Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Ogólnym celem tej procedury jest sekwencyjne dostarczanie różnych typów biologicznie istotnych cząsteczek w sposób kontrolowany pod względem dawki i o wysokiej wydajności przy użyciu mikroprzepływowego porera wspomaganego wirami (Vortex assisted microfluidic porer). Osiąga się to poprzez przygotowanie czterech probówek wiriówek o pojemności 50 ml, zawierających pojedynczo roztwory DPBS z komórkami i biomolekułami, a następnie przymocowanie każdej probówki do odpowiedniego uchwytu na fiolki połączonego z pneumatycznym systemem sterowania przepływem. Drugim krokiem jest wprowadzenie rurek wlotowych z każdej odpowiedniej fiolki do urządzenia mikroprzepływowego z wbudowanymi 15-pinowymi elektrodami. Następnie komórki są przepływane do urządzenia, gdzie zostają uwięzione w mikroskalowych wirach tworzących się w komorach do elektroporacji.

Ostatnim krokiem jest przyłożenie krótkich impulsów elektrycznych do uwięzionych komórek, po czym bezzwłocznie wstrzykuje się roztwory zawierające biomolekuły przeznaczone do wprowadzenia do cytosolu. Ostatecznie komórki uzyskane w tym procesie mogą zostać uwolnione i zebrane do dalszych analiz. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że proponowana metoda umożliwia sekwencyjne dostarczanie kontrolowanej ilości wielu cząsteczek do wcześniej wyselekcjonowanej, identycznej populacji komórek przy wysokiej wydajności i przeżywalności.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki wymiany płynów są trudne do opanowania ze względu na czas trwania etapu przepływu zimnego przy każdym roztworze. Moment przełączenia determinuje stabilność wychwytywania komórek. W tym eksperymencie zostanie użyta linia komórkowa raka przerzutowego piersi M-D-A-M-B 2 31 w stężeniu 1 × 10⁵ komórek/ml w objętości 10 ml na kolbę hodowlaną T75, w podłożu Leibovitz's L 15 uzupełnionym o 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny.

Inkubować komórki z dodatkiem streptomycyny w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C w atmosferze 0% dwutlenku węgla. Dwa dni po wysianiu zebrać komórki do dalszych eksperymentów. Po przemyciu komórek buforem fosforanowym (PBS) lub DPBS potraktować je 0,25% trypsyną z EDTA przez dwie minuty.

Dodaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej, aby dezaktywować aktywność enzymatyczną; komórki odwirować przez pięć minut przy 200 ×g, a następnie resuspender w pożywce do końcowego stężenia 5 × 10⁵ komórek na mililitr. Projekt i wykonanie urządzenia do elektroporacji mikrofluidycznej nie zostaną pokazane w tym filmie, lecz są opisane w towarzyszącym mu manuskrypcie. System składa się z wlotów dla komórek, cząsteczek oraz roztworu płuczącego.

Dwa proste kanały, w których zachodzi ogniskowanie inercyjne. 10 komór do elektroporacji z elektrodami oraz wylot do konfiguracji eksperymentów przepływowych. W odpowiednich miejscach, poprzez otwory w mikrokanale, wprowadzić wylot, rurkę z polieteroketonu (PEEK) oraz 15-pinową aluminiową elektrodę do przyłożenia krótkich impulsów wysokiego napięcia.

Elektroda 15-pinowa składa się z 10 elektrod dodatnich i pięciu ujemnych. Każda elektroda dodatnia jest oddalona o 1,5 milimetra od elektrody ujemnej, natomiast każda elektroda o tej samej polaryzacji jest oddalona od siebie o 1,35 milimetra. Podłącz urządzenie elektryczne do generowania krótkich impulsów prostokątnych o wysokim napięciu do aluminiowych elektrod, które stykają się z przepływającymi roztworami.

W przypadku formy z PDMS sprzęt powinien składać się z generatora impulsów oraz zbudowanego wewnętrznie wzmacniacza wysokiego napięcia. Przygotuj cztery probówki do wirowania o pojemności 50 mililitrów, zawierające odpowiednio DPBS oraz roztwory z komórkami i cząsteczkami. Przymocuj każdą probówkę do odpowiedniego uchwytu na fiolki podłączonego do pneumatycznego systemu sterowania przepływem.

Podłączyć rurki wlotowe z uchwytów na fiolki do odpowiednich otworów wlotowych w urządzeniu mikroprzepływowym. Następnie ustawić napięcie impulsów prostokątnych na 100 voltów.

Aby natężenie pola elektrycznego w komorze do elektroporacji wynosiło 0,7 kV/cm, należy ustawić regulator ciśnienia na 40 PSIA. Do równomiernego ciśnienia wszystkich fiolek z próbkami wykorzystywany jest pojedynczy, ręcznie regulowany system zasilania azotem, który za pomocą szybkozłączy rozdzielacza umożliwia terminową aktywację poszczególnych portów z roztworami. Do sterowania zaworami służy dedykowane oprogramowanie LabVIEW.

