Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka w pączkujących drożdżach

Protokół ten wykorzystuje regulowany promotor, który umożliwia kontrolowaną ekspresję białka. W tym eksperymencie używamy plazmidu o wysokiej kopii dwóch mikronów, który wyraża domenę N dwa z preparowanego promotora metioniny. Za pomocą tego przekształcane są komórki drożdży typu dzikiego.

Plazmid i transformanty są wybierane na płytkach pozbawionych uol. Po nocnym wzroście. W selektywnych pożywkach komórki są synchronizowane przez wzrost bez pośrednictwa kortyzolu. Areszt.

Wreszcie, ekspresja jest indukowana przez przeniesienie komórek do pożywki pozbawionej metioniny podczas eksperymentu w czasie. Stężenie białka jest monitorowane za pomocą western blotting i rozwoju fenotypu morfologicznego za pomocą mikroskopii. Cześć, jestem Claudia i pracuję na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu Purdue.

Jestem de Bari Muji w alarze i jestem w laboratorium, a także w laboratorium AL. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę analizy rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka w indukcji organizmu. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania morfologicznych i molekularnych aspektów fenotypu podziału komórki obserwowanego po nadekspresji domeny N dwa endocytarnego białka adaptacyjnego nieobecnego dwóch.

Więc zacznijmy. Protokół ten rozpoczyna się od zbudowania szczepu drożdży, który wyrazi interesujące Cię białko. W naszym przypadku przekształciliśmy szczep drożdży typu dzikiego W 3 0 3 z wysoką kopią DNA w osoczu, który zawiera n-te dwa pod kontrolą tłumionego promotora metioniny, dwa milimolowe tłumiki metioniny spełniają aktywność promotora 25.

Podczas gdy pożywka pozbawiona metioniny pozwala na maksymalną ekspresję, wybierz sześć kolonii z płytki zawierającej niedawno przekształcone komórki i zaszczep w 50 mililitrach selektywnej pożywki z 0,2 milimolową metioniną w stożkowej kolbie, inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min następnego ranka. Oszacuj gęstość komórek, mierząc gęstość optyczną kultury przy 600 nanometrach. Przenieś ekwiwalent 20 OD 600 nanometrów na mililitr komórek do sterylnej probówki wirówkowej i zbierz przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce YPD przez wirowanie, aby zsynchronizować cykl komórkowy aole do końcowego stężenia 15 mikrogramów na mililitr z zapasu jednego miligrama na mililitr w DMSO. Inkubować przez cztery godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Po czterech godzinach sprawdź procent komórek zatrzymanych w mitozie.

Oglądając pod mikroskopem i licząc liczbę komórek z pąkami o równej wielkości, przejdź do następnego kroku. Tylko wtedy, gdy zatrzymanie jest większe niż 90%Zbierz komórki przez odwirowanie z prędkością 2200 obr./min przez pięć minut. Po trzech przemyciach lodowatą wodą, resus, zawiesić granulkę w selektywnym podłożu pozbawionym metioniny o gęstości komórek około 0,5 OD 600 nanometrów na mililitr.

Przenieś połowę objętości komórek do nowej sterylnej probówki i dodaj metioninę do końcowego stężenia 0,2 milimola. Będzie to służyć jako kontrola efektów wynikających z podstawowych poziomów ekspresji białka. Włóż obie kultury do inkubatora o temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Komórki są analizowane pod kątem rozwoju fenotypu co godzinę przez sześć godzin za każdym razem. Punktowo przenieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej każdej kultury do sterylnej probówki z mikrofuge i zbierz komórki przez wirowanie, odessaj supernatant i ponownie zawiesij osad w pożywce o pojemności 70 mikrolitrów. Następnie dodaj 30 mikrolitrów błękitu metylenowego z zapasu jednego miligrama na mililitr w sterylnej wodzie.

Następnie odpipetować około sześciu mikrolitrów tej zawiesiny na czystym szklanym szkiełku podstawowym i nałożyć szkiełko nakrywkowe na kroplę. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć cienką, jednolitą warstwę komórek między szklanymi interfejsami. Podziel kartkę okładkową na dziewięć ćwiartek i zrób trzy zdjęcia w każdej ćwiartce.

