Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie różnych typów biologicznie znaczących cząsteczek w sposób sekwencyjny i kontrolowany dawką z wysoką wydajnością za pomocą porera mikroprzepływowego wspomaganego Vortex, osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie czterech 50-mililitrowych probówek wirówkowych indywidualnie zawierających roztwory DPBS z komórkami i biomolekułami oraz przymocowanie każdej probówki do odpowiedniego uchwytu na fiolkę podłączonego do pneumatycznego systemu kontroli przepływu. Drugim krokiem jest wprowadzenie rurek wlotowych z każdej odpowiedniej fiolki do urządzenia mikroprzepływowego z wbudowanymi 15-pinowymi elektrodami. Następnie komórki są przepływane do urządzenia, gdzie są uwięzione w wirach w mikroskali powstających w komorach elektroporacyjnych.

Ostatnim krokiem jest natychmiastowe zastosowanie krótkich impulsów elektrycznych do uwięzionych komórek, a następnie wstrzyknięcie roztworów zawierających biomolekuły, które mają zostać dostarczone do cytozolu. Ostatecznie komórki uzyskane w tym procesie mogą zostać uwolnione i zebrane do dalszej analizy. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że proponowana technika jest w stanie sekwencyjnie dostarczać kontrolowaną ilość wielu cząsteczek do wstępnie wyselekcjonowanej identycznej populacji komórek z wysoką wydajnością i żywotnością.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wymiany płynów są trudne do nauczenia, ponieważ czas kroku przepływu na zimno w każdym roztworze. Krok przełączania decyduje o stabilności pułapkowania komórek. Przerzutowa linia komórkowa raka piersi M-D-A-M-B 2 31 zostanie użyta na tej płytce eksperymentalnej jeden razy 10 do piątej komórki na mililitr w objętości 10 mililitrów na T 75 Kolba do hodowli tkankowej w pożywce Leibovitz L 15 uzupełniona o 10% objętości na objętość, płodową surowicę bydlęcą i 1% penicylinę.

Streptomycyna inkubuje komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 0% dwutlenku węgla. Dwa dni po wysianiu zbierz komórki do eksperymentów. Po umyciu komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanem bukos lub DPBS traktuj komórki 0,25% trypiną EDTA przez dwie minuty.

Dodaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej, aby dezaktywować komórki osadów aktywności enzymatycznej przez centryfuzję przez pięć minut w temperaturze 200 razy G i ponownie zawiesić pożywkę do końcowego stężenia pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr. Projekt i wykonanie urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej nie zostanie pokazane w tym filmie, ale jest opisane w dołączonym manuskrypcie. System składa się z wlotów dla komórek, cząsteczek i roztworu do spłukiwania.

Dwa proste kanały, w których występuje ogniskowanie inercyjne. 10 komór elektroporacyjnych z elektrodami i wyjściem do ustawień do eksperymentów przepływowych. Włóż wylot, polieter, eteroket lub rurkę szczytową oraz 15-pinową elektrodę aluminiową do krótkiego impulsu i wysokiego napięcia do wyznaczonych miejsc przez otwory w mikrokanaliku.

Elektroda 15-pinowa składa się z 10 elektrod dodatnich i pięciu elektrod ujemnych. Każda elektroda dodatnia jest oddalona od elektrody ujemnej o 1,5 milimetra, a każda elektroda o tej samej polaryzacji jest oddalona od siebie o 1,35 milimetra. Podłącz sprzęt elektryczny do generowania impulsów krótkiej fali prostokątnej o wysokim napięciu do aluminiowych elektrod, które stykają się z przepływającymi roztworami.

W formie PDMS sprzęt powinien składać się z generatora impulsów i zbudowanego we własnym zakresie wzmacniacza wysokiego napięcia. Przygotuj cztery 50-mililitrowe probówki wirówkowe zawierające pojedynczo DPBS i roztwory z komórkami i cząsteczkami. Podłączyć każdą probówkę do odpowiedniego uchwytu na fiolki podłączonego do pneumatycznego układu sterowania przepływem.

Podłączyć rurki wlotowe z uchwytów na fiolki do odpowiednich otworów wlotowych w urządzeniu mikroprzepływowym. Następnie ustaw. Wielkość impulsów fali prostokątnej wynosi wolty do 100 woltów.

Aby natężenie pola elektrycznego w komorze elektroporacyjnej było równoważne 0,7 kilowolta na centymetr. Ustaw regulator ciśnienia na 40 PSIA pojedyncze, ręcznie regulowane źródło azotu służy do równomiernego zwiększania ciśnienia we wszystkich fiolkach z próbkami i wykorzystuje kolektor o dużej prędkości do szybkiej aktywacji poszczególnych portów roztworu. Korzystanie z niestandardowego oprogramowania do podglądu laboratorium do sterowania zaworami.