Otwórz oprogramowanie LabVIEW oznaczone jako valve runner i wybierz opcję run z menu rozwijanego o nazwie Operate. Kliknij odpowiednią ikonę zaworu valve one, aby otworzyć zawór zbiornika DPBS w celu dostosowania prędkości przepływu niezbędnej do stabilnego wychwytywania komórek i generowania wirów przez 1,5 minutes. Ikona zaworu powinna zmienić kolor z szarego na zielony po aktywacji przepływu; przepuść jednocześnie roztwór płuczący oraz roztwór z komórkami przez urządzenie przez 10 seconds przed etapem wychwytywania komórek.

Aby zapewnić niezakłócony przepływ podczas etapu zmiany roztworu, ten krótki krok współprzepływu należy powtarzać przy każdej zmianie roztworu. Przełącz aktywny port roztworu z roztworu płuczącego na roztwór z komórkami, aby uwięzić komórki w komorze do elektroporacji na 30 sekund. Na tym filmie niebieskie sygnały fluorescencyjne reprezentują żywe haczyki.

Komórki w stadiach 3, 3, 3, 4, 5. Otwórz port płukący i przemyj urządzenie przez 20 sekund. W celu usunięcia nieuwięzionych zanieczyszczających komórek wprowadź roztwór zawierający pierwszą analizowaną cząsteczkę.

Jodek propidyny do urządzenia w celu wizualizacji. W tej demonstracji zamiast nici DExT znakowanych fluorescencyjnie zastosowano barwniki kwasów nukleinowych ze względu na lepszy stosunek sygnału do szumu tych barwników. Niezwłocznie po wstrzyknięciu roztworu molekularnego przyłóż pięć krótkich impulsów, monitorując w czasie rzeczywistym za pomocą oscyloskopu amplitudę i liczbę przyłożonych impulsów elektrycznych. Sygnały fluorescencyjne cząsteczek można wizualizować pod mikroskopem. Inkubuj komórki przez 100 sekund w roztworze molekularnym. Następnie wprowadź do urządzenia roztwór zawierający drugą cząsteczkę, barwnik kwasów nukleinowych yo-yo 1.

W tej demonstracji druga cząsteczka jest dostarczana bez dodatkowych impulsów elektrycznych. Ten film potwierdza, że komórki wykazują teraz wszystkie trzy sygnały fluorescencyjne: zielony dla yo-yo one, czerwony dla jodku propidynyum oraz niebieski dla hooks.

3, 3, 3, 4, 5. Przenieś komórki do płytki 96-dołkowej w celu przeprowadzenia dalszych analiz, obniżając ciśnienie robocze poniżej 5 PSI. Z każdego procesu uwalniania zbierane jest około 100 µL roztworu zawierającego 100 komórek.

Procedurę elektroporacji należy powtórzyć co najmniej trzykrotnie, aby zebrać wystarczającą liczbę komórek do wirowania przed cytometrią przepływową. Płytkę 96-dołkową zawierającą przetworzone komórki wirowano z prędkością 228 ×g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usunięto supernatant zawierający nadmiar cząsteczek fluorescencyjnych i resuspendowano komórki w DPBS.

W przypadku dostarczenia nici DExT znakowanych fluorescencyjnie, komórki poddano następnie analizie w celu oceny poboru molekularnego. Wydajność określono za pomocą cytometrii przepływowej. Skuteczność dostarczenia molekuł wyznaczono jakościowo poprzez monitorowanie zmian intensywności fluorescencji elektroporowanych komórek w C two, co potwierdziło, że 90% leczonych komórek pobrało anionową cząsteczkę nici DExT o masie 70 000 Dalton.

Wydajność dla każdej przetransportowanej cząsteczki dekstranu, zdefiniowana jako stosunek liczby komórek, które pomyślnie pobrały interesującą nas cząsteczkę, do całkowitej liczby przetworzonych komórek, nie różniła się znacząco w zależności od masy cząsteczkowej lub ładunków elektrycznych. Wszystkie badane cząsteczki dekstranu zostały dostarczone do cytozolu z wydajnością przekraczającą 70%. Przedstawione tutaj reprezentatywne profile cytometrii przepływowej dotyczą komórek, które nie zostały poddane elektroporacji. Próg fluorescencji wskazujący na pomyślne dostarczenie cząsteczek został ustalony na podstawie danych w taki sposób, aby sygnały z próbek kontrolnych znajdowały się poniżej tego progu.

Te reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej dla komórek poddanych sekwencyjnej elektroporacji przedstawiają wykres cytometrii przepływowej obok obrazów smug fluorescencyjnych; zielone ramki reprezentują sygnały z komórek pobierających wyłącznie neutralny dekstran o masie 3000 Da, a czerwone ramki reprezentują sygnały z komórek pobierających wyłącznie jonową nić DExT o masie 3000 Da; sygnały fluorescencyjne z komórek pobierających obie cząsteczki nici DExT, zaznaczone na żółto, wskazują na wydajność dostarczania obu cząsteczek na poziomie 56%. Po opracowaniu technika ta będzie użyteczna dla badaczy z dziedziny medycyny, biotechnologii i farmakologii w celu badania kombinacji odczynników terapeutycznych w celu osiągnięcia efektów synergistycznych w leczeniu złożonych chorób.

Należy pamiętać, że praca z impulsami elektrycznymi o wysokim napięciu może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak zapewnienie odpowiedniego uziemienia.