Name: Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj mikrofluidyczną elektroporację wspomaganą wirami do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do komórek z wysoką wydajnością i zachowaniem ich żywotności. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę dawkowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez program Rowland Junior Fellow. Autorzy pragną wyrazić wdzięczność naukowcom i pracownikom Instytutu Rowlanda na Harvardzie: Chrisowi Stokesowi za pomoc w opracowaniu specjalnie zbudowanego, wspomaganego komputerowo zestawu do kontroli ciśnienia, dr Diane Schaak za jej wkład w obsługę próbek biologicznych, Winfieldowi Hillowi za opracowanie konfiguracji elektrycznej, dr Alavaro Sanchezowi za udzielenie dostępu do cytometru przepływowego, Scottowi Bevisowi, Kenny'emu Spencerowi i Donowi Rogersowi za obróbkę mechanicznych elementów hydraulicznych wymaganych do konfiguracji ciśnienia. Wzorce mikroprzepływowe zostały wyprodukowane w Center for Nanoscale Systems (CNS) na Uniwersytecie Harvarda.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Płytka 1×105 komórek/ml linii komórkowej przerzutowego raka piersi MDA-MB-231 w objętości 10 ml na kulturę tkankową kolba T75 w pożywce L-15 firmy Leibovitz uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.</li>
	<li>Inkubować komórki MDA-MB-231 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 0% CO2 .</li>
	<li>Zbierz komórki do eksperymentów 2 dni po wysianiu, traktując komórki 0,25% trypsyną-EDTA przez 2 minuty i dezaktywuj aktywność enzymatyczną trypsyny, dodając 8 ml pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Granulki przez odwirowanie przez 5 minut przy 200 × g i ponowne zawieszenie w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS, 1x, bez Ca2+ i Mg2+) do końcowego stężenia 5 × 105 komórek/ml.</li>
</ol>
2. Projektowanie i produkcja urządzeń
UWAGA: Maska, produkcja formy wzorcowej i proces zamykania mikrokanałów mają być prowadzone w czystym pomieszczeniu, podczas gdy proces odlewania mikrokanałów z polidimetylosiloksanu (PDMS) można przeprowadzić na zwykłym stole laboratoryjnym.
<ol>
	<li>Zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe, jak pokazano na rysunku 1, za pomocą programu AutoCAD. Urządzenie powinno składać się z wlotu z wieloma portami wtryskowymi, filtrami zgrubnymi i dwoma równoległymi prostymi prostokątnymi kanałami inercyjnymi ogniskowania (L = 7 mm, W = 40 μm i H = 70 μm). Indywidualny kanał prosty składa się z 5 komór elektroporacyjnych, które są oddalone od siebie o 800 μm (WC = 400 μm) z dwoma otworami przelotowymi na elektrody aluminiowe. Dwie poprzecznie przylegające komory elektroporacyjne dzielą otwór na elektrodę ujemną. Dwa proste kanały łączą się w wylot w dolnej części obszaru elektroporacji.</li>
	<li>Przekonwertuj plik CAD z mikrowzorami na plik GDSII za pomocą programu LinkCAD. Napisz mikrowzory na półfabrykacie fotomaski o wymiarach 5 x 5 cali za pomocą laserowego edytora masek. Opracuj maskę, postępując zgodnie z protokołem producenta. UWAGA: Proces opracowywania maski obejmuje wywoływanie fotorezystu, trawienie chromu i usuwanie oporu. Alternatywnie, mikrowzory wydrukowane na przezroczystości o wysokiej rozdzielczości (>20 000 dpi) można kupić od zewnętrznego producenta i wykorzystać jako fotomaskę. Końcowe cechy mikroskali na fotomasce powinny być przezroczyste, aby pasowały do polaryzacji ujemnego fotorezystu.</li>
	<li>Wykonaj odlew konstrukcji urządzenia przy użyciu standardowych technik miękkiej litografii23 z ujemną powłoką fotorezystu na 4-calowej płytce krzemowej przy 2,000 obr./min, aby uzyskać ostateczną grubość 70 μm.</li>
	<li>Wstępnie piecz wafel z ujemnym fotorezystem przez 20 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Skontaktuj maskę z waflem i wystaw na działanie źródła UV (17,4 mJ/cm2) przez 80 sekund za pomocą nakładki na maskę.</li>
	<li>Rozwijaj odsłoniętą płytkę przez 4 minuty w wywoływaczu SU-8.</li>
	<li>Zmierz rozwiniętą grubość fotorezystu za pomocą profilometru powierzchniowego.</li>
	<li>Rygorystycznie wymieszaj elastomer w stosunku 10:1 do utwardzacza (zestaw elastomerów silikonowych) i wlej mieszaninę na formę odlewniczą, aby wygenerować repliki PDMS. Odgazować elastomer odlewniczy przez 30 minut i utwardzić formę odlewniczą odgazowanym elastomerem w piecu w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Rozwarstwiona utwardzona replika PDMS z wzorami mikrokanalików z formy i otworami na wloty, wyloty i wkłucia elektrod za pomocą imadła kołkowego. UWAGA: Normalna średnica krawędzi skrawającej imadła sworzniowego powinna wynosić 0.76 mm, co jest wystarczające do szczelnego trzymania rurki PEEK (OD 1/32") i elektrod aluminiowych (OD 0.029") na miejscu.</li>
