Name: Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę tworzenia wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka w warunkach mikrograwitacji przy użyciu bioreaktorów RWV. Technika ta umożliwia badanie interakji komórkowych i mechanizmów chorobowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez NIAID, NIH, DHHS federalne granty badawcze R01 AI036525 i U19 AI082655 (CCHI) dla MBS oraz przez grant NIH DK048373 dla AF. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych lub Narodowych Instytutów Zdrowia.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie próbki krwi zostały pobrane od ochotników, którzy uczestniczyli w protokole o numerze HP-00040025-1. Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Uniwersytetu Maryland zatwierdziła ten protokół i zezwoliła na pobranie próbek krwi od zdrowych ochotników do badań zawartych w tym manuskrypcie. Cel tego badania został wyjaśniony ochotnikom, a wszyscy ochotnicy wyrazili świadomą, podpisaną zgodę przed pobraniem krwi.
Uwaga: Patrz Tabela 1 dla przygotowania pożywki suplementu. Patrz Tabela 2 w celu przygotowania pożywek 3-D.
1. Przygotowanie naczyń hodowlanych
<ol>
	<li>Odkręcić nakrętkę otworu napełniania naczynia o pojemności 50 ml i napełnić 50 ml sterylnej pożywki hodowlanej (np. RPMI). Wszystkie zabiegi wykonuj w sterylnych warunkach w okapie laminarnym.</li>
	<li>Załóż nakrętkę i wytrzyj rozlane medium na dowolnej powierzchni 70% etanolem.</li>
	<li>Pozostawić naczynie do inkubacji przez co najmniej 15 minut do O/N przy suchej temperaturze rynkowej.</li>
	<li>Użyj portu do napełniania, aby wyrzucić pożywkę hodowlaną i dodać 30 ml pożywki 3D.</li>
	<li>Wytrzyj rozlane medium na dowolnej powierzchni 70% etanolem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Ludzka linia komórek nabłonkowych (HCT-8)24,40.
	<ol>
		<li>Komórki hodowlane w RPMI uzupełnione 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 50 μg/ml gentamycyny, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM buforu HEPES i 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (suplement 1). Przy 70% konfluencji podziel komórki w stosunku 1:5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ludzkie fibroblasty okrężnicy (komórki CCD-18Co)24,41.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek w pożywce Basal Eagle wzbogacona o suplement 1. Przy zbieganiu podziel komórki w stosunku 1:3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)24,42.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek w pożywce Endothelial Basal Medium (EBM) wzbogacona o 100 μg/ml heparyny, 3 μg/ml suplement wzrostu komórek śródbłonka (ECGS) i suplement 1. Przy 70% konfluencji podziel komórki w stosunku 1:2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Limfocyty/monocyty
	<ol>
		<li>Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) z krwi przez wirowanie w gradiacji gęstości przy użyciu standardowych technik43.
		<ol>
			<li>Krótko, używając pipety o pojemności 10 ml, ostrożnie dodać 30 ml rozcieńczonej krwi (krew 1:1: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki wirowej o dużej gęstości. Po etapie wirowania limfocyty i monocyty będą znajdować się w "białej" warstwie między pożywką wirującą o gęstości a warstwami osocza.</li>
			<li>Zebrać białą warstwę za pomocą pipety transferowej. Unikaj zanieczyszczenia granulocytów, ograniczając zbieranie pożywki wirowej o dużej gęstości. Po umyciu43 należy użyć PBMC w takim stanie, w jakim jest, lub w stanie kriokonserwowanym w płynie N2, 
			Uwaga: Należy podkreślić, że PBMC w dużej mierze składa się z limfocytów i monocytów, z niewielkim udziałem komórek dendrytycznych i innych typów komórek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodować wszystkie komórki w standardowych warunkach hodowli w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek osadzonych w kolagenie
<ol>
	<li>Określ liczbę potrzebnych wkładek na podstawie liczby warunków eksperymentalnych, które należy ustawić. Umieść odpowiednią liczbę wkładek w dołkach płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę HUVEC i fibroblastów:
	<ol>
		<li>Przemyć kolby dwukrotnie w PBS i odłączyć komórki za pomocą trypsyny, 0,25% (1x) z 0,05% etylenodiaminotetraoctanu trypsyny i tetrasodu (Trypsin-EDTA). Dodaj tyle roztworu trypsyny, aby pokryć całą powierzchnię hodowli komórkowej. Oderwanie następuje zwykle w ciągu 5 do 15 minut</li>
		<li>Zebrać oderwane komórki w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml pożywki Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) -30% pożywki FBS.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 30 ml pożywki DMEM-30% FBS.</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę żywotnych komórek, rozcieńczając 20 μl zawieszonych komórek 20 μl barwnika błękitu trypanowego. Załaduj hemocytometr mieszaniną komórek. Żywotne PBMC będą białe czyste; nieżywotny PBMC uzyska barwnik i stanie się niebieski.
