Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Badamy, jak dzielące się komórki wiernie przekazują swoje chromosomy podczas mitozy, koncentrując się na maszynach molekularnych i mechanizmach zapewniających dokładną segregację chromosomów. Synchronizujemy komórki, aby badać procesy molekularne, które zmieniają się wraz z cyklem komórkowym. Bez tych metod kluczowe zmiany byłyby ukryte w niezsynchronizowanej populacji komórek.

W porównaniu z innymi metodami synchronizacji, zatrzymanie czynnika alfa u mutantów BAR1 zapewnia czystsze, odwracalne zatrzymanie G1, pozwalające śledzić cały proces kultury drożdży przechodzącą synchronicznie przez cykl. Nasze badania ujawniają dynamiczną lokalizację białek i zmiany aktywności w całym cyklu komórkowym, rzucając światło na kluczowe procesy mitotyczne, takie jak segregacja chromosomów i utrzymanie wrzeciona. Na początek zaszczep drożdże w 25 mililitrach nośnika YPAD i inkubuj przez noc, aby osiągnąć gęstość optyczną 600 nanometrów między 0,5 a 2,0.

Rozcieńcz komórki drożdży do gęstości optycznej o długości 600 nanometrów 0,5. Dodaj do hodowli czynnik alfa, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. Po 2,5 do 3,5 godziny po dodaniu czynnika alfa polić procent niezapuszczonych komórek shmooowanych pod mikroskopem, aby ocenić zatrzymanie komórek.

Następnie odkręcaj hodowlę w wirówce o stężeniu 3 000 g przez trzy do pięciu minut w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Ostrożnie wylej supernatant, aby usunąć czynnik alfa. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 25 mililitrach YPAD zawierającego 1% dimetylosulfoksydu do mycia komórek.

Przełóż granulkę komórkową do świeżej rurki i powtórz płukania jeszcze dwa razy, co daje łącznie trzy płukania, aby usunąć wszelkie pozostałości czynnika alfa. Następnie dodaj YPAD do wymytych komórek, aby ostateczna objętość wyniosła 25 mililitrów, a następnie przelej zawiesinę do nowej kolby do dalszej inkubacji lub użycia. Pobierz próbkę z punktu czasu zerowego natychmiast po uwolnieniu i utrwal próbkę.

Po 60 minutach po uwolnieniu oceń synchronizację populacji komórek pod mikroskopem świetlnym. W razie potrzeby dodaj czynnik alfa ponownie 60 minut po uwolnieniu do końcowego stężenia jednego mikrograma na mililitr, aby zablokować przejście do kolejnego cyklu komórkowego. Kontynuuj pobieranie próbek punktowych co 15 minut, do 180 minut lub tak długo, jak będzie potrzebne.

Aby utrwalić komórki drożdży, wiruj jeden mililitr hodowli przez minutę z maksymalną prędkością. Całkowicie zasysaj nadmiar. Następnie ponownie zawiesić pellet w 500 mikrolitrach roztworu utrwalacza i inkubować w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez 2 do 15 minut.

Po wirowaniu komórek stałych zasysaj supernatant i ponownie zawiesij pellet w 500 mikrolitrach buforu potasowego o mocy 0,1 molu przy pH 6,4. Przed obrazowaniem wiruj stałe ogniwa w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Po wsaniu supernatantu ponownie zawiesij pellet w 10 do 100 mikrolitrach roztworu trytonu, DAPI i sorbitolu.

Pipeta około 0,8 mikrolitra zabarwionego zawiesiny komórkowej bezpośrednio na środek czystej pokrywki. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie rozprowadzić kroplę w okrągłym obszarze o wielkości około jednego centymetra kwadratowego. Przyłóż folię na preparat mikroskopowy.

Używając kimwipe, delikatnie dociskaj krawędzie pokrywki, aby równomiernie rozprowadzić próbkę. Następnie zabezpiecz krawędzie pokrywy lakierem do paznokci, aby zabezpieczyć próbkę. Zabierz przygotowane preparaty do mikroskopu wyposażonego w obiektyw olejowy z aperturą 60 razy, aperturę numeryczną 1,42 oraz zestaw laserowy i filtrujący w czerwieni, kolorze, błękitnie i dalekoczerwonym kolorze.

Skupić mikroskop na komórkach drożdży przyklejonych do pokrywki. Po ustawieniu ostrości dostosuj ustawienia ekspozycji dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby uzyskać stosunek sygnału do szumu co najmniej trzy do jednego. Dostosuj ustawienia akwizycji, aby zebrać od 14 do 20 obrazów w stosie z, przy czym każdy fragment znajduje się w odstępach 0,2 mikrometra, pokrywając całkowitą głębokość od dwóch do czterech mikrometrów.

Na mikroskopach wyposażonych w moduły post-processing wybierz opcje Dekonwolucji i Szybkiej Projekcji dla każdego obrazu stosu z. Pobierz stosy z próbki, wykonując wystarczającą liczbę obrazów, aby zarejestrować około 100 do 200 komórek drożdży dla każdego warunku eksperymentalnego lub punktu czasowego. Do analizy otwórz rzutowane obrazy w oprogramowaniu ImageJ.

Dostosuj jasność i kontrast każdego kanału fluorescencyjnego, aby poprawić widoczność. Aby przeanalizować postęp cyklu komórkowego, policz 100 komórek dla każdego punktu czasowego i klasyfikuj je jako zawierające jedno lub dwa jądra. Aby obliczyć procent komórek wykazujących punkty Stu2-GFP, standaryzuj ustawienia jasności kanału zielonego na wszystkich obrazach.

Policz komórki wykazujące punktki Stu2-GFP, które współlokalizują się ze Spc110-mCherry punktami, jako pozytywne na lokalizację kinetochoru. Następnie, aby zmierzyć intensywność białkowych punktów, użyj narzędzia do wyboru odręcznego, aby wyznaczyć obszar zainteresowania wokół sygnału. Dodaj wybór do Menedżera Regionu Zainteresowań, naciskając T lub wybierając opcję z menu Menedżera ROI.

W Menedżerze ROI kliknij Mierz, aby obliczyć intensywność punktów. Aby zobrazować zmiany w czasie, narysuj średnią intensywność z 95% przedziałami ufności dla każdego punktu czasowego. Policz około 100 komórek na każde schorzenie.

W komórkach zatrzymanych G1 Stu2-GFP lokalizował się w pojedynczym okrężnym punkcie bieguna wrzecionowego z dodatkowym sygnałem rozproszonym wzdłuż mikrotubul cytoplazmatycznych. 60 minut po uwolnieniu Stu2-GFP zlokalizował się jako dwa punkty przylegające do zdublowanych słupów wrzecionowych oznaczonych Spc110-mCherry. Po 90 minutach, podczas anafazy, Stu2-GFP pojawił się zarówno w pobliżu biegunów wrzeciona, jak i wzdłuż mikrotubul rozciągających się wzdłuż pojedynczej osi.

Po wyjściu z mitotycznej lampy, po 120 minutach, Stu2-GFP pojawił się ponownie na mikrotubulach astralnych w cytoplazmie. Ilościowa analiza wykazała, że intensywność Stu2-GFP w pobliżu biegunów wrzeciona wzrosła we wczesnej mitozie, osiągając szczyt przed anafazą i spadając później. Procent komórek dwuściennych osiągnął szczyt około 90 minut, co wskazuje na zsynchronizowane wejście w anafazę.