Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji
July 25th, 2016
Komórki rosnące w środowisku trójwymiarowym (3D) reprezentują wyraźną poprawę w stosunku do hodowli komórek w środowiskach 2D (np. kolby lub szalki). W tym artykule opisano rozwój wielokomórkowego 3-wymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelita ludzkiego hodowanej w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktory o obrotowych ściankach i naczyniach (RWV).
Ogólnym celem tej procedury jest opisanie rozwoju wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelita ludzkiego hodowanej w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktory o obrotowych ściankach. Metoda ta ma szeroki potencjał jako narzędzie odkrywcze zarówno w dziedzinie zdrowia, jak i choroby. W tym interakcje z patogenami, transport antygenów i procesy zapalne.
Głównymi zaletami tej techniki jest naśladowanie różnorodności fenotypowej kota oraz zastosowanie bioreaktorów naczyniowych D-12, które umożliwiają wydajną dyfuzję składników odżywczych i tlenu. Zacznij od odkręcenia nakrętki z otworu napełniania naczynia hodowlanego i dodania 50 mililitrów naszego PMI. Gdy naczynie jest pełne, załóż nakrętkę i wytrzyj rozlane medium 70% etanolem.
Pozostawić naczynie do inkubacji przez co najmniej 15 minut do nocy w temperaturze pokojowej. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, użyj portu napełniania, aby wyrzucić pożywkę hodowlaną i dodaj 30 mililitrów pożywki 3D do naczynia. Załóż korek na króciec napełniania i ponownie wytrzyj rozlane medium 70% etanolem.
Wyjąć z inkubatora kolby zawierające ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej i ludzkie fibroblasty okrężnicy z inkubatora i przemyć je dwukrotnie PBS. Następnie odłącz komórki, przykrywając je 0,25% roztworem trypsyny z 0,05% trypsyną EDTA. Po odłączeniu komórek zbierz je w 50-mililitrowej tubie wstępnie załadowanej 30 mililitrami DMEM zawierającymi 30% FBS.
Wirować probówkę przez 10 minut, aby granulować komórki. Następnie ponownie zawieś komórki w 30 mililitrach DMEM zawierającym 30% FBS. Następnie rozcieńczyć 20 mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek 20 mikrolitrami niebieskiego barwnika trypanowego.
Załaduj hemocytometr mieszaniną komórek i policz stężenie żywych komórek. Następnie ponownie zawieś każdy typ komórki na poziomie od 50 do 80 milionów komórek na mililitr w DMEM zawierającym 30% FBS. Najpierw umieść odpowiednią liczbę wkładek kulturowych w dołkach sześciodołkowej płytki.
Następnie przygotuj mieszaninę kolagenu, dodając najpierw 10x DMEM, 10x pożywkę do rozpuszczania, 200 milimolową L-glutaminę i podgrzej inaktywowany FBS do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie dodaj kolagen bydlęcy typu pierwszego, lamininę, kolagen typu czwartego, fibronektynę, proteoglikan siarczanu heparyny, a na koniec dodaj wodorotlenek sodu, aby zneutralizować pH roztworu. Jeśli w dowolnym momencie mieszanina zmieni kolor na żółtawy i kwaśny, dodaj kilka kropli sterylnego 1 normalnego wodorotlenku sodu, aby zneutralizować mieszaninę.
Zamknij probówkę i wymieszaj roztwór, odwracając go kilka razy, unikając tworzenia się pęcherzyków. Gdy nie mieszasz, trzymaj roztwór na lodzie, aby zapobiec jego polimeryzacji. Po wymieszaniu dodaj zawiesiny komórkowe do preparatu kolagenowego i wymieszaj probówki, delikatnie odwracając probówki kilka razy, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
Następnie umieść je z powrotem na lodzie. Dodaj cztery do pięciu mililitrów roztworu komórki zawierającej kolagen do każdej wkładki i pozwól kolagenowi żelować w kapturze z niewielkim lub żadnym ruchem przez godzinę. Po godzinie przenieś sześciodołkową płytkę do inkubatora na jedną do dwóch dodatkowych godzin.
