Name: Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka w pączkujących drożdżach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-24T16:05:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Poznaj metodę analizy rozwoju fenotypu morfologicznego w drożdżach Saccharomyces cerevisiae w zależności od stężenia białka. Protokół wykorzystuje regulowany promotor do kontrolowanej ekspresji białka na poziomie populacji i pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Brianowi G. Coonowi oraz Claudii B. Hannie za pomocne dyskusje i wsparcie.
Projekt ten był finansowany z funduszy startowych Departamentu Nauk Biologicznych Uniwersytetu Purdue dla R. Claudio Aguilara oraz z grantu badawczego Institutional Research Grant American Cancer Society dla R. Claudio Aguilara za pośrednictwem Purdue Cancer Center.

A. Hodowla komórek i indukcja białka
W tej sekcji opisano warunki hodowli komórkowej, synchronizację cyklu komórkowego za pomocą nocodazolu, a następnie indukcję ekspresji białka z promotora regulowanego w komórkach drożdży.
<ol>
 <li>Szczep drożdży typu dzikiego W303 (leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15) jest transformowany plazmidowym DNA o wysokiej liczbie kopii (2μ), zawierającym gen docelowy (ENTH2) pod kontrolą promotora tłumionego przez metioninę (MET25). Stężenie 2mM metioniny jest wystarczające do zahamowania aktywności promotora, natomiast pożywki pozbawione metioniny umożliwiają maksymalną ekspresję. W związku z tym można zastosować różne stężenia metioniny, aby uzyskać pożądany poziom ekspresji białka. Transformację DNA plazmidowego w komórkach W303 przeprowadza się metodą LiAc-TE zgodnie ze standardowymi procedurami.2
 Uwaga: Eksperyment ten należy przeprowadzić, hodując komórki przez noc w obecności 2mM metioniny, aby zapewnić ekspresję białka jedynie na poziomie tła. Następnego ranka ekspresję białka należy indukować poprzez resuspensję komórek w pożywce pozbawionej metioniny bezpośrednio po synchronizacji cyklu komórkowego (około 4h). Stwierdzono jednak, że fenotyp podziału komórkowego zależny od ENTH2 indukuje się dopiero po nagromadzeniu w komórkach znacznego stężenia ENTH2 (zazwyczaj po 4-6h indukcji białka3), co sprawia, że przebieg czasowy analizy wszystkich przejawów fenotypu jest bardzo długi (co najmniej 16h). Zaobserwowano, że hodowanie komórek przez noc w obecności 0,2mM metioniny tłumi fenotyp morfologiczny, ale pozwala na utrzymanie podkrytycznego stężenia białka, które można szybko zwiększyć do poziomów indukujących fenotyp po przeniesieniu na pożywkę pozbawioną metioniny. Umożliwia to szczegółową analizę ciężkich przejawów defektu podziału komórkowego w stosunkowo krótszym czasie. Zaleca się zatem, aby badacz dobierał stężenie metioniny poniżej progu indukcji fenotypu w zależności od konkretnego przypadku.</li>
 <li>Wybrać sześć kolonii z płytki zawierającej niedawno transformowane komórki i zaszczepić je do 50 ml selektywnej pożywki z 0,2mM metioniny w sterylnej kolbie stożkowej, stosując standardowe techniki sterylne. Inkubować przez noc w temperaturze 30°C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm. (Więcej informacji na temat standardowych warunków hodowli drożdży znajduje się w ref. 4) </li>
