Name: Pomiar replikatywnej długości życia pączkujących drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Naucz się mierzyć replikatywną długość życia komórek macierzystych drożdży Saccharomyces cerevisiae. Ta metoda pozwala badać geny wpływające na starzenie się komórek eukariotycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana z grantu przyznanego M.K. i B.K.K. przez Ellison Medical Foundation. M. K. jest stypendystą Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging. Chcielibyśmy podziękować Soumyi Kotireddy za pomoc podczas filmowania.

Część 1: Przygotowanie szczepów i płytek do analizy replikacyjnej długości życia
W tej sekcji opisano przygotowanie stałych płytek YEPD do wykorzystania w eksperymencie dotyczącym replikacyjnej długości życia oraz przygotowanie komórek drożdży do analizy długości życia.
<ol>
	<li>Stosując odpowiednią technikę sterylną, przygotuj płytki z agarem YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% bacto-peptonu, 2% agaru, 2% glukozy), które zostaną wykorzystane do hodowli komórek drożdży oraz do analizy replikacyjnej długości życia. Należy przygotować co najmniej 2 płytki na każde 4-5 szczepów analizowanych w eksperymencie długości życia. Płytki powinny zostać przygotowane co najmniej 2 dni przed eksperymentem i pozostawione do wyschnięcia przed rozpoczęciem analizy. Jeśli eksperyment nie zostanie rozpoczęty w ciągu 4-5 dni od wylania płytek, należy umieścić je w inkubatorze chłodniczym i owinąć parafilmem lub folią plastikową, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	<li>Wyjmij szczepy drożdży z mrożonych zapasów i wykonaj posiew smugowy w celu uzyskania pojedynczych kolonii na płytkach z agarem YEPD. Do 6 szczepów można łatwo wysiać na jednej płytce YEPD, dzieląc ją na równoliczne sektory w kształcie kawałków tortu.</li>
	<li>Inkubuj komórki w temperaturze 30°C przez 2 dni.</li>
	<li>Wyjmij komórki z inkubatora i przenieś komórki z pojedynczej kolonii metodą patchingu na świeżą płytkę YEPD. Dla każdego szczepu należy przygotować dwa patche z dwóch różnych kolonii. Na tym etapie analizowane szczepy powinny zostać zakodowane, aby zapewnić przeprowadzenie eksperymentu replikacyjnej długości życia metodą „ślepej próby”, w której osoby dokonujące dyssekcji nie znają tożsamości poszczególnych szczepów.</li>
	<li>Inkubuj zakodowane, przeniesione komórki w temperaturze 30°C do następnego wieczora.</li>
	<li>Wyjmij komórki i delikatnie przenieś komórki z każdego zakodowanego szczepu metodą patchingu na świeże płytki YEPD, które będą służyć jako płytki eksperymentalne do analizy replikacyjnej długości życia. Komórki należy nanosić wzdłuż linii pionowej po lewej stronie płytki YEPD (Rycina 1). Optymalna liczba to około 3-5 patchy na płytkę, zakładając analizę replikacyjnej długości życia 20 komórek z każdego patcha. Nie jest konieczne (ani wskazane) przenoszenie dużej liczby komórek na świeżą płytkę YEPD, ponieważ spowoduje to gęsty wzrost komórek podczas inkubacji nocnej, co może ograniczyć ich późniejszą replikacyjną długość życia.</li>
	<li>Inkubuj świeżo przygotowane płytki przez noc w temperaturze pokojowej na blacie.</li>
</ol>
Część 2: Ustawienie komórek do analizy replikacyjnej długości życia.
W tej sekcji opisujemy sposób rozmieszczania komórek drożdży na płytce oraz metodę pozyskiwania dziewiczych komórek potomnych do analizy replikacyjnego czasu życia. Od tego momentu wszystkie płytki powinny być zabezpieczone folią Parafilm, z wyjątkiem czasu przeprowadzania sekcji, aby zapobiec wysychaniu.
<ol>
	<li>Używając mikroskopu wyposażonego w aparat do mikrodysekcji odpowiedni dla drożdży, przenieś około 50 komórek z pierwszego wysianego szczepu w miejsce na płytce oddalone od wysianych komórek. Jeśli stolik mikroskopu posiada podziałkę, można z niej skorzystać, aby ułatwić odnalezienie komórek podczas kolejnych iteracji. W przypadku mikroskopu Zeiss Axioscope 40 komórki z pierwszego wysianego szczepu można umieścić w współrzędnych 90 x 10 i układać stamtąd w pionie.</li>
	<li>Oczyść igłę z komórek, wielokrotnie dotykając powierzchni agaru, a następnie wykonaj otwór w agarze, przebijając go igłą. Otwór ten będzie służył jako znacznik orientacyjny na płytce podczas kolejnych iteracji dysekcji i usuwania komórek potomnych. Należy uważać, aby do otworu nie dostały się komórki drożdży, w przeciwnym razie urosną one i utworzą kolonię.</li>
