Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

Drożdże budzące się Croce Visi były szeroko wykorzystywane do badania biologii starzenia się. W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia macierzystych komórek drożdży. Cześć, jestem Kristen Steffen z laboratorium Briana Kennedy'ego w Katedrze Biochemii na Uniwersytecie Waszyngtońskim.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę pomiaru długości życia replikacyjnego macierzyńskich komórek drożdży. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania genów wpływających na długość życia komórek drożdży. Zapraszamy do oglądania.

Do eksperymentu nad długością życia replikacyjnego oraz przygotowania komórek drożdży do analizy długości życia konieczne jest przygotowanie stałych płytek YEPD. Przygotuj agarowe płytki YEPD, stosując odpowiednią technikę sterylną. Przygotuj co najmniej dwie płytki na każde cztery do pięciu szczepów analizowanych w eksperymencie dotyczącym długości życia.

Płytki te należy przygotować co najmniej dwa dni przed eksperymentem określającym długość życia i pozostawić do wyschnięcia przed rozpoczęciem testu. Jeśli eksperyment nie odbędzie się w ciągu czterech do pięciu dni od zalania płytek, powinny one zostać owinięte parafilmem lub folią plastikową i umieszczone w inkubatorze chłodniczym, aby zapobiec wysychaniu. Wyjąć szczepy drożdży z zamrożonych zasobów i wysiać w celu otrzymania pojedynczych kolonii.

Na płytki agarowe YEPD. Do sześciu szczepów można łatwo wysiać na jednej płytce YEPD, dzieląc ją na równowielkie sektory w kształcie kawałków tortu. Inkubuj komórki w temperaturze 30 °C przez dwa dni.

Po inkubacji wyjmij komórki z inkubatora i przenieś komórki z pojedynczej kolonii na świeżą płytkę YEPD. W tym momencie szczepy przeznaczone do analizy powinny zostać zakodowane, aby zapewnić przeprowadzenie eksperymentu dotyczącego długości życia replikacyjnego metodą ślepej próby, tak aby osoby wykonujące rozdzielanie nie znały tożsamości poszczególnych szczepów.

Następnie inkubuj komórki z naniesionymi plamkami w temperaturze 30 °C do następnego wieczora. Wyjmij komórki i delikatnie przenieś plamki z każdego powlekanego szczepu na świeże płytki YEPD. Będą one służyć jako płytki eksperymentalne wykorzystywane do badania długości życia replikacyjnego.

Komórki do analizy należy nakładać wzdłuż pionowej linii po lewej stronie płytki YEPD. Nie należy przenosić zbyt wielu komórek na jedną świeżą płytkę YEPD. Ponieważ spowodowałoby to zbyt gęsty wzrost komórek podczas inkubacji nocnej i wpłynęło na ich długość życia replikacyjnego, optymalna liczba wynosi od około trzech do pięciu plamek na płytkę.

Zakładając, że analiza długości życia replikacyjnego zostanie przeprowadzona na 20 komórkach z każdego obszaru, eksperyment dotyczący długości życia jest już w pełni przygotowany i pozostało jedynie inkubować próbki przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie jutro będziemy mogli przystąpić do mikrodysekcji, aby ustawić komórki drożdży na płytce i uzyskać dziewicze komórki potomne do analizy długości życia replikacyjnego.

Należy użyć mikroskopu wyposażonego w aparat do mikrodyssekcji odpowiedni dla drożdży. Przenieś około 50 komórek z pierwszej plamki szczepu w miejsce na płytce oddalone od komórek z plamki. Jeśli stolik mikroskopu posiada skalę, można z niej skorzystać, aby ułatwić odnalezienie komórek podczas kolejnych iteracji.

Czasami komórki mogą zablokować się w igle, co może stanowić problem, jeśli zostaną uwolnione w niewłaściwym momencie. Aby upewnić się, że igła jest czysta i wolna od komórek, należy wielokrotnie dotknąć nią powierzchni agaru. Następnie należy wykonać otwór w agarze, wbijając igłę przez jego powierzchnię.