		<ol>
			<li>Ponownie zawiesić każdy typ komórek w pożywce DMEM-30% FBS o stężeniu 5 - 8 x 107 komórek ml- 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komórkowe żele kolagenowe 
	nuta: Każde naczynie będzie wymagało przygotowania ~5 ml żelu kolagenowego zawierającego komórki.
	<ol>
		<li>W stożkowej probówce o pojemności 50 ml przygotuj mieszaninę kolagenu, dodając 1 x pożywkę DMEM, uzupełnioną 50 μg/ml gentamycyny, 2 mM L-glutaminy i 10% inaktywowanego termicznie FBS oraz 3 mg/ml kolagenu bydlęcego-I, 10 μg/ml lamininy, 40 μg/ml kolagenu IV, 10 μg/ml fibronektyny, 2 μg/ml proteoglikanu siarczanu heparyny i 15 mM NaOH (w celu osiągnięcia fizjologicznego pH).</li>
		<li>Zamknij probówkę i wymieszaj, odwracając kilka razy, aż mieszanina będzie w pełni homogenizowana. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. 
		WAŻNE: Trzymaj mieszaninę na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.
		<ol>
			<li>Krok krytyczny: Jeśli mieszanina ma kwaśny wygląd (żółtawy kolor), dodaj kilka kropli sterylnego 1 N NaOH, aby zneutralizować mieszaninę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do mieszaniny wzbogaconego kolagenu (opisanej powyżej) dodać odpowiednio skoncentrowany HUVEC i fibroblasty o gęstości 1,0 - 1,2 i 1,5 - 2,0 x 106 komórek/ml. Zamknij probówki i wymieszaj, odwracając kilka razy, aż mieszanina będzie w pełni homogenizowana. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. WAŻNE: Trzymaj mieszaninę na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.</li>
		<li>Dodaj 4 - 5 ml komórkowego żelu kolagenowego do każdej wkładki, uprzednio załadowanej do płytki 6-dołkowej i pozostaw do żelowania w kapturze z niewielkim lub żadnym ruchem przez 1 godzinę.</li>
		<li>Po 1 godzinie przenieść 6-dołkową płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na dodatkowe 1-2 godziny.</li>
		<li>Umieść 6-dołkową płytkę z powrotem w kapturze i za pomocą sterylnych kleszczyków i skalpela aseptycznie odetnij membranę od wkładki, odrywając od niej żel zawierający komórki. Pokrój oderwany żel na małe kwadraty (~5 x 5 mm).</li>
		<li>Dodaj małe kwadraty zawierające komórki do 50-mililitrowego HARV za pomocą portu napełniania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek nabłonka HCT-8:
	<ol>
		<li>Umyć kolby dwukrotnie w PBS i odłączyć komórki za pomocą trypsyny, 0,25% (1x) z traktowaniem Trypsyny-EDTA. Dodaj tyle roztworu trypsyny, aby pokryć całą powierzchnię hodowli komórkowej. Oderwanie następuje zwykle w ciągu 10 do 15 minut.</li>
		<li>Zebrać oderwane komórki w 30 ml pożywki DMEM-30% FBS.</li>
		<li>Wirówka DMEM-30% FBS zawierająca probówkę o pojemności 500 x g przez 10 min.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 30 ml pożywki DMEM-30% FBS.</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę żywotnych komórek, jak opisano w ppkt 3.2.5.</li>
		<li>Zawiesić komórki nabłonkowe HCT-8 w pożywce DMEM-30% FBS w stężeniu 107 komórek ml-1.</li>
		<li>Dodać 1 ml skoncentrowanych komórek nabłonka HCT-8 do 50 ml HARV za pomocą portu napełniania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z portu napełniania, dodaj dodatkową pożywkę hodowlaną 3D, aż naczynie będzie prawie pełne (~20 ml).</li>
	<li>Załóż korek i przetrzyj krawędź portu napełniania 70% etanolem.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę w każdym porcie strzykawki RWV: umieścić strzykawkę o pojemności 5 ml zawierającą 3-4 ml pożywki 3-D w jednym porcie, a pustą strzykawkę o pojemności 5 ml w drugim porcie.</li>
	<li>Usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki, wciągając do pustej strzykawki, podczas gdy mniej więcej taka sama objętość pożywki jest wstrzykiwana przez drugi port strzykawki.</li>
	<li>Umieść naczynia w bioreaktorze, włącz zasilanie i ustaw prędkość na około 13 do 14 obrotów na minutę. 
