Name: Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-05T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj zaktualizowany protokół montażu minibioreaktorów MBRA do badania dynamiki mikrobiomu jelitowego. Ta metoda umożliwia skalowalne, wysokoprzepustowe hodowle mikroorganizmów z zachowaniem powtarzalności wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez NIH T32 Molecular Basis of Infectious Disease Predoctoral Fellowship, NIH T32DK007664 oraz NIH U19AI157981 Microbiome Discovery and Mechanisms to Combat Antibiotic Resistance at Mucosal Surfaces.
Autorzy dziękują Haydenowi Curnynowi za jego wkład w projektowanie i produkcję uchwytów bioreaktorów i uchwytów rurek stosowanych w tym systemie.
Rysunek 2 i rysunek 3 zostały częściowo utworzone w https://BioRender.com

<ol><li>Gilbert, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the human microbiome.</a> Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+simple+state+communities+to+study+microbial+interactions%3A+examples+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions.</a> Front Microbiol. 13, 801864(2022).</li>
<li>Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+de+Wiele%2C+T+%22The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+in+vitro+and+ex+vivo+models%22">The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models</a>. , Springer. Cham. (2015).</li>
<li>McDonald, J. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microbial+community+reproducibility%2C+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li>
<li>Feria-Gervasio, D., Denis, S., Alric, M., Brugère, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maintenance+of+a+human+proximal+colon+microbiota+using+the+continuous+fermentation+system+P-ECSIM%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).</li>
<li>Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiniBioReactor+arrays+%28MBRAs%29+as+a+tool+for+studying+C.+difficile+physiology+in+the+presence+of+a+complex+community%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community.</a> Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).</li>
<li>Robinson, C. D., Auchtung, J. M., Collins, J., Britton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemic+Clostridium+difficile+strains+demonstrate+increased+competitive+fitness+compared+to+nonepidemic+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates.</a> Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).</li>
<li>Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+stable%2C+reproducible+microbial+communities+from+different+fecal+donors+using+minibioreactor+arrays+%28MBRAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs).</a> Microbiome. 3 (1), 42(2015).</li>
<li>Auchtung, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+simplified+microbial+communities+that+inhibit+Clostridioides+difficile+infection+through+dilution%2Fextinction%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction.</a> mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).</li>
<li>Hobson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiniBioReactor+array+%28MBRA%29+in+vitro+gut+model%3A+A+reliable+system+to+study+microbiota-dependent+response+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22JAC+Antimicrob+Resist%22%5BJournal%5D)">MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment.</a> JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).</li>
<li>Auchtung, T. A., Lerma, A. I., Schuchart, K., Auchtung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+effects+of+antibiotics+across+preclinical+models+of+the+human+gastrointestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota.</a> Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).</li>
<li>Naimi, S., Viennois, E., Gewirtz, A. T., Chassaing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+impact+of+commonly+used+dietary+emulsifiers+on+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota.</a> Microbiome. 9 (1), 66(2021).</li>
<li>Bolyen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interactive%2C+scalable+and+extensible+microbiome+data+science+using+QIIME+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2.</a> Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).</li>
<li>Hobson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbiota-dependent+response+to+anticancer+treatment+in+an+in+vitro+human+microbiota+model%3A+a+pilot+study+with+hydroxycarbamide+and+daunorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin.</a> Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).</li>
<li>Jensen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fiber+monosaccharide+content+alters+gut+microbiome+composition+and+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation.</a> Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).</li>
<li>Ghimire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+synergistic+effects+of+quercetin+and+rice+bran+on+human+gut+microbiota+reduces+Enterobacteriaceae+family+abundance+and+elevates+propionate+in+a+bioreactor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model.</a> Front Microbiol. 12, 751225(2021).</li>
<li>Hu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minibioreactor+arrays+to+model+microbiome+response+to+alcohol+and+tryptophan+in+the+context+of+alcohol-associated+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).</li>
<li>Jens, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBRA-2%3A+A+modified+chemostat+system+to+culture+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms.</a> Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Protokół ten opisuje kompletny montaż i podstawową obsługę macierzy minibioreaktorów (MBRA) do wysokowydajnej hodowli społeczności bakteryjnych, wprowadzając kilka kluczowych udoskonaleń do wcześniej opublikowanej metody. System MBRA pozostaje wszechstronnym i opłacalnym narzędziem, które umożliwia naukowcom hodowlę złożonych ekosystemów mikrobiologicznych przy jednoczesnym wspieraniu wielu replik eksperymentalnych. W tej zaktualizowanej wersji wprowadzamy ulepszenia, które zwiększają odtwarzalność, usprawniają przepływ pracy i zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia. Należą do nich chemicznie trawione słomki PTFE (rysunek 2), aby zapobiec odklejaniu, słomka zasilająca na linii mediów (rysunek 2) w celu zminimalizowania tworzenia się biofilmu, znormalizowane długości rurek z dołączonym uchwytem na rurki wydrukowanym w 3D (plik uzupełniający 3) dla bardziej kompaktowej i zorganizowanej konfiguracji oraz zoptymalizowany protokół ponownego użycia, który eliminuje potrzebę pełnego demontażu między eksperymentami. Łącznie te udoskonalenia stanowią iteracyjne ulepszenia opracowane dzięki szerokiemu wykorzystaniu systemu MBRA w różnych zastosowaniach eksperymentalnych w naszym laboratorium. Odnosząc się zarówno do krytycznych etapów montażu, jak i praktycznych ulepszeń, dyskusja ta podkreśla użyteczność MBRA jako stale rozwijającego się systemu modelowego do badań nad mikrobiomem.