Otwór ten będzie służył jako znacznik ułatwiający orientację na płytce podczas kolejnych powtórzeń sekcji i usuwania pojedynczych komórek. Należy uważać, aby do otworu nie dostały się komórki drożdży, ponieważ mogą one ulec wzrostowi i utworzyć kolonię bezpośrednio nad otworem. Ustaw pojedyncze komórki drożdży w pionowej linii w 20 równomiernie rozłożonych pozycjach, zachowując odstęp od jednej do trzech średnic igły pomiędzy każdą pozycją komórki.

W przypadku każdych kilku komórek, umieść dwie komórki obok siebie w tej samej pozycji w linii, zamiast jednej. Pozwala to na zapewnienie redundancji podczas selekcji dziewiczych komórek potomnych. Jeśli jedna z przeniesionych komórek nie podzieli się pomiędzy 10. a 11. pozycją w linii, wykonaj w agarze poziomą serię od siedmiu do ośmiu otworów.

Będzie to służyć jako znacznik ułatwiający orientację na płytce podczas kolejnych sekcji i usuwania komórek potomnych. Ponownie przypominamy, aby uważać, by komórki drożdży nie dostały się do otworów, gdyż mogą one wyrosnąć i utworzyć kolonię. Powtórz tę procedurę dla każdego obszaru na płytce, kontynuując rozmieszczanie komórek pionowo wzdłuż tej samej osi.

Należy pamiętać, aby podczas wykonywania otworów w AER liczba stworzonych otworów odpowiadała numerowi patcha, tak aby dla pierwszego patcha był jeden otwór, a dla drugiego dwa. Po rozmieszczeniu komórek dla każdego patcha, zabezpiecz płytkę parafilmem i inkubuj w temperaturze 30 °C przez około dwie godziny. Pamiętaj, że od tego momentu wszystkie płytki powinny być zabezpieczone parafilmem, z wyjątkiem czasu przeprowadzania sekcji.

Aby zapobiec wysychaniu, należy powtórzyć tę procedurę dla każdej płytki. W eksperymencie dotyczącym analizy długości życia ważne jest upewnienie się, że każda komórka zaczyna jako pierwotna komórka potomna.

Aby to zrobić, najpierw wyjmij płytki z inkubatora i upewnij się, że większość komórek w macierzy uległa podziałowi komórkowemu. Tutaj mamy komórki, które zostały wcześniej ustawione w linii i widać, że po dwóch godzinach w inkubatorze zaczęły się dzielić. Obecnie mamy komórkę macierzystą – tę większą, z którą połączona jest nowo powstała komórka potomna, a ta komórka potomna jest komórką, która zostanie wykorzystana do rozpoczęcia pomiaru długości życia.

Jeśli wymagany jest dodatkowy czas na zakończenie podziałów komórkowych, należy ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Zaczynając od pierwszej komórki w macierzy, należy użyć igły, aby oddzielić komórki potomne od komórki macierzystej, delikatnie przykładając igłę do przylegających do siebie komórek.

Czasami pomocne jest delikatne opukanie boku podstawy mikroskopu, gdy igła spoczywa na komórkach. Następnie oddzieloną komórkę potomną należy umieścić w pionowej linii komórek, zastępując nią komórkę macierzystą oraz wszelkie dodatkowe komórki potomne, przesuwając te ostatnie tymczasowo na bok. Powtórz te kroki dla każdej z komórek w macierzy.

Jeśli komórka nie podzieli się, należy pobrać komórkę potomną z jednej z nadmiarowych komórek znajdujących się obok komórki testowej. Po zakończeniu procesu powinno się otrzymać 20 komórek potomnych dla każdego patcha ustawionego pionowo na płytce do badania długości życia. Wszystkie komórki macierzyste i nadmiarowe komórki potomne należy zebrać w jedną grupę i przenieść z powrotem do obszaru w pobliżu patchy, zwanego cmentarzyskiem (graveyard).

Ważne jest, aby utrzymać niepożądane komórki w znacznej odległości od komórek poddawanych analizie długości życia, aby zapobiec tworzeniu się mikrokolonii i wyczerpaniu lokalnych składników odżywczych. Po oddzieleniu komórek, usuń je z płytki i inkubuj w temperaturze 30 °C przez około dwie godziny. Powtórz te kroki dla każdej płytki w eksperymencie.