	<li>Bezpośrednio nad otworem ułóż pionowo pojedyncze komórki drożdży w 20 równomiernie rozmieszczonych pozycjach, zachowując odstęp 1-3 średnic igły (~100 μM) między każdą pozycją (Ryc. 1). Co kilka komórek umieść dwie komórki obok siebie w tej samej pozycji w linii zamiast jednej. Zapewnia to redundancję podczas selekcji dziewiczych komórek potomnych, jeśli jedna z przeniesionych komórek nie podzieli się.</li>
	<li>Między 10th a 11th pozycją w linii wykonaj poziomą serię 7-8 otworów w agarze. Będą one służyć jako znacznik orientacyjny na płytce podczas kolejnych iteracji dysekcji i usuwania komórek potomnych. Należy uważać, aby do otworów nie dostały się komórki drożdży, w przeciwnym razie urosną one i utworzą kolonię.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.1-2.4 dla każdego wysiania na płytce, kontynuując układanie komórek w pionie wzdłuż tej samej osi. W kroku 2.2 liczba wykonanych otworów powinna odpowiadać numerowi wysiania (jeden otwór dla pierwszego wysiania, dwa otwory dla drugiego itd.).</li>
	<li>Po ułożeniu komórek dla każdego wysiania, zabezpiecz płytkę folią Parafilm i inkubuj w 30°C przez około 2 godziny.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.1-2.6 dla każdej płytki w eksperymencie.</li>
</ol>
Część 3: Pozyskiwanie dziewiczych komórek potomnych do analizy długości życia
W tej sekcji rozpoczynamy analizę długości życia, upewniając się, że każda komórka startuje jako dziewicza komórka potomna.
<ol>
	<li>Wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź, czy większość rozmieszczonych komórek uległa podziałowi. Jeśli wymagany jest dodatkowy czas na zakończenie podziału komórek, zwróć płytkę do inkubatora.</li>
	<li>Zaczynając od pierwszej rozmieszczonej komórki, użyj igły, aby oddzielić komórki potomne od komórki macierzystej, delikatnie przykładając igłę do przylegających do siebie komórek. Czasami pomocne jest stuknięcie w bok podstawy mikroskopu w momencie, gdy igła spoczywa na komórkach.</li>
	<li>Umieść oddzieloną komórkę potomną w linii pionowej, zastępując komórkę macierzystą oraz wszelkie dodatkowe komórki potomne i przesuwając je tymczasowo na bok.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2 i 3.3 dla każdej z rozmieszczonych komórek. Jeśli komórka nie uległa podziałowi, pobierz komórkę potomną z jednej z nadmiarowych komórek umieszczonych w kroku 2.3. Po zakończeniu powinieneś otrzymać 20 komórek potomnych dla każdego patcha, wyrównanych pionowo na płytce do analizy długości życia.</li>
	<li>Zbierz wszystkie komórki macierzyste i nadmiarowe komórki potomne w jedną grupę i przenieś je z powrotem w obszar w pobliżu patchy („cmentarzysko”). Ważne jest, aby trzymać niepotrzebne komórki z dala od komórek poddawanych analizie długości życia, aby zapobiec tworzeniu się mikrokolonii i wyczerpaniu lokalnych składników odżywczych.</li>
	<li>Zabezpiecz płytkę Parafilmem i inkubuj w temperaturze 30°C przez około 2 godziny.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.6 dla każdej płytki w eksperymencie.</li>
</ol>
Część 4: Pomiar zdolności replikacyjnej pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Przygotować arkusze danych dotyczące długości życia. Arkusz danych dotyczący długości życia może być prostą tabelą, w której każdy wiersz odpowiada pojedynczej komórce macierzystej, a każda kolumna odpowiada punktowi czasowemu wieku (Rysunek 2). Oznaczyć każdy arkusz danych zgodnie z liczbą analizowanych szczepów.</li>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora i sprawdzić, czy większość rozmieszczonych komórek przeszła co najmniej jeden podział komórkowy. Jeśli potrzebny jest dodatkowy czas na zakończenie podziału komórek, zwrócić płytkę do inkubatora.</li>
	<li>Zaczynając od pierwszej rozmieszczonej komórki na pierwszej płytce, wizualnie zaobserwować komórkę macierzystą i komórkę(i) potomną oraz określić liczbę przeprowadzonych podziałów komórkowych. Zazwyczaj łatwo jest określić, ile komórek potomnych wytworzyła komórka macierzysta, na podstawie charakterystycznych wzorów rozmieszczenia komórek. Zapisać liczbę komórek potomnych wytworzonych przez komórkę macierzystą w odpowiednim polu w arkuszu oceny długości życia.</li>
	<li>Użyć igły, aby oddzielić komórki potomne od komórki macierzystej, zgodnie z opisem w kroku 3.2.</li>
	<li>Pozostawić komórkę macierzystą w jej pozycji w linii pionowej i przesunąć komórkę(i) potomną(e) tymczasowo na bok.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.3-4.5 dla każdej z rozmieszczonych komórek.</li>
	<li>Zebrać wszystkie odseparowane komórki potomne i przenieść je do „cmentarzyska” (graveyard), znajdującego się w pobliżu oryginalnych plamek.</li>