Sukces systemu MBRA zależy w dużej mierze od precyzyjnego montażu i sterylizacji komponentów w celu zapewnienia pracy bez zanieczyszczeń. Kluczowe kroki obejmują prawidłowy montaż nasadek, przewodów i złączy serii Q, które ułatwiają montaż modułowy i umożliwiają wprowadzanie mediów oraz zbieranie odpadów. Zapewnienie szczelnego uszczelnienia między butelkami z mediami, zbiornikami na odpady i komorami bioreaktora ma zasadnicze znaczenie dla zapobiegania wyciekom i utrzymania sterylnych warunków. Kolejnym krytycznym krokiem jest weryfikacja natężenia przepływu pompy perystaltycznej przed eksperymentami, ponieważ niespójności mogą prowadzić do nierównomiernego dostarczania pożywki i mogą wpływać na dynamikę wzrostu drobnoustrojów. Większość wielokanałowych pomp perystaltycznych wykorzystujących kasety zawiera mechanizm regulacji okluzji, który powinien być używany do precyzyjnego dostrojenia natężenia przepływu każdego kanału. Nawet przy prawidłowej kalibracji rurki E-lab pozostają głównym źródłem zmienności. Aby temu zapobiec, ważne jest wizualne monitorowanie częstotliwości i wielkości kropel pożywki wchodzących do każdej komory bioreaktora zarówno podczas początkowego napełniania, jak i na początku eksperymentów. Te kontrole wizualne pozwalają na wczesne wykrycie niespójności natężenia przepływu, które w przeciwnym razie mogłyby zagrozić odtwarzalności eksperymentalnej. Tabela 2 zawiera strategie rozwiązywania typowych problemów napotkanych podczas montażu i użytkowania MBRA. Te kroki rozwiązywania problemów zapewniają powtarzalność między eksperymentami i zapobiegają zakłóceniom podczas długotrwałej uprawy.
Pomimo swoich mocnych stron, system MBRA ma pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów. W przeciwieństwie do bardziej zaawansowanych systemów, MBRA nie ma możliwości aktywnego monitorowania, takich jak pomiary gęstości optycznej (OD) w czasie rzeczywistym, kontrola pH i regulacja temperatury. Ten brak aktywnego pomiaru ogranicza zdolność systemu do monitorowania dynamicznych zmian we wzroście drobnoustrojów i aktywności metabolicznej w czasie rzeczywistym. Ponadto, chociaż system obsługuje uprawę beztlenową w komorach, nie obejmuje zintegrowanej kontroli gazów, co może ograniczać zastosowania wymagające precyzyjnych środowisk mikroaerofilowych lub wzbogaconych w CO2 . W przypadku badań wymagających takiej kontroli bardziej odpowiednie mogą być alternatywne systemy z wbudowaną regulacją gazu.
System MBRA oferuje kluczowe zalety w porównaniu z istniejącymi modelami bioreaktorów, w tym wysoką przepustowość, skalowalność i opłacalność, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do hodowli złożonych społeczności bakteryjnych w ciągłym przepływie, aby naśladować dynamiczne środowiska, takie jak ludzki przewód pokarmowy 6,8,10. Jego kompaktowa, modułowa konstrukcja pozwala na jednoczesną pracę wielu bioreaktorów, dzięki czemu idealnie nadaje się do badań wysokoprzepustowych, takich jak badania przesiewowe społeczności pochodzących z kału pod kątem odporności na inwazję patogenów9. Ta modułowa konstrukcja zapewnia dużą elastyczność eksperymentalną: każdy pasek może być zasilany przez pojedynczą butelkę z pożywką, jak pokazano w tym protokole, lub przez maksymalnie sześć różnych źródeł pożywki, po jednym na każdą komorę bioreaktora. Objętość robocza zależy od długości cienkiej słomy odpadowej PTFE włożonej do króćca odpływowego każdej komory, która określa wysokość cieczy; w tym protokole słomki o średnicy 25 mm utrzymują objętość roboczą 15 ml, ale objętości w zakresie 1-20 ml można osiągnąć poprzez przycinanie lub wydłużanie słomki. Dodatkowo krótsze słomki paszowe są wkładane do wlotu mediów, aby skierować dopływ w kierunku podstawy komory, zapobiegając spływaniu mediów po ściankach komory i zmniejszając tworzenie się biofilmu powyżej linii napełniania. Prędkości pompy lub średnicę przewodów pompy można również regulować, aby zmienić szybkość obrotu systemu. Do tej pory system MBRA był szeroko stosowany do badania zmian funkcjonalnych i składowych społeczności drobnoustrojów w odpowiedzi na różne czynniki, w tym antybiotyki10, leki przeciwnowotworowe14 i różne związki dietetyczne 12,15,16,17 . Prosta, modułowa konstrukcja sprawia, że idealnie nadaje się do adaptacji do różnych potrzeb eksperymentalnych. Na przykład MBRA został zmodyfikowany do badania biofilmów w warunkach podobnych do chemostatu18, co dowodzi jego wszechstronności w badaniach ekologii drobnoustrojów poza kulturami planktonu.
Przyszłe wersje systemu MBRA mogą skorzystać z dodatkowych ulepszeń inżynieryjnych, które zwiększą jego funkcjonalność, precyzję i potencjał przepustowości. Jednym z takich ulepszeń jest włączenie dodatkowych portów do każdej komory bioreaktora. Porty te mogą być wykorzystywane do wspomagania aktywnego monitorowania parametrów środowiskowych, takich jak pH, temperatura, gaz czy gęstość optyczna. Rozwiązałoby to jedno z najważniejszych ograniczeń modelu, umożliwiając informacje zwrotne i monitorowanie w czasie rzeczywistym. Ulepszenia geometrii komory lub portu mogą ułatwić dokładniejsze i bardziej dostępne czyszczenie, zmniejszając gromadzenie się pozostałości i przebarwienia oraz poprawiając długoterminową możliwość ponownego użycia. Integracja dodatkowych pomp perystaltycznych z programowalnymi timerami pozwoliłaby na pulsacyjne lub dobowe wprowadzanie mediów, lepiej symulując środowiska związane z gospodarzem, takie jak cykle żywieniowe w ludzkim jelicie. Wreszcie, druk 3D z alternatywnych materiałów, takich jak odporne chemicznie, autoklawowalne polimery, może pozwolić na większą trwałość i kompatybilność z szerszą gamą odczynników. Razem te ulepszenia mogą znacznie rozszerzyć eksperymentalny zakres i wierność platformy MBRA.
Podsumowując, MBRA zapewnia potężną, wysokowydajną platformę do hodowli i badania społeczności mikrobiologicznych w kontrolowanych warunkach. Chociaż ma ograniczenia w aktywnym monitorowaniu i kontroli pH, jego elastyczność, skalowalność i opłacalność sprawiają, że jest nieocenionym narzędziem dla szerokiego zakresu badań mikrobiologicznych, szczególnie tych wymagających wysokiej powtarzalności i przepustowości eksperymentalnej. Co ważne, modułowa konstrukcja i podejście do produkcji systemu sprawiają, że jest on z natury elastyczny; Naukowcy mają i mogą nadal dostosowywać MBRA do szerokiego wachlarza celów eksperymentalnych. Ta zdolność adaptacji zapewnia, że MBRA może nadal ewoluować wraz z pojawiającymi się pytaniami naukowymi i technologiami, zachowując swoje znaczenie jako wszechstronna platforma do badań nad mikrobiomem.