	Uwaga: Krok krytyczny: Szybkość rotacji może być konieczna kilkukrotna regulacja podczas eksperymentu, aby utrzymać komórki krążące w naczyniu, unikając w ten sposób kontaktu ze ściankami naczynia.</li>
	<li>Hodowla komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w warunkach mikrograwitacji, dostarczana przez bioreaktor RWV.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 3-4 dni, zastępując około 30 ml świeżą pożywką 3-D.</li>
	<li>Po 4 dniach (±1 dniu) wyjmij naczynia z bioreaktora i dodaj limfocyty/monocyty do naczyń (2 x 107/naczynie).</li>
	<li>Umieścić naczynia z powrotem w bioreaktorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na dodatkowe 5 dni (±1 dzień).</li>
	<li>Po dodatkowych 5 dniach (9 dzień hodowli) dodaj limfocyty/monocyty do naczyń (2 x 107 / naczynie) i kontynuuj hodowle przez maksymalnie 12 dodatkowych dni.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 3-4 dni, zastępując około 30 ml świeżą pożywką 3-D.</li>
</ol>
4. Pobieranie kultur 3D do badań histologicznych
<ol>
	<li>Za pomocą pipety transferowej zebrać każdy mały fragment żelu, zwany teraz "konstruktem", do sześciodołkowej płytki zawierającej 10 ml 10% buforu formaliny. Pozostawić na 3 godziny w temperaturze pokojowej lub na 12 - 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj kasety do przetwarzania tkanek i zatapiania, etykietując i dodając dwa kawałki podkładek piankowych do biopsji do każdej kasety.</li>
	<li>Zanurz kasety w 10% buforze formalinowym.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść stałe konstrukcje między dwiema piankowymi podkładkami.</li>
	<li>Zanurz kasety w 10% buforze formalinowym.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami osadzania, dzielenia i barwienia44.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że w Urzędzie Patentów i Znaków Towarowych Stanów Zjednoczonych złożono nietymczasowe zgłoszenie patentowe w USA (numer: 13/360,539).

W tym manuskrypcie opisujemy rozwój bioinżynieryjnego modelu błony śluzowej jelita ludzkiego składającego się z wielu typów komórek, w tym pierwotnych ludzkich limfocytów, fibroblastów i komórek śródbłonka, a także linii komórkowych nabłonka jelitowego24. W tym modelu 3D komórki są hodowane w bogatej w kolagen macierzy zewnątrzkomórkowej w warunkach mikrograwitacji24.
Jak opisano wcześniej, głównymi cechami tego modelu są: (i) zdolność do naśladowania org...