	<li>Stwórz zamknięte kanały mikroprzepływowe, przyklejając repliki PDMS do szkiełka podstawowego poddanego działaniu myjki tlenowo-plazmowej na 7 sekund przy mocy częstotliwości radiowej i ciśnieniu parcjalnym tlenu wynoszącym odpowiednio 75 W i 500 mTorr.</li>
</ol>
3. Eksperymenty z przepływem
<ol>
	<li>Włóż aluminiowe elektrody (średnica zewnętrzna 0.029") i rurkę wylotową PEEK (średnica zewnętrzna 1/32") w wyznaczone miejsca przez otwory w mikrokanaliku (patrz rysunek 3B).</li>
	<li>Podłączyć sprzęt elektryczny18 odpowiedzialny za generowanie krótkich impulsów prostokątnych o wysokim napięciu do elektrod aluminiowych (patrz rysunek 3C), które stykają się z przepływającymi roztworami w formie PDMS. UWAGA: Sprzęt powinien składać się z generatora impulsów i zbudowanego we własnym zakresie wzmacniacza wysokiego napięcia. Rozdział 18</li>
	<li>Przygotować cztery probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające pojedynczo DPBS, roztwory z komórkami i biomolekuły, a następnie przymocować każdą probówkę do odpowiedniego uchwytu na fiolki podłączonego do pneumatycznego układu kontroli przepływu (patrz rysunek 3A). Rozdział 18</li>
	<li>Podłącz rurkę wlotową PEEK z uchwytów na fiolki do odpowiednich otworów wlotowych w urządzeniu mikroprzepływowym.</li>
	<li>Ustaw wielkość impulsów fali prostokątnej, V, na 100 V, aby natężenie pola elektrycznego, E = V/Le, w komorze elektroporacyjnej było równe 0,7 kV/cm. UWAGA: Tutaj Le jest odległością między dwoma punktami, w których elektrody dodatnia i ujemna stykają się z przepływającym roztworem (patrz rysunek 1).</li>
	<li>Ustaw regulator ciśnienia na 40 psi. UWAGA: Pojedyncze, ręcznie regulowane źródło azotu służy do równomiernego zwiększania ciśnienia we wszystkich fiolkach z próbkami, a kolektor o dużej prędkości jest wykorzystywany do terminowej aktywacji poszczególnych portów roztworu za pomocą niestandardowego oprogramowania LabVIEW. Rozdział 18</li>
	<li>Aby sterować zaworem, otwórz niestandardowe oprogramowanie LabVIEW oznaczone jako Valve Runner i kliknij uruchom w menu rozwijanym zatytułowanym operate.</li>
	<li>Włącz zawory, klikając każdą odpowiednią ikonę zaworu. UWAGA: Ikona zaworu powinna zmienić kolor na zielony, gdy jest aktywowany. Kliknięcie aktywnej ikony spowoduje dezaktywację i zamknięcie zaworu. Ikona zamkniętego zaworu powinna zmienić kolor na szary.</li>
	<li>Otwórz zawór zbiornika DPBS (tj. roztworu myjącego), aby zalać prędkość przepływu wymaganą do stabilnego wytwarzania wirów zatrzymujących komórki przez 1.5 minuty.</li>
	<li>Przełącz port roztworu aktywnego z roztworu myjącego na roztwór ogniwa, aby uwięzić ogniwa w komorze elektroporacyjnej na 30 sekund (tj. etap wychwytywania komórek).</li>
	<li>Przepływaj zarówno roztwory myjące, jak i komórkowe jednocześnie przez urządzenie przez 10 sekund przed etapem wychwytywania komórek, aby zapewnić niezakłócony przepływ podczas etapu przełączania roztworu. UWAGA: Ten krótki krok współprzepływu należy powtarzać na każdym kroku zmiany rozwiązania.</li>
	<li>Włącz port mycia i przepłucz urządzenie przez 20 sekund w celu usunięcia nieuwięzionych komórek zanieczyszczających.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór zawierający pierwszą cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania (0,2 mg/ml 3 000 Da obojętnych i anionowych cząsteczek dekstranu lub 1,5 mg/ml 70 000 Da obojętnych cząsteczek dekstranu) do urządzenia.</li>
	<li>Zastosuj pięć krótkich impulsów (Δt = 30 ms w odstępach 2 sekund) natychmiast po wstrzyknięciu roztworu molekularnego i monitoruj wielkość i czas trwania zastosowanych impulsów elektrycznych w czasie rzeczywistym za pomocą oscyloskopu.</li>
	<li>Powtórz krok 3.10 tyle razy, ile wynosi liczba dodatkowych cząsteczek do dostarczenia. Przy każdej dostawie molekularnej inkubuj komórki przez 100 s w roztworze molekularnym, a następnie przepłucz urządzenie roztworem myjącym przez 100 s, aby usunąć nadmiar cząsteczek.</li>
	<li>Uwolnij komórki w 96-dołkowej płytce do dalszej analizy, obniżając ciśnienie robocze poniżej 5 psi. UWAGA: Z każdego uwolnienia pobiera się około 100 μl roztworu ze 100 komórkami.</li>
	<li>Uruchom kroki eksperymentalne od 3.9 do 3.16 trzy razy, aby zebrać wystarczającą liczbę komórek do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą przetworzone komórki przez 5 minut w temperaturze 228 × g.</li>
	<li>Usunąć supernatant zawierający nadmiar cząsteczek fluorescencyjnych.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w DPBS w celu analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Ogniwa obciążnikowe w cytometrze przepływowym do analizy wydajności absorpcji molekularnej.</li>
</ol>