Mikrobiom człowieka to złożony ekosystem mikroorganizmów, który odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i ma głęboki wpływ na zdrowie człowieka. Ludzki mikrobiom obejmuje wiele anatomicznych miejsc w całym naszym ciele, z których każde zawiera dynamiczne społeczności drobnoustrojów aktywnie oddziałujących na siebie w sposób, którego jeszcze w pełni nie rozumiemy1. Poszerzanie naszej wiedzy na temat udziału społeczności drobnoustrojów w zdrowiu i chorobie zależy od naszego zrozumienia interakcji mikrobiologicznych zachodzących w tych środowiskach1. Aby skutecznie badać i manipulować tymi skomplikowanymi systemami w celach terapeutycznych, konieczne jest podejście redukcjonistyczne. Badanie indywidualnych interakcji mikrobiologicznych przy użyciu uproszczonych systemów modelowych ułatwia lepsze zrozumienie pełnej złożoności mikrobiomu2.
Dostępna jest szeroka gama systemów modelowych do hodowli społeczności mikrobiologicznych pochodzących od człowieka. Systemy te poszerzyły naszą wiedzę na temat społeczności drobnoustrojów związanych z człowiekiem i obejmują zarówno jednoetapową hodowlę wsadową, jak i bardziej złożone wieloetapowe systemy ciągłego przepływu. Systemy modelowe, takie jak symulator ekosystemu mikrobiologicznego jelit człowieka3, jednostopniowy system chemostatu dwunaczyniowego4 oraz system kontroli środowiska mikrobiotyjelitowej 5 odtwarzają warunki fizjologiczne określonych miejsc anatomicznych i zapewniają bliskie przybliżenia środowisk mikrobiologicznych in vitro . Jednak ich zastosowanie przez mikrobiologów jest ograniczone, ponieważ są kosztowne, wymagają wysokiej jakości wiedzy technicznej do obsługi i konserwacji oraz mają ograniczoną przepustowość.
Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy system Minibioreactor Array (MBRA) – jednostopniowy system hodowli o ciągłym przepływie, zaprojektowany w celu ułatwienia stabilnego wzrostu społeczności drobnoustrojów z różnych źródeł w kontrolowanym środowisku 6,7,8. System MBRA wyróżnia się na tle innych modeli jelit prostotą montażu i obsługi w połączeniu z wysoką przepustowością, która pozwala na jednoczesną hodowlę wielu społeczności drobnoustrojów, zwiększając wydajność eksperymentów. Co więcej, prosty i kompaktowy charakter tego systemu pozwala na jego działanie w komorach beztlenowych i mikrooksykowych, aby ułatwić rozwój bakterii z miejsc beztlenowych i niedotlenionych, takich jak przewód pokarmowy i pochwa. Wszechstronny charakter tego systemu został wykorzystany do badań przesiewowych zbiorowisk przewodu pokarmowego opornych na Clostridioides difficile9, a także do testowania wpływu antybiotyków10,11 i substratów dietetycznych12 na społeczności drobnoustrojów.
MBRA są wytwarzane przez druk 3D lub produkcję addytywną, przy czym priorytetem jest przejrzystość i wodoodporność w naszym wyborze materiałów (patrz Tabela materiałów , aby uzyskać informacje o polimerach). Każda tablica składa się z sześciu oddzielnych komór, z których wszystkie są wyposażone w porty do importu mediów, eksportu odpadów i pobierania próbek. Świeże media są w sposób ciągły dostarczane do systemu, podczas gdy odpady są jednocześnie usuwane, a natężenie przepływu jest precyzyjnie kontrolowane przez dwie pompy perystaltyczne. Zawartość systemu jest stale mieszana za pomocą mieszadeł i 60-punktowej płytki mieszającej, aby ułatwić uzyskanie jednorodnych kultur. Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem objętości roboczej 15 ml na komorę, chociaż każdy bioreaktor może pomieścić zakres 1-20 ml w zależności od wymagań eksperymentalnych. Pompa perystaltyczna i rurka pompy mogą obsługiwać natężenia przepływu w zakresie od 0,016 do 2,9 ml/min, co odpowiada szybkościom obrotu wynoszącym odpowiednio około 15,63 do 0,09 h. Chociaż system jest kompatybilny z szeroką gamą preparatów pożywek oraz dodatków dietetycznych lub odżywczych, należy wziąć pod uwagę pewne względy praktyczne: media o dużej lepkości mogą wymagać ponownej kalibracji natężenia przepływu, a obecność nierozpuszczonych cząstek lub nierozpuszczalnych składników może zatkać rurki pompy lub wąskie złącza, szczególnie przy niższych natężeniach przepływu. Modułowość systemu pozwala na szybkie i łatwe dostosowanie eksperymentów poprzez dostosowanie wyboru podłoża, pobierania próbek, natężenia przepływu i objętości roboczej. W połączeniu z czterema 24-kanałowymi pompami perystaltycznymi i dwiema 60-punktowymi płytkami mieszającymi, system może obsługiwać 48 oddzielnych komór na eksperyment w jednej komorze beztlenowej, wspierając wysokoprzepustowe badania przesiewowe beztlenowe.