Aby zmierzyć zdolność replikacyjną poszczególnych komórek, należy przygotować arkusze danych dotyczących długości życia. Arkusz danych dotyczących długości życia może mieć formę prostej tabeli, w której każdy wiersz odpowiada pojedynczej komórce macierzystej, a każda kolumna odpowiada konkretnemu punktowi wiekowemu. Należy pamiętać o odpowiednim oznakowaniu każdego arkusza danych zgodnie z liczbą analizowanych szczepów.

Na wstępie należy wyjąć płytki z inkubatora i upewnić się, że większość komórek w matrycy przeszła co najmniej jeden podział. Jeśli wymagany jest dodatkowy czas na ukończenie podziału komórkowego, należy zwrócić płytkę do inkubatora. Proces rozpoczyna się od pierwszej komórki matrycy na pierwszej płytce, dokonując wizualnej obserwacji komórki macierzystej oraz komórki lub komórek potomnych w celu określenia liczby dokonanych podziałów komórkowych.

Zazwyczaj łatwo jest określić, ile komórek potomnych wytworzyła komórka macierzysta, na podstawie charakterystycznych wzorów rozmieszczenia komórek. W tym przypadku bardzo łatwo zauważyć liczbę wytworzonych komórek, ponieważ widoczne są dwie komórki o tej samej wielkości, z których każda jest mniejsza od komórki macierzystej. Zapisz liczbę komórek potomnych wytworzonych przez komórkę macierzystą w odpowiednim polu na arkuszu oceny długości życia.

Następnie, używając igły, oddziel komórki potomne od komórki macierzystej zgodnie z wcześniejszym opisem, delikatnie przykładając igłę do przytwierdzonych komórek i opukując bok podstawy mikroskopu w momencie, gdy igła spoczywa na komórkach. Pozostaw komórkę macierzystą w jej pozycji w linii pionowej i tymczasowo przesuń komórkę potomną lub komórki potomne na bok. Powtórz te kroki dla każdej z komórek w układzie.

Na koniec zbierz wszystkie odrzucone komórki potomne i przenieś je do strefy utylizacji znajdującej się obok pierwotnych plamek. Zabeziecz płytkę folią Parafilm i inkubuj w temperaturze 30 °C przez dwie do trzech godzin. Powtórz proces odrzucania komórek potomnych i inkubację.

Krok dla każdej płytki w eksperymencie. Powtarzaj całą tę procedurę, aż wszystkie komórki macierzyste przestaną się dzielić. Pamiętaj, że wraz z wiekiem komórek macierzystych postęp cyklu komórkowego zwalnia, dlatego w późniejszych etapach zaleca się inkubację płytek przez dłuższe okresy czasu między punktami pomiaru wieku; następnie płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.

Surowe dane uzyskane z eksperymentu nad długością życia replikacyjnego to lista liczb odpowiadających komórkom potomnym wytworzonym przez każdą komórkę macierzystą w każdym punkcie czasowym. Jak widać tutaj. Poprzez zsumowanie każdego wiersza arkusza wyników otrzymuje się długość życia replikacyjnego dla każdej komórki macierzystej.

Dane z innych komórek z tej samej grupy eksperymentalnej można połączyć w celu wygenerowania krzywej przeżywalności i przeprowadzenia obliczeń statystycznych. Krzywa powinna być w przybliżeniu zgodna z kinetyką Gompertza-Makehama, wykazując kształt sigmoidalny z niską śmiertelnością wczesną, po której następuje stosunkowo szybki spadek przeżywalności i spłaszczenie krzywej w późniejszym wieku. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić eksperyment określający replikatywną długość życia drożdży.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że komórki będą nadal się dzielić, dopóki nie znajdą się w niskiej temperaturze. Należy zatem pamiętać o pozostawieniu płytek w temperaturze 4°C przez noc, aby rano nie otrzymać zbyt wielu komórek potomnych do policzenia. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.