Name: Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metody synchronizacji cyklu komórkowego u drożdży Saccharomyces cerevisiae w celu badania segregacji chromosomów podczas mitozy. Technika alfa-faktora umożliwia precyzyjną analizę lokalizacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy University of Utah Cell Imaging Core za utrzymanie obiektu mikroskopu Delta Vision. Prace te były częściowo wspierane przez granty NIH F31CA2717405 (dla M.G.S.) i T32GM141848 (dla M.G.S. i T.C.S.), 5 For the Fight (dla M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (dla M.P.M.) oraz NIH grant R35GM142749 (dla M.P.M.).

1. Konstrukcja szczepów do analizy i obrazowania cyklu komórkowego
<ol>
	<li>Projektuj startery do C-terminalnego oznaczania interesującego genu za pomocą plazmidów Pringle Tagging (pFA6a) 24. Krótko mówiąc, projektuj startery F2 i R1, które w połączeniu z plazmidami serii pFA6a wytwarzają produkt PCR, który można bezpośrednio przekształcić w drożdże, aby wygenerować "oznaczoną" wersję interesującego genu. Użyj par primerów i plazmidów zawartych w Tabeli 1 , aby oznaczyć geny interesujące tego protokołu. Strategie projektowania plazmidów i primerów do oznaczania genów drożdży na końcu C zostały szczegółowo opisane przez Longtine i in.24. UWAGA: Metoda ta może być stosowana do produkcji białek oznaczonych fluorescencją do obrazowania lub białek oznaczonych Auxin Inducible Degron (AID), aby ułatwić zatrzymanie cyklu komórkowego oraz inne eksperymenty możliwe dzięki degradacji docelowego białka18. Na przykład, aby oznaczyć CDC20 tagiem AID (IAA7), starter do tagowania do przodu składa się z 25-40 zasad genu CDC20 tuż przed kodonem stop, z wyłączeniem kodona STOP (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), a także sekwencję adaptera Pringle Plasmid F2 (5' cggatccccgggttaattaa 3') dołączoną do końca 3', aby uzyskać końcową sekwencję zapalników (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). Odwrotny zapalnik CDC20 do oznaczania zawiera odwrócony zestaw 25-40 par zasad bezpośrednio po kodonie STOP (5' ATTATATGCCTTGACATGAA CTTTTTTTTTTTTTTTTTTA 3') oraz sekwencją adaptera Pringle Plasmid R1 (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') do uzyskania końcowej sekwencji primerowej (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). Ważne jest również, aby zauważyć, że stosowanie primerów PCR krótszych niż 40 par zasad obniży efektywność integracji z genomem drożdży.</li>
	<li>Rozcieńczaj sprężarki w biologii molekularnej o temperaturze wodnej do 10 μM.</li>
	<li>Wykonaj PCR z parą plazmidów F2 i R1 oraz odpowiednim plazmidem znakującym przy użyciu standardowych metod, zgodnie z programem cyklera termicznego opisanym w Tabeli 2, a następnie potwierdź rozmiar produktu PCR za pomocą elektroforezy żelu agarozowego.</li>
	<li>Zaszczep drożdży przekształcić w 25 mL kultury ekstraktu drożdżowego Peptone Adenine Dextrose (YPAD) i uprawiać przez noc w temperaturze 23 °C. Do budowy drożdży cdc20-AID (które po leczeniu auxiną rozkładają Cdc20), przekształcony szczep może już zawierać OsTIR1 wyparowany z locus ektopowego, albo OsTIR1 może być skrzyżowany w późniejszych18.</li>
	<li>Następnego ranka sprawdź OD600 nocnej kultury. Jeśli kultura OD <2.0, przejdź do kroku 1.6. Jeśli OD > 2,0, rozcieńcz do ~0,2-0,4 i pozwól na 2-3 cykle wzrostu.</li>
	<li>Pobieraj komórki przy OD600 = ~0,4-2,0, aby upewnić się, że są w fazie logarytmicznej wzrostu. Pobieraj 5 przedawkowań komórek na przemianę (np. 5 ml OD600 = 1,0). Jeśli wykonuje się więcej niż jedną transformację tego samego szczepu, komórki można łączyć na tym etapie. Komórki pobierz przez wirowanie w 3000 x g przez 5 minut w 23 °C.</li>
	<li>Usuń supernatant i przemyj granulat komórki 25 mL wody, a następnie wiruj w 3000 x g przez 5 minut w temperaturze 23 °C.</li>
	<li>Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w 1 mL 0,1 M octana litu (LiAc) i przenieś do probówek o pojemności 1,6 mL. Jeśli wykonujesz więcej niż jedną transformację, rozdziel 1 mL resuspension na kilka lamp (np. dla 2 transformacji rozdziel 2x 500 μL; dla 3 rozdziel 3x 333 μL itd.).</li>
	<li>Wirówki w wirówce na 1000 x g przez 2 minuty w 23 °C i odrzucaj supernatant.</li>
	<li>Dodaj do pelletu komórkowego następujące (w tej kolejności): i) 240 μL PEG (50%), ii) 36 μL 1,0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 μg DNA plemnika łososia, gotowanego wcześniej przez 5 minut, iv) 54 μL wody.</li>
	<li>Dodaj 10 μL produktu PCR (uzyskanego w kroku 1.3) do komórek i wiru przez 1 minutę, zapewniając dokładne wymieszanie.</li>