Protokół ten służy jako wizualny przewodnik i zaktualizowana wersja wcześniej opublikowanej metody montażu i obsługi MBRA opracowanej przez nasze laboratorium4. Wprowadzono kilka kluczowych ulepszeń w celu zwiększenia odtwarzalności, usprawnienia przepływu pracy i zminimalizowania zanieczyszczeń. Po pierwsze, słomki z PTFE są teraz trawione chemicznie, aby zapobiec ich odklejaniu się i wpadaniu do komór bioreaktora. Po drugie, do linii zasilających dodano słomkę do pożywki, aby skierować przepływ mediów do dna komór, zapobiegając spływaniu mediów po ściankach komory. Było to znane źródło powstawania biofilmu. Po trzecie, długości rurek C-flex zostały ustandaryzowane i skrócone, a wydrukowany w 3D uchwyt na rurkę został zaprojektowany, aby stworzyć bardziej kompaktową, zorganizowaną konfigurację. Wreszcie, bioreaktory nie są już w pełni demontowane między każdym użyciem, co znacznie skraca czas i koszty materiałowe związane z powtarzającymi się eksperymentami. Te i inne przyrostowe udoskonalenia odzwierciedlają iteracyjną optymalizację opartą na szerokim wykorzystaniu systemu w wielu projektach w naszym laboratorium.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Prowadnica V-Tap, standardowe rozmiary od 0-80 do 5/8"</td><td>Narzędzia Big Gator</td><td>STD500NP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &m; M Filtr strzykawkowy</td><td>Rybak</td><td>SLGVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Napęd mieszający 2mag MIXdrive 60 (tylko napęd)</td><td>Magazyn 2MAG</td><td>MF 41060</td><td></td></tr><tr><td>Igły podskórne Air-tite, 22G x3"</td><td>Firma VWR</td><td>89219-274</td><td></td></tr><tr><td>BD 1mL Sterylne strzykawki z końcówką ślizgową Sterylne</td><td>Rybak</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktor</td><td>Proto-Labs (Proto-Labs)</td><td>NIE</td><td>Wydrukowano w 3D z tworzywa sztucznego DMS Somos Watershed. Zobacz plik uzupełniający 1 dla szablonu</td></tr><tr><td>Uchwyty do bioreaktorów</td><td>Proto-Labs (Proto-Labs)</td><td>NIE</td><td>Wydrukowano w 3D z PA 12 Black. Zobacz plik uzupełniający 2 dla szablonu.</td></tr><tr><td>Zakrętka do butelki z rozpuszczalnikiem Diba Omnifit Q-Series, GL38/38-430 (szkło), 2 porty UNF(F) bez zaworów, niebieska</td><td>Cole'a Parmera</td><td>EW-21942-86</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Diba Omnifit, PTFE, 1/8" (3,2 mm) średnicy zewnętrznej x 1,5 mm średnicy wewnętrznej</td><td>Cole'a Parmera</td><td>EW-21942-76</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Dibafit, 1/4"-28 UNF(M) płaskie dno do 3,2 mm średnica wewnętrzna, PEEK</td><td>Cole'a Parmera</td><td>EW-21941-49</td><td></td></tr><tr><td>IRWIN 12001ZR Klucz do gwintowników #0-1/4" Rękojeść T</td><td>Amazonka</td><td>B00004YOB0</td><td></td></tr><tr><td>Irwin Hanson Gwintownik frakcji SAE ze stali wysokowęglowej 1/4 cala. 1 szt.</td><td>Zoro powiedział:</td><td>G7695682</td><td></td></tr><tr><td>Loctite Heavy Duty Epoxy Quick Set 8-płynowa butelka o uncji</td><td>Amazonka</td><td>B0044F59N0</td><td></td></tr><tr><td>Złącze męsko-męskie Luer Lock</td><td>Mikrofluidyka Darwina</td><td>DM-MM-LUER-PP&nbsp;</td><td>Alternatywa: Strategic Applications Inc Złącze Luer męskie na męskie - 10/opk - Fisher - NC9876577</td></tr><tr><td>Złączki adaptera Masterflex, Luer na Luer, Nylon, Avantor</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX45502-56</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, żeńska adapter luer na króciec węża, 1/16" ID</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX45502-00</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, żeńska adapter luer do króćca węża, średnica wewnętrzna 3/32"</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX45502-02</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, żeńska Adaptery Luer do króćca węża, 1/8"</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX45502-04</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, męska Luer Lock do adaptera kolczastego węża, 1/8</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX45505-04</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, męska Luer x 1/4-28 UNF</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX45505-82</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, polipropylen, kolanko, przejściówka typu luer na złączkę męską</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX45508-26</td><td></td></tr><tr><td>Przewód pompy Masterflex Ismatec, 2-stopowy, Tygon S3 E-Lab, średnica wewnętrzna 0.89 mm</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX96460-26</td><td></td></tr><tr><td>Przewód pompy Masterflex Ismatec, 2-punktowy, Tygon S3 E-Lab, średnica wewnętrzna 1.14 mm</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX96460-30</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex&reg; Rurka przesyłowa, C-Flex, nieprzezroczysta biała, 1/8" ID x 1/4" OD; 25 stóp</td><td>Firma VWR</td><td>MFLX06424-67</td><td></td></tr><tr><td>Mohr' powiedział: s Szczypta do rurek&nbsp;</td><td>Firma VWR</td><td>470201-374</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki błotników z gumy neoprenowej &frac12; &rdquo; OD x &frac14; &rdquo; Średnica wewnętrzna x 1/16" Grubość&nbsp;</td><td>Amazonka</td><td>B01A29F1R0</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna uszczelka gumowa septa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z553905</td><td></td></tr><tr><td>Spinbar Micro Stir Bary</td><td>Firma VWR</td><td>58948-375</td><td></td></tr><tr><td>Tetra-Etch</td><td>Firma R.S. Hughest</td><td>TE-500</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na rurki</td><td>Proto-Labs (Proto-Labs)</td><td>NIE</td><td>Wydrukowano w 3D z PA 12 Black. Zobacz plik uzupełniający 3 dla szablonu.</td></tr><tr><td>Wielokanałowa pompa kasetowa Watson-Marlow 205S</td><td>Watsona-Marlowa</td><td>020.3724.00A</td><td>Alternatywa: Cyfrowe pompy perystaltyczne Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 lub Pompa perystaltyczna Masterflex Ismatec IPC, 0,1 do 11,25 obr./min, 24-kanałowa, 115/230 VAC, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH</td></tr></tbody></table>

zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (mbra)

Updated Protocol for the Assembly and Use of the Minibioreactor Array (MBRA)

Mikrobiom człowieka składa się z różnorodnych i dynamicznych społeczności drobnoustrojów, które odgrywają istotną rolę w zdrowiu gospodarza. Zrozumienie tych społeczności i ich reakcji na czynniki środowiskowe ma kluczowe znaczenie dla rozwoju terapii opartych na mikrobiomie. Tradycyjne modele in vitro do hodowli mikrobioty ludzkiej często nie są skalowalne i wymagają rozległej wiedzy technicznej, co ogranicza ich dostępność i przepustowość. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy system Minibioreactor Array (MBRA) – modułową, jednostopniową platformę o ciągłym przepływie do wysokowydajnej hodowli zbiorowisk drobnoustrojów. System ten umożliwia równoległą hodowlę do 48 odrębnych zbiorowisk mikroorganizmów, wspierając elastyczność eksperymentalną przy jednoczesnym utrzymaniu stabilnego wzrostu złożonych ekosystemów. Protokół ten zawiera szczegółowe wskazówki dotyczące wytwarzania, montażu, sterylizacji i obsługi MBRA. Modułowa konstrukcja systemu pozwala na łatwą integrację z komorami beztlenowymi i umożliwia dostosowanie do szerokiego zakresu zastosowań eksperymentalnych. Został wykorzystany do badania reakcji mikrobiologicznych na antybiotyki, związki dietetyczne i inwazję patogenów oraz do badań przesiewowych w poszukiwaniu społeczności odpornych na patogeny. Dzięki swojej dostępności, skalowalności i odtwarzalności, MBRA stanowi potężny system modelowy do badania interakcji mikrobiologicznych i postępów w badaniach nad mikrobiomem.