Pierwszy przełom w budowie modelu 3D został odnotowany na początku lat 80., kiedy naukowcy zaczęli badać różne typy rusztowań (np. lamininę, kolagen typu I, kolagen IV i fibronektynę) oraz koktajle czynników wzrostu, aby poprawić interakcje komórka-komórka i ECM w "statycznych" modelach 3D1-7. Od tego czasu głównym problemem związanym z tymi modelami były ograniczenia w przenoszeniu składników odżywczych i tlenu w pożywce i konstruktach tkankowych8. W przeciwieństwie do komórek w środowisku in vivo, które otrzymuje stały przepływ składników odżywczych i tlenu z otaczających sieci naczyń krwionośnych, statyczny charakter tych modeli utrudnia ich efektywną dystrybucję do komórek. Na przykład agregaty komórkowe generowane w modelach statycznych in vitro, które przekraczają kilka milimetrów, niezmiennie rozwijają niedotlenione, martwicze jądra9. Bioreaktory RWV mogą obejść ten problem, zapewniając dynamikę płynów, która umożliwia wydajną dyfuzję składników odżywczych i tlenu 10-12. Jednak do tej pory prace z wykorzystaniem bioreaktorów RWV ograniczały się do włączenia jednego lub dwóch typów komórek 13-17. Co więcej, zamiast orientacji przestrzennej podobnej do tkanek natywnych, komórki te tworzyły agregaty komórkowe. Głównym powodem tych ograniczeń był brak rusztowania zdolnego do zintegrowanego łączenia komórek. Rusztowania stosowane do tej pory w bioreaktorach RWV składają się, z nielicznymi wyjątkami 16-18, głównie z mikrokulek syntetycznych, cylindrów rurowych lub małych arkuszy 13-15,19-23. Są to sztywne materiały, których składem i elastycznością nie można manipulować, a do których komórki są przymocowane do ich powierzchni. W związku z tym jest mało prawdopodobne, że modele te zapewnią system, w którym można będzie oceniać, w sposób zintegrowany, różne składniki komórek, takie jak komórki zrębu (np. fibroblasty, komórki odpornościowe i śródbłonka), które powinny być rozproszone w rusztowaniu, aby ściśle naśladować tkankę ludzką.
Tutaj opisujemy rozwój wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej ludzkiego jelita, składającego się z linii komórek nabłonka jelitowego oraz pierwotnych ludzkich limfocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów24. Komórki te hodowano w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktor RWV 13,25-30. W naszym modelu 3D ECM posiada wiele odrębnych właściwości, takich jak osmolalność podobna do pożywki hodowlanej (np. znikome ograniczenia dyfuzyjne podczas hodowli) oraz zdolność do włączania komórek i innych istotnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej, a także odpowiednią sztywność do stosowania w bioreaktorach24. Systemy biologiczne są bardzo złożone, a w ciągu ostatnich kilku lat nastąpiła zmiana punktu ciężkości badań nad błonami śluzowymi w kierunku badania interakcji komórek z otoczeniem, a nie badania ich w izolacji. W szczególności znaczenie interakcji komórka-komórka w wpływie na przeżycie i różnicowanie komórek jelitowych jest dobrze udokumentowane 31-34. W szczególności komunikacja między komórkami nabłonkowymi a ich niszą ma głęboki wpływ na ekspansję i różnicowanie komórek nabłonka 35. Rzeczywiście, powszechnie przyjmuje się, że nie tylko interakcje między komórkami, ale także między komórkami mają kluczowe znaczenie dla utrzymania i różnicowania komórek nabłonkowych w modelach hodowli 3D. Wcześniejsze badania wykazały, że białka jelitowe ECM, takie jak kolagen I 24,36,37, laminina 38 i fibronektyna 39, odgrywają zasadniczą rolę w wpływaniu na komórki nabłonka jelitowego w celu uzyskania orientacji przestrzennej podobnej do natywnej błony śluzowej. W związku z tym rozwój nowych technologii, takich jak nasz model 3D24, które mogą naśladować różnorodność fenotypową jelit, jest konieczny, jeśli naukowcy zamierzają odtworzyć złożoną architekturę komórkową i strukturalną oraz funkcję mikrośrodowiska jelitowego. Modele te stanowią ważne narzędzie w opracowywaniu i ocenie nowych leków doustnych i potencjalnych szczepionek.