	<li>Inkubuj komórki w temperaturze 30 °C przez 30 minut w bębnie walcowym w ciepłym pomieszczeniu lub w termowstrząsie przy 1000 obr./min.</li>
	<li>Ogniwa przeciwtemperaturowe w temperaturze 42 °C przez 15 minut w kąpieli wodnej. UWAGA: Optymalny czas szoku cieplnego może się różnić w zależności od tła szczepu drożdży. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem tła odkształcenia W303.</li>
	<li>Wirówki w 1000 x g przez 2 minuty w 23 °C. Usuń supernatant i delikatnie zawiesz ponownie w 100 μL wody.</li>
	<li>W przypadku przemian z użyciem KanMX lub innego wyboru leku, komórki płytkowe na YPAD inkubują płytki w temperaturze 23 °C, a następnego dnia replikują płytę na płytkę. UWAGA: Pozwolenie na jeden dzień wzrostu na YPAD jest kluczowe, aby umożliwić ekspresję genów oporności na leki w przekształconych komórkach.</li>
	<li>Dla transformacji z użyciem markerów auxotroficznych (URA, HIS itp.), komórki płytowe bezpośrednio na nośniku selektywnym.</li>
	<li>Inkubuj płytki w temperaturze 23 °C przez 3 dni, aby umożliwić wzrost kolonii drożdży transformujących się w organizmie.</li>
	<li>Zweryfikować poprawne oznaczanie genu za pomocą genomowego PCR lub western blotting. Metody te zostały szczegółowo opisane przez Burnette25 oraz Chu i in.26. UWAGA: Przy produkcji szczepów z wieloma oznaczonymi allelami nie zaleca się powtarzanej transformacji bez krzyżowania wstecznego, ponieważ transformacja może być procesem mutagennym. Aby uzyskać szczep zawierający Stu2-GFP i Spc110-mCherry, zalecamy na przykład oddzielne przekształcenie szczepów w celu uzyskania Stu2-GFP i Spc110-mCherry, a następnie połączenie tych alleli w jeden haploidalny szczep poprzez krzyżowanie drożdży, sporulację, rozwarstwienie tetrady oraz analizę genotypową. Więcej informacji o krzyżowaniu drożdży można znaleźć u Stansfield i Stark27 oraz Morin i in.28. Aby przeprowadzić α-czynnikowy atak-uwalnianie, użyty szczep haploidalny musi być MATa.</li>
</ol>
2. Hodowla drożdży i synchronizacja cyklu komórkowego: α-czynnikowy zatrzymanie-uwalnianie
<ol>
	<li>Inokuluj drożdże do 25 mL kultury YPAD na noc w temperaturze 23 °C, aby następnego ranka uzyskać OD600 = 0,5-2,0.<ol>
		<li>Jeśli komórki są powyżej OD600 = 2,0 rano, rozcieńcz do OD600 = 0,2-0,4 i pozwól im rosnąć przez co najmniej 1 cykl komórkowy (2-3 godziny w 23 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńcz ogniwa z powrotem do OD600 = 0,5 i dodaj α-czynnik do końcowego stężenia 1 μg/mL (zapasowe 10 mg/mL w DMSO). Komórki idealnie powinny mieć mutację bar1 (np. bar1-1), która czyni je bardziej wrażliwymi na czynnik α. Komórki typu dzikiego BAR1 są mniej wrażliwe na czynnik α i wymagają stężenia α-czynnika co najmniej o rząd wielkości wyższego, aby prawidłowo go zatrzymać, co jest mniej ekonomiczne.</li>
	<li>Po 2,5-3,5 godzinie po zatrzymaniu sprawdź stopień zatrzymania, licząc procent komórek niezajętych shmoo. Gdy 90-95% komórek zostanie shmooowanych (zatrzymanych w G1), przystąpi do zwolnienia. Czas rozwoju będzie się różnił w zależności od szczepu drożdży, podłoża wzrostu i temperatury.</li>
	<li>Uwalnij komórki z zatrzymania α-czynnikowego, obracając się w wirówce w wirówce o 3000 x g przez 3-5 minut w 23 °C, a następnie wylewając supernatant.</li>
	<li>Płucz komórki, ponownie zawieszając granulat w 25 mL YPAD + 1% DMSO.</li>
	<li>Powtórz kroki 2,4-2,5 dwa razy, co daje łącznie trzy mycia, wymieniając zużytą tubkę raz po pierwszym myciu.</li>
	<li>Dodaj YPAD do komórek, aby zwiększyć ostateczną objętość do 25 mL i przenieś komórki do nowej piersiówki. UWAGA: Użycie nowej kolby jest kluczowe, aby wyeliminować śladowe ilości α-czynnika, które mogłyby uniemożliwić uwolnienie.</li>
	<li>Weź próbkę w punkcie czasowym (0 min) i popraw (patrz instrukcje fiksacji w krokach 4.1 do 4.4).</li>
	<li>Kontynuuj pobieranie próbek punktowych co 15 minut, jeśli wzrost następuje w temperaturze 23 °C. Ten czas zmienia się w innych temperaturach w zależności od tego, jak szybko komórki rosną.</li>
	<li>Po około 60 minutach oceń synchronizację uwalniania, sprawdzając pod mikroskopem świetlnym jednolite małe pąki (rozmiar pąka < 25% komórki macierzystej).</li>
	<li>Opcjonalnie) Po 60 minutach po uwolnieniu ponownie dodaj α czynnik do końcowego stężenia 1 μg/mL, aby zapobiec przejściu do kolejnego cyklu komórkowego. Potwierdź synchroniczne uwalnianie komórek, weryfikując jednolitą morfologię małych pąków przed dodaniem.</li>
	<li>Kontynuuj pobieranie próbek punktów czasowych do 180 minut lub tak długo, jak chcesz. W temperaturze 23 °C metafaza występuje ~45-60 minut po uwolnieniu, anafaza ~60-90 minut po uwolnieniu, a większość komórek znajduje się w nowym G1 już 120 minut po uwolnieniu.</li>