	<li>Zabezpieczyć płytkę Parafilmem i inkubować w temperaturze 30°C przez 2-3 godziny.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.3-4.8 dla każdej płytki w eksperymencie.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.2-4.9, aż wszystkie komórki macierzyste przestaną się dzielić. W miarę starzenia się komórek macierzystych progresja cyklu komórkowego zwalnia, dlatego wskazane będzie inkubowanie płytek przez dłuższe okresy czasu pomiędzy punktami czasowymi wieku. Płytki można przechowywać w temperaturze 4°C przez noc.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki.
Surowe dane uzyskane w eksperymencie nad replikacyjną długością życia stanowią listę liczb odpowiadających komórkom potomnym wytworzonym przez każdą komórkę macierzystą w każdym punkcie czasowym (Rysunek 2). Poprzez zsumowanie każdego wiersza arkusza wyników otrzymuje się replikacyjną długość życia dla każdej komórki macierzystej. Dane dla komórek macierzystych z tej samej grupy eksperymentalnej można połączyć w celu wygenerowania krzywej przeżywalności (Rysunek 3A) oraz przeprowadzenia obliczeń statystycznych, takich jak średnia długość życia, mediana długości życia oraz odchylenie standardowe. Można zastosować test nieparametryczny, taki jak test sum rang Wilcoxona, aby określić, czy między grupami eksperymentalnymi wykryto istotne różnice w długości życia. Gdy eksperyment przebiega prawidłowo, krzywa przeżywalności powinna być w przybliżeniu zgodna z kinetyką Gompertza-Makehama, wykazując kształt sigmoidalny z niską śmiertelnością wczesną, po której następuje stosunkowo szybki spadek przeżywalności i spłaszczenie krzywej w późniejszym wieku. Większość szczepów typu dzikiego wykazuje wartości replikacyjnej długości życia w zakresie 20-30 pokoleń, choć zgłaszano odchylenia poza ten zakres.
<img alt="Proces inkubacji drożdży; schemat kreskowania, nakładania i płytek do badania długości życia w celu analizy wzrostu kolonii." src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> 
<img alt="Śledzenie linii komórkowej drożdży, schemat przedstawia układ mikromanipulacyjny do eksperymentu nad długością życia." src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1.5"> 
Rycina 1. Schemat typowej płytki do badania replikatywnej długości życia. Wieczorem przed rozpoczęciem mikrodyssekcji komórek drożdży, 3-5 szczepów jest lekko nakładanych na powierzchnię płytki YEPD (czerwone ramki) w linii pionowej wzdłuż jednej krawędzi płytki. Po nocnym wzroście, około 30 pojedynczych komórek z każdego szczepu jest rozmieszczanych pionowo w linii zawierającej 20 pozycji. Analiza długości życia zostanie przeprowadzona na pierwotnych komórkach potomnych uzyskanych z tych komórek wyjściowych. Dodatkowe komórki uzyskane podczas mikrodyssekcji w trakcie eksperymentu (np. niepożądane komórki potomne) są przenoszone do „cmentarza” (szary owal), który znajduje się z dala od komórek eksperymentalnych, aby uniknąć lokalnego wyczerpania składników odżywczych podczas tworzenia się kolonii.
<img alt="Diagram gęstości populacji; wykres siatkowy przedstawiający analizę rozkładu danych liczbowych, wzór kreskowania." src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2"> 
Rycina 2. Arkusz zliczania replikatywnej długości życia. Przedstawiono surowe dane z eksperymentu nad replikatywną długością życia. Każdy wiersz odpowiada pojedynczej matczynej komórce drożdży, a każda kolumna odpowiada punktowi wiekowemu. Liczba wpisana w każdym polu to liczba komórek potomnych wytworzonych przez tę komórkę matczyną w danym punkcie wiekowym. Każdy szczep jest oznaczony kodem liczbowym w taki sposób, aby osoba dokonująca dyssekcji komórek drożdży nie miała wiedzy o tożsamości analizowanych szczepów. Dla każdego szczepu badaniu poddano dwadzieścia komórek.
<img alt="Wykres analizy długości życia; WT vs SIR2-OE u drożdży, przedstawiający frakcję żywych komórek w zależności od pokoleń." src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywne krzywe przeżywalności i wzrostu z eksperymentu nad replikatywną długością życia. (A) Krzywe przeżywalności uzyskano poprzez wykreślenie frakcji wciąż żyjących komórek macierzystych w funkcji wieku replikatywnego (liczby podziałów komórkowych). (B) Krzywe wzrostu uzyskano poprzez wykreślenie średniej liczby komórek potomnych wytworzonych przez dany szczep w funkcji punktu czasowego wieku. W tym przykładzie szczep nr 2 żyje dłużej, ale rośnie wolniej, co potwierdza mniejsze początkowe nachylenie wykresu wzrostu.