<ol><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+Past+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Electroporation Past present and future.</a> Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).</li>
<li>Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+electro-microfluidic+channel+for+single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation.</a> Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).</li>
<li>Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+electroporative+dye+uptake+by+mouse+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells.</a> Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+anticancer+agents+mediated+by+electroporation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro.</a> Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).</li>
<li>Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells+by+an+improved+version+of+MultiRound+Gateway+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology.</a> Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).</li>
<li>Heller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+interleukin-12+plasmid+DNA+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation.</a> DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Effects+of+Nanosecond+Pulsed+Electric+Fields+Combined+with+Low+Concentration+of+Gemcitabine+on+Human+Oral+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma.</a> In Vitro PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electroporation+chip+using+multiple+electric+field+zones+in+a+single+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel.</a> Appl Phys Lett. 101, (2012).</li>
<li>Wang, S. N., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanofluidics+based+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanofluidics based cell electroporation.</a> Biomicrofluidics. 7, (2013).</li>
<li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, U649-U693 (2009).</li>
<li>Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-encapsulation+of+two+plasmids+in+chitosan+microspheres+as+a+non-viral+gene+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle.</a> J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, U311-U313 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+size-based+rare+cell+enrichment+using+microscale+vortices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li>
<li>Yun, H. Y., Hur, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+multi-molecule+delivery+using+vortex-assisted+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation.</a> Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).</li>
<li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory+and+methods%2C+perspectives+for+drug+delivery%2C+gene+therapy+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).</li>
<li>Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-assisted+DNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vortex-assisted DNA delivery.</a> Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).</li>
<li>Jia, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+minicircle+vector+for+deriving+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.</a> Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).</li>
<li>Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+hematopoietic+stem+cells+Implications+for+gene+therapy+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease.</a> Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem-Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Unlabeled+Proteins+into+Living+Cells+by+Electroporation+and+Isolation+of+Viable+Protein-Loaded+Cells+Using+Dextran+Fluorescein+Isothiocyanate+as+a+Marker+for+Protein-Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake.</a> Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Electroporation-Fast+Molecular-Exchange+by+Electroosmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).</li>
<li>Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+electrophoretic+DNA+transfer+into+cells.+The+effect+of+DNA+interaction+with+electropores%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores.</a> Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).</li>
<li>Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li>
<li>Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+specific+antibodies+into+electropermeabilized+cells+is+a+valuable+tool+for+eliminating+specific+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions.</a> Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dzięki nowej, równoległej platformie do elektroporacji, oprócz wszystkich zalet, jakie zapewnia wcześniej opracowany system jednokomorowy, osiągnięto 10-krotne zwiększenie przepustowości i wydajności dostarczania wielu cząsteczek. 18 Wcześniej dostępne zalety obejmują (i) wstępne oczyszczanie komórek docelowych o jednolitym rozkładzie wielkości w celu zwiększenia żywotności, (ii) precyzyjną i indywidualną kontrolę dawki molekularnej oraz (iii) niski operacyjny prąd elektryczny. Znakowane fluorescencyjnie dekst...