Następnie umieść płytkę z powrotem w kapturze do hodowli tkankowej i użyj pary sterylnych kleszczy i skalpela, aby aseptycznie odciąć membranę od wkładki. Oderwij komórkę zawierającą żel od membrany, a następnie pokrój oderwany żel na małe kwadraty. Dodaj małą komórkę zawierającą kwadraty kolagenu do jednego z wstępnie napełnionych 50-mililitrowych naczyń za pomocą portu napełniania.
Następnie należy przygotować zawiesinę ludzkich komórek nabłonkowych HCT-8 zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 10 milionów komórek na mililitr w DMEM zawierającym 30% FBS. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek HCT-8 do 50-mililitrowego naczynia za pomocą jego portu napełniania.
Po dodaniu komórek dodaj dodatkowe 20 mililitrów pożywki hodowlanej 3D do naczynia, tak aby było prawie pełne. Załóż korek i zwilż krawędź portu napełniania 70% etanolem. Następnie umieść pięciomililitrową strzykawkę zawierającą trzy do czterech mililitrów pożywki 3-D w jednym porcie naczynia, a pustą pięciomililitrową strzykawkę w drugim porcie.
Usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki, wciągając do pustej strzykawki, podczas gdy mniej więcej taka sama objętość pożywki jest wstrzykiwana przez drugą strzykawkę do naczynia. Po usunięciu całego powietrza umieść naczynia w bioreaktorze, włącz zasilanie i ustaw prędkość na 13 do 14 obrotów na minutę. W razie potrzeby dostosuj prędkość, aby zapobiec kontaktowi komórek ze ścianami naczynia.
Hoduj komórki w mikrograwitacji i zmieniaj pożywkę co trzy do czterech dni. Aby zmienić pożywkę, użyj metody podwójnej strzykawki, aby zastąpić około 30 mililitrów zużytej pożywki świeżą pożywką 3D. Po trzech do pięciu dniach w hodowli wyizolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.
Następnie wyjmij naczynie z bioreaktora i dodaj około 20 milionów komórek składających się z limfocytów i monocytów do naczyń przez port napełniania. Umieść naczynia z powrotem w bioreaktorze i kulturze na dodatkowe cztery do sześciu dni. Około dziewiątego dnia hodowli dodaj do naczynia dodatkowe 20 milionów komórek składających się z limfocytów i monocytów i kontynuuj hodowle przez maksymalnie 12 dodatkowych dni.
Pod koniec eksperymentu użyj pipety transferowej, aby zebrać każdy mały fragment żelu, zwany teraz konstruktem, i umieść go w dołkach sześciodołkowej płytki zawierającej 10 mililitrów 10% buforu formaliny. Utrwal konstrukcje na trzy godziny w temperaturze pokojowej, a następnie postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami osadzania histologicznego, sekcji i barwienia. Metody przedstawione w tym filmie pozwalają na stworzenie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelita ludzkiego.
W hodowli mikrograwitacyjnej komórki stają się dobrze zróżnicowane i tworzą uporządkowane, przypominające kosmki cechy do 20 dnia. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu sześciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przestrzeganiu dobrych wytycznych dotyczących hodowli komórkowych.
Kluczowe znaczenie ma systematyczna kontrola komórek pod kątem żywotności, zanieczyszczenia mykoplazmą i zmian w zachowaniu wzrostu komórek. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia, w celu identyfikacji markerów linii i różnicowania komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować wielokomórkowy 3-wymiarowy model organotypowy błony śluzowej ludzkiego jelita hodowanej w warunkach mikrograwitacji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje rozwój wielokomórkowego 3-D modelu organotypowego ludzkiej błony śluzowej jelita wyhodowanego w warunkach mikrograwitacji przy użyciu bioreaktorów z obracającą się ścianą (RWV). Ten innowacyjny podejście poprawia hodowlę komórek w porównaniu z tradycyjnymi metodami 2-D.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania mikrograwitacji
Tło
- Modele hodowli komórek 3-D lepiej naśladują warunki in vivo.