</ol>
3. Hodowla drożdży i synchronizacja cyklu komórkowego: zatrzymanie i uwolnienie Cdc20
<ol>
	<li>Zaszczep nocną hodowlę drożdży w temperaturze 23 °C, aby uzyskać OD600 = 0,5-2,0 następnego ranka.<ol>
		<li>Jeśli komórki będą powyżej OD600 = 2,0 następnego ranka, rozcieńcz do OD600 = 0,2-0,4 i pozwól im rosnąć przez co najmniej 1 cykl komórkowy (2-3 godziny w 23 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńcz do OD600 = 0,5 i dodaj auksynę do końcowego stężenia 500 μM z 1 M zapasu (500x) do wszystkich hodowli. W przypadku hodowli przyjmujących inne leki (nocodazol) należy dodawać je równocześnie z auxiną w odpowiednim stężeniu (np. ~10 μg/mL nocodazolu).</li>
	<li>Po 2 godzinach od zatrzymania należy sprawdzić stopień zatrzymania, licząc procent dużych komórek pączkowych (duże pączki określa się jako obecność pąka > 25% wielkości komórek matczych). Gdy 90-95% komórek zostanie zatrzymanych w mitozie, należy pobrać próbki lub uwalniać komórki z zatrzymania, w zależności od zastosowania eksperymentalnego. Jeśli 90% komórek nie zostanie zatrzymanych, pozwól hodowli dalej rosnąć i sprawdzaj ją co 15-30 minut. Czas rozwoju będzie się różnił w zależności od szczepu drożdży, podłoża wzrostu i temperatury. UWAGA: Nie zaleca się pozwalać na zbyt długie zatrzymania (dłużej niż 4 godziny) podczas zwolnienia, ponieważ długotrwałe zatrzymania mogą obniżyć żywotność komórek.</li>
	<li>Aby uwolnić się od zatrzymania wyczerpania Cdc20, należy zebrać hodowlę przez wirowanie w 3000 x g przez 3-5 minut w temperaturze 23 °C.</li>
	<li>Myj komórki, ponownie zawieszając granulat w 25 mL YPAD + 1% DMSO, a następnie pobieraj przez wirowanie w 3000 x g przez 3-5 minut w temperaturze 23 °C.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.4-3.5, co daje łącznie 2 mycia.</li>
	<li>Dodaj YPAD do komórek, aby osiągnąć końcową objętość 25 mL i przenieś komórki do nowej kolby. UWAGA: Użycie nowej piersiówki jest kluczowe, aby usunąć śladowe ilości auxiny, które mogą zapobiec jej uwolnieniu.</li>
	<li>Weź punkt 0 i napraw (patrz instrukcje fiksacji w krokach 4.1 do 4.4).</li>
	<li>Kontynuuj pomiar punktów co 10-15 minut przez pożądaną długość kursu. W temperaturze 23 °C większość komórek zwolniłaby się po zatrzymaniu po 50-70 minutach. UWAGA: Komórki nie uwalniają się tak synchronicznie po zatrzymaniu wyczerpania Cdc20, jak przy zatrzymaniu α czynnika. Jednak może być przydatne badanie anafazy lub mitotycznych zdarzeń wyjściowych. Dodatkowo, technicznym ograniczeniem tego zatrzymania-uwalniania jest to, że w późniejszych punktach po uwolnieniu trudniej jest rozróżnić komórki metafazy, które jeszcze się nie uwolniły, od tych, które uwolniły się wcześniej i osiągnęły metafazę kolejnego cyklu komórkowego. W razie potrzeby można to przezwyciężyć, wykonując obrazowanie żywych komórek w celu śledzenia pojedynczych komórek podczas ich uwalniania po zatrzymaniu lub dodając czynnik α do hodowli (zakładając, że komórki są MATa), aby zatrzymać komórki w G1 po wyjściu z mitozy.</li>
</ol>
4. Utrwalanie drożdży
<ol>
	<li>Wirówka 1 mL (lub 0,5-1,5 przedawkowania) hodowli przez 1 minutę z maksymalną prędkością (~20 000 x g) w 23 °C.</li>
	<li>Aspiruj z nadnaczyni i ponownie zawiesij komórki w 500 μL roztworu utrwalacza (3,7% formaldehydu w 0,1 M fosforanu potasu (KPi), pH 6,4).</li>
	<li>Inkubuj komórki w roztworze utrwalającym przez 2-15 minut w miejscu 23 °C. W eksperymentach z przebiegiem czasu zaleca się stabilizację komórek przez 15 minut, aby wyrównać czas wirowania komórek podczas pobierania próbek. UWAGA: Czas utrwalania powinien być zoptymalizowany dla konkretnych fluoroforów i interesujących nas białek.</li>
	<li>Ogniwa wirówkowe przez 1 minutę z maksymalną prędkością przy 23 °C, odciągnij supernatant i ponownie zawiesij w 500 μL 0,1 M KPi (pH 6,4). Komórki w KPi można przechowywać w temperaturze 4 °C aż do momentu gotowości do obrazowania. UWAGA: Stały sygnał fluorescencyjny komórek może działać do 2 tygodni, w zależności od fluoroforu, jednak do ilościowej identyfikacji sygnałów fluorescencyjnej należy zebrać obrazy w ciągu 7 dni.</li>
</ol>
5. Przygotowanie preparatów do obrazowania
<ol>
	<li>Po przygotowaniu do obrazowania wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością w 23 °C i odrzucaj supernatant. Ponownie zawiesz komórki w roztworze Triton/DAPI/sorbitol o stężeniu 10-100 μL (1,2 M sorbitol, 1% tryton, 0,1 M KPi, pH 7,5, 2 μg/mL DAPI).</li>
