Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking
6 września 2024
Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.
Elektroporacja tymczasowo zwiększa przepuszczalność błony komórkowej za pomocą impulsów elektrycznych o wysokim napięciu. Istnieje kilka szybko rozwijających się metod leczenia klinicznego opartych na elektroporacji, które są ukierunkowane na komórki mięśniowe i neuronalne. Dlatego tak ważne jest zbadanie, w jaki sposób elektroporacja wpływa na zdolność tych pobudliwych komórek do wyzwalania potencjałów czynnościowych.
Eksperymenty in vitro są bardzo ważne dla zrozumienia wpływu elektroporacji na pobudliwe komórki. Jednak pierwotne miocyty i neurony mają bardzo złożony profil ekspresji kanałów jonowych, co sprawia, że niezwykle trudno jest rozplątać wzajemne oddziaływanie między wzbudzeniem a elektroporacją. Opracowaliśmy protokół monitorowania wywołanych elektroporacją zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przy użyciu ogniw HEK z tet-on.
Komórki te wyrażają minimalny zestaw kanałów sodowych i potasowych, które sprawiają, że są pobudliwe. W związku z tym komórka ta uprościła eksperymenty i teoretyczną analizę uzyskanych wyników. Korzystając z naszego protokołu, odkryliśmy, że bardzo łagodna elektroporacja może już dramatycznie wpłynąć na akceptowalność komórek.
Wyniki te utorują drogę do opracowania teoretycznych modeli elektroporacji i akceptowalności komórek, a to pomoże społeczności ulepszyć szybko pojawiające się terapie oparte na elektroporacji w sercu, mózgu i mięśniach szkieletowych. Na początek odpipetuj jeden mililitr PBS do jednego dołka z dwudołkowymi szkiełkami komory nakrywkowej. Dodaj 10 mikrolitrów sterylnego roztworu poli-L-lizyny o stężeniu jednego miligrama na mililitr i dobrze wymieszaj pipetą.
Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym, a następnie usunąć PBS z poli-L-lizyną bez dalszego mycia. Aby wysiać komórki, przygotuj rozcieńczenie podstawowego roztworu doksycykliny od 1 do 10 w pożywce hodowlanej w 1,5-mililitrowej probówce. Teraz wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby T-25.
Trypsynizuj komórki 2,5 mililitra roztworu trypsyny EDTA w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Dodaj 2,5 mililitra świeżej pożywki hodowlanej i delikatnie odpipetuj komórki, aby oderwać je od powierzchni. Obliczyć objętość zawiesiny komórek trypsynizowanych potrzebna do założenia hodowli.
Odejmij poprzednio obliczoną objętość zawiesiny komórek od 1 470 mikrolitrów, aby obliczyć objętość pożywki hodowlanej. Aby przygotować próbki z pobudliwymi komórkami S HEK, należy pipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej i zawiesiny komórek trypsynizowanych do jednego dołka. Dodać 30 mikrolitrów rozcieńczenia doksycykliny.
Dobrze wymieszać za pomocą delikatnego pipetowania tuż przed umieszczeniem komór w inkubatorze dwutlenku węgla. W celu przygotowania próbek z niepobudliwymi komórkami NS HEK należy odpipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej do dołka i dodać 90% obliczonej objętości zawiesiny komórek dla komórek S HEK bez doksycykliny. Inkubuj komory w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni przed eksperymentem.
Przed eksperymentem odpipetuj trzy mikrolitry potencjometrycznego roztworu podstawowego barwnika do 1,5-mililitrowej probówki. Pozostawić otwartą probówkę w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym na około 15 minut, aby etanol odparował, a barwnik potencjometryczny wyschł, a następnie dodać 997 mikrolitrów zimnej pożywki hodowlanej o temperaturze czterech stopni Celsjusza do probówki, aby rozpuścić barwnik do końcowego stężenia 12 mikromolowych. Następnie usuń pożywkę hodowlaną ze studzienki.
Dodaj jeden mililitr potencjometrycznego roztworu barwnika do komórek. Wstaw komórki do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubuj je przez 20 minut. Następnie usuń potencjometryczny roztwór barwnika i zachowaj go w tubce do dalszego ponownego wykorzystania w maksymalnie sześciu sekwencyjnych eksperymentach w ciągu jednego dnia.
