Wielopoziomowa mikrodysekcja i profilowanie funkcjonalno-strukturalne gałęzi tętniczych ludzkiego nerki
5 września 2025
W artykule przedstawiono krok po kroku protokół izolacji i oceny funkcjonalnej ludzkich gałęzi tętnic nerkowych, ułatwiający badania przedkliniczne w celu opracowania farmaceutycznego.
Nasze badania mają na celu opracowanie ustandaryzowanych metod izolacji i funkcjonalnej oceny ludzkich gałęzi tętnic nerkowych, odkrycie mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych i ukierunkowanie terapii celowanych. Wcześniejsze badania opierały się na modelach zwierzęcych lub obrazowaniu pośrednim, w którym nasza miografia drutowa bezpośrednio odzwierciedla funkcję ludzkiej tętnicy nerkowej in vitro. Nasza metoda umożliwia precyzyjną, specyficzną dla człowieka analizę naczyniową, przezwyciężając ograniczenia gatunkowe i usprawniając opracowywanie leków translacyjnych.
Na początek upewnij się, że tkanka nerkowa pozostaje całkowicie zanurzona w płynie podczas transportu, aby utrzymać żywotność tkanki i integralność strukturalną. Wizualnie zidentyfikuj płaszczyznę koronalną, lokalizując wnękę nerki i wyrównując cięcie tak, aby przechodziło zarówno przez miedniczkę nerkową, jak i boczną wypukłą granicę. Za pomocą sterylnego skalpela przetnij nerkę wzdłuż tej płaszczyzny koronalnej, aby utworzyć dwie symetryczne połówki i odsłonić struktury wewnętrzne, takie jak piramidy i kolumny nerkowe.
Pod mikroskopem stereoskopowym użyj nożyczek do mikrodysekcji i kleszczy, aby skrupulatnie oddzielić tętnice międzypłatowe, łukowate i międzyzrazikowe w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym z czarnym dnem. Następnie delikatnie usuń otaczającą tkankę i tłuszcz z wypreparowanych tętnic w tym samym 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym z czarnym dnem, aby dokładnie je oczyścić. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji pokrój oczyszczone tętnice na pierścienie o długości około dwóch milimetrów w celu zbadania funkcji naczyń krwionośnych.
Ostrożnie włóż pierwszy przewód doprowadzający do pierścienia tętniczego w naczyniu. Zegnij jedną stronę drutu prowadzącego pod kątem 90 stopni i przenieś pierścień tętniczy z drutem do komory. Przed zamocowaniem pierścienia tętniczego na uchwycie próbki należy zanotować długość naczynia.
Umieść pierścień między dwoma uchwytami i odczytaj skalę mikrometryczną, gdzie jedna działka skali równa się 10 mikrometrom. Odejmij początkową wartość skali zmierzoną, gdy uchwyty po prostu się stykają, aby obliczyć długość i szerokość pierścienia tętniczego. Następnie przymocuj pierścień tętniczy do uchwytu na próbkę typu małż za pomocą dostarczonych przez przyrząd, dokręcając je w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.
Następnie przeciągnij drugi przewód prowadzący przez pierścień tętniczy. Owiń drut zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół mocujących na obu końcach, mocno przymocowując go do powierzchni uchwytu próbki. Wybierz Ustawienia normalizacji z menu DMT i ustaw kalibrację okularu na jeden milimetr na działkę, ciśnienie docelowe na 13.3 kilopaskala, IC1/IC100 na 0.9, czas uśredniania online na trzy sekundy i czas opóźnienia na 60 sekund.
Wybierz kanał odpowiadający tętnicy docelowej i otwórz ekran Normalizacja z menu DMT. W odpowiednich polach wprowadź punkty końcowe tkanki, ponieważ a1 równa się zero, a a2 równa się zmierzonej długości naczynia w milimetrach. Wprowadź średnicę drutu jako 40 mikrometrów i wprowadź odczyt mikrometru ze skali.
Kliknij przycisk Dodaj punkt, aby zapisać dane. Teraz zastosuj pasywne rozciąganie i odczekaj trzy minuty. Wprowadź nowy odczyt mikrometru jako następny punkt i kliknij Dodaj punkt.
Dodaj pięć mililitrów 60 roztworu jonów potasu do komory, aby wywołać skurcz naczynia za pośrednictwem potasu. Aby wypłukać 60 roztworów jonów potasu, dodaj trzy razy pięć mililitrów roztworu Krebsa. Aby ocenić skurcz wywołany przez fenylefrynę, zależny od stężenia, należy zastosować skumulowaną fenylefrynę w krokach co pół logarytmu od 10 do potęgi ujemnych dziewięciu do 10 do potęgi ujemnych czterech zębów trzonowych.
W celu przeprowadzenia dodatkowych testów na obecność narkotyków należy przemyć komorę ciepłymi pięcioma mililitrami roztworu Krebsa co najmniej pięć razy, aż napięcie powróci do wartości podstawowej i pozostanie stabilne przez co najmniej 10 minut. Tętnica międzypłatowa została pomyślnie wycięta z rdzenia nerkowego, ukazując grubą ścianę naczyniową i otaczającą tkankę tłuszczową, która wymagała starannego usunięcia w celu zachowania integralności strukturalnej. Tętnica łukowata została odizolowana w połączeniu korowo-rdzeniowym, wykazując cieńszą ścianę naczyniową i łukowatą trajektorię.