 <li>Następnego ranka oszacować gęstość komórek, mierząc gęstość optyczną kultury przy 600nm. Przenieść ilość komórek odpowiadającą 20 OD600nm do sterylnej probówki do wirowania i zebrać poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Resuspender komórki w YPD do stężenia 0,4 OD600nm/ml i dodać Nocodazole do końcowego stężenia 15μg/ml ze stoku 1mg/ml w DMSO. Inkubować przez 4h w temperaturze 30°C przy wstrząsaniu z prędkością 200rpm. Uwaga: Można zastosować alternatywne metody zatrzymania cyklu, w tym zatrzymanie w fazie G0 przy użyciu czynnika alfa lub w fazie G1-S przy użyciu hydroksymocznika. Stwierdzono, że zatrzymanie w mitozie przy użyciu Nocodazole jest wystarczająco proste i skuteczne dla naszych celów.</li>
 <li>Po 4h sprawdzić odsetek komórek zatrzymanych w mitozie, licząc pod mikroskopem liczbę komórek z pączkami o tej samej wielkości. Jeśli odsetek zatrzymania przekracza 90%, przejść do następnego kroku. W przeciwnym razie utrzymywać komórki w Nocodazole aż do uzyskania pożądanego odsetka zatrzymania mitotycznego.</li>
 <li>Zebrać komórki przez wirowanie przy 2200 rpm przez 5min i przemyć trzy razy lodowatą wodą. Po ostatnim przemyciu resuspender osad w selektywnej pożywce pozbawionej metioniny do gęstości komórek ~ 0,5 OD600nm/ml. Przenieść połowę objętości komórek do nowej sterylnej probówki i dodać metioninę do końcowego stężenia 0,2mM. Będzie to służyć jako kontrola efektów wynikających z podstawowego poziomu ekspresji białka. Wyznacza to pierwszy punkt czasowy eksperymentu (czas = 0h). Analizować komórki co godzinę przez 6h.</li>
</ol>
B. Analiza rozwoju fenotypu
Uwaga: Wszystkie opisane poniżej metody analizy nie muszą być wykonywane jednocześnie.
Oznaczanie poziomu ekspresji białek metodą Western blotting
<ol>
 <li>W każdym punkcie czasowym zmierz OD600nm hodowli i zbierz ekwiwalent 2 OD600nm komórek poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5 mins.</li>
 <li>Resuspenduj osad w 1ml sterylnej wody i przenieś zawiesinę do probówki eppendorfa o pojemności 1,5ml. Powtórz wirowanie, aby uzyskać osad. Odessij supernatant.</li>
 <li>Resuspenduj osad w 50μl buforu do próbek SDS-PAGE Laemmli (50mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerolu, 2% β-merkaptoetanolu i 0,006% błękitu bromofenolowego). Dodaj 50μl mytych kwasem szklanych kulek (o średnicy 0,2-0,4 mikrona) i mieszaj w wortexie przez 1 min.</li>
 <li>Gotuj probówki na bloku grzewczym w 95°C przez 2 mins, ponownie wymieszaj w wortexie przez 30 secs, a następnie kontynuuj gotowanie przez 5 mins. Zamroź próbkę białka w -20°C.</li>
 <li>Rozdziel próbki białek na żelu SDS-PAGE 12%, przenieś je na membranę nitrocelulozową i przeprowadź analizę Western blotting z użyciem odpowiednich przeciwciał w celu wykrycia białka docelowego. W tym przykładzie badamy obecność domen ENTH znakowanych hemaglutyniną (HA), inkubując je z przeciwciałem mysim anty-HA (Covance, Princeton, NJ) w rozcieńczeniu 1:2000 w buforze Blotto-Tween (1XPBS, 5% beztłustego mleka w proszku, 0,1% Tween). Pozwala się, aby przeciwciało wtórne kozie anty-mysie znakowane HRP (Pierce) w rozcieńczeniu 1:2500, również w Blotto-Tween, związało się z przeciwciałem pierwotnym na membranie przez 1h w temperaturze pokojowej. Do wykrycia przeciwciała anty-mysiego znakowanego HRP zastosowano substrat chemiluminescencyjny Supersignal West Pico.</li>
 <li>Ilościowo określ poziomy ekspresji białka za pomocą densytometrii.</li>
</ol>
W tej sekcji opisano dwie metody śledzenia rozwoju fenotypu w funkcji zwiększenia stężenia białka. Pierwsza metoda opiera się na populacji komórek, natomiast druga analizuje go na poziomie pojedynczej komórki.
