Wielopoziomowa mikrodysekcja i profilowanie funkcjonalno-strukturalne gałęzi tętniczych ludzkiego nerki

Nasze badania mają na celu opracowanie ustandaryzowanych metod izolacji i funkcjonalnej oceny ludzkich gałęzi tętnic nerkowych, odkrycie mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych i ukierunkowanie terapii celowanych. Wcześniejsze badania opierały się na modelach zwierzęcych lub obrazowaniu pośrednim, w którym nasza miografia drutowa bezpośrednio odzwierciedla funkcję ludzkiej tętnicy nerkowej in vitro. Nasza metoda umożliwia precyzyjną, specyficzną dla człowieka analizę naczyniową, przezwyciężając ograniczenia gatunkowe i usprawniając opracowywanie leków translacyjnych.

Na początek upewnij się, że tkanka nerkowa pozostaje całkowicie zanurzona w płynie podczas transportu, aby utrzymać żywotność tkanki i integralność strukturalną. Wizualnie zidentyfikuj płaszczyznę koronalną, lokalizując wnękę nerki i wyrównując cięcie tak, aby przechodziło zarówno przez miedniczkę nerkową, jak i boczną wypukłą granicę. Za pomocą sterylnego skalpela przetnij nerkę wzdłuż tej płaszczyzny koronalnej, aby utworzyć dwie symetryczne połówki i odsłonić struktury wewnętrzne, takie jak piramidy i kolumny nerkowe.

Pod mikroskopem stereoskopowym użyj nożyczek do mikrodysekcji i kleszczy, aby skrupulatnie oddzielić tętnice międzypłatowe, łukowate i międzyzrazikowe w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym z czarnym dnem. Następnie delikatnie usuń otaczającą tkankę i tłuszcz z wypreparowanych tętnic w tym samym 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym z czarnym dnem, aby dokładnie je oczyścić. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji pokrój oczyszczone tętnice na pierścienie o długości około dwóch milimetrów w celu zbadania funkcji naczyń krwionośnych.

Ostrożnie włóż pierwszy przewód doprowadzający do pierścienia tętniczego w naczyniu. Zegnij jedną stronę drutu prowadzącego pod kątem 90 stopni i przenieś pierścień tętniczy z drutem do komory. Przed zamocowaniem pierścienia tętniczego na uchwycie próbki należy zanotować długość naczynia.

Umieść pierścień między dwoma uchwytami i odczytaj skalę mikrometryczną, gdzie jedna działka skali równa się 10 mikrometrom. Odejmij początkową wartość skali zmierzoną, gdy uchwyty po prostu się stykają, aby obliczyć długość i szerokość pierścienia tętniczego. Następnie przymocuj pierścień tętniczy do uchwytu na próbkę typu małż za pomocą dostarczonych przez przyrząd, dokręcając je w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.

Następnie przeciągnij drugi przewód prowadzący przez pierścień tętniczy. Owiń drut zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół mocujących na obu końcach, mocno przymocowując go do powierzchni uchwytu próbki. Wybierz Ustawienia normalizacji z menu DMT i ustaw kalibrację okularu na jeden milimetr na działkę, ciśnienie docelowe na 13.3 kilopaskala, IC1/IC100 na 0.9, czas uśredniania online na trzy sekundy i czas opóźnienia na 60 sekund.

Wybierz kanał odpowiadający tętnicy docelowej i otwórz ekran Normalizacja z menu DMT. W odpowiednich polach wprowadź punkty końcowe tkanki, ponieważ a1 równa się zero, a a2 równa się zmierzonej długości naczynia w milimetrach. Wprowadź średnicę drutu jako 40 mikrometrów i wprowadź odczyt mikrometru ze skali.

Kliknij przycisk Dodaj punkt, aby zapisać dane. Teraz zastosuj pasywne rozciąganie i odczekaj trzy minuty. Wprowadź nowy odczyt mikrometru jako następny punkt i kliknij Dodaj punkt.

Dodaj pięć mililitrów 60 roztworu jonów potasu do komory, aby wywołać skurcz naczynia za pośrednictwem potasu. Aby wypłukać 60 roztworów jonów potasu, dodaj trzy razy pięć mililitrów roztworu Krebsa. Aby ocenić skurcz wywołany przez fenylefrynę, zależny od stężenia, należy zastosować skumulowaną fenylefrynę w krokach co pół logarytmu od 10 do potęgi ujemnych dziewięciu do 10 do potęgi ujemnych czterech zębów trzonowych.

W celu przeprowadzenia dodatkowych testów na obecność narkotyków należy przemyć komorę ciepłymi pięcioma mililitrami roztworu Krebsa co najmniej pięć razy, aż napięcie powróci do wartości podstawowej i pozostanie stabilne przez co najmniej 10 minut. Tętnica międzypłatowa została pomyślnie wycięta z rdzenia nerkowego, ukazując grubą ścianę naczyniową i otaczającą tkankę tłuszczową, która wymagała starannego usunięcia w celu zachowania integralności strukturalnej. Tętnica łukowata została odizolowana w połączeniu korowo-rdzeniowym, wykazując cieńszą ścianę naczyniową i łukowatą trajektorię.

Zidentyfikowano tętnicę międzyzrazikową biegnącą liniowo przez korę nerkową o bardzo cienkiej ściance i ściśle zintegrowanej z tkanką korową. Analiza histologiczna wykazała, że tętnica międzypłatowa miała najgrubszą ścianę naczyniową z wyraźną przydanką, podczas gdy tętnice łukowate i międzyzrazikowe wykazywały coraz cieńsze ściany i mniej warstw mięśni gładkich. Normalizacja tętnic polegała na wielokrotnym rozciąganiu mechanicznym i stymulacji wywołanej potasem, ustalając stabilne warunki napięcia wyjściowego we wszystkich próbkach.

Skumulowane dodanie fenylefryny od 10 do potęgi od minus 9 do 10 do potęgi ujemnych stężeń 4 molowych indukowało stopniowo silniejsze skurcze w pierścieniach tętniczych w sposób zależny od dawki. W tętnicach z fenylefryną zwiększenie stężenia acetylocholiny z 10 do potęgi ujemnej 8 do trzech razy 10 do potęgi ujemnych 5 molowych powodowało zależne od stężenia rozszerzenie naczyń krwionośnych.