyraźne oscylacje fluorescencji zmieniające się w czasie. Wraz ze wzrostem natężenia pola elektrycznego odpowiedź zmieniała się i wykazywała trwałą depolaryzację przy napięciu 400 woltów na centymetr.

Niepobudliwe komórki nie wykazywały znaczących szczytów w odpowiedzi na najniższe natężenia pola elektrycznego, co wskazuje na brak wzbudzenia. Przy wyższych natężeniach pola elektrycznego niepobudliwe ogniwa wykazywały również trwałą depolaryzację, co wskazuje na elektroporację. Maksymalną liczbę pików w ogniwach pobudliwych zaobserwowano przy napięciu 150 woltów na centymetr, z tendencją spadkową liczby pików wraz ze wzrostem napięcia powyżej tego punktu.