	<li>Pipeta ~0,8 μL komórek bezpośrednio na czysty pokrywak. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie rozprowadzić kroplę komórki w okrąg o wymiarach około 1 cm2 w centrum pokrywy.</li>
	<li>Przyłóż folię na preparat mikroskopowy. Użyj Kimwie, aby delikatnie docisnąć wokół preparatu, aby rozprowadzić próbkę.</li>
	<li>Zabezpiecz krawędzie pokrywy lakierem do paznokci.</li>
	<li>Opcjonalnie przechowywać w chłodnym, ciemnym miejscu do 4-6 godzin przed obrazowaniem, aby pomóc komórkom się uspokoić i zapobiec nadmiernemu ruchowi.</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<ol>
	<li>Zabierz szkiełko do mikroskopu wyposażonego w obiektyw olejowy 60x/1.42 oraz zestaw laserowy i filtr czerwony, zielony, niebieski, dalekoczerwony. Można też używać obiektywów o wyższym powiększeniu (do 100x).</li>
	<li>Skupić mikroskop na komórkach drożdży przyklejonych do pokrywki. UWAGA: Jeśli komórki drożdży poruszają się zbyt mocno, preparaty można zostawić w chłodnym, ciemnym miejscu na 20-60 minut, aby się osadziły.</li>
	<li>Gdy drożdże są ostre, dostosuj ustawienia ekspozycji każdego kanału, aby uzyskać stosunek sygnału do szumu co najmniej 3:1, zapewniając, że fluorescencyjne punkty nie są nadmiernie naświetlone. UWAGA: Na przykład w systemie obrazującym, którego używamy z naukową kamerą CMOS, używając obiektywu 60x 550 i oleju immersyjnego o współczynniku załamania n = 1,516, ustawiając maksymalny sygnał czerwonego kanału na 1000-2000 au, zielonego na 3000 au, niebieskiego na 3000 au oraz DIC na 4000-5000 au, co daje wysokiej jakości obrazy.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia akwizycji, aby objąć 14-20 stosów Z o średnicy 0,2 μm, co daje łączny zakres 2-4 μm.</li>
	<li>W przypadku mikroskopów wyposażonych w moduły post-processingu wybierz Dekonwolucję i Szybką Projekcję dla każdego stosu.</li>
	<li>Zbieraj stosy komórek Z, wykonując wystarczająco dużo zdjęć, aby uchwycić ~100-200 komórek dla każdego stanu lub punktu czasowego.</li>
	<li>Zapoznaj się z Plikiem Uzupełniającym 1 , aby uzyskać instrukcje programowe z zrzutami ekranu z oprogramowania do obrazowania.</li>
</ol>
7. Analiza obrazów
<ol>
	<li>Otwórz projekcję obrazów w ImageJ i dostosuj jasność oraz kontrast, aby oglądać różne kanały. Jeśli mikroskop używany do obrazowania nie posiada modułów postprocessingu, wykonaj maksymalną projekcję stosów Z na tym etapie.</li>
	<li>Aby określić postęp cyklu komórkowego, należy liczyć 100 komórek na każdy punkt czasowy i klasyfikować je jako zawierające jedno lub dwa jądra. Alternatywnie, można obliczyć długość wrzeciona lub odległość między ciałami biegunów wrzeciona, aby zdefiniować stan cyklu komórkowego. Odległość między ogniskami Spc110 < 1,5 μm odpowiada komórkom metafazowym, a odległość > 1,5 μm komórkom anafazowym.</li>
	<li>Aby obliczyć intensywności punktów białka (np. Stu2-GFP), użyj narzędzia wyboru odręcznego , aby narysować granicę interesującego sygnału. Dodaj ten sygnał do menedżera ROI (Region of Interest), naciskając T lub korzystając z menu. W menedżerze ROI wybierz Mierz, aby obliczyć intensywność każdego wybranego punktu. Aby zobaczyć zmiany sygnału punktowego w czasie, narysuj średnią intensywność z 95% przedziałem ufności na wykresie liniowym dla każdego punktu czasu.</li>
	<li>Aby obliczyć procent komórek z punktami Bub1-GFP, upewnij się, że minimalne i maksymalne ustawienia jasności w zielonym kanale są takie same dla różnych obrazów. Komórki z punktem Bub1-GFP wykazującym nakładanie się z punktem Mtw1-mCherry są liczone jako Bub1 zlokalizowane w kinetochorze; w przeciwnym razie komórka jest liczona jako ujemna. Policz ~100 komórek na każde schorzenie. Aravamudhan i in.29 zawierają więcej informacji na temat lokalizacji Bub1 w kinetochorach.</li>
	<li>Aby obliczyć procent dużych pączkowych komórek jednojądrowych, policzyć liczbę komórek z dużym pąkiem i jednym jądrem (jeden sygnał DAPI) w populacji i podzielić przez całkowitą liczbę komórek.</li>
	<li>Zapoznaj się z Plikiem Uzupełniającym 1 , gdzie znajdziesz instrukcje do oprogramowania z zrzutami ekranu z oprogramowania do obrazowania.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Wykorzystanie synchronizacji cyklu komórkowego u drożdży pączkujących umożliwia badanie kluczowych mechanizmów różnych procesów komórkowych. Zastosowanie zatrzymań-uwalniania G1 z terapią α-czynnikową umożliwia synchroniczny przebieg populacji komórek przez etapy cyklu komórkowego i, jak pokazaliśmy, może ujawnić dynamiczne wzorce lokalizacji regulatorów komórkowych, takich jak Stu236. Zatrzymywanie cyklu komórkowego można również osiągnąć za pomocą metod genetycznych poprzez wyczerpanie ...