Aby ułatwić rozwój bakterii beztlenowych, takich jak te znajdujące się w przewodzie pokarmowym, MBRA można skonfigurować i obsługiwać w komorach beztlenowych. Aby zademonstrować zdolność do hodowli złożonych zbiorowisk bakteryjnych bezpośrednio z odpowiednich miejsc w ludzkim ciele, przygotowano próbkę kału ludzkiego i wyhodowano ją w tym systemie. Wszystkie prace przeprowadzono w komorze beztlenowej ustawionej na 37°C, a kultury hodowano w naszym bioreaktorze BRM37.
Gnojowicę kałową przygotowano przez beztlenowe rozmrożenie ludzkiego stolca, a następnie zmieszanie z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 25% w/v. Po potwierdzeniu sterylności, dziewięć komór bioreaktora zaszczepiono po 3 ml tej samej gnojowicy kałowej. Zbiorowiska mikrobiologiczne hodowano przez noc bez użycia pożywki i usuwania odpadów, w wyniku czego przez 16 godzin prowadzono oddzielne kultury wsadowe. Następnie włączono pompy zasilające i ustawiono je na natężenie przepływu 1,92 ml na godzinę. Po czterech dniach ciągłego przepływu próbki pobrano z bioreaktorów i przeanalizowano je pod kątem składu zbiorowiska drobnoustrojów przy użyciu sekwencjonowania genu 16S rRNA, a następnie odszumiania za pomocą Deblur i klasyfikacji taksonomicznej z bazą danych SILVA 138 SSU w QIIME 213. We wszystkich dziewięciu powtórzeniach wykryto łącznie 65 rodzajów, ale bioreaktory były zdominowane tylko przez 18 rodzajów, z których każdy zawierał co najmniej 2% liczebności w każdej z dziewięciu kontrprób (ryc. 5). Bioreaktory wykazały wysoką odtwarzalność, tak że 22 z 65 rodzajów wykryto we wszystkich dziewięciu powtórzeniach, a dodatkowe 17 rodzajów wykryto w co najmniej połowie powtórzeń. Większość rodzajów nieobecnych w co najmniej jednym reaktorze (37 z 43 rodzajów) to gatunki rzadkie, z których każdy ma względną liczebność poniżej 2% w bioreaktorach. Podsumowując, kultury MBRA o ciągłym przepływie wspierały złożone, powtarzalne zbiorowiska drobnoustrojów pochodzących z tej samej próbki kału, nawet po oddzielnych hodowlach wsadowych przez 16 godzin w każdej komorze bioreaktora.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Matryca minibioreaktorów (MBRA). W pełni zmontowany MBRA, w tym etykiety na drzewo rur linii zasilającej i kanalizacyjnej, komory bioreaktora i pas bioreaktora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Przewodnik po wytrawianiu PTFE i układ portów MBRA. (A) Schemat blokowy do naśladowania dla wytrawiania mediów i odpadów słomek PTFE. (B) Każda komora bioreaktora zawiera port na słomkę z pożywką + gwintowany męski luer, odpadowy słomę + gwintowany męski luer i przegrodę + gwintowany męski luer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Drzewa linii zasilających i odpadowych MBRA. Reprezentatywne obrazy do naśladowania podczas montażu (A) drzewa linii zasilającej i (B) drzewa linii ścieków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig4.jpg"> 
Rysunek 4: System nakrętek do butelek z nośnikami i systemu poziomów odpadów. (A) Przykład zmontowanej nakrętki do butelki serii Q używanej do wciągania mediów do MBRA. (B) Obraz wielopoziomowego systemu zbierania odpadów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig5.jpg"> 
Rycina 5: Względna liczebność rodzajów bakterii. (A) Skumulowany wykres słupkowy przedstawia względną liczebność wszystkich rodzajów, które zawierają co najmniej 2% liczebności w którejkolwiek z wyświetlanych próbek. (B) Wskaźniki różnorodności alfa obserwowanych OTU i różnorodności Shannona między wszystkimi dziewięcioma komorami bioreaktora. Wszystkie dziewięć komór bioreaktora zostało zaszczepionych tą samą gnojowicą kałową przygotowaną z ludzkiego kału. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Składowe MBRA. Zdjęcia i opisy wszystkich poszczególnych części wymaganych do pełnego montażu MBRA, wraz z ilością potrzebną dla każdego komponentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Table1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Przewodnik rozwiązywania problemów. Typowe problemy napotkane podczas uruchamiania MBRA wraz z ich potencjalnymi przyczynami i zalecanymi rozwiązaniami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Table2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Plik Stl do drukowania 3D pasków Minibioreactor Array. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Supplementary%20File%201.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Plik Stl do drukowania 3D uchwytów bioreaktorów używanych do zakotwiczania bioreaktorów do płytek mieszających. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3.: Plik Stl do drukowania 3D uchwytów rur używanych do organizowania rur odpływowych C-flex i rurek zasilających wychodzących z MBRA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

The human microbiome comprises diverse and dynamic microbial communities that play essential roles in host health. Understanding these communities and ...