<table><tbody><tr><td>Bioreaktor z poczwórnym rotatorem/niezależnym naczyniem o obrotowych ściankach (RWV)&nbsp;</td><td>Synthecon</td><td>RCCs-4DQ</td><td>Do 4 zbiorników. Dostępne są również modele z większą lub mniejszą liczbą naczyń.</td></tr><tr><td>Jednorazowe naczynie 50 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td>Pudełko z 4 naczyniami</td></tr><tr><td>HCT-8 komórek nabłonkowych&nbsp;</td><td>Fibroblasty ATCC</td><td>CCL-244</td><td></td></tr><tr><td>CCD-18Co&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów HUVEC-Basic&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>bFGF</td></tr><tr><td>Czynnik komórek macierzystych&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7901</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu hepatocytów&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1404</td><td>HGF</td></tr><tr><td>Endothelin 3</td><td>Sigma</td><td>E9137</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Wyizolowany z mysiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego guza Engelbreth-Holm-Swarm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V7259</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę VEGF&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-4377(</td><td>LIF</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-trijodo-L-tyronina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-6397</td><td>T3</td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma</td><td>C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>BD</td><td>354008</td><td>Wyizolowana z ludzkiego osocza</td></tr><tr><td>apo-Transferyna</td><td>Sigma</td><td>T-1147</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan heparanu&nbsp; proteoglycan</td><td>Sigma</td><td>H4777</td><td>Izolowany z błony podstawnej myszy&nbsp; Engelbreth-Holm-Swarm tumor</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Wyizolowany z ludzkiego łożyska</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM, puder</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina&ndash; PBS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen bydlęcy typu I&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomincyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>BME</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Śródbłonek Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM-2</td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>ECGS</td></tr></tbody></table>

opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Ponieważ komórki rosnące w trójwymiarowym (3-D) środowisku mają potencjał, aby wypełnić wiele luk w hodowli komórek w środowiskach 2-D (np. kolbach lub szalkach). W rzeczywistości powszechnie uznaje się, że komórki hodowane w kolbach lub szalkach mają tendencję do różnicowania się i utraty wyspecjalizowanych cech tkanek, z których pochodzą. Obecnie istnieją głównie dwa rodzaje systemów hodowli 3D, w których komórki są umieszczane w rusztowaniach naśladujących natywną macierz zewnątrzkomórkową (ECM): (a) modele statyczne i (b) modele wykorzystujące bioreaktory. Pierwszym przełomem były statyczne modele 3D. Modele 3D wykorzystujące bioreaktory, takie jak bioreaktory o obrotowych ściankach i zbiornikach (RWV), są nowszym osiągnięciem. Oryginalna koncepcja bioreaktorów RWV została opracowana w NASA Johnson Space Center na początku lat 90. i uważa się, że przezwycięża ograniczenia modeli statycznych, takie jak rozwój niedotlenionych, martwiczych rdzeni. Bioreaktory RWV mogą obejść ten problem, zapewniając dynamikę płynów, która umożliwia efektywną dyfuzję składników odżywczych i tlenu. Bioreaktory te składają się z podstawy rotatora, która służy do podtrzymywania i obracania dwóch różnych formatów naczyń hodowlanych, które różnią się typem źródła napowietrzania: (1) wolno obracające się naczynia boczne (STLV) ze współosiowym natleniaczem pośrodku lub (2) naczynia o wysokim współczynniku kształtu (HARV) z natlenianiem za pomocą płaskiej membrany do przenoszenia gazu z kauczuku silikonowego. Zbiorniki te umożliwiają wydajny transfer gazu przy jednoczesnym unikaniu tworzenia się pęcherzyków i wynikających z tego turbulencji. Warunki te skutkują przepływem laminarnym i minimalną siłą ścinającą, która modeluje zmniejszoną grawitację (mikrograwitację) wewnątrz naczynia hodowlanego. W niniejszym artykule opisano opracowanie wielokomórkowego 3-D organotypowego modelu błony śluzowej jelita ludzkiego składającego się z linii komórek nabłonka jelitowego oraz pierwotnych ludzkich limfocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów hodowanych w warunkach mikrograwitacji dostarczanych przez bioreaktor RWV.

Wcześniej opracowaliśmy wielokomórkowy trójwymiarowy model organotypowy błony śluzowej jelita ludzkiego, składający się z linii komórkowej nabłonka jelitowego oraz pierwotnych ludzkich limfocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów hodowanych w warunkach mikrograwitacji24 (Rysunek 1). Fibroblasty i komórki śródbłonka osadzono w macierzy z kolagenu I wzbogaconej o dodatkowe białka błony podstawnej jelit45 (tj. lamininę, kolagen IV, fibronektyn...