Zidentyfikowano tętnicę międzyzrazikową biegnącą liniowo przez korę nerkową o bardzo cienkiej ściance i ściśle zintegrowanej z tkanką korową. Analiza histologiczna wykazała, że tętnica międzypłatowa miała najgrubszą ścianę naczyniową z wyraźną przydanką, podczas gdy tętnice łukowate i międzyzrazikowe wykazywały coraz cieńsze ściany i mniej warstw mięśni gładkich. Normalizacja tętnic polegała na wielokrotnym rozciąganiu mechanicznym i stymulacji wywołanej potasem, ustalając stabilne warunki napięcia wyjściowego we wszystkich próbkach.
Skumulowane dodanie fenylefryny od 10 do potęgi od minus 9 do 10 do potęgi ujemnych stężeń 4 molowych indukowało stopniowo silniejsze skurcze w pierścieniach tętniczych w sposób zależny od dawki. W tętnicach z fenylefryną zwiększenie stężenia acetylocholiny z 10 do potęgi ujemnej 8 do trzech razy 10 do potęgi ujemnych 5 molowych powodowało zależne od stężenia rozszerzenie naczyń krwionośnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolowania i funkcjonalnej oceny ludzkich gałęzi tętnic nerek, poprawiając badania przedkliniczne w zakresie rozwoju leków. Metoda ta pozwala na bezpośrednią ocenę funkcji naczyń krwionośnych człowieka, radząc sobie z ograniczeniami poprzednich modeli na zwierzętach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia naczyń
- Rozwój farmaceutyczny
Tło
- Poprzednie badania opierały się na modelach zwierzęcych lub pośrednich technikach obrazowania.
- Myografia drutowa zapewnia bezpośrednią ocenę funkcji ludzkiej tętnicy nerkowej in vitro.
- Zrozumienie dysfunkcji naczyń jest kluczowe dla opracowania ukierunkowanych terapii.
- Standaryzowane metody są konieczne dla dokładnej funkcjonalnej oceny.
Cel badania
- Ustanowić protokół izolowania ludzkich gałęzi tętnic nerek.
- Ocenić właściwości funkcjonalne tych tętnic.
- Poprawić translacyjny rozwój leków poprzez stosowanie ludzkich modeli.
Stosowane metody
- Izolowanie tętnic nerek za pomocą technik mikrodyssekcji.
- Ocena funkcjonalna poprzez myografię drutową.
- Indukowanie skurczu za pomocą roztworów jonów potasu i fenyloefryn.
- Analiza histologiczna struktury tętnic.
Główne wyniki
- Udana dysekcja tętnic międzypłaszczyznowych, łukowatych i międzypłaszczyznowych.
- Wykazane skurcze zależne od dawki w odpowiedzi na fenyloefrynę.
- Ustanowienie stabilnych warunków napięcia początkowego w próbkach.
- Rozkurcz obserwowany w wstępnie skurczonej tętnicach z acetylocholiną.
Wnioski
- Protokół pozwala na precyzyjną analizę funkcjonalną ludzkich tętnic nerek.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów dysfunkcji naczyń.
- Zwiększa potencjał opracowania ukierunkowanych terapii w chorobach naczyń nerek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized microdissection and functional profiling of human renal arterial branches address a critical gap in translational vascular research, enabling direct interrogation of human-specific mechanisms underlying renal vascular dysfunction. This approach enhances predictive confidence for target validation and mechanistic de-risking in early-stage drug discovery, particularly for renal and cardiovascular portfolios. By providing reproducible, quantitative vascular reactivity data, the protocol supports risk-adjusted advancement decisions and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional assessment of human renal arteries, overcoming species translation barriers.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying vasomotor responses to pharmacological agents.
- Facilitates robust target validation through reproducible, quantitative contractility and relaxation data.
- Provides structural-functional correlation for pathway clarification in renal vascular disease.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, human-relevant vascular assay systems for compound evaluation.
- Standardizes normalization and measurement protocols to ensure reproducibility across studies.
- Generates quantitative outputs suitable for comparative screening of vasoactive compounds.
- Enables scalability and platform reuse for diverse pharmacological interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional vascular readouts with disease-relevant human tissue, enhancing translational continuity.
- Supports biomarker development by linking structural and functional vessel characteristics.
- Reduces late-stage biological risk by providing human-specific preclinical data.
- Informs risk-adjusted progression of renal and cardiovascular therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through preclinical validation, providing a bridge between target identification and translational research in renal vascular disease.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via direct human vessel analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative contractility and relaxation data for compound profiling.
- Analytics: Provides standardized measurements of vasomotor responses and vessel structure.
- Translational Research: Ensures continuity by using human tissue models relevant to clinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for functional vascular assessment across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in renal vascular research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable functional assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by providing robust human data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of renal and cardiovascular assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection, histology, and wire myography instrumentation.
- Demands access to high-quality human renal tissue and specialized analytical infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of normalization and measurement protocols.
- May require adaptation for different arterial branch sizes and tissue conditions.
- Dependent on tissue viability and precise anatomical identification for reproducible results.