Dlatego nasze badania koncentrują się na mikrobiomie jelitowym, a konkretnie na tym, jak można go zmodyfikować, aby zapobiec kolonizacji szkodliwych patogenów. Jednocześnie jesteśmy zainteresowani zrozumieniem ekologicznych reguł i mechanizmów stojących za tą odpornością na kolonizację. Technologie, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, zaawansowana bioinformatyka, myszy wolne od zarazków i modele jelitowe in vitro, zmieniają sposób, w jaki badamy społeczności drobnoustrojów i ich rolę w zdrowiu i chorobie.Jednym z największych wyzwań związanych z modelami jelitowymi in vitro jest ich eksploatacja z dużą przepustowością. To, czego potrzebujemy, to systemy, które pozwolą na funkcjonalne badanie społeczności mikrobiologicznych na dużą skalę. Matryca minibioreaktorów to system hodowli o ciągłym przepływie, który został zaprojektowany w celu rozwiązania problemu braku przepustowości w innych systemach.Pozwala nam to na zwiększenie skali eksperymentów, przy jednoczesnym uchwyceniu złożonych i powtarzalnych zachowań społeczności drobnoustrojów. Na początek upewnij się, że paski matrycy minibioreaktora są wydrukowane w 3D i zawierają sześć niezależnych komór bioreaktora. Ułóż wszystkie elementy potrzebne do montażu.Za pomocą gwintownika 1/4 cala 28 NF z kluczem do gwintowników z rękojeścią T. Gwintuj trzy porty 1/4 cala w każdej komorze, aby włożyć złączki. Po umyciu komory wodą umieść w każdej komorze mieszadło magnetyczne o wymiarach 10 na 3 milimetry i dodaj jeden mililitr wody destylowanej.Następnie umieść gumową podkładkę na górze każdego portu bioreaktora. Do każdej komory wkręć jedną przynętę męską z gwintem słomy z słomą, jedną przynętę męską z gwintem ze słomy odpadowej i jedną pustą przynętę męską z gwintem do portów. Teraz włóż sześć gumowych przegród na 3/32-calowe żeńskie zadziory przynęty i złóż górny rękaw każdej przegrody w dół, aby zakryć szyję.Przymocuj je do wyznaczonych portów każdej komory. Wytnij paski rurek C-flex o żądanej długości i liczbie. Przymocuj 1/8-calowy żeński zadzior przynęty do jednego końca, a łącznik blokady męskiej przynęty do przeciwległego końca każdej długości rurki.Następnie włóż 1/16-calową żeńską zadziorę przynęty do każdego końca czerwonej dwustopniowej rurki E-lab o średnicy wewnętrznej 1,14 milimetra i pomarańczowej dwuczęściowej rurki E-lab o średnicy wewnętrznej 0,89 milimetra. Podłącz przygotowaną rurkę E-lab do rurki C-flex i upewnij się, że każda z sześciu długości rurki C-flex jest podłączona do jednej czerwonej i jednej pomarańczowej żyłki E-lab za pomocą żeńskich przynęt. Następnie przytnij rurkę C-flex na różne długości zgodnie z wymaganiami.Przymocuj 1/8-calowy żeński zadzior przynęty i męski łącznik blokady przynęty do obu końców jednego 3-calowego elementu i 12-calowego kawałka rurki C-flex. Przymocuj męskie łączniki blokady przynęty do obu końców pozostałych elementów. Zamontuj drzewo linii kanalizacyjnej zgodnie ze schematem 3D.Przymocuj odsłonięte końce czerwonej rurki E-lab z dwoma przystankami do końcowych zamków męskiej przynęty na drzewie linki odpadowej w kolejności rosnącej w oparciu o długość rurki C-flex. Następnie połącz 3-calową rurkę C-flex z żeńskim zadziorem przynęty 1/8 cala i łącznikiem blokady przynęty męskiej do szczytu drzewa linii odpływowej. Zmontuj drzewo linii zasilającej zgodnie ze schematem 3D.Połącz odsłonięte końce pomarańczowej rurki E-lab z dwoma przystankami do końcowych zamków męskiej przynęty na drzewie żyłki paszowej w kolejności rosnącej w oparciu o długość rurki C-flex i przymocuj 12-calową rurkę C-flex do górnej części drzewa linii zasilającej. Przymocuj rurkę C-flex o zmiennej długości na końcu drzewa linii zasilającej do bioreaktora, układając je w porządku rosnącym od najkrótszej linii po lewej stronie do najdłuższej po prawej. Przymocuj rurkę C-flex o zmiennej długości na końcu drzewa linii odpływowej do paska bioreaktora w kolejności malejącej, przy czym najdłuższa linia znajduje się po lewej stronie, a najkrótsza po prawej, aby dostosować się do umieszczenia pompy.Zwiąż wszystkie przewody zasilające C-flex po lewej stronie paska i zabezpiecz je opaską zaciskową. Uformuj pętlę z pomarańczową rurką E-lab z dwoma przystankami między liniami C-flex i zabezpiecz pętlę za pomocą taśmy autoklawu, a następnie powtórz proces dla czerwonej rurki E-lab z dwoma przystankami po stronie odpadowej paska bioreaktora. Przykryj samicę przynęty na końcu odpadów i nakarm drzewa żyłki folią, aby zapobiec zanieczyszczeniu.Poluzuj przynęty z gwintem zewnętrznym z przegrodami w każdej komorze bioreaktora, aby umożliwić ucieczkę pary podczas autoklawowania. Po umieszczeniu zestawu w pojemniku autoklawu, należy rozciągnąć drzewa linii paszowej i odpadowej do oddzielnych pojemników sąsiadujących z tym, w którym znajdują się paski MBRA. Aby przymocować system do pomp, usuń taśmę autoklawu mocującą rurki E-lab zarówno do przewodów odpływowych, jak i zasilających, a następnie rozwiąż wiązki przewodów C-flex.Umieść MBRA między dwiema pompami na górze płyty mieszającej. Zaciśnij go za pomocą uchwytów wydrukowanych w 3D i wyrównaj z zaznaczonymi pozycjami mieszania na płycie. Teraz podłącz rurkę E-lab przewodu zasilającego do wkładów pompy perystaltycznej i umieść ograniczniki przewodów w szczelinach wkładów.Powtórz ten proces dla rurki przewodu odpływowego E-lab na pompie znajdującej się po prawej stronie płytki mieszającej. Następnie zablokuj wkłady pompy perystaltycznej w pompie. Ułóż rurki C-flex starannie za pomocą uchwytów na rurki wydrukowane w 3D.Podłącz koniec drzewa linii odpływowej do rurki podłączonej do butelek na odpady. Następnie przymocuj żeńską przynętę na rurce wejściowej przewodu zasilającego do męskiego złącza na 12-calowej rurce z nakrętki butelki z mediami. Włącz obie pompy, aby rozpocząć przepływ mediów i upewnij się, że obie pompy są ustawione na obrót zgodnie z ruchem wskazówek zegara, gdy odpady są umieszczone po prawej stronie pomp.Obserwuj wielkość i rytm kropel w każdej komorze bioreaktora. Jeśli zauważysz jakąkolwiek zmienność lub nieprawidłowość, wymień pomarańczową dwustopniową rurkę E-lab podłączoną do komory, której dotyczy problem, aby zmniejszyć zmiany natężenia przepływu. Gdy komory są pełne, wyłącz obie pompy i pozwól bioreaktorom siedzieć przez 24 do 48 godzin, aby sprawdzić zanieczyszczenie przed rozpoczęciem eksperymentu.Przełącz wejście mediów na jednolitrowy pojemnik z 10% wybielaczem w wodzie dejonizowanej i zwiększ natężenie przepływu na obu pompach do maksimum, aby wyprzeć zawartość komór bioreaktora z wybielaczem. Gdy komory zostaną oczyszczone z mediów, odwróć MBRA, aby dezynfekować powyżej linii napełniania przez pięć minut. Po pięciu minutach wypraw system i odczekaj dodatkowe pięć minut na sterylizację.Po oczyszczeniu komór z pożywki i sterylizacji przez 10 minut, zastąp wybielacz jednym litrem wody dejonizowanej i przepłucz system, aż woda przejdzie. Następnie odłącz rurki E-lab bioreaktora od pomp i wyjmij MBRA. Usuń zużyte przegrody z bioreaktora i opróżnij każdą komorę, aż pozostanie tylko jeden mililitr wody.Wymień przegrodę, pomarańczową rurkę E-lab z dwoma przystankami i autoklaw całkowicie zmontowany pasek, jak pokazano wcześniej. Po trzech cyklach ponownego użycia wykonaj następujące kroki. Próbkę kału ludzkiego przygotowano i wyhodowano w systemie MBRA.Po czterech dniach ciągłego przepływu, społeczność mikroorganizmów we wszystkich dziewięciu bioreaktorach została zdominowana przez 18 rodzajów bakterii, z których każdy zawierał co najmniej 2% względnej liczebności w dowolnej kontrpróbie. 22 z 65 wykrytych rodzajów było obecnych we wszystkich dziewięciu powtórzeniach bioreaktorów, wykazując wysoką odtwarzalność. Analiza różnorodności alfa wykazała minimalną zmienność między powtórzeniami zarówno w obserwowanych operacyjnych jednostkach taksonomicznych, jak i w indeksie różnorodności Shannona.