Komórki rosnące w środowisku trójwymiarowym (3D) reprezentują wyraźną poprawę w stosunku do hodowli komórek w środowiskach 2D (np. kolby lub szalki). W tym artykule opisano rozwój wielokomórkowego 3-wymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelita ludzkiego hodowanej w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktory o obrotowych ściankach i naczyniach (RWV).

Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis opracowania wielokomórkowego trójwymiarowego (3-D) modelu organotypowego błony śluzowej jelita człowieka, hodowanego w warunkach mikrograwitacji zapewnianych przez bioreaktory z obrotową ścianą naczynia. Metoda ta wykazuje szeroki potencjał jako narzędzie badawcze zarówno w stanach zdrowia, jak i w przebiegu chorób, obejmując interakcje z patogenami, transport antygenów oraz procesy zapalne.Głównymi zaletami tej techniki są naśladowanie różnorodności fenotypowej kota oraz zastosowanie bioreaktorów w naczyniach D-12, które umożliwiają efektywną dyfuzję składników odżywczych i tlenu. Rozpocznij od odkręcenia nakrętki z portu napełniającego naczynie hodowlane i dodania 50 mililitrów PMI. Po napełnieniu naczynia zamknij je nakrętką i przetrzyj rozlane medium 70% etanolem.Inkubować naczynie przez co najmniej 15 minut lub przez noc w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji odessać pożywkę hodowlaną przez port napełniający i dodać do naczynia 30 mililitrów pożywki do hodowli 3-D. Zakręcić port napełniający i ponownie przetrzeć wszelkie rozlane krople pożywki 70% etanolem.Wyjmij z inkubatora kolby z niemal konfluencyjnymi ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępkowej oraz ludzkimi fibroblastami okalniczymi i przemyj je dwukrotnie PBS. Następnie odklej komórki, pokrywając je 0,25% roztworem trypsyny z 0,05% trypsyną EDTA. Po odklejeniu komórek zbierz je do probówki o pojemności 50 ml zawierającej uprzednio 30 ml DMEM z 30% FBS.Odwirować probówkę przez 10 minut w celu osadzenia komórek. Następnie zawiesić komórki ponownie w 30 mililitrach DMEM zawierającego 30% FBS. Dalej, 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej rozcieńczyć 20 mikrolitrami barwnika trypan blue.Napełnij komorę countingową hemocytometrem mieszaniną komórek i określ stężenie żywych komórek. Następnie zawieś każdy typ komórek w stężeniu od 50 do 80 milionów komórek na mililitr w pożywce DMEM zawierającej 30% FBS. W pierwszej kolejności umieść odpowiednią liczbę insertów hodowlanych w dołkach płytki sześciodołkowej.Następnie przygotuj mieszaninę kolagenu, dodając najpierw 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 millimolar L-glutamine oraz inaktywowaną ciepłem FBS do probówki stożkowej o pojemności 50 milliliter. Następnie dodaj bovine collagen type one, laminin, collagen type four, fibronectin, heparin sulfate proteoglycan, a na koniec dodaj wodorotlenek sodu, aby zneutralizować pH roztworu. Jeśli w dowolnym momencie mieszanina nabierze żółtawego koloru charakterystycznego dla środowiska kwasowego, dodaj kilka kropel sterylnego 1 normal sodium hydroxide, aby zneutralizować mieszaninę.Zamknąć probówkę i wymieszać roztwór, kilkakrotnie go odwracając, unikając przy tym powstawania pęcherzyków powietrza. Poza procesem mieszania przechowywać roztwór w lodzie, aby zapobiec jego polimeryzacji. Po wymieszaniu dodać zawiesiny komórkowe do preparatu kolagenowego i wymieszać zawartość probówek, delikatnie odwracając je kilka razy, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.Następnie należy umieścić je z powrotem na lodzie. Do każdego insertu dodać od czterech do pięciu mililitrów roztworu kolagenu zawierającego komórki i pozostawić kolagen do żelowania w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez jedną godzinę, unikając lub ograniczając ruchy. Po godzinie przenieść płytkę 6-dołkową do inkubatora na dodatkowe jedną do dwóch godzin.Następnie należy przenieść płytkę z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą sterylnej pęsety oraz