<ol><li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+yeast+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li>
<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li>
<li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li>
<li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Starzenie się jest procesem degeneracyjnym charakteryzującym się postępującym pogorszeniem stanu komponentów komórkowych i organelli, co prowadzi do śmierci. Drożdże pączkująceSaccharomyces cerevisiaebył szeroko wykorzystywany do badania biologii starzenia się, a wykazano, że kilka czynników determinujących długowieczność drożdży jest konserwatywnych u eukariontów wielokomórkowych, w tym u nicieni, muszek i myszy1Ze względu na brak łatwo mierzalnych fenotypów związanych z wiekiem, starzenie się drożdży badano niemal wyłącznie poprzez pomiar długości życia komórek w różnych kontekstach, stosując dwa powszechnie używane paradygmaty długości życia2Chronologiczna długość życia odnosi się do czasu, przez który komórka macierzysta może przetrwać w stanie niedzielącym się, podobnym do stanu spoczynku, i proponuje się, aby służyła ona jako model starzenia się komórek postmitotycznych u eukariotów wielokomórkowych. Z kolei replikacyjna długość życia odnosi się do liczby komórek potomnych wytworzonych przez komórkę macierzystą przed wystąpieniem starzenia i uważa się, że stanowi ona model starzenia w komórkach aktywnych mitotycznie. Przedstawiamy tutaj uogólniony protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży pączkujących. Celem testu replikacyjnej długości życia jest ustalenie, ile razy każda komórka macierzysta wypączkuje. Doświadczony badacz może łatwo odróżnić komórki macierzyste od potomnych, używając standardowego mikroskopu optycznego (całkowite powiększenie 160X), takiego jak Zeiss Axioscope 40 lub inny porównywalny model. Fizyczna separacja komórek potomnych od komórek macierzystych jest realizowana przy użyciu manualnego mikromanipulatora wyposażonego w igłę światłowodową. Typowe laboratoryjne szczepy drożdży produkują 20-30 komórek potomnych na jedną komórkę macierzystą, a jeden eksperyment dotyczący długości życia trwa od 2 do 3 tygodni.