Liczba komórek w polu nie powinna być większa niż 30 komórek, aby umożliwić dokładne określenie ilościowe. Policz liczbę komórek pokazujących badany fenotyp, które w tym przykładzie są pączkującymi komórkami drożdży z wydłużonymi i/lub połączonymi pąkami, które nie oddzielają się od siebie. Liczymy również liczbę martwych komórek zidentyfikowanych na podstawie ich niebieskiego koloru od czasu defektu podziału komórkowego wywołanego n-tym.

Dwie nadekspresje prowadzą do śmierci komórki, aby za każdym razem uwidocznić defekty specyficzne dla fenotypu. Umieść podwielokrotność jednego mililitra kultury w sterylnej probówce z mikro fuge i zbierz komórki przez odwirowanie reus. Zawiesić osad komórkowy w 100 mikrolitrach po jednym miligramie na mililitr, kalorycznym białym roztworze w sterylnej wodzie i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

Barwienie bielą wapienną umożliwia wizualizację ściany komórkowej e. Umyj granulkę trzy razy za pomocą jednego XPBS. Zawiesiliśmy końcowy granulat w 100 mikrolitrach PBS.

Obserwuj komórki pod mikroskopem i uzyskuj obrazy w powiększeniu 100 razy za pomocą optyki UV do wizualizacji ściany komórkowej. Aby zobrazować septynę oznaczoną GFP, uzyskaj obrazy za pomocą filtra FS E, określ ilościowo procent komórek z defektami ściany komórkowej i lokalizacją septyny mis, korzystając z metody pokazanej wcześniej, dzieląc szkiełko okładkowe na dziewięć ćwiartek i wykonując trzy obrazy na kwadrant w celu zliczenia wideo TimeLapse. Mikroskopia pojedynczych komórek drożdży wymaga podłoża z wbudowanymi grządkami agros do wykonania grządki agros.

Najpierw wyczyść szkiełko z wklęsłym wgłębieniem 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, gdy szkiełko wysycha. Ugotuj 0,06 grama agros w pięciu mililitrach selektywnej pożywki pozbawionej metioniny w kuchence mikrofalowej, aż agros całkowicie się rozpuści. Odpipetować 200 mikrolitrów agros zawierającego podłoże w szkiełku.

Wciśnij i odwróć kolejną czystą szklankę, przesuwając się po niej, upewniając się, że pod spodem nie uwięzione są pęcherzyki powietrza. Gdy żel zastygnie, należy płynnie odsunąć szkiełko od szkiełka wgłębieniowego, utrzymując ich powierzchnie przez cały czas równoległe. Dzięki temu powierzchnia grządki agros jest zlicowana z powierzchnią zjeżdżalni wgłębieniowej.

Oczyść obszar szkiełka otaczający łóżko agros delikatną chusteczką. Zjeżdżalnia jest teraz gotowa do użycia w czasie równym czterem godzinom. Przenieś jeden mililitr komórek z kultury do sterylnej probówki z mikrofugą i zbierz przez odwirowanie.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach świeżych selektywnych pożywek pozbawionych metioniny. Nałóż wazelinę na krawędzie szkiełka nakrywkowego. Następnie umieść kroplę zawiesiny komórkowej na środku grządki agros i równomiernie rozprowadź, delikatnie dociskając na nią szkiełko nakrywkowe.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego i utrwal jego pozycję, wykładając krawędzie lakierem do paznokci. Po wyschnięciu lakieru do paznokci umieść szkiełko na podgrzewanym stoliku mikroskopu. Używamy mikroskopu Zeiss Axio 200 M wyposażonego w kamerę cyfrową Zeiss Axio camm, monochromatyczną kamerę cyfrową MRM, aby wybrać pole, które zawiera nie więcej niż 10 komórek odpowiednio rozmieszczonych, ponieważ pole z czasem stanie się zatłoczone.