Ilościowe oznaczenie fenotypu podziału komórek i śmierci komórkowej
<ol>
 <li>W każdym punkcie czasowym przenieść 1ml zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki Eppendorf, stosując techniki sterylne, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5 mins. </li>
 <li>Odssać nadsącz i resuspender osad w 70μl medium, a następnie dodać 30μl błękitu metylenowego z roztworu stokowego o stężeniu 1mg/ml w sterylnej wodzie. Błękit metylenowy jest niebieskim barwnikiem witalnym, który staje się bezbarwny w środowisku redukującym cytozolu, w związku z czym martwe komórki można zidentyfikować po ich niebieskim kolorze. </li>
 <li>Nanieść pipetą ~6μl tej zawiesiny na czyste szkiełko przedmiotowe i przykryć kroplę szkiełkiem nakrywką. Delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć cienką, jednorodną warstwę komórek między powierzchniami szkła.</li>
 <li>Podzielić szkiełko nakrywkowe na 9 kwadrantów i wykonać po 3 zdjęcia z każdego kwadrantu, zgodnie z instrukcją na Rys. 2. Liczba komórek w polu nie powinna przekraczać 30 komórek, aby umożliwić dokładną kwantyfikację. Każde szkiełko nakrywkowe można obrazować przez około 15 mins, zanim pęcherzyki powietrza uszkodzą preparat.</li>
 <li>Policzyć liczbę komórek wykazujących badany fenotyp. Defekt podziału komórek indukowany nadekspresją ENTH2 prowadzi do śmierci komórkowej, dlatego liczymy również liczbę martwych komórek zidentyfikowanych po niebieskim kolorze.</li>
 <li>Obliczyć procent komórek o określonym fenotypie.</li>
 <li>Przedstawić dane na wykresie, jak pokazano na Rys. 3.</li>
</ol>
Wizualizacja defektów specyficznych dla fenotypu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
Komórki z zaburzeniami podziału, obserwowane przy nadekspresji ENTH2, często charakteryzują się defektami ściany komórkowej oraz błędną lokalizacją septyn3 (wizualizowaną za pomocą białek fuzji z GFP). Ścianę komórkową drożdży pączkujących można łatwo zwizualizować poprzez barwienie Calcofluor White (CfW), który nieodwracalnie wiąże się z chityną w ścianach komórkowych drożdży.
<ol>
 <li>W każdym punkcie czasowym odlać 1ml kultury do sterylnej probówki typu Eppendorf i zebrać komórki poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5 mins w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy w 100μl roztworu CfW o stężeniu 1mg/ml w sterylnej wodzie i inkubować przez 5 mins w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
 <li>Zebrać komórki poprzez wirowanie i przemyć 3 razy przy użyciu 1X PBS.</li>
 <li>Resuspender osad w 100μl 1X PBS i obrazować pod mikroskopem, korzystając z optyki UV (ściana komórkowa) oraz filtra FITC (GFP-septin) przy powiększeniu 100X.</li>
 <li>Ilościowo określić procent komórek z defektem ściany komórkowej i błędną lokalizacją septyn, postępując zgodnie z krokami 4-6 w sekcji B.2.1.</li>
</ol>
B.3. Określanie rozwoju fenotypu na poziomie pojedynczej komórki: mikroskopia wideo time-lapse.
<ol>
 <li>Oczyścić szkiełko przedmiotowe z wklęsłym wgłębieniem 70% alkoholem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Zagotować 0,06 g agarozy w 5 ml selektywnego podłoża pozbawionego metioniny w sterylnym szklanym probówce w mikrofalówce, aż agaroza całkowicie się rozpuści.</li>
 <li>Szybko nanieść pipetą 200 μl podłoża z agarozą do wgłębienia w szkiełku i przykryć je innym czystym szkiełkiem przedmiotowym, upewniając się, że pod spodem nie pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Po zestaleniu się żelu gładko odsunąć górne szkiełko od szkiełka z wgłębieniem, utrzymując ich powierzchnie przez cały czas równolegle do siebie. Zapewnia to, że powierzchnia warstwy agarozy jest zlicowana z powierzchnią szkiełka z wgłębieniem. Oczyścić obszar szkiełka wokół warstwy agarozy delikatną chusteczką. Szkiełko jest teraz gotowe do użycia.</li>
 <li>W czasie t = 4 godziny przenieść 1 ml komórek z hodowli do sterylnej probówki typu Eppendorf i zebrać poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej. 