skalpela aseptycznie wyciąć membranę z insertu. Oddzielić żel zawierający komórki od membrany, a następnie pociąć oddzielony żel na małe kwadraty. Przenieść małe kwadraty kolagenu z komórkami do jednego z wcześniej napełnionych naczyń o pojemności 50 milliliter, korzystając z otworu wlewowego.Następnie przygotuj zawiesinę ludzkich komórek nabłonkowych HCT-8 zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Zawiesić komórki w stężeniu 10 milionów komórek na mililitr w pożywce DMEM zawierającej 30% FBS. Następnie, za pomocą otworu wlewowego, dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek HCT-8 do naczynia o pojemności 50 mililitrów.Po dodaniu komórek do naczynia należy dolać dodatkowe 20 mililitrów pożywki do hodowli 3-D, aż będzie ono prawie pełne. Zakręcić naczynie i zwilżyć krawędź otworu wlewowego 70% etanolem. Następnie w jednym z portów naczynia umieścić strzykawkę o pojemności pięciu mililitrów zawierającą od trzech do czterech mililitrów pożywki do hodowli 3-D, a w drugim porcie pustą strzykawkę o pojemności pięciu mililitrów.Usuń wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza, wciągając je do pustej strzykawki, podczas gdy w podobnej objętości medium jest wstrzykiwane przez drugą strzykawkę do naczynia. Po usunięciu całego powietrza umieść naczynia w bioreaktorze, włącz zasilanie i ustaw prędkość na 13 do 14 obrotów na minutę. Dostosuj prędkość w razie potrzeby, aby zapobiec kontaktowi komórek ze ściankami naczynia.Hoduj komórki w warunkach mikrograwitacji, wymieniając pożywkę co trzy do czterech dni. W celu wymiany pożywki zastosuj metodę dwóch strzykawek, aby zastąpić około 30 mililitrów zużytej pożywki świeżą pożywką do hodowli 3D. Po trzech do pięciu dniach hodowli wyizoluj mononuklearne komórki krwi obwodowej zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Następnie wyjmij naczynie z bioreaktora i poprzez port napełniający dodaj do naczynia około 20 milionów komórek składających się z limfocytów i monocytów. Umieść naczynia z powrotem w bioreaktorze i inkubuj przez kolejne cztery do sześciu dni. Około dziewiątego dnia hodowli dodaj do naczynia kolejne 20 milionów komórek składających się z limfocytów i monocytów i kontynuuj hodowlę przez maksymalnie 12 dodatkowych dni.Po zakończeniu eksperymentu należy za pomocą pipety transferowej zebrać każdy mały fragment żelu, zwany odtąd konstruktem, i umieścić go w dołkach płytki sześcio-dołkowej zawierającej 10 ml 10% buforu formaliny. Konstrukty należy utrwalać przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzić standardowe protokoły zatopienia w materiale histologicznym, krojenia i barwienia. Metody przedstawione w tym filmie pozwalają na stworzenie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego ludzkiej błony śluzowej jelita.W hodowli w warunkach mikrograwitacji komórki ulegają pełnemu zróżnicowaniu i do 20. dnia tworzą uporządkowane struktury przypominające kosmki. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu sześciu godzin, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przestrzeganie zasad dobrej praktyki hodowli komórkowych.Kluczowe jest systematyczne kontrolowanie żywotności komórek, zanieczyszczenia mykoplazmami oraz zmian w dynamice wzrostu komórek. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak immunohistochemia, w celu identyfikacji markerów linii komórkowych i różnicowania komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak opracować wielokomórkowy trójwymiarowy (3-D) model organotypowy ludzkiej błony śluzowej jelita hodowany w warunkach mikrograwitacji.

development-multicellular-three-dimensional-organotypic-model-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Poznaj metodę tworzenia wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka w warunkach mikrograwitacji przy użyciu bioreaktorów RWV. Technika ta umożliwia badanie interakji komórkowych i mechanizmów chorobowych.

Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji

Przeglądaj więcej filmów