Gdy komórki się dzielą, rób zdjęcie pola co pięć minut przez około pięć godzin. Aby uniknąć wielokrotnego ustawiania ostrości. Programujemy oprogramowanie do akwizycji obrazów tak, aby automatycznie pobierało kilka obrazów Zacka w każdym punkcie czasowym.

Obraz o najlepszej ostrości zostanie wybrany później do montażu filmu w celu zapewnienia odpowiedniego ciepła dla komórek, zewnętrzne źródło ciepła oprócz podgrzewanych etapów zapewnionych przez pozostawienie przechodzącego białego światła mikroskopu włączonego przez cały czas trwania regresji fenotypu obrazowania można badać poprzez montaż obrazów w film za pomocą oprogramowania Image J. Tutaj pokazujemy reprezentatywne wyniki nadekspresji naszego interesującego nas białka. N-te dwa.

Po pierwsze, ekspresja białka n-tego dwóch. W czasie trwania eksperymentu określono lizaty z komórek wykazujących ekspresję HA, a dwa z nich analizowano metodą western blot przy użyciu monoklonalnego przeciwciała anty HA, jak wykazano w komórkach immuno blot hodowanych w obecności 0,2 milimolowej metioniny o minimalnej ekspresji białka. Jednak komórki hodowane w pożywkach pozbawionych metioniny wykazują stały wzrost stężenia S 2 w czasie trwania eksperymentu.

Następnie analizowano komórki hodowane w obecności lub bez metioniny przez sześć godzin, ponieważ niskie stężenie n-tych dwóch nie jest w stanie wywołać fenotypu podziału komórki lub śmierci komórki. Niewielki odsetek komórek jest martwych, na co wskazuje ich niebieski kolor po zabarwieniu błękitem metylenowym. Podobnie liczba jąder na komórkę, ściana komórkowa i organizacja septyny są normalne zgodnie z oczekiwaniami.

Natomiast nadmierna ekspresja M, dwa prowadzi do masywnego defektu podziału komórki i śmierci komórki, o czym świadczą długie łańcuchy połączonych wydłużonych pąków, które zachowują niebieski kolor po zabarwieniu błękitem metylenowym. Większość komórek fenotypowych jest wielojądrowa, na co wskazuje barwienie DPI. Białe barwienie Calcior wskazuje na nagromadzenie nieprawidłowych plam ściany komórkowej.

Ponadto septyna jest rażąco źle zlokalizowana i zdezorganizowana. Kwantyfikacja fenotypu w funkcji czasu jest pokazana na tym wykresie, gdzie otwarte okręgi reprezentują zero milimolowej metioniny, a zamknięte koła reprezentują 0,2 milimolowej metioniny. Widzimy tutaj, że gdy n-te dwa stężenie narasta w komórkach z czasem, procent komórek wykazujących fenotyp podziału komórkowego również rośnie.

Komórki kontrolne hodowane w temperaturze 0,2. Milli metionina pokazuje, że rozwój fenotypu jest funkcją podwyższonego stężenia białka, a nie z powodu warunków hodowli komórkowej. Wreszcie, rozwój fenotypu po n-tej drugiej nadekspresji jest rejestrowany przez poklatkową mikroskopię wideo.

Po czterech godzinach n-tej dwie komórki nadekspresji wykazują łagodny fenotyp morfologicznego podziału komórki. W miarę postępu filmu widzimy nienormalne i wydłużone okresy wzrostu pąków wierzchołkowych, co prowadzi do powstania bardzo wydłużonych pąków. Obserwujemy również zdarzenia związane z pojawieniem się nowych pąków, zanim dojdzie do separacji komórek.

Ponadto obserwuje się, że pąki wyłaniają się z kilku obszarów komórki matki, dając początek pojawieniu się gałęzi. Właśnie pokazaliśmy, jak scharakteryzować i przeanalizować rozwój fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka na liście pączkujących. Wykonując tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o głaskaniu komórek przy zalecanych prędkościach wirowania, ponieważ większe prędkości mogą uszkodzić komórki.

Ważne jest również, aby pamiętać o dodaniu błękitu metylenowego i chlorku tuż przed obrazowaniem, ponieważ są one toksyczne dla komórek jasnowschodnich. Więc dzięki za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.