Uwaga: Zaleca się wybór późniejszego punktu czasowego, aby zapewnić wysoki poziom ekspresji białka i zagwarantować rozwój fenotypu. Wymagane są eksperymenty pilotażowe w celu ustalenia czasu indukcji dla każdego przypadku z osobna. 
 </li>
 <li>Odssać nadsącz i resuspendować komórki w 100 μl świeżego selektywnego podłoża pozbawionego metioniny.</li>
 <li>Nanieść wazelinę na krawędzie szkiełka cover-slip. Następnie nanieść kroplę zawiesiny komórkowej na środek warstwy agarozy i rozprowadzić ją równomiernie, delikatnie dociskając do niej szkiełko cover-slip.</li>
 <li>Uszczelnić krawędzie szkiełka cover-slip wazeliną i utrwalić jego położenie, obrysowując brzegi lakierem do paznokci. Odczekać do wyschnięcia lakieru.</li>
 <li>Umieścić szkiełko na podgrzewanym stoliku mikroskopu i wybrać pole widzenia zawierające nie więcej niż 10 odpowiednio rozmieszczonych komórek. W miarę podziałów komórek pole widzenia z czasem będzie stawało się bardziej zatłoczone.</li>
 <li>Wykonować zdjęcie pola widzenia co 5 minut przez ok. 5 godzin. Progresję fenotypu można badać, składając zdjęcia w film za pomocą oprogramowania ImageJ (<a name="cite">Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2005</a>).</li>
</ol>
Uwaga: Do obrazowania żywych komórek wykorzystujemy mikroskop Zeiss Axiovert 200M, monochromatyczną kamerę cyfrową Zeiss Axiocam MRm oraz oprogramowanie do akwizycji obrazów Carl Zeiss Axiovision (wersja 4.4). Kontrolę temperatury uzyskuje się poprzez umieszczenie preparatów na podgrzewanym stoliku utrzymywanym w temperaturze 30°C za pomocą urządzenia PeCon Tempcontrol 37. 
Aby uniknąć wielokrotnej konieczności ponownego ustawiania ostrości, warto zaprogramować oprogramowanie do akwizycji obrazu tak, aby automatycznie rejestrowało kilka obrazów w stosie z (z-stack) w każdym punkcie czasowym, a następnie wybrać obraz z najlepszą ostrością podczas montażu filmu. Niektóre oprogramowania do akwizycji obrazu oferują funkcję autofokusu dla eksperymentów w serii czasowej. W takim przypadku zaleca się korzystanie z tej opcji.
Komórki drożdży typu dzikiego najlepiej rosną w temperaturze 30°C, dlatego kontrola temperatury jest kluczowa. Aby zapewnić odpowiednie ciepło, pomocne jest zastosowanie zewnętrznego źródła ciepła jako uzupełnienie podgrzewanego stolika. Na przykład w naszym przypadku pozostawiamy włączone prześwietlenie białym światłem mikroskopu przez cały czas trwania obrazowania. 
Kluczowe jest również unikanie pęcherzyków powietrza podczas przygotowywania warstwy agarozy i „kanapki” komórkowej. Powietrze uwięzione w pęcherzykach rozszerza się podczas długotrwałego ogrzewania, co może spowodować przemieszczenie komórek poza obszar obrazowania.
Ważne jest również upewnienie się, że pozycje poszczególnych komórek w polu widzenia nie zmieniają się znacząco w trakcie procesu obrazowania, zwłaszcza podczas prób ponownego ustawienia ostrości. Dla programu ImageJ dostępne są wtyczki do stabilizacji obrazu, które pozwalają korygować niewielkie przesunięcia pozycji komórek po zmontowaniu filmu. (<a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</a>).