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży.

Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

Starzenie się jest procesem degeneracyjnym charakteryzującym się postępującym pogorszeniem stanu komponentów i organelli komórkowych, co prowadzi do śmierci. Pączkujący ...

Drożdże budzące się Croce Visi były szeroko wykorzystywane do badania biologii starzenia się. W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia macierzystych komórek drożdży. Cześć, jestem Kristen Steffen z laboratorium Briana Kennedy'ego w Katedrze Biochemii na Uniwersytecie Waszyngtońskim.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę pomiaru długości życia replikacyjnego macierzyńskich komórek drożdży. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania genów wpływających na długość życia komórek drożdży. Zapraszamy do oglądania.Do eksperymentu nad długością życia replikacyjnego oraz przygotowania komórek drożdży do analizy długości życia konieczne jest przygotowanie stałych płytek YEPD. Przygotuj agarowe płytki YEPD, stosując odpowiednią technikę sterylną. Przygotuj co najmniej dwie płytki na każde cztery do pięciu szczepów analizowanych w eksperymencie dotyczącym długości życia.Płytki te należy przygotować co najmniej dwa dni przed eksperymentem określającym długość życia i pozostawić do wyschnięcia przed rozpoczęciem testu. Jeśli eksperyment nie odbędzie się w ciągu czterech do pięciu dni od zalania płytek, powinny one zostać owinięte parafilmem lub folią plastikową i umieszczone w inkubatorze chłodniczym, aby zapobiec wysychaniu. Wyjąć szczepy drożdży z zamrożonych zasobów i wysiać w celu otrzymania pojedynczych kolonii.Na płytki agarowe YEPD. Do sześciu szczepów można łatwo wysiać na jednej płytce YEPD, dzieląc ją na równowielkie sektory w kształcie kawałków tortu. Inkubuj komórki w temperaturze 30 °C przez dwa dni.Po inkubacji wyjmij komórki z inkubatora i przenieś komórki z pojedynczej kolonii na świeżą płytkę YEPD. W tym momencie szczepy przeznaczone do analizy powinny zostać zakodowane, aby zapewnić przeprowadzenie eksperymentu dotyczącego długości życia replikacyjnego metodą ślepej próby, tak aby osoby wykonujące rozdzielanie nie znały tożsamości poszczególnych szczepów.Następnie inkubuj komórki z naniesionymi plamkami w temperaturze 30 °C do następnego wieczora. Wyjmij komórki i delikatnie przenieś plamki z każdego powlekanego szczepu na świeże płytki YEPD. Będą one służyć jako płytki eksperymentalne wykorzystywane do badania długości życia replikacyjnego.Komórki do analizy należy nakładać wzdłuż pionowej linii po lewej stronie płytki YEPD. Nie należy przenosić zbyt wielu komórek na jedną świeżą płytkę YEPD. Ponieważ spowodowałoby to zbyt gęsty wzrost komórek podczas inkubacji nocnej i wpłynęło na ich długość życia replikacyjnego, optymalna liczba wynosi od około trzech do pięciu plamek na płytkę.Zakładając, że analiza długości życia replikacyjnego zostanie przeprowadzona na 20 komórkach z każdego obszaru, eksperyment dotyczący długości życia jest już w pełni przygotowany i pozostało jedynie inkubować próbki przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie jutro będziemy mogli przystąpić do mikrodysekcji, aby ustawić komórki drożdży na płytce i uzyskać dziewicze komórki potomne do analizy długości życia replikacyjnego.Należy użyć mikroskopu wyposażonego w aparat do mikrodyssekcji odpowiedni dla drożdży. Przenieś około 50 komórek z pierwszej plamki szczepu w miejsce na płytce oddalone od komórek z plamki. Jeśli stolik mikroskopu posiada skalę, można z niej skorzystać, aby ułatwić odnalezienie komórek podczas kolejnych iteracji.Czasami komórki mogą zablokować się w igle, co może stanowić problem, jeśli zostaną uwolnione w niewłaściwym momencie. Aby upewnić się, że igła jest czysta i wolna od komórek, należy wielokrotnie dotknąć nią powierzchni agaru. Następnie należy wykonać otwór w agarze, wbijając igłę przez jego powierzchnię.Otwór ten będzie służył jako znacznik ułatwiający orientację na płytce podczas kolejnych powtórzeń sekcji i usuwania pojedynczych komórek. Należy uważać, aby do otworu nie dostały się komórki drożdży, ponieważ mogą one ulec wzrostowi i utworzyć kolonię bezpośrednio nad otworem. Ustaw pojedyncze komórki drożdży w pionowej linii w 20 równomiernie rozłożonych pozycjach, zachowując odstęp od jednej do trzech średnic igły pomiędzy każdą pozycją komórki.W przypadku każdych kilku komórek, umieść dwie komórki obok siebie w tej samej pozycji w linii, zamiast jednej. Pozwala to na zapewnienie redundancji podczas selekcji dziewiczych komórek potomnych. Jeśli jedna z przeniesionych komórek nie podzieli się pomiędzy 10. a 11. pozycją w linii, wykonaj w agarze poziomą serię od siedmiu do ośmiu otworów.Będzie to służyć jako znacznik ułatwiający orientację na płytce podczas kolejnych sekcji i usuwania komórek potomnych. Ponownie przypominamy, aby uważać, by komórki drożdży nie dostały się do otworów, gdyż mogą one wyrosnąć i utworzyć kolonię. Powtórz tę procedurę dla każdego obszaru na płytce, kontynuując rozmieszczanie komórek pionowo wzdłuż tej samej osi.Należy pamiętać, aby podczas wykonywania otworów w AER liczba stworzonych otworów odpowiadała numerowi patcha, tak aby dla pierwszego patcha był jeden otwór, a dla drugiego dwa. Po rozmieszczeniu komórek dla każdego patcha, zabezpiecz płytkę parafilmem i inkubuj w temperaturze 30 °C przez około dwie godziny. Pamiętaj, że od tego momentu wszystkie płytki powinny być zabezpieczone parafilmem, z wyjątkiem czasu przeprowadzania sekcji.Aby zapobiec wysychaniu, należy powtórzyć tę procedurę dla każdej płytki. W eksperymencie dotyczącym analizy długości życia ważne jest upewnienie się, że każda komórka zaczyna jako pierwotna komórka potomna.Aby to zrobić, najpierw wyjmij płytki z inkubatora i upewnij się, że większość komórek w macierzy uległa podziałowi komórkowemu. Tutaj mamy komórki, które zostały wcześniej ustawione w linii i widać, że po dwóch godzinach w inkubatorze zaczęły się dzielić. Obecnie mamy komórkę macierzystą – tę większą, z którą połączona jest nowo powstała komórka potomna, a ta komórka potomna jest komórką, która zostanie wykorzystana do rozpoczęcia pomiaru długości życia.Jeśli wymagany jest dodatkowy czas na zakończenie podziałów komórkowych, należy ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Zaczynając od pierwszej komórki w macierzy, należy użyć igły, aby oddzielić komórki potomne od komórki macierzystej, delikatnie przykładając igłę do przylegających do siebie komórek.Czasami pomocne jest delikatne opukanie boku podstawy mikroskopu, gdy igła spoczywa na komórkach. Następnie oddzieloną komórkę potomną należy umieścić w pionowej linii komórek, zastępując nią komórkę macierzystą oraz wszelkie dodatkowe komórki potomne, przesuwając te ostatnie tymczasowo na bok. Powtórz te kroki dla każdej z komórek w macierzy.Jeśli komórka nie podzieli się, należy pobrać komórkę potomną z jednej z nadmiarowych komórek znajdujących się obok komórki testowej. Po zakończeniu procesu powinno się otrzymać 20 komórek potomnych dla każdego patcha ustawionego pionowo na płytce do badania długości życia. Wszystkie komórki macierzyste i nadmiarowe komórki potomne należy zebrać w jedną grupę i przenieść z powrotem do obszaru w pobliżu patchy, zwanego cmentarzyskiem (graveyard).Ważne jest, aby utrzymać niepożądane komórki w znacznej odległości od komórek poddawanych analizie długości życia, aby zapobiec tworzeniu się mikrokolonii i wyczerpaniu lokalnych składników odżywczych. Po oddzieleniu komórek, usuń je z płytki i inkubuj w temperaturze 30 °C przez około dwie godziny. Powtórz te kroki dla każdej płytki w eksperymencie.Aby zmierzyć zdolność replikacyjną poszczególnych komórek, należy przygotować arkusze danych dotyczących długości życia. Arkusz danych dotyczących długości życia może mieć formę prostej tabeli, w której każdy wiersz odpowiada pojedynczej komórce macierzystej, a każda kolumna odpowiada konkretnemu punktowi wiekowemu. Należy pamiętać o odpowiednim oznakowaniu każdego arkusza danych zgodnie z liczbą analizowanych szczepów.Na wstępie należy wyjąć płytki z inkubatora i upewnić się, że większość komórek w matrycy przeszła co najmniej jeden podział. Jeśli wymagany jest dodatkowy czas na ukończenie podziału