Podział komórek eukariotycznych jest silnie regulowany poprzez program zwany cyklem komórkowym. Wysoce zachowane i dynamiczne procesy zachodzące w cyklu komórkowym sprawiają, że badanie jest interesujące samo w sobie, ale mają też szerokie implikacje, które wspierają badania innych procesów biologicznych komórek – na przykład wiele organelli przechodzi dramatyczną przebudowę podczas podziału komórkowego, a obfitość i lokalizacja wielu białek są silnie regulowanew całym 1,2,3. Chociaż w układach metazoowych występują pewne dodatkowe warstwy złożoności w porównaniu do drożdży, w tym większa różnorodność kinaz i białek regulacyjnych oraz dodatkowe sygnały z sygnałów zewnętrznych u metazo, podział komórkowy jest ogólnie bardzo dobrze zachowany we wszystkich eukariontach 4,5. Wiele fundamentalnych badań nad ustanowieniem kluczowych informacji dotyczących postępu cyklu komórkowego i kluczowych kroków regulacyjnych wykonano u drożdży, a drożdże pozostają niezwykle atrakcyjnym organizmem do badania zagadnień związanych z cyklem komórkowym z wielu powodów 6,7. Najważniejszym z nich jest szeroki wachlarz dostępnych metod manipulacji cyklem komórkowym, umożliwiający zatrzymanie na różnych etapach i synchronizację komórek. Dodatkowe zalety to krótki cykl komórkowy drożdży (~90-150 minut w zależności od temperatury i warunków podłoża), łatwość manipulacji genetycznej oraz szeroki zakres alleli warunkowych umożliwiających badania w kontekście typu dzikiego.
Przebieg przez różne fazy cyklu komórkowego jest napędzany aktywnością kilku kluczowych kinaz, w tym wszechobecnej kinazy zależnej od cyklinu (Cdk), kinazy podobnej do Polo oraz zorzy polarnej. Punkty kontrolne cyklu komórkowego regulują postęp w cyklu komórkowym, zapewniając, że komórki nie przechodzą do kolejnego etapu podziału, chyba że spełnione są określone warunki 8,9. Te punkty kontrolne oraz regulowane przez nie przejścia mogą być wykorzystywane przez badaczy, aby osiągnąć długotrwałe zatrzymanie lub zatrzymanie i uwolnienie przejściowe, aby zsynchronizować populację komórek (Rysunek 1). Na przykład punkt kontrolny dotyczący zaangażowania cyklu komórkowego (punkt restrykcyjny lub Start u drożdży) zapewnia, że komórka ma wystarczająco dużo składników odżywczych, aby zaangażować się w podział przed rozpoczęciem replikacji DNA10. Ten punkt kontrolny można manipulować w drożdżach haploidalnych, aby osiągnąć zatrzymanie G1, wykorzystując program godowy drożdży, który oddziałuje na cykl komórkowy. W drożdżach piekarskich (Saccharomyces cerevisiae) komórki haploidalne mają jeden z dwóch typów godowych, MATa lub MATα, które są genetycznie określone przez locus typu godowego. Drożdże jednego typu kopulacyjnego są wrażliwe na feromony godowe drugiego typu i reagują aktywacją kaskady sygnalizacyjnej kinazy MAP, która ostatecznie fosforyluje i stabilizuje inhibitor Cdk Far1, uniemożliwiający wejście do cyklu komórkowego poprzez wiązanie się z kompleksem Cln1/2-Cdk i blokowanie jego aktywności 11,12,13. Komórki reagujące na feromony godowe można wizualnie określić na podstawie obecności projekcji godowej lub shmoo (Rysunek 1). W ten sposób chemicznie syntetyzowany czynnik α można dodać do hodowli komórek MATA, aby uzyskać zatrzymanie G1. Innym przejściem cyklu komórkowego, na którym naukowcy mogą dążyć do synchronizacji komórek drożdży, jest przejście z metafazy do anafazy. Podczas mitozy Punkt Kontrolny Montażu Wrzeciona (SAC) monitoruje przyczepianie kinetochorów do mikrotubul i hamuje anafazę promującą kompleks/cyklosom (APC/C) poprzez sekwestrowanie jej aktywatora, Cdc20, gdy wykryto nieprzyłączone kinetochory. APC/C to kompleks ligazy E3, który jest niezbędny do wejścia w anafazę. Gdy SAC jest spełniony, Cdc20 wiąże APC/C, a APC/C ubikwitynuje kilka białek, głównie sekurynę i cyklinę B, co celuje w ich degradację, wspierając segregację chromosomów i mitotyczne wyjście14,15. Chociaż sam Cdc20 nie jest składnikiem SAC, jego hamowanie jest celem aktywacji SAC; dlatego indukowalne wyczerpanie Cdc2O może być wykorzystane do zatrzymania hodowli drożdży w metafazie (Rysunek 1)16.
Protokół ten obejmuje dwie metody manipulacji cyklem komórkowym drożdży oraz przykładowe zastosowanie każdej z tych metod. W pierwszym przypadku do zatrzymania komórek w G1 stosuje się czynnik α, po czym następuje krok płukania w celu uwolnienia komórek z zatrzymania, co skutkuje synchronicznym wejściem w cykl komórkowy. Zsynchronizowane komórki będą kontynuowane przez cały cykl komórkowy, umożliwiając badaczom śledzenie i badanie komórek na każdym etapie cyklu komórkowego. W tej metodzie monitorowana jest dynamiczna lokalizacja interesującego białka tagowanego GFP, Stu2, oraz śledzona jest jego powiązanie z wrzecionem mitotycznym. Metoda ta wykorzystuje również element oznaczonego korpusu bieguna wrzecionowego (SPB), Spc110-mCherry, który umożliwia pomiary długości wrzeciona mitotycznego i jest doskonałym wskaźnikiem postępu cyklukomórkowego 17. Metoda ta pokazuje, jak zatrzymanie i uwalnianie cyklu komórkowego umożliwia synchronizację populacji komórek, ułatwiając badanie białka lub innego interesującego komponentu przez cały cykl komórkowy.