W ostatnich latach wykorzystanie impulsów elektrycznych do ułatwienia cytozolowego dostarczania cząsteczek zewnątrzkomórkowych stało się atrakcyjnym sposobem manipulowania komórkami ssaków. 1 Proces ten, znany również jako elektroporacja, odwracalnie przenika błonę komórkową, umożliwiając cząsteczkom z natury nieprzepuszczalnym dla błony dostęp do wewnątrzkomórkowego środowiska komórek. Ponieważ praktycznie każda cząsteczka może zostać wprowadzona do cytozolu przez tymczasowo utworzone pory w błonie dowolnego typu komórek za pomocą elektroporacji, technika ta została opisana jako bardziej powtarzalna, uniwersalna i bardziej wydajna niż inne metody, w tym podejścia za pośrednictwem wirusa, chemiczne i optyczne. 2-3 Technika ta została wykorzystana do wprowadzenia cząsteczek fluorescencyjnych,4 leków 5 i kwasów nukleinowych6-7 przy jednoczesnym utrzymaniu komórek przy życiu i nienaruszonym. Biorąc pod uwagę te korzyści, elektroporacja została przyjęta jako powszechna technika laboratoryjna do transfekcji DNA, terapii genowej in vivo 8 i badań nad szczepieniami komórek. Jednak konwencjonalnym systemom elektroporacji nadal trudno jest jednocześnie osiągnąć praktyczną wydajność i żywotność w przypadku próbek o dużej niejednorodności wielkości, ponieważ natężenie pola elektrycznego wymagane do udanej elektroporacji jest ściśle skorelowane ze średnicą ogniwa. Co więcej, systemy te nie pozwalają na precyzyjną kontrolę wielu dostarczanych ilości molekularnych ze względu na zależność od masowego stochastycznego procesu dostarczania molekularnego. 9 Aby rozwiązać te problemy, wiele grup opracowało platformy elektroporacji mikroprzepływowej, oferujące zalety niższych napięć poracji, lepszej wydajności transfekcji, znacznego zmniejszenia śmiertelności komórek i zdolności do dostarczania wielu cząsteczek. 10-13 Korzyści te były możliwe dzięki niewielkim rozmiarom mikroskalowych systemów elektroporacji, których długość podziałki elektrod wynosi submilimetry, co znacznie obniża napięcia wymagane do pomyślnego dostarczenia. Co więcej, te mikroskalowe systemy elektroporacji mogą osiągać równomierny rozkład pola elektrycznego i szybko rozpraszać wytworzone ciepło, co skutkuje zmniejszoną śmiertelnością komórek przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności dostarczania. Wykorzystanie przezroczystych materiałów w tych mikroczipach pozwala dodatkowo na obserwację procesu elektroporacji in situ w celu szybkiej modyfikacji parametrów. 2,12 Jednak precyzyjna kontrola dawki oraz kontrola parametrów zależnych od molekularnych i komórkowych, wymagana w pojawiających się badaniach i zastosowaniach terapeutycznych,6,14-16 nadal pozostaje nierozwiązana.
Ta praca przedstawia mikroprzepływowy system elektroporacji wspomagany wirami, zdolny do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do wcześniej wybranej identycznej populacji komórek docelowych. Ogniwa o jednolitym rozkładzie wielkości są izolowane przed elektroporacją przy użyciu wcześniej opisanego mechanizmu pułapkowania selektywnego pod względem wielkości. 17-18 Dzięki jednolitemu rozkładowi wielkości uzyskano mniejsze różnice w wydajności elektroporacji i zwiększoną żywotność przy danym natężeniu pola elektrycznego. 19 Co więcej, ciągłe mieszanie uwięzionych komórek za pomocą wirów w mikroskali pozwoliło na równomierne dostarczanie cząsteczek przez cały cytozol, zgodnie z wynikami zgłoszonymi wcześniej przy użyciu innej platformy elektroporacji wspomaganej wirami. 20 Aby wykazać, że system ten będzie miał zastosowanie do szerokiego zakresu cząsteczek powszechnie wykorzystywanych w zastosowaniach biologicznych, makrocząsteczki o szerokim zakresie mas cząsteczkowych dostarczono do komórek raka piersi z przerzutami. Ponadto, dzięki monitorowaniu procesów w czasie rzeczywistym, praca ta dostarcza więcej dowodów, które mogą położyć kres długotrwałej debacie na temat mechanizmu dostarczania molekularnego podczas elektracji, który jest głównie zapośredniczony przez elektroforezę, a nie za pośrednictwem dyfuzji. 