Otwórz oprogramowanie widoku laboratorium oznaczone jako prowadnica zaworu i kliknij uruchom w menu rozwijanym zatytułowanym Operacja. Kliknij odpowiednią ikonę zaworu pierwszego, aby otworzyć zawór zbiornika DPBS w celu zalania prędkości przepływu wymaganej do stabilnego generowania wirów zatrzymujących komórki przez 1,5 minuty. Ikona zaworu powinna zmienić kolor z szarego na zielony, gdy jest aktywowany, zarówno mycie, jak i roztwory komórek jednocześnie przez urządzenie przez 10 sekund przed etapem pułapkowania komórek.

Aby zapewnić niezakłócony przepływ podczas etapu przełączania roztworu, ten krótki krok przepływu co należy powtarzać na każdym etapie przełączania roztworu. Przełącz port roztworu aktywnego z roztworu myjącego na roztwór ogniwa, aby uwięzić komórki w komorze elektroporacyjnej na 30 sekund. W tym filmie niebieskie sygnały fluorescencyjne reprezentują realne haki.

Ogniwa 3, 3, 3, 4, 5 stopniowe. Włącz port mycia i płucz urządzenie przez 20 sekund. W celu usunięcia uwięzionych komórek zanieczyszczających nont przepływa roztwór zawierający pierwszą cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania.

Jodek propidyny do urządzenia w celach wizualizacyjnych. W tej demonstracji zamiast znakowanych fluorescencyjnie nici DExT stosuje się barwniki kwasu nukleinowego ze względu na lepszy stosunek szumu do sygnału barwników, które stosują pięć krótkich impulsów natychmiast po wstrzyknięciu roztworu molekularnego, monitorują wielkość i liczbę zastosowanych impulsów elektrycznych w czasie rzeczywistym za pomocą oscyloskopu, sygnały fluorescencyjne cząsteczek można wizualizować pod mikroskopem, Inkubuj komórki przez 100 sekund w roztworze molekularnym. Następnie przepływ, roztwór zawierający drugą cząsteczkę, kwas nukleinowy barwnik jo-jo do urządzenia.

W tej demonstracji druga cząsteczka jest dostarczana bez dodatkowych zastosowań impulsów elektrycznych. Ten film potwierdza, że komórki wyrażają teraz wszystkie trzy sygnały fluorescencyjne. Zielony dla jo-jo, jeden, czerwony dla propidy, jodku i niebieski dla haczyków.

3, 3, 3, 4, 5. Uwolnij ogniwa do 96-dołkowej płytki w celu dalszej analizy, obniżając ciśnienie robocze poniżej pięciu PSI. Z każdego uwolnienia pobiera się około 100 mikrolitrów roztworu ze 100 komórkami.

Procedurę elektroporacji należy powtórzyć co najmniej trzy razy, aby zebrać wystarczającą ilość komórek do wirowania metodą cytometrii przepływowej. Płytka 96-dołkowa zawierająca przetworzone komórki w temperaturze 228 razy G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usuń supernatant zawierający nadmiar cząsteczek fluorescencyjnych i ponownie zawieś komórki w DPBS.

Jeśli dostarczono fluorescencyjnie znakowane nici DExT, komórki są następnie analizowane pod kątem wychwytu molekularnego. Skuteczność za pomocą cytometrii przepływowej. Pomyślne dostarczenie molekularne zostało jakościowo określone przez monitorowanie zmian w intensywności fluorescencji elektroporowanych komórek orbitujących w C dwa, co potwierdziło, że 90% leczonych komórek wychwytuje 70 000 daltonów jonowej cząsteczki nici DExT.

Wydajność dla każdej przeniesionej cząsteczki dekstranu, zdefiniowana jako stosunek liczby komórek, które pomyślnie wchłonęły cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania, do całkowitej liczby przetworzonych komórek nie różniła się istotnie w zależności od masy cząsteczkowej lub ładunków elektrycznych. Wszystkie badane cząsteczki dekstranu zostały dostarczone do cytozolu ze skutecznością większą niż 70%Pokazane tutaj są nasze reprezentatywne profile cytometrii przepływowej dla komórek, które nie zostały poddane elektroporacji. Próg fluorescencyjny wskazujący na pomyślne dostarczenie molekularne jest ustalany na podstawie danych w taki sposób, aby sygnały z próbek kontrolnych znajdowały się poniżej progu.

Te reprezentatywne dane cytometrii przepływowej dla komórek sekwencyjnie elektroporowanych wyświetlają wykres cytometrii przepływowej obok obrazów smug fluorescencyjnych, zielone pola reprezentują sygnały z komórek pobierających 3000, tylko daltonowy neutralny dekstran, a czerwone pola reprezentują sygnały z komórek. Wychwyt 3000 Daltonów, jonowa nić DExT, tylko sygnały fluorescencyjne z komórek wychwytujących, obie cząsteczki nici DExT pokazane na żółto wskazują na wydajność dostarczania podwójnej cząsteczki wynoszącą 56%Po jej opracowaniu. Technika ta będzie przydatna dla naukowców z dziedziny medycyny, biotechnologii i farmakologii w celu zbadania kombinacji odczynników terapeutycznych w celu osiągnięcia synergicznych efektów w leczeniu złożonych chorób.

Nie zapominaj, że praca z impulsami elektrycznymi o wysokim napięciu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak upewnienie się, że jesteś uziemiony.