W drugiej metodzie zatrzymanie mitotyczne odbywa się poprzez zużycie Cdc20 przy użyciu systemu degronu indukującego auksynę (AID)18. W komórkach ekspresujących TIR1 (białko F-box pochodzenia roślinnego) każde białko z tagiem AID będzie ulokkwitynowane i degradowane po dodaniu auxiny. Tutaj używamy Cdc20 oznaczonego AID, aby umożliwić indukowalną degradację Cdc20, co powoduje zatrzymanie metafazy. Populacja ta jest następnie monitorowana pod kątem rekrutacji oznaczonego składnika SAC Bub1-GFP do kinetochorów, używając oznakowanego białka kinetochoru Mtw1-mCherry jako markera fiducjalnego. Chociaż Bub1 pełni niezależne od SAC role w kinetochorach i lokalizuje się do kinetochorów we wczesnej mitozie, jego trwała lokalizacja kinetochoru w komórkach zatrzymanych sygnalizuje nieprawidłowe przyczepienie kinetochoru do mikrotubul19. Udowodniliśmy to, lecząc komórki trucizną mikrotubul, nokodazolem, która zakłóca przyłączenia kinetochoru i mikrotubul. Ten eksperyment pokazuje, jak procesy specyficzne dla konkretnej fazy cyklu komórkowego można badać przy użyciu wysoce regulowanych metod zatrzymania. Dodatkowo wykazujemy, że auksynę można wypłukać z kultur cdc20-AID, umożliwiając uwolnienie w anafazę i wejście do nowego cyklu komórkowego, choć z naszego doświadczenia wynika, że te kultury nie uwalniają się tak synchronicznie jak α-czynnikowe zatrzymanie-uwolnienie. Te dwie metody aresztowania i uwalniania są skuteczne i łatwe do wdrożenia, ale badacze z drożdżami mają do dyspozycji wiele innych metod, aby zatrzymać komórki na różnych etapach cyklu komórkowego 20,21,22,23. Szczegóły dotyczące tych metod można znaleźć w Dyskusji.

<table><tbody><tr><td>?-czynnik</td><td>Zakład Syntezy Rdzeniowej Uniwersytetu Utah</td><td></td><td>Sekwencja: WHWLQLKPGQPMY</td></tr><tr><td>1,5 mL Pippendorf Tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10mM mieszanka dNTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe lampy o pojemności 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>5x bufor reakcji HF Phusion</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowiec</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401C-212</td><td></td></tr><tr><td>Sól hemisiarczanowa adeniny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agar, granulowany</td><td>Apex Chemicals and Reagents</td><td>20-275</td><td></td></tr><tr><td>Agarozy</td><td>Produkty Apex Bioresearch</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw Amsco Century Steam Sterilizer</td><td>Steris</td><td>SV-1262</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowa woda DI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Auxina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Katalog#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4</td><td></td></tr><tr><td>Cargille Laser Liquid</td><td>Laboratoria Cargille</td><td>20130</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (40,6-Diamidino-2-fenylindol, dihydrochlorek)</td><td>Sondy molekularne</td><td>Cat#D1306</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa z kwasu deoksyrybonukleinowego z jąder łososia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Tetraacetat disodu etylendiaminy</td><td>Fisher Chemical</td><td>S811-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54f</td><td>ImageJ2</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>Mieszacz wirowy o stałej prędkości</td><td>VWR</td><td>https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny DV Ultra</td><td>Leica</td><td>https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE</td><td>Serial #: NV01063. Brak poparcia</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Chemical</td><td>Katalog#F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Aparat żelowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Owl EasyCast B1</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermenty</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>11312A</td><td></td></tr><tr><td>Szklane slajdy</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>Platforma Innova 2300</td><td>Nowy Brunszwik</td><td>NB-2300</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna do probówek 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>2525</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna do probówek 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>Dwuchlorek octana litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158-250G</td><td></td></tr><tr><td>Master cycler nexus X2</td><td>Eppendorf</td><td>https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety p2, p20, p200 i p1000 oraz odpowiadające im końcówki</td><td>Rainin</td><td>L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541014</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Calbiochem</td><td>Cat#487928; CAS: 31430-18-9; Lot#B35705</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowe G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7252</td><td></td></tr><tr><td>CZOP</td><td>Badania Hampton</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>Pepton granulowany&nbsp;</td><td>Bioreagenty Fishera</td><td>BP9725-5</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion HF</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-X</td><td>Rainin</td><td>PX-100R</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dibazowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>424195000</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monozasadowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>424200025</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zasilania</td><td>Bio-Rad</td><td>23786</td><td></td></tr><tr><td>Rozpocznij Acquire Ultra 1.2.2</td><td>softWoRx Cytiva</td><td>Uzyskaj z DV Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Bioreagenty Fishera</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rur</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>kąpiel wodna</td><td>VWR</td><td>WBE10A11B</td><td></td></tr><tr><td>Woda, Ultra Czysta</td><td>Produkty Apex Bioresearch</td><td>18-194</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy granulowany</td><td>Bioreagenty Fishera</td><td>BP9727-5</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Manipulation and Analysis of Cell Cycle-Dependent Processes in Budding Yeast

