Pomiar replikatywnej długości życia pączkujących drożdży

Pączkujące drożdże Croce Visi były szeroko stosowane do badania biologii starzenia się. W tym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej żywotności komórek macierzystych drożdży. Cześć, nazywam się Kristen Steffen i pracuję w laboratorium Briana Kennedy'ego na Wydziale Biochemii Uniwersytetu Waszyngtońskiego.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania genów, które wpływają na długość życia komórek drożdży. Więc zacznijmy.

Do eksperymentu replikacyjnej długości życia i przygotowania komórek drożdży do analizy długości życia należy przygotować do tego solidne płytki YEPD. Do przygotowania tych płytek agarowych YEPD należy użyć odpowiedniej sterylnej techniki. Przygotuj co najmniej dwie płytki na każde cztery do pięciu szczepów, które mają być analizowane w eksperymencie dotyczącym długości życia.

Płytki te powinny być przygotowane co najmniej dwa dni przed eksperymentem dotyczącym długości życia i pozostawione do wyschnięcia przed rozpoczęciem badania długości życia. Jeśli eksperyment nie odbędzie się w ciągu czterech do pięciu dni od nalania płytek, należy je zawinąć w folię lub plastik i umieścić w inkubatorze z chłodzeniem, aby zapobiec wysuszeniu. Usuń szczepy drożdży z zamrożonych zapasów i smuguj pojedyncze kolonie.

Na płytkach agarowych YEPD. Na tej samej płycie YEPD można łatwo rozsiać do sześciu szczepów, dzieląc płytkę na cząstki w kształcie ciasta o równej wielkości. Inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni.

Po inkubacji należy wyjąć komórki z inkubatora i umieścić komórki z pojedynczej kolonii na świeżej płytce YEPD. W tym momencie szczepy, które mają być analizowane, powinny być powlekane, aby zapewnić, że eksperyment replikacyjny długości życia zostanie przeprowadzony na ślepo. Tam, gdzie sekcje nie znają tożsamości poszczególnych szczepów. Łańcuchy.

Następnie inkubuj połatane pokryte komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza do następnego wieczora. Usuń komórki i delikatnie nałóż komórki z każdego powlekanego szczepu na świeże płytki YEPD. Będą one służyć jako płytki eksperymentalne używane do replikacji żywotności.

Komórki analityczne powinny być załatane wzdłuż pionowej linii po lewej stronie płytki YEPD. Nie należy umieszczać zbyt wielu komórek na jednej świeżej płytce YEPD. Ponieważ spowoduje to gęsty wzrost komórek podczas nocnej inkubacji i wpłynie na ich żywotność replikacyjną, optymalne jest około trzech do pięciu plastrów na płytkę.

Zakładając, że replikacyjna analiza długości życia zostanie przeprowadzona na 20 komórkach z każdej łaty, teraz eksperyment z długością życia jest już gotowy i wszystko, co muszą zrobić, to inkubować przez noc na stole laboratoryjnym. A potem jutro możemy rozpocząć mikro preparację, aby umieścić komórki drożdży na płytce i uzyskać pierwotne komórki potomne. Do replikacyjnej analizy żywotności.

Użyj mikroskopu wyposażonego w aparat do mikropreparacji odpowiedni dla drożdży. Przenieś około 50 komórek z pierwszego szczepu plastra do pozycji na płytce dystalnej do załatanych komórek. Jeśli stolik mikroskopu jest stopniowany, te gradacje można zastosować, aby zapewnić, że komórki będą łatwe do znalezienia podczas kolejnych iteracji.

Czasami komórki mogą utknąć w igle, co może stanowić problem, jeśli wyjdą w niewłaściwym czasie. Aby upewnić się, że igła jest czysta i wolna od komórek, należy kilkakrotnie przyłożyć ją do powierzchni agaru. Następnie utwórz otwór w agarze, przepychając igłę przez powierzchnię agaru.

Otwór ten posłuży jako znacznik do orientacji na płytce podczas kolejnych iteracji sekcji i usuwania komórek kropkowych. Uważaj, aby komórki drożdży nie dostały się do otworu, w przeciwnym razie wyrosną i utworzą kolonię bezpośrednio nad otworem. Pionowo wyrównane pojedyncze komórki drożdży w 20 równomiernie rozmieszczonych pozycjach z jedną do trzech średnic igieł między każdą pozycją komórki.

Dla każdych kilku komórek umieść dwie komórki obok siebie w tym samym miejscu w linii, a nie jedną. Pozwala to na redundancję podczas selekcji pierwotnych komórek potomnych. Jeśli jedna z przeniesionych komórek nie podzieli się między 10. a 11. pozycją w linii, utwórz poziomą serię od siedmiu do ośmiu otworów w agarze.

Będzie to służyć jako marker do orientacji na płytce podczas kolejnych sekcji i usuwania komórek potomnych. Ponownie uważaj, aby komórki drożdży nie dostały się do otworów, w przeciwnym razie będą rosły i tworzyły kolonię. Powtórz tę procedurę dla każdej łaty na płytce, kontynuując układanie komórek pionowo wzdłuż tej samej osi.

Ważne jest, aby pamiętać, że podczas tworzenia otworu w AER, liczba utworzonych otworów powinna odpowiadać numerowi łaty, tak aby był jeden otwór na pierwszą łatkę i dwa otwory na drugą. Po ułożeniu komórek dla każdego plastra sparaformuj płytkę i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około dwie godziny. Pamiętaj, że od tego momentu wszystkie płyty powinny być sfilmowane para, z wyjątkiem sytuacji, gdy są poddawane sekcji.