14 W przeciwieństwie do innych systemów elektroporacji, platforma ta w unikalny sposób zapewnia połączone zalety precyzyjnego dostarczania wielu cząsteczek, wysokiej wydajności dostarczania molekularnego, minimalnej śmiertelności komórek, szerokiego zakresu rozmiarów i ładunków dostarczanych cząsteczek, a także wizualizacji procesu elektroporacji w czasie rzeczywistym. Biorąc pod uwagę te możliwości, opracowany system elektroporacji ma praktyczny potencjał jako wszechstronne narzędzie do badań nad przeprogramowaniem komórek,6,14,21-22 zastosowań dostarczania leków10,19 oraz zastosowań wymagających dogłębnego zrozumienia mechanizmów dostarczania molekularnego elektroporacji.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 linia komórek nowotworowych</td><td>Amerykańska kolekcja kultur typu (ATCC)</td> <td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 Medium</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Tlenowy środek do czyszczenia plazmy Technics</td><td>Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M profilarka powierzchni</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 ELASTOMER SILIKONOWY ZESTAW</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprężony azot gazowy</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>Reduktor wysokiego ciśnienia</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Reduktor wylotowy</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>Wyspa zaworowa o dużej prędkości 3/2-drożnej 8</td> Zawór zwrotny <td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inline Idex</td><td>Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32" OD x 3/32" ID Rury poliuretanowe</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4" OD X 0,17" ID Rury poliuretanowe</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16" PEEK</td><td>Rurki Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32" PEEK</td><td>Idex Zdrowie i Nauka</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>Złączki rurowe PEEK</td><td>Idex Zdrowie i nauka</td> Generator impulsów <td>P881</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Drut</td> aluminiowy HP <td>8110A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Firma Bob Martin</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 kolba hodowlana</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Tetrametylodamina, 3 000 MW, Anionowe</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Tetrametylodamina, 70 000 MW, Neutralny&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutralny</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Elektroporacja cieszy się coraz większym zainteresowaniem w ostatnich latach, ponieważ jest to bardzo skuteczna technika fizycznego wprowadzania do komórek egzogennych sond molekularnych. W ramach tej pracy opisano platformę elektroporacji mikroprzepływowej zdolną do dostarczania wielu cząsteczek do komórek ssaków z precyzyjną i zależną od molekularności kontrolą parametrów. Zdolność systemu do izolowania ogniw o jednolitym rozkładzie wielkości pozwala na mniejsze różnice w wydajności elektroporacji w zależności od danego natężenia pola elektrycznego; w związku z tym zwiększona żywotność próbki. Co więcej, funkcja wizualizacji procesu pozwala na obserwację procesu wychwytu molekularnego fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym, co pozwala na szybką korektę parametrów dostarczania molekularnego in situ w celu zwiększenia wydajności. Aby pokazać ogromne możliwości opisywanej platformy, makrocząsteczki o różnych rozmiarach i ładunkach elektrycznych (np. Dekstran o MW 3 000 i 70 000 Da) zostały dostarczone do komórek przerzutowego raka piersi z wysoką wydajnością dostarczania (>70%) dla wszystkich badanych cząsteczek. Opracowana platforma dowiodła swojego potencjału do wykorzystania w rozszerzaniu dziedzin badawczych, w których korzystne mogą być techniki elektroporacji w układzie scalonym.