<ol><li>Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22High+efficiency+transformation+with+lithium+acetate+in+Molecular+Genetics+of+Yeast%3A+A+Practical+Approach%22">High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press Inc. New York. 121-134 (1994).</li>
<li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Getting+started+with+yeast+in+Guide+to+Yeats+genetics+and+Molecular+Biology%22">Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology</a>. , Academic Press Inc. San Diego. 3-21 (1991).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opisuje sposób monitorowania rozwoju fenotypu morfologicznego (komórki drożdży niezdolnej do prawidłowego podziału komórkowego) po nadekspresji białka. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zbieraniu komórek drożdży poprzez wirowanie z zalecaną prędkością, ponieważ wyższe prędkości mogą uszkodzić komórki i zafałszować wyniki. Błękit metylenowy oraz Calcofluor white należy dodać do żywych komórek bezpośrednio przed obrazowaniem, gdyż są one toksyczne. Procedurę tę można również łatwo dosto...

<table><tbody><tr><td>Nocodazole</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy 1% (w/v)</td><td>Odczynnik</td><td>VWR international</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor White</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Odczynnik</td><td>VWR international</td><td>VW3339-2</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Usuwanie genów i nadekspresja białek to powszechne metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek wSaccharomyces cerevisiaeChociaż niniejszy protokół opiera się na nadekspresji białka, można go łatwo dostosować do fenotypów morfologicznych zależnych od supresji ekspresji białka. Nasze laboratorium jest zainteresowane badaniem właściwości sygnałowych białka adaptorowego endocytozy epsyny. W tym celu zastosowaliśmy podejście z wykorzystaniem dominującego negatywu, w którym nadekspresywowano konserwowanąEProszę podać treść HTML do przetłumaczenia. Nie załączyłeś żadnego tekstu w swojej wiadomości.NDepending on the input you provide, I will translate the HTML content. Please provide the source HTML.TWygląda na to, że Twoja wiadomość została przerwana. Czy chciałbyś przekazać treść do tłumaczenia, czy potrzebujesz pomocy w czymś innym?Hdomena homologiczna (ENTH), aby zakłócić funkcje endogennej epsyny-2 (Ent2 lub YLR206W). Zaobserwowaliśmy, że nadekspresja domeny ENTH białka Ent2 (ENTH2) w komórkach typu dzikiego prowadziła do defektu podziału komórkowego, który zależy od błędnej lokalizacji rodziny białek rusztowaniowych – septyn.

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Delecja genu oraz nadekspresja białka to powszechne metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy...

Niniejszy protokół wykorzystuje regulowany promotor, który umożliwia kontrolowaną ekspresję białek. W tym doświadczeniu stosujemy wysokokopiowy plazmid typu 2-mikronowe, który wykazuje ekspresję domeny N2 pod kontrolą promotora tłumionego przez metioninę. Przekształcone zostają za jego pomocą komórki drożdży typu dzikiego.Plazmidy i transformanty wyselekcjonowano na płytkach pozbawionych uol. Po nocnej inkubacji w pożywce selektywnej komórki zsynchronizowano poprzez zahamowanie wzrostu indukowane brakiem kortyzolu.Wreszcie, ekspresja jest indukowana poprzez przeniesienie komórek do pożywki pozbawionej metioniny podczas eksperymentu w szeregu czasowym. Stężenie białka monitoruje się za pomocą techniki western blotting, a rozwój fenotypu morfologicznego za pomocą mikroskopii. Cześć, jestem Claudia z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Purdue.Nazywam się Bari Muji i pracuję w laboratorium AL. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy rozwoju fenotypu morfologicznego w zależności od stężenia białka w indukcie ciała. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania morfologicznych i molekularnych aspektów fenotypu podziału komórkowego, który obserwuje się podczas nadekspresji domeny N2 endocytycznego białka adaptacyjnego absent two.Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół rozpoczyna się od konstrukcji szczepu drożdży, który będzie wykazywał ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania. W naszym przypadku przeprowadzono transformację szczepu drożdży typu dzikiego W 3 0 3 plazmidowym DNA o wysokiej liczbie kopii, zawierającym nth two pod kontrolą promotora tłumionego przez metioninę; 2 mM metioniny hamuje aktywność promotora met 25.Podczas gdy pożywka pozbawiona metioniny pozwala na maksymalną ekspresję, wybierz sześć kolonii z szalki zawierającej niedawno przekształcone komórki i zaszczep w 50 ml pożywki selektywnej z 0,2 mM metioniny w kolbie stożkowej; inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 RPM. Następnego ranka oszacuj gęstość komórek, mierząc gęstość optyczną kultury przy 600 nm. Przenieś odpowiednik 20 OD 600 nm na ml komórek do sterylnej probówki do wirowania i zbierz je poprzez odwirowanie.Resuspenduj komórki w pożywce YPD, mieszając je na wortexie, aby zsynchronizować cykl komórkowy do końcowego stężenia 15 µg/mL, korzystając z roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/mL w DMSO. Inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 RPM. Po czterech godzinach sprawdź odsetek komórek zatrzymanych w fazie mitozy.Po obejrzeniu preparatu pod mikroskopem i policzeniu liczby komórek z pączkami o tej samej wielkości, należy przejść do następnego kroku. Tylko w przypadku, gdy zatrzymanie przekracza 90%, zebrać komórki poprzez wirowanie przy 2200 RPM przez pięć minut. Po trzykrotnym przemyciu lodowatą wodą, zawiesić osad w pożywce selektywnej pozbawionej metioniny, przy gęstości komórkowej wynoszącej około 0,5 OD 600 nanometrów na mililitr.Przenieś połowę objętości komórek do nowej sterylnej probówki i dodaj metioninę do końcowej stężenia 0,2 millimolar. Służyć to będzie jako kontrola efektów wynikających z podstawowego poziomu ekspresji białek. Wróć obie kultury do inkubatora ustawionego na 30 stopni Celsjusza.Komórki analizuje się pod kątem rozwoju fenotypu co godzinę przez sześć godzin w każdym punkcie czasowym. Przenieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej z każdej hodowli do sterylnej probówki do wirowania i odwirowuj komórki, odessaj nadsącz i resuspenduj osad w 70 µL pożywki. Następnie dodaj 30 µL błękitu metylowego z roztworu zapasowego o stężeniu 1 mg/mL w sterylnej wodzie.Następnie nanieś pipetą około 6 µL tej zawiesiny na czystą szkiełko przedmiotowe i przykryj kroplę szkiełkiem cover slip. Delikatnie dociśnij szkiełko cover slip, aby utworzyć cienką, jednorodną warstwę komórek między szklanymi powierzchniami. Podziel pole pod szkiełkiem cover slip na dziewięć kwadrantów i wykonaj trzy zdjęcia z każdego kwadrantu.Liczba komórek w jednym polu nie powinna przekraczać 30, aby umożliwić dokładną kwantyfikację. Należy policzyć liczbę komórek wykazujących badany fenotyp, którymi w tym przykładzie są pączkujące komórki drożdży z wydłużonymi i/lub złączonymi pączkami, które nie oddzieliły się od siebie. Liczymy również liczbę martwych komórek, zidentyfikowanych po niebieskim kolorze, ponieważ defekt podziału komórkowego został wywołany przez nth.Nadekspresja prowadzi do śmierci komórek, co pozwala na wizualizację specyficznych defektów fenotypowych w każdym punkcie czasowym. Do sterylnej probówki do wirówki przeniesiono 1 mL kultury i zebrano komórki poprzez wirowanie. Osad komórkowy zawieszono w 100 µL roztworu Calwhite o stężeniu 1 mg/mL w sterylnej wodzie i inkubowano przez pięć minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.Barwienie