Aby zapobiec wysuszeniu, powtórz tę procedurę dla każdej płytki. W eksperymencie. Do analizy długości życia ważne jest, aby mieć pewność, że każda komórka zaczyna się jako pierwotna komórka potomna.

Aby to zrobić, należy najpierw wyjąć płytki z inkubatora i sprawdzić, czy większość komórek macierzy została poddana podziałowi komórek. Mamy tu do czynienia z komórkami, które zostały wcześniej wyrównane i widać, że po dwóch godzinach w inkubatorze zaczęły się dzielić. A teraz mamy komórkę matkę, większą dołączoną do swojego ciała, pierwotną komórkę potomną, a ta dziewicza komórka potomna jest komórką, która zostanie użyta do rozpoczęcia życia.

Jeśli potrzeba dodatkowego czasu, aby umożliwić zakończenie podziałów komórek, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Począwszy od pierwszej komórki tablicy. Użyj igły, aby odłączyć komórki potomne od komórki macierzystej, delikatnie umieszczając igłę na przymocowanych komórkach.

Czasami pomocne jest stuknięcie w bok podstawy mikroskopu, gdy igła spoczywa na komórkach. Następnie umieść odłączoną komórkę potomną w pionowej linii komórek, zastępując komórkę macierzystą i wszelkie dodatkowe komórki potomne i tymczasowo odsuwając je na bok. Powtórz te kroki dla każdej z komórek tablicy.

Jeśli komórka nie dzieli się, weź komórkę potomną z jednej z nadmiarowych komórek umieszczonych obok komórki testowej. Po zakończeniu powinieneś mieć 20 komórek potomnych dla każdej łatki wyrównanych pionowo na płytce żywotności. Zbierz wszystkie komórki macierzyste i dodatkowe komórki potomne w stos i przenieś je z powrotem do obszaru w pobliżu plam zwanych cmentarzem.

Ważne jest, aby trzymać niechciane komórki z dala od komórek poddawanych analizie długości życia, aby zapobiec tworzeniu się mikrokolonii i wyczerpaniu lokalnych składników odżywczych. Po rozdzieleniu komórek należy rozbić płytkę i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około dwie godziny. Powtórz te kroki dla każdej płytki w eksperymencie.

Aby zmierzyć zdolność replikacyjną poszczególnych komórek, należy przygotować arkusze danych dotyczących żywotności. Arkusz danych długości życia może być prostą siatką, w której każdy wiersz odpowiada pojedynczej komórce macierzystej, a każda kolumna odpowiada punktowi wieku. Pamiętaj, aby oznaczyć każdy arkusz danych zgodnie z liczbą szczepów, które mają być analizowane.

Aby rozpocząć, najpierw wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź, czy większość komórek matrycy przeszła co najmniej jeden podział komórkowy. Jeśli potrzeba więcej czasu, aby umożliwić zakończenie podziału komórek, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Zacznij od pierwszej komórki tablicy na pierwszej płytce i obserwuj wzrokowo matkę i córkę, komórkę lub komórki, aby określić liczbę podziałów komórkowych, które wystąpiły.

Ogólnie rzecz biorąc, łatwo jest określić, ile komórek potomnych wyprodukowała matka, na podstawie charakterystycznych wzorców ułożenia komórek. To jest naprawdę proste do sprawdzenia, ile komórek wyprodukował, ponieważ są tam dwie i są tego samego rozmiaru i obie są mniejsze niż matka. Zapisać liczbę komórek potomnych wytworzonych przez komórkę macierzystą w odpowiednim polu na arkuszu oceny długości życia.

Następnie użyj igły, aby odłączyć komórki potomne od komórki macierzystej, jak opisano wcześniej, delikatnie umieszczając igłę na przymocowanych komórkach i stukając w bok podstawy mikroskopu, gdy igła spoczywa na komórkach. Utrzymuj komórkę macierzystą na swoim miejscu w linii pionowej i tymczasowo odsuń komórkę lub komórki potomne na bok. Powtórz te kroki dla każdej z komórek tablicy.

Na koniec zbierz wszystkie odrzucone komórki potomne i przenieś je na cmentarz znajdujący się w pobliżu oryginalnych łatek. Sfilmować płytkę i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin. Powtórz odrzucanie komórek potomnych i inkubację.

Krok dla każdej płytki w eksperymencie. Powtarzaj całą tę procedurę, aż wszystkie komórki macierzyste przestaną się dzielić. Należy pamiętać, że wraz ze starzeniem się komórek macierzystych postęp cyklu komórkowego staje się wolniejszy i pożądane będzie inkubowanie płytki przez dłuższy czas między punktami starczymi, a następnie płytki można umieścić w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Surowe dane uzyskane w eksperymencie replikacyjnej długości życia są listą liczb odpowiadających komórkom potomnym wyprodukowanym przez każdą komórkę matkę w każdym punkcie wieku. Jak widać tutaj. Sumując każdy wiersz arkusza wyników, uzyskuje się replikacyjną długość życia dla każdej komórki macierzystej.

Dane z innych komórek z tej samej grupy eksperymentalnej można łączyć w celu wygenerowania krzywej przeżycia i wykonania obliczeń statystycznych. Krzywa powinna być z grubsza zgodna z kinetyką Gomperts Mac am, wykazując kształt esicy z niską wczesną śmiertelnością, po której następuje stosunkowo szybki spadek przeżywalności i spłaszczenie krzywej w późniejszym wieku. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić eksperyment z replikacją żywotności drożdży.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że komórki będą się dzielić, gdy nie będą na zimno. Pamiętaj więc, aby na noc ustawić płytki w temperaturze czterech stopni, aby nie skończyć ze zbyt dużą liczbą komórek potomnych do policzenia rano. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.