updated-protocol-for-assembly-use-minibioreactor-array

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Hemmerich, J. i in. Protokół optymalizacji heterologicznego wytwarzania białek z wykorzystaniem zautomatyzowanej technologii mikrobioreaktorów. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje użycie zautomatyzowanego mikrobioreaktora do monitorowania wzrostu bakterii i wydzielania białek fluorescencyjnej w odpowiedzi na różne formuły mediów. Genetycznie zmodyfikowana bakteria ekspresyjna wydzielniowa fluorescencja jest hodowana pod antybiotykowym selekcją i zaszczepiana w dołkach o zróżnicowanych...

Monitorowanie wzrostu bakterii w różnych formułach ośrodka za pomocą zautomatyzowanego mikrobioreaktora

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Korzystając z bioreaktora pneumatycznego, demonstrujemy montaż, działanie i wydajność tego jednorazowego systemu bioreaktorów do wzrostu komórek ssaków.

Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Nowatorski projekt reaktora, nazwany bioreaktorem o wysokiej gęstości (HDBR), jest prezentowany do hodowli i badania społeczności drobnoustrojów o dużej gęstości. W tym przypadku HDBR jest z powodzeniem stosowany w konfiguracji fotobioreaktora (PBR) do badania metabolizmu azotu przez mieszaną społeczność glonów o dużej gęstości.

Nowatorski bioreaktor do hodowli o dużej gęstości różnych zbiorowisk mikroorganizmów

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Opisano protokół produkcji komórek zależnych od kotwiczenia mikronośnikowo-mikrobioreaktorowymi jako potencjalne terapie oparte na komórkach. Ukierunkowane na ostry zespół niedociągania oddechowego ilustruje porównywalną wydajność komórek i korzystną ekspresję genów w porównaniu do warunków procesów opartych na kolbach. Protokół ten jest rozszerzalny na inne komórki zależne od kotwiczenia oraz wskazania celowe.

Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego

Poznaj zaktualizowany protokół montażu minibioreaktorów MBRA do badania dynamiki mikrobiomu jelitowego. Ta metoda umożliwia skalowalne, wysokoprzepustowe hodowle mikroorganizmów z zachowaniem powtarzalności wyników.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Przeglądaj więcej filmów