komórkowego, należy zwrócić płytkę do inkubatora. Proces rozpoczyna się od pierwszej komórki matrycy na pierwszej płytce, dokonując wizualnej obserwacji komórki macierzystej oraz komórki lub komórek potomnych w celu określenia liczby dokonanych podziałów komórkowych.Zazwyczaj łatwo jest określić, ile komórek potomnych wytworzyła komórka macierzysta, na podstawie charakterystycznych wzorów rozmieszczenia komórek. W tym przypadku bardzo łatwo zauważyć liczbę wytworzonych komórek, ponieważ widoczne są dwie komórki o tej samej wielkości, z których każda jest mniejsza od komórki macierzystej. Zapisz liczbę komórek potomnych wytworzonych przez komórkę macierzystą w odpowiednim polu na arkuszu oceny długości życia.Następnie, używając igły, oddziel komórki potomne od komórki macierzystej zgodnie z wcześniejszym opisem, delikatnie przykładając igłę do przytwierdzonych komórek i opukując bok podstawy mikroskopu w momencie, gdy igła spoczywa na komórkach. Pozostaw komórkę macierzystą w jej pozycji w linii pionowej i tymczasowo przesuń komórkę potomną lub komórki potomne na bok. Powtórz te kroki dla każdej z komórek w układzie.Na koniec zbierz wszystkie odrzucone komórki potomne i przenieś je do strefy utylizacji znajdującej się obok pierwotnych plamek. Zabeziecz płytkę folią Parafilm i inkubuj w temperaturze 30 °C przez dwie do trzech godzin. Powtórz proces odrzucania komórek potomnych i inkubację.Krok dla każdej płytki w eksperymencie. Powtarzaj całą tę procedurę, aż wszystkie komórki macierzyste przestaną się dzielić. Pamiętaj, że wraz z wiekiem komórek macierzystych postęp cyklu komórkowego zwalnia, dlatego w późniejszych etapach zaleca się inkubację płytek przez dłuższe okresy czasu między punktami pomiaru wieku; następnie płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.Surowe dane uzyskane z eksperymentu nad długością życia replikacyjnego to lista liczb odpowiadających komórkom potomnym wytworzonym przez każdą komórkę macierzystą w każdym punkcie czasowym. Jak widać tutaj. Poprzez zsumowanie każdego wiersza arkusza wyników otrzymuje się długość życia replikacyjnego dla każdej komórki macierzystej.Dane z innych komórek z tej samej grupy eksperymentalnej można połączyć w celu wygenerowania krzywej przeżywalności i przeprowadzenia obliczeń statystycznych. Krzywa powinna być w przybliżeniu zgodna z kinetyką Gompertza-Makehama, wykazując kształt sigmoidalny z niską śmiertelnością wczesną, po której następuje stosunkowo szybki spadek przeżywalności i spłaszczenie krzywej w późniejszym wieku. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić eksperyment określający replikatywną długość życia drożdży.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że komórki będą nadal się dzielić, dopóki nie znajdą się w niskiej temperaturze. Należy zatem pamiętać o pozostawieniu płytek w temperaturze 4°C przez noc, aby rano nie otrzymać zbyt wielu komórek potomnych do policzenia. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Określanie żywotności replikacyjnej u drożdży pączkujących

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

W niniejszym opracowaniu opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z modelem chronologicznej długości życia drożdży w celu zbadania genów i szlaków regulujących lub przyczyniających się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Ten film opisuje tradycyjną, opartą na płytkach metodę pomiaru długości życia C. elegans. Przykładowy protokół mierzy długość życia robaków poddanych działaniu RNAi.

Analiza długości życia: pomiar długowieczności C. elegans

Opisujemy tutaj działanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia ciągłe i wysokorozdzielcze obrazowanie mikroskopowe pojedynczych pączkujących komórek drożdży podczas ich pełnego okresu replikacji i/lub chronologicznego życia.

Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Naucz się mierzyć replikatywną długość życia komórek macierzystych drożdży Saccharomyces cerevisiae. Ta metoda pozwala badać geny wpływające na starzenie się komórek eukariotycznych.

Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

Przeglądaj więcej filmów