bielą wapniową umożliwia wizualizację ściany komórkowej. Osad należy przemyć trzykrotnie 1×PBS. Ostateczny osad zawiesza się w 100 µL PBS.Obserwuj komórki pod mikroskopem i wykonaj zdjęcia przy powiększeniu 100x, używając optyki UV do wizualizacji ściany komórkowej. Aby zwizualizować septynę znakowaną GFP, wykonaj zdjęcia przy użyciu filtra FS E. Ilościowo określ odsetek komórek z defektami ściany komórkowej i nieprawidłową lokalizacją septyny, stosując wcześniej opisaną metodę polegającą na podzieleniu szkiełka podstawowego na dziewięć kwadrantów i wykonaniu trzech zdjęć na każdy kwadrant w celu przeliczenia. Mikroskopia pojedynczych komórek drożdży wymaga zastosowania podłoży agarowych z zatopionym medium; aby przygotować podłoże agarowe.Najpierw należy oczyścić szkiełko przedmiotowe z wgłębieniem za pomocą 70% alkoholu i pozostawić do wyschnięcia. W tym czasie w mikrofalówce należy zagotować 0,06 g agros w 5 ml selektywnego podłoża pozbawionego metioniny, aż do całkowitego i szybkiego rozpuszczenia agros. Następnie na szkiełko należy nanieść pipetą 200 µl pożywki zawierającej agros.W zagłębieniu należy odwrócić kolejne czyste szkiełko przedmiotowe, upewniając się, że pod spodem nie pozostały pęcherzyki powietrza. Po zestaleniu żelu należy płynnym ruchem przesunąć górne szkiełko w stronę przeciwną do szkiełka z zagłębieniem, przez cały czas utrzymując równoległość ich powierzchni. Zapewnia to, że powierzchnia warstwy agarozy jest zlicowana z powierzchnią szkiełka z zagłębieniem.Oczyść obszar slajdu wokół łoża agarowego delikatną chusteczką. Slajd jest teraz gotowy do użycia po upływie czterech godzin. Przenieś 1 mL komórek z hodowli do sterylnej probówki typu microfuge i zbierz je poprzez wirowanie.Odssać supernatant i zawiesić komórki ponownie w 100 µL świeżej pożywki selektywnej pozbawionej metioniny. Na krawędziach szkiełka nakrywnego nanieść wazelinę. Następnie nanieść kroplę zawiesiny komórkowej na środek warstwy agarosy i rozprowadzić ją równomiernie, delikatnie dociskając szkiełko nakrywne.Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywki i utrwal jego pozycję, smarując brzegi lakierem do paznokci. Po wyschnięciu lakieru umieść preparat na podgrzewanym stole mikroskopu. Używamy mikroskopu Zeiss Axio 200 M wyposażonego w monochromatyczną cyfrową kamerę Zeiss Axio camm, MRM, aby wybrać pole widzenia zawierające nie więcej niż 10 komórek w odpowiednich odstępach, ponieważ z czasem pole to stanie się zbyt gęste.W miarę podziału komórek należy wykonywać zdjęcie pola widzenia co pięć minut przez około pięć godzin. Aby uniknąć wielokrotnej korekty ostrości, programujemy oprogramowanie do akwizycji obrazów tak, aby automatycznie pobierało kilka obrazów w osi Z w każdym punkcie czasowym.Obraz z najlepszą ostrością zostanie wybrany później do montażu filmu. Aby zapewnić komórkom odpowiednią temperaturę, oprócz podgrzewanych stołików zastosowano zewnętrzne źródło ciepła, pozostawiając włączone prześwietlające białe światło mikroskopu przez cały czas obrazowania. Regresję fenotypową można badać poprzez montaż obrazów w film przy użyciu oprogramowania Image J. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki nadekspresji badanego białka. Numer dwa.W pierwszej kolejności określono ekspresję białka nth two w trakcie przebiegu eksperymentu. Lizaty z komórek wykazujących ekspresję HA nth two analizowano metodą western blotting przy użyciu monoklonalnego przeciwciała anty-HA. Jak pokazuje immunoblot, komórki hodowane w obecności 0,2 mM metioniny wykazują minimalną ekspresję białka. Natomiast komórki hodowane w pożywce pozbawionej metioniny wykazują stały wzrost stężenia S two w czasie trwania eksperymentu.Następnie przeanalizowano komórki hodowane przez sześć godzin w obecności lub przy braku metioniny, ponieważ niskie stężenie nth dwa nie jest w stanie wywołać fenotypu podziału komórkowego lub wyłącznie śmierci komórkowej. Niewielki odsetek komórek jest martwy, co wskazuje ich niebieski kolor po barwieniu błęknitem metylenowym. Analogicznie, liczba jąder na komórkę, ściana komórkowa oraz organizacja septyn są prawidłowe, zgodnie z oczekiwaniami.W przeciwieństwie do tego, nadekspresja M2 prowadzi do masywnego defektu podziału komórkowego i śmierci komórek, co objawia się obecnością długich łańcuchów połączonych, wydłużonych pączków, które zachowują niebieski kolor po barwieniu błękitem metylenowym. Większość komórek fenotypowych jest wielojądrowa, co wykazuje barwienie DPI. Barwienie Calcofluor white wykazuje obecność skupisk nieprawidłowych fragmentów ściany komórkowej.Ponadto septyna jest w dużym stopniu błędnie zlokalizowana i zdezorganizowana. Ilościowe określenie fenotypu w funkcji czasu przedstawiono na tym wykresie, gdzie otwarte kółka reprezentują 0 mM metioniny, a pełne kółka reprezentują 0,2 mM metioniny. Widzimy tutaj, że wraz z narastaniem stężenia nth two w komórkach w czasie, rośnie odsetek komórek wykazujących fenotyp podziału komórkowego.Komórki kontrolne hodowane w obecności 0,2 mM metioniny wykazują, że rozwój fenotypu jest funkcją podwyższonego stężenia białka, a nie warunków hodowli komórkowej. Na koniec rozwój fenotypu po nadekspresji nth dwa został utrwalony za pomocą mikroskopii wideo time-lapse.Po czterech godzinach nth, dwie komórki z nadekspresją wykazują łagodny fenotyp morfologiczny podziału komórkowego. W miarę trwania filmu obserwujemy nieprawidłowe i wydłużone okresy wzrostu pączka apikalnego, co prowadzi do powstania bardzo wydłużonych pączków. Obserwujemy również przypadki pojawiania się nowych pączków przed wystąpieniem procesu separacji komórek.Dodatkowo zaobserwowano, że pąki wyłaniają się z kilku obszarów komórki macierzystej, co prowadzi do powstania wyglądu rozgałęzionego. Właśnie pokazaliśmy, jak charakteryzować i analizować rozwój fenotypu morfologicznego w zależności od stężenia białka w drożdżach pączkujących. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pelletowaniu komórek przy zalecanych prędkościach wirowania, ponieważ zbyt wysokie prędkości mogą uszkodzić komórki.Ważne jest również pamiętanie o dodaniu błękitu metylenowego i chlorku bezpośrednio przed obrazowaniem, ponieważ są one toksyczne dla komórek linii Light East. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

analysis-development-morphological-phenotype-as-function-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego jako funkcji stężenia białka w drożdżach pączkujących

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów.  Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Prezentujemy metodę ilościowego określania fenotypów wzrostu pojedynczych komórek drożdży, gdy rosną one w kolonie na stałych podłożach, za pomocą mikroskopii poklatkowej zwanej One-cell Duubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Heterogeniczność populacji genetycznie identycznych komórek rosnących w kolonie może być bezpośrednio obserwowana i określana ilościowo.

ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Ten manuskrypt opisuje metodę badania przesiewowego bibliotek mutantów Candida albicans średniej wielkości pod kątem fenotypów morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaków za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej.

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę analizy rozwoju fenotypu morfologicznego w drożdżach Saccharomyces cerevisiae w zależności od stężenia białka. Protokół wykorzystuje regulowany promotor do kontrolowanej ekspresji białka na poziomie populacji i pojedynczych komórek.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Przeglądaj więcej filmów