Delikatnie umyj ogniwa trzykrotnie roztworem tyrodowym. Po ostatnim płukaniu odpipetować jeden mililitr roztworu tyrodowego o niskiej zawartości potasu do studzienki. Na początek należy przygotować ogniwa HEK do elektroporacji, a następnie skonfigurować synchronizację dostarczania impulsów z akwizycją obrazu za pomocą sygnału TTL z systemu mikroskopowego, który wyzwala generator impulsów.
Na dnie komory umieść dwie równoległe elektrody z drutu platynowo-irydowego o średnicy 0,8 milimetra i pięciomilimetrowej odległości między wewnętrznymi krawędziami. Zamocuj komorę pod mikroskopem, a następnie podłącz elektrody do generatora impulsów. Za pomocą sondy napięciowej i prądowej podłącz wyjście generatora impulsów do oscyloskopu, aby umożliwić weryfikację prawidłowego dostarczania impulsów podczas eksperymentu.
Skoncentruj ogniwa na jasnym polu i zobrazuj ogniwa znajdujące się pośrodku między elektrodami. Zrób 80 zdjęć w trybie poklatkowym z szybkością co najmniej 25 klatek na sekundę. Oświetl ogniwa falą wzbudzenia o długości 635 nanometrów, ustaw czas ekspozycji na 10 milisekund i wykryj emisję na około 700 nanometrach.
Po przejęciu odczekaj dwie minuty. Dostosuj napięcie na interfejsie generatora impulsów na 63 wolty. Nagrywaj film poklatkowy w ten sam sposób co dwie minuty.
Podczas tych akwizycji należy zastosować pojedynczy impuls o długości 100 mikrosekund w momencie uzyskania 10. obrazu. Uzyskuj obrazy o napięciach impulsowych 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 i 200 woltów. Oszacuj pole elektryczne, na które narażone są ogniwa, jako przyłożony stosunek napięcia do odległości elektrody.
W celu analizy danych wyeksportuj nagrania poklatkowe do formatu TIFF, a następnie umieść wszystkie nagrania poklatkowe zastosowanych napięć z pojedynczego eksperymentu w jednym folderze. Zmień nazwę każdego nagrania poklatkowego, aby MATLAB mógł rozpoznać pole elektryczne. W przypadku akwizycji na początku eksperymentu, w której nie stosuje się impulsu, zmień jego nazwę, używając frazy 000Vcm.
Następnie otwórz aplikację pobraną z GitHub. Kliknij Wybierz folder danych", aby wybrać folder zawierający nagrania poklatkowe z jednego eksperymentu. Aby wybrać piksele, użyj dwóch suwaków, aby określić dolny próg dla wyraźnego obrazu membran i wysoki próg dla wyeliminowania zanieczyszczeń z analizy.
Teraz kliknij Analizuj dane. W zakładce "Analiza" pojawi się tabela z wyodrębnionymi parametrami. Po prawej stronie tabeli zostaną wyświetlone wykresy względnej fluorescencji w czasie dla każdego użytego pola elektrycznego.
Wybierz wykresy dla danego pola elektrycznego z menu rozwijanego po lewej stronie nad tabelą. Sprawdź wszystkie wykresy i wykonaj ręczną korektę w przypadku wykrycia fałszywego szczytu. wybierz Wyczyść piki AUTO"u dołu zakładki Analiza", aby usunąć automatycznie wykryte szczyty.
Kliknij wykres, aby ręcznie określić nowy punkt czasowy szczytu. W razie potrzeby wybierz opcję Uruchom ponownie automatyczne wykrywanie szczytów" u dołu zakładki Analiza, aby ponownie przeprowadzić automatyczne wykrywanie szczytów. Wyodrębnione parametry zostaną teraz dostosowane do nowego piku.
Następnie wybierz Eksportuj dane"w prawym dolnym rogu Analizy"kartę, aby wyeksportować dane do tego samego folderu, co plik mapy punktowej, plik arkusza kalkulacyjnego i obrazy PNG dla każdego użytego pola elektrycznego. Impulsy elektryczne o napięciu 126 woltów na centymetr wywołały wielokrotne piki fluorescencji w pobudliwych komórkach, o czym świadczą wyraźne oscylacje fluorescencji zmieniające się w czasie. Wraz ze wzrostem natężenia pola elektrycznego odpowiedź zmieniała się i wykazywała trwałą depolaryzację przy napięciu 400 woltów na centymetr.
Niepobudliwe komórki nie wykazywały znaczących szczytów w odpowiedzi na najniższe natężenia pola elektrycznego, co wskazuje na brak wzbudzenia. Przy wyższych natężeniach pola elektrycznego niepobudliwe ogniwa wykazywały również trwałą depolaryzację, co wskazuje na elektroporację. Maksymalną liczbę pików w ogniwach pobudliwych zaobserwowano przy napięciu 150 woltów na centymetr, z tendencją spadkową liczby pików wraz ze wzrostem napięcia powyżej tego punktu.
Przegląd
To badanie bada wpływ elektroporacji na generowaną potencjał czynnościowy w komórkach pobudliwych przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu. Protokół koncentruje się na optycznym monitorowaniu zmian w napięciu transbłonowym i dynamice potencjału czynnościowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Elektrofizjologia
Tło
- Elektroporacja zwiększa przepuszczalność błony komórkowej poprzez impulsy wysokiego napięcia.
- Rozumienie wpływu elektroporacji na komórki pobudliwe jest kluczowe dla zastosowań klinicznych.
- Pierwotne miocyty i neurony stanowią złożone wyzwania w badaniach interakcji kanałów jonowych.
- Komórki HEK zapewniają uproszczony model do takich badań.
Cel badania
- Aby monitorować zmiany indukowane elektroporacją w generowaniu potencjału czynnościowego.
- Aby wykorzystać komórki HEK z aktywnością spiking tet-on dla jaśniejszych wniosków.
- Aby zwiększyć zrozumienie wpływu elektroporacji na zachowanie komórek pobudliwych.
Stosowane metody
- Techniki monitorowania optycznego do oceny potencjału czynnościowego.
- Elektroporacja zastosowana do genetycznie zmodyfikowanych komórek HEK.
- Automatyczna ekstrakcja istotnych parametrów elektrofizjologicznych.
- Ustawienia eksperymentalne in vitro dla kontrolowanych obserwacji.
Główne wyniki
- Elektroporacja znacząco wpływa na generowaną potencjał czynnościowy w komórkach HEK.
- Zmiany w napięciu transbłonowym zostały pomyślnie zmonitorowane.
- Automatyczne metody zapewniły niezawodne wyciąganie danych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wpływu elektroporacji na komórki pobudliwe.
Wnioski
- Protokół oferuje cenné narzędzie do badania elektroporacji w komórkach pobudliwych.
- Zdobyte wnioski mogą wpłynąć na zastosowania kliniczne ukierunkowane na komórki mięśniowe i neuronalne.
- Dalsze badania mogłyby rozszerzyć zastosowanie tych wyników.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Electroporation-based therapies increasingly target excitable tissues, but off-target effects on neuronal and muscle cells present significant safety and efficacy challenges. This protocol enables quantitative, high-content assessment of electroporation-induced changes in action potential generation using a simplified, genetically engineered HEK cell model. The approach supports predictive de-risking and mechanistic understanding at critical discovery and preclinical inflection points for biopharma portfolios developing electroporation-enabled modalities.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of electroporation effects on excitable cell function using a controlled, minimal ion channel system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating excitation and electroporation interplay without confounding native cell complexity.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and safety liabilities for electroporation-based interventions.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, optically monitored assay for quantifying action potential changes across electric field strengths.
- Delivers standardized, automated extraction of electrophysiological parameters for robust data comparison.
- Enables scalable evaluation of compound or device effects on excitable cell responses to electroporation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with translational modeling of electroporation effects in cardiac, neural, and muscle tissues.
- Supports continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical risk assessment for therapy development.
- Informs biomarker strategies for monitoring electroporation-induced functional changes in target tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for electroporation-enabled therapeutics, bridging mechanistic validation and translational modeling.
- Discovery Biology: Quantifies action potential disruption and recovery, clarifying electroporation impact on excitable cell function.
- Screening: Offers a standardized, high-content assay for evaluating electric pulse parameters and candidate interventions.
- Analytics: Provides automated, quantitative readouts of transmembrane voltage and action potential metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Supports modeling of dose-response and safety thresholds relevant to in vivo applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanistic studies and preclinical risk assessment across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in electroporation effects on excitable cells and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for cross-team adoption.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient triage of electroporation-based assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapies targeting excitable tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, optical imaging, and quantitative data analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy, pulse generation, and automated analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data interpretation for reproducibility.
- Adaptation to other excitable cell models may require protocol optimization.
- Interpretation is limited to the simplified ion channel context of engineered HEK cells.