- Środowiska mikrograwitacji mogą wpływać na zachowanie komórek i ich interakcje.
- Bioreaktory z obracającą się ścianą ułatwiają dyfuzję składników odżywczych i tlenu.
- Rozumienie błony śluzowej jelita jest kluczowe dla badań nad zdrowiem i chorobami.
Cel badania
- Opracowanie 3-D modelu organotypowego ludzkiej błony śluzowej jelita.
- Zbadanie interakcji komórkowych w środowisku mikrograwitacji.
- Dostarczenie platformy do badania mechanizmów zdrowia i chorób.
Stosowane metody
- Wykorzystanie bioreaktorów z obracającą się ścianą do hodowli komórek.
- Przygotowanie wielokomórkowego modelu do symulacji błony śluzowej jelita.
- Ocenę interakcji i reakcji komórkowych.
- Ocenę efektywności dyfuzji składników odżywczych i tlenu.
Główne wyniki
- Model 3-D z powodzeniem naśladował fenotypowe zróżnicowanie komórek jelitowych.
- Warunki mikrograwitacji wpłynęły na zachowanie komórek i ich interakcje.
- Model wykazał potencjał do badania interakcji patogenów i procesów zapalnych.
- W bioreaktorze osiągnięto efektywną dyfuzję składników odżywczych i tlenu.
Wnioski
- Opracowany model jest znaczącym postępem w technologii hodowli komórek.
- Oferuje nowe wglądy w mechanizmy zdrowia i chorób jelit.
- To podejście może być cennym narzędziem dla przyszłych badań biomedycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa grown under microgravity provides a physiologically relevant system for studying host-pathogen interactions, antigen trafficking, and inflammatory processes. By mimicking in vivo tissue architecture and cellular diversity, the model enhances predictive confidence in preclinical target validation and mechanistic de-risking. It supports translational continuity from discovery through preclinical stages by enabling reproducible, quantitative assessment of mucosal responses in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving epithelial-immune interactions in a multicellular human intestinal mucosa model.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining differentiated, villus-like structures under microgravity conditions.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in early-stage target selection by modeling human mucosal complexity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening of compounds affecting barrier function or immune modulation.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled microgravity culture and defined cell seeding ratios.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple experimental runs with consistent construct formation by day 20.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Models human intestinal mucosa with epithelial, endothelial, fibroblast, and lymphocyte components for disease-relevant studies.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal culture up to 30 days with stable phenotypic features.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of inflammatory processes and pathogen interactions in a controlled, human-derived system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical modeling, particularly for gastrointestinal and immunology-focused pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mucosal immune responses and epithelial integrity in a human-relevant 3-D system.
- Screening: Delivers quantitative outputs via histological and immunohistochemical readouts after construct fixation and sectioning.
- Analytics: Enables comparison of cellular localization, differentiation markers, and structural organization across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through sustained culture of multicellular constructs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, rotatable bioreactor-based platform applicable across multiple intestinal disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through phenotypic diversification and villus-like morphogenesis under microgravity.
- Operational Value: Standardization via defined cell seeding, collagen gelation, and bioreactor speed control (13–14 rpm).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage failure risk from poor target selection in mucosal targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on effects in a complex, human-derived intestinal model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, 3-D gel preparation, and bioreactor operation.
- Dependence on rotating-wall-vessel bioreactors (HARV/STLV) and sterile, bubble-free fluid handling.
- Necessitates cross-team standardization for cell sourcing, collagen mixing, and medium change schedules.
- Adaptation considerations include scaling cell types and ratios for different mucosal regions or disease states.
- Practical limitations include extended culture timelines (up to 30 days) and sensitivity to shear stress if bioreactor speed is not properly adjusted.