Komórki eukariotyczne podążają za zachowanym cyklem komórkowym, który reguluje różnorodne procesy, w tym utrzymanie DNA i homeostazę organelli. Badanie procesów komórkowych zależnych od cyklu komórkowego jest często konieczne do właściwej interpretacji wyników eksperymentalnych. Dostępne są metody chemiczne i genetyczne umożliwiające synchronizację cyklu komórkowego w komórkach hodowanych w szerokim spektrum organizmów, w tym modele kręgowców, umożliwiające badanie procesów zależnych od cyklu komórkowego. Jednak wśród organizmów modelowych drożdże pączkujące pozostają potężnym narzędziem do analizy cyklu komórkowego ze względu na szczególnie solidne metody synchronizacji, krótki czas generowania oraz genetyczną podatność na przetwarzanie. Drożdże dzielą podstawowe mechanizmy cyklu komórkowego z innymi eukariontami, co umożliwiło przełomowe odkrycia w regulacji cyklu komórkowego. Protokół ten szczegółowo opisuje metody analizy cyklu komórkowego u drożdży, koncentrując się na eksperymentach G1 z zatrzymaniem i uwalnieniem oraz mitotycznym zatrzymaniem i uwalnianiem, w tym konstrukcją szczepów, przygotowaniem hodowli oraz mikroskopią. Przedstawiono metody znakowania PCR do uzyskania odpowiednich szczepów do zatrzymań cyklu komórkowego oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Zatrzymanie G1 osiąga się przy użyciu czynnika α feromonów peptydowych, a krótkie płukania prowadzą do synchronicznego uwalniania i postępu cyklu komórkowego. Próbki pobierane są w różnych momentach po wypuszczeniu do cyklu komórkowego i utrwalane do mikroskopii. Druga metoda zatrzymuje komórki drożdży w mitozie poprzez wyczerpanie regulatora cyklu komórkowego Cdc20, aby osiągnąć populację zatrzymaną metafazą, a także opcjonalne uwolnienie do anafazy. Próbki są utrwalane i przygotowywane do obrazowania przed i po uwolnieniu, a następnie są obrazowane i analizowane. Analiza obrazów koncentruje się na katalogowaniu dynamicznej lokalizacji oraz zmian liczebności białek w cyklu komórkowym. Metody synchronizacji te są odpowiednie do różnorodnych manipulacji cyklu komórkowego, a choć ich zastosowanie w obrazowaniu stałych komórek jest tutaj podkreślone, można je dostosować do wielu innych analiz, w tym obrazowania żywych komórek oraz testów biochemicznych i molekularnych.

Analiza zmian w lokalizacji białek zależnych od cyklu komórkowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej może być łatwo przeprowadzona metodami opisanymi tutaj. Nasza grupa od dawna interesuje się dynamiczną regulacją i funkcją wrzeciona mitotycznego. W drożdżach ciała biegunów wrzeciona (oznaczone składnikiem Spc110) pełnią funkcję centrów organizujących mikrotubule, z których wychodzą włókna mikrotubul, tworząc strukturę wrzeciona mitotycznego30. Białko wiążące m...

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Eukaryotic cells follow a conserved cell cycle that regulates diverse processes, including DNA maintenance and organelle homeostasis. Studying cellular ...

Badamy, jak dzielące się komórki wiernie przekazują swoje chromosomy podczas mitozy, koncentrując się na maszynach molekularnych i mechanizmach zapewniających dokładną segregację chromosomów. Synchronizujemy komórki, aby badać procesy molekularne, które zmieniają się wraz z cyklem komórkowym. Bez tych metod kluczowe zmiany byłyby ukryte w niezsynchronizowanej populacji komórek.W porównaniu z innymi metodami synchronizacji, zatrzymanie czynnika alfa u mutantów BAR1 zapewnia czystsze, odwracalne zatrzymanie G1, pozwalające śledzić cały proces kultury drożdży przechodzącą synchronicznie przez cykl. Nasze badania ujawniają dynamiczną lokalizację białek i zmiany aktywności w całym cyklu komórkowym, rzucając światło na kluczowe procesy mitotyczne, takie jak segregacja chromosomów i utrzymanie wrzeciona. Na początek zaszczep drożdże w 25 mililitrach nośnika YPAD i inkubuj przez noc, aby osiągnąć gęstość optyczną 600 nanometrów między 0,5 a 2,0.Rozcieńcz komórki drożdży do gęstości optycznej o długości 600 nanometrów 0,5. Dodaj do hodowli czynnik alfa, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. Po 2,5 do 3,5 godziny po dodaniu czynnika alfa polić procent niezapuszczonych komórek shmooowanych pod mikroskopem, aby ocenić zatrzymanie komórek.Następnie odkręcaj hodowlę w wirówce o stężeniu 3 000 g przez trzy do pięciu minut w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Ostrożnie wylej supernatant, aby usunąć czynnik alfa. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 25 mililitrach YPAD zawierającego 1% dimetylosulfoksydu do mycia komórek.Przełóż granulkę komórkową do świeżej rurki i powtórz płukania jeszcze dwa razy, co daje łącznie trzy płukania, aby usunąć wszelkie pozostałości czynnika alfa. Następnie dodaj YPAD do wymytych komórek, aby ostateczna objętość wyniosła 25 mililitrów, a następnie przelej zawiesinę do nowej kolby do dalszej inkubacji lub użycia. Pobierz próbkę z punktu czasu zerowego natychmiast po uwolnieniu i utrwal próbkę.Po 60 minutach po uwolnieniu oceń synchronizację populacji komórek pod mikroskopem świetlnym. W razie potrzeby dodaj czynnik alfa ponownie 60 minut po uwolnieniu do końcowego stężenia jednego mikrograma na mililitr, aby zablokować przejście do kolejnego cyklu komórkowego. Kontynuuj pobieranie próbek punktowych co 15 minut, do 180 minut lub tak długo, jak będzie potrzebne.Aby utrwalić komórki drożdży, wiruj jeden mililitr hodowli przez minutę z maksymalną prędkością. Całkowicie zasysaj nadmiar. Następnie ponownie zawiesić pellet w 500 mikrolitrach roztworu utrwalacza i inkubować w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez 2 do 15 minut.Po wirowaniu komórek stałych zasysaj supernatant i ponownie zawiesij pellet w 500 mikrolitrach buforu potasowego o mocy 0,1 molu przy pH 6,4. Przed obrazowaniem wiruj stałe ogniwa w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Po wsaniu supernatantu ponownie zawiesij pellet w 10 do 100 mikrolitrach roztworu trytonu, DAPI i sorbitolu.Pipeta około 0,8 mikrolitra zabarwionego zawiesiny komórkowej bezpośrednio na środek czystej pokrywki. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie rozprowadzić kroplę w okrągłym obszarze o wielkości około jednego centymetra kwadratowego. Przyłóż folię na preparat mikroskopowy.Używając kimwipe, delikatnie dociskaj krawędzie pokrywki, aby równomiernie rozprowadzić próbkę. Następnie zabezpiecz krawędzie pokrywy lakierem do paznokci, aby zabezpieczyć próbkę. Zabierz przygotowane preparaty do mikroskopu wyposażonego w obiektyw olejowy z aperturą 60 razy, aperturę numeryczną 1,42 oraz zestaw laserowy i filtrujący w czerwieni, kolorze, błękitnie i dalekoczerwonym kolorze.Skupić mikroskop na komórkach drożdży przyklejonych do pokrywki. Po ustawieniu ostrości dostosuj ustawienia ekspozycji dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby uzyskać stosunek sygnału do szumu co najmniej trzy do jednego. Dostosuj ustawienia akwizycji, aby zebrać od 14 do 20 obrazów w stosie z, przy czym każdy fragment znajduje się w odstępach 0,2 mikrometra, pokrywając całkowitą głębokość od dwóch do czterech mikrometrów.Na mikroskopach wyposażonych w moduły post-processing wybierz opcje Dekonwolucji i Szybkiej Projekcji dla każdego obrazu stosu z. Pobierz stosy z próbki, wykonując wystarczającą liczbę obrazów, aby zarejestrować około 100 do 200 komórek drożdży dla każdego warunku eksperymentalnego lub punktu czasowego. Do analizy otwórz rzutowane obrazy w oprogramowaniu ImageJ.Dostosuj jasność i kontrast każdego kanału fluorescencyjnego, aby poprawić widoczność. Aby przeanalizować postęp cyklu komórkowego, policz 100 komórek dla każdego punktu czasowego i klasyfikuj je jako zawierające jedno lub dwa jądra. Aby obliczyć procent komórek wykazujących punkty Stu2-GFP, standaryzuj ustawienia jasności kanału zielonego na wszystkich obrazach.Policz komórki wykazujące punktki Stu2-GFP, które współlokalizują się ze Spc110-mCherry punktami, jako pozytywne na lokalizację kinetochoru. Następnie, aby zmierzyć intensywność białkowych punktów, użyj narzędzia do wyboru odręcznego, aby wyznaczyć obszar zainteresowania wokół sygnału. Dodaj wybór do Menedżera Regionu Zainteresowań, naciskając T lub wybierając opcję z menu Menedżera ROI.W Menedżerze ROI kliknij Mierz, aby obliczyć intensywność punktów. Aby zobrazować zmiany w czasie, narysuj średnią intensywność z 95% przedziałami ufności dla każdego punktu czasowego. Policz około 100 komórek na każde schorzenie.W komórkach zatrzymanych G1 Stu2-GFP lokalizował się w pojedynczym okrężnym punkcie bieguna wrzecionowego z dodatkowym sygnałem rozproszonym wzdłuż mikrotubul cytoplazmatycznych. 60 minut po uwolnieniu Stu2-GFP zlokalizował się jako dwa punkty przylegające do zdublowanych słupów wrzecionowych oznaczonych Spc110-mCherry. Po 90 minutach, podczas anafazy, Stu2-GFP pojawił się zarówno w pobliżu biegunów wrzeciona, jak i wzdłuż mikrotubul rozciągających się wzdłuż pojedynczej osi.Po wyjściu z mitotycznej lampy, po 120 minutach, Stu2-GFP pojawił się ponownie na mikrotubulach astralnych w cytoplazmie. Ilościowa analiza wykazała, że intensywność Stu2-GFP w pobliżu biegunów wrzeciona wzrosła we wczesnej mitozie, osiągając szczyt przed anafazą i spadając później. Procent komórek dwuściennych osiągnął szczyt około 90 minut, co wskazuje na zsynchronizowane wejście w anafazę.

manipulation-analysis-cell-cycle-dependent-processes-budding

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Inherent Dynamics Visualizer to interaktywny pakiet wizualizacji, który łączy się z narzędziem do wnioskowania o sieci regulacji genów w celu ulepszonego, usprawnionego generowania funkcjonalnych modeli sieciowych. Wizualizator może być używany do podejmowania bardziej świadomych decyzji dotyczących parametryzacji narzędzia wnioskowania, zwiększając w ten sposób zaufanie do wynikowych modeli.

Inherent Dynamics Visualizer, interaktywna aplikacja do oceny i wizualizacji wyników z potoku wnioskowania o sieci regulacji genów

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Jednym z wyzwań związanych z analizą eksperymentów z synchronizowanymi szeregami czasowymi jest to, że eksperymenty często różnią się długością powrotu do zdrowia po synchronizacji i okresem cyklu komórkowego. W związku z tym pomiary z różnych eksperymentów nie mogą być analizowane zbiorczo ani łatwo porównywane. W tym miejscu opisujemy metodę dopasowywania eksperymentów, aby umożliwić porównania specyficzne dla fazy.

Wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży.

Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Poznaj metody synchronizacji cyklu komórkowego u drożdży Saccharomyces cerevisiae w celu badania segregacji chromosomów podczas mitozy. Technika alfa-faktora umożliwia precyzyjną analizę lokalizacji białek.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Przeglądaj więcej filmów