Opracowany równoległy mikrofluidyczny elektroporator dostarczył makrocząsteczki o różnych rozmiarach i ładunkach elektrycznych do żywych komórek przerzutowego raka piersi. Skuteczność dostarczenia cząsteczek określono jakościowo poprzez monitorowanie zmian intensywności fluorescencji elektroporowanych komórek w ruchu in situ, a następnie potwierdzono za pomocą pomiarów ilościowych w analizie cytometrii przepływowej. Rycina 4A pokazuje, że 90% leczonych komórek pobrało neutralny dekstran o masie ...

Platforma elektroporacji wspomagana wirami mikroprzepływowymi została opracowana do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do identycznych populacji komórek z precyzyjną i niezależną kontrolą dawkowania. Etap oczyszczania komórek docelowych w oparciu o rozmiar, poprzedzający elektroporację, przyczynił się do zwiększenia wydajności dostarczania molekularnego i żywotności komórek przetworzonych.

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

Ogólnym celem tej procedury jest sekwencyjne dostarczanie różnych typów biologicznie istotnych cząsteczek w sposób kontrolowany pod względem dawki i o wysokiej wydajności przy użyciu mikroprzepływowego porera wspomaganego wirami (Vortex assisted microfluidic porer). Osiąga się to poprzez przygotowanie czterech probówek wiriówek o pojemności 50 ml, zawierających pojedynczo roztwory DPBS z komórkami i biomolekułami, a następnie przymocowanie każdej probówki do odpowiedniego uchwytu na fiolki połączonego z pneumatycznym systemem sterowania przepływem. Drugim krokiem jest wprowadzenie rurek wlotowych z każdej odpowiedniej fiolki do urządzenia mikroprzepływowego z wbudowanymi 15-pinowymi elektrodami. Następnie komórki są przepływane do urządzenia, gdzie zostają uwięzione w mikroskalowych wirach tworzących się w komorach do elektroporacji.Ostatnim krokiem jest przyłożenie krótkich impulsów elektrycznych do uwięzionych komórek, po czym bezzwłocznie wstrzykuje się roztwory zawierające biomolekuły przeznaczone do wprowadzenia do cytosolu. Ostatecznie komórki uzyskane w tym procesie mogą zostać uwolnione i zebrane do dalszych analiz. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi met

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirowaniem do sekwencyjnej dostawy cząsteczek

Opracowano nowy system mikrofluidyczny wykorzystujący zjawisko pompowania pasywnego oraz sterowany przez użytkownika system dostarczania płynów. Ze względu na niski koszt, łatwość obsługi, precyzję objętościową, wysoką prędkość, powtarzalność i automatyzację, system mikrofluidyczny ten ma potencjał do zastosowania w szerokim zakresie aplikacji biologicznych.

Szybki system dostarczania oparty na kropelkach do pompowania pasywnego w urządzeniach mikroprzepływowych

Opisano narzędzie oraz odczynniki do sekwencyjnej izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek z próbki, bez konieczności użycia energii elektrycznej. Narzędzie składa się z sorbentu umieszczonego w pipecie transferowej, natomiast odczynniki do izolacji opierają się na zasadach ekstrakcji do fazy stałej. Izolowane makrocząsteczki mogą być analizowane za pomocą testów immunologicznych oraz PCR.

Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Opisano protokół produkcji i obsługi urządzeń do odwadniania pól (Field-DW), a także wstępne badania wpływu pól elektrycznych na zawartość kropel.

Wykorzystanie zmniejszonej interakcji kropelka-powierzchnia w celu optymalizacji transportu bioanalitów w cyfrowej mikrofluidyce

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Ta praca dostarcza metody wytwarzania platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach oraz zastosowania mikrosfer poliakrylamidowych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Metoda microsphere-PCR umożliwia otrzymanie jednoniciowych amplikonów DNA bez rozdzielania dwuniciowego DNA.

Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Testy kropelek wody w oleju są przydatne do chemii analitycznej, ewolucji enzymów i analizy pojedynczych komórek, ale zazwyczaj wymagają mikrofluidyki do formowania kropel. W tym miejscu opisujemy emulgację z szablonami cząstek, bezprzepływowe podejście do wykonywania testów kropelkowych.

Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten protokół opisuje zminiaturyzowaną edycję genomu CRISPR–Cas9 receptora TCRα/β w pierwotnych ludzkich komórkach T za pomocą ‘DMF-ekcji’, platformy elektroporacji cyfrowych mikrofluidów (DMF). Metoda umożliwia równoległą edycję genów z małym zapotrzebowaniem na wysoką żywotność i jest ponadto przystosowana do dostarczania mRNA do wielowarstwowymi 3D kulistości.

Platforma elektroporacji cyfrowej mikrofluidycznej do edycji genomu CRISPR z niskim wejściem i transfekcji mRNA w zawiesinach limfocytów T oraz modelach komórkowych 3D

Poznaj mikrofluidyczną elektroporację wspomaganą wirami do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do komórek z wysoką wydajnością i zachowaniem ich żywotności. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę dawkowania.

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